Reação colorimétrica para formaldeído: aplicação quantitativa com digitalização de imagens

Instituto de Química

RAFAEL HENRIQUE MEDEIROS

REAÇÃO COLORIMÉTRICA PARA FORMALDEÍDO:

APLICAÇÃO QUANTITATIVA COM DIGITALIZAÇÃO DE

IMAGENS

CAMPINAS

2015

RAFAEL HENRIQUE MEDEIROS

REAÇÃO COLORIMÉTRICA PARA FORMALDEÍDO:

APLICAÇÃO QUANTITATIVA COM DIGITALIZAÇÃO DE

IMAGENS

ORIENTADORA: Profa. Dra. ADRIANA VITORINO ROSSI

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO RAFAEL HENRIQUE MEDEIROS E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ADRIANA VITORINO ROSSI.

ASSINATURA DA ORIENTADORA

CAMPINAS 2015

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestre em QUÍMICA na área de QUÍMICA ANALÍTICA.

À Profa. Dra. Adriana pela aceitação da realização do mestrado, pela enorme paciência e auxílio para a elaboração e escrita dos relatórios associados ao mestrado e pelos conceitos e conhecimentos compartilhados durante todo o trabalho, que corroboraram positivamente para o desenvolvimento desse trabalho.

Ao grupo GPQUAE por todo o auxílio, ideias e contribuições constantes. Especialmente à Acácia pela ajuda, paciência e diversão no cotidiano.

À CPG-IQ/UNICAMP e ao FAEPEX-UNICAMP pelo auxílio financeiro para a participação da 37a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, realizada entre 26 e 29 de maio de 2014, em Natal – RN, com a apresentação de um trabalho intitulado “Determinação de formaldeído em leite através de digitalização de imagens em dispositivo microfluídico”,

Ao CNPQ pela bolsa concedida.

A todos amigos e familiares que me suportaram positivamente durante esse processo.

Formaldeído (FA) é um produto com elevada toxicidade e presença relatada em produtos industrializados e naturais. Apesar da adição de FA ser proibida em produtos de uso humano, ele pode ser encontrado como contaminante de leite adulterado. Neste trabalho, foi desenvolvido um método de análise de FA por análise de imagens digitalizadas de dispositivos microfluidicos em suporte de papel (PAD). Inicialmente estudou-se um método colorimétrico para quantificação de FA em solução aquosa com detecção espectrofotométrica em 585 nm, com adição de 1,00 mL de solução aquosa de FA; 1,50 mL de H2SO4 concentrado e 100 L de solução

de ácido cromotrópico 5 % (m/v), seguindo-se de diluição da mistura reacional na proporção 1:1 (v:v) com água deionizada e transferência de 10 μL dessa mistura diluída para o μPAD. Obteve-se curva analítica com sensibilidade de 0,0404 L mg-1

e limite de quantificação de 0,96 mg L-1, na faixa de 1,0 a 25,0 mg L-1 de FA. A quantificação de FA em leite foi realizada pela adição de 1,00 mL de leite, 50 μL de solução de FeCl3 1 % (m/v) e 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1, com aquecimento até

ebulição por 1 min, transferência de 10 μL da mistura reacional para o μPAD e secagem com ar quente por 10 min. Ensaios de interferência foram avaliados para diversos compostos (teste t, 95 % de confiança), tendo sido obtido que ureia não interfere, enquanto a alteração do pH do leite para valores abaixo de 6,6 e a presença de acetaldeído prejudicam a formação do produto colorido do FA. Com os dados do sistema RGB (Red, Blue e Green) da conversão de imagens digitalizadas do μPAD, chegou-se a um modelo de calibração univariada (sensibilidade de 0,00795 L mg-1 e limite de quantificação de 5,2 mg L-1)e de calibração multivariada (método MLR, com valor de r² = 0,9955), neste caso com resultados precisos, mas não exatos. Os resultados da calibração univariada foram exatos e precisos, com valores de desvios aceitáveis de acordo com parâmetros da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, indicando sua adequação em termos acessibilidade de procedimento, custo e tratamento de dados, sugerindo potencial para aplicação.

Formaldehyde (FA) is a product with high toxicity, presented in industrial and natural products. Despite the prohibition of its addition in products for human consumption, FA can be found as a contaminant in milk. In the present work, a method for the analysis of FA by image digitalization of microfluidic paper-based devices (PAD) was developed. A colorimetric method for quantification of FA in aqueous solution was studied with spectrophotometric detection in 585 nm, with the addition of 1,00 mL of FA aqueous solution, 1,50 mL of concentrated H2SO4 and 100

L of 5 % (m/v) chromotropic acid solution. The reactional mixture was diluted 1:1 (v/v) and 10 L transferred to the μPAD. The calibration curve was constructed in the concentration range from 1,0 to 25,0 mg L-1 (sensibility = 0,0404 L mg-1; limit of quantification = 0,96 mg L-1). The quantification of FA in milk was studied with addition of 1,00 mL of milk, 50 μL of 1 % (m/v) FeCl3 solution and 0,75 mL of 12 mol

L-1 H2SO4. The reactional mixture was then heated to water boiling point for 1 min

and 10 μL was transferred to the μPAD, followed by a dryness step in a hot air flow for 10 min. Interferences were studied (t-test, 95 confidence level). Urea, a common adulterant found in milk, does not interfere in the formation of the chromogen, while the alteration of milk under pH 6,6 and the presence of acetaldehyde interfere in the colorimetric reaction. Data from the conversion of the digitalized images of the μPAD to the RGB system (Red, Blue and Green) were used for univariate (sensibility = 0,00795 L mg-1; limit of quantification = 5,2 mg L-1) and multivariate calibration (MLR method; r² = 0,9955). The MLR calibration was precise, but inaccurate. The results of univariate calibration were accurate and precise, according to parameters of the Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), which indicates it is adequate in terms of accessibility, cost and data treatment. The results show the potential application of the developed method.

AR – Absorbância refletida

AA – Acetaldeído AC – Ácido acético AF – Ácido fórmico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitáriaa AT - Acetona

BA – Benzaldeído

C – Concentração analítica CA – Ácido cromotrópico

DARPA – Departamento de Defesa dos Estados Unidos DPR – desvio padrão relativo

EMBRAPA - Empresa Brasileira de P esquisa Agropecuária FA – formaldeído

FeCl3 - solução de FeCl3 1 % m/v

GPQUAE – Grupo de Pesquisas em Química Analítica e Educação IAL – Instituto Adolfo Lutz

IARC – International Agency for Research on Cancer INCA – Instituto Nacional do Câncer

LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação

MAPA – Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento MLR – Regressão linear múltipla

MP-RS – Ministério Público do Rio Grande do Sul

NIOSH – National Institute for Occupational Safety and Health PCR – Regressão em componentes principais

PDMS – Polidimetilsiloxano

PIC-Jr. – Programa de Iniciação Científica Júnior PLS – Regressão por mínimos quadrados

PMMA - Polimetilmetacrilato

RDC – Resolução de Diretoria Colegiada RGB – Componentes do Sistema RGB UR – Ureia

V –Volume dos reagentes

WHO – World Health Organization λ – Comprimento de onda (nm)

PAD – dispositivo microfluidico em papel σ – Desvio padrão

Tabela 1. Informações de trabalhos analíticos com PAD...22

Tabela 2. Alguns efeitos de diferentes faixas de concentrações de FA e intervalos de

exposição à saúde humana ao (adaptado de INCA, 2012)...23

Tabela 3. Alguns estudos de quantificação de FA em diversas amostras...24 Tabela 4. Características de alguns reagentes colorimétricos descritos na literatura

para detecção de FA...25

Tabela 5. Influência do pH na qualidade e características do leite...28 Tabela 6. Ajuste das condições da reação em solução de CA e H2SO4...40

Tabela 7. Descrição de condições testadas para ajuste da reação de CA e H2SO4

em solução...46

Tabela 8. Algumas figuras de mérito da curva analítica para FA com dados

espectrofotométricos...57

Tabela 9. Algumas figuras de mérito da calibração univariada da componente

G...76

Tabela 10. Parâmetros do modelo de calibração multivariada das componentes

RGB...77

Tabela 11. Análise de variância para o ajuste do modelo linear de calibração

multivariado (método MLR)...77

Tabela 12. Alguns parâmetros (concentração prevista pelo modelo de calibração,

desvio e desvio padrão relativo) obtidos pelos métodos de calibração univariado (componente G) e multivariado (regressão linear múltipla dos componentes RGB) para as concentrações baixa, média e altas utilizadas no ensaio de exatidão e precisão intra-corrida...80

Figura 1. Esquema de adulteração de leite no estado do Rio Grande do Sul em

2013 (Folha, 2013)...27

Figura 2. Esquema do procedimento de impressão e secagem para a produção do

μPAD padrão utilizado nos testes...37

Figura 3. Representação da disposição das amostras no PAD; cada amostra foi adicionada em 3 zonas reacionais sequenciais para uma melhor reprodutibilidade, e, após a análise digital, a média entre as 3 era utilizada para avaliação dos resultados...42

Figura 4. Estrutura do ácido cromotrópico...50 Figura 5. Proposta de etapas e coloridos da reação do ácido cromotrópico com o FA

(adaptado de Fagnani et al, 2003), sendo (1): interação de CA com FA e eliminação de uma molécula de água; (2): formação do colorido a partir da oxidação e desidratação do composto intermediário; A e B representam estruturas propostas para o colorido responsável pela coloração roxo/violeta da solução...50

Figura 6. Espectro de absorbância do produto cromórofo originado da adição de

1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1, 300 L de solução de CA e 1,00 mL de H2SO4

concentrado, seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min...51

Figura 7. Espectros de absorbância do produto colorido da reação de 1,00 mL de

solução de FA 30,0 e 300,0 mg L-1, 300 L de CA e 3,00 mL dos respectivos ácidos: a) H2SO4 12 mol L-1, b) HCl e c) H3PO4 (ambos com adição de 70 L de de H2O2

2,5 10-2 mol L-1), aquecido em banho termostatizado 90 °C por 1 h...52

Figura 8. Variação da absorbância do produto colorido da reação de 1,00 mL de FA

20,0 mg L-1, 300 L de CA e 1,00 mL de H2SO4 em diferentes concentrações,

aquecido em banho termostatizado a 60 °C por 10 min...54

Figura 9. Variação da absorbância do produto colorido da reação de 1,00 mL de FA

20,0 mg L-1, 300 L de CA e diferentes quantidades de H2SO4 concentrado,

aquecido a 60 °C por 10 min...55

Figura 10. Efeito da concentração de CA na intensidade do produto colorido da

reação de 1,00 mL de FA 20,0 mg L-1, 1,50 mL de H2SO4 concentrado e solução de

CA, aquecido em banho termostatizado a 60 °C por 10 min...55

Figura 11. Curva analítica nas melhores condições estabelecidas para a reação de

1,00 mL de solução de FA,100 L de CA e 1,50 mL de H2SO4 concentrado,

seguindo-se de aquecimento em água a 60 °C por 10 min. A corresponde à absorbância e CFA a concentração de FA...57

diluição da mistura reacional em 1:1 (v/v) para transferência para µPAD; B= branco (ausência de FA)...59

Figura 13. Produto da reação de leite (cru e destilado) com Fe3+ + H2SO4 12 mol L-1

e CA em meio ácido (100 L de FA 20,0 mg L-1 + 0,50 mL de H2SO4; (1) Leite + FA

+ H2SO4 + Fe3+; (2) Leite + H2SO4 + Fe3+; (3) Leite destilado + FA + H2SO4 + Fe3+;

(4) Leite destilado + H2SO4 + Fe3+; (5) Leite + FA + H2SO4 + CA; (6) Leite + H2SO4 +

CA; (7) Leite destilado + FA + H2SO4 + CA;(8) Leite destilado + H2SO4 + AC...60

Figura 14. (a) Imagem digitalizada do μPAD da avaliação dos ácidos para a reação

de detecção de FA em leite; transferência de 10 μL da mistura reacional de 1,00 mL de leite com diferentes concentrações de FA, 100 μL de solução de FeCl3 e 1,00 mL

de H2SO4 12 mol L-1 ou HCl concentrado, aquecido em banho termostatizado a 90 ºC

por tempo suficiente para aparecimento da cor da solução; transferência de 10 L da mistura reacional; B= Branco (ausência de FA) (b) Variação dos valores de AR das

componentes R, G e B para os ácidos avaliados, com os símbolos (●) para HCl e (■)

para H2SO4 12 mol L-1 ...61

Figura 15. Roda de cores, representando as cores primárias, secundárias e

terciárias e as respectivas cores complementares, que são obtidas observando-se o oposto da cor selecionada. Para o produto colorido obtido na reação, com cor semelhante ao vermelho-violeta indicada na imagem, a cor complementar é o amarelo verde, o que justifica a maior sensibilidade da componente G...67

Figura 16. Efeito da quantidade de H2SO4 12 mol L-1 na reação de 1,00 mL de leite

cru com FA na concentração de 20 mg L-1 e 100μL de solução de FeCl3 1, aquecido

em banho termostatizado a 90 ºC por 2 min; diluição 1:2 (v/v) com medidas espectrofotométricas...63

Figura 17. (a) Imagem do μPAD da avaliação do tempo de aquecimento para a

reação de 1,00 mL de leite cru com diferentes concentrações de FA, 100 μL de solução de FeCl3 e 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1, aquecido em banho termostatizado

a 90 ºC por 1, 2 ou 5 min; transferência de 10 μL da mistura reacional. Amostras de 1,0 e 5,0 mg L-1 com 5 min de aquecimento apresentaram coloração idêntica ao branco; B= Branco (ausência de FA); (b) Variação dos valores de AR das

componentes R e G, onde os símbolos representam dados obtidos com 1 (■), 2 (●) e

à 90 ºC e em água em ebulição; transferência de 10 μL da mistura reacional (imagem alterada para melhor disposição dos resultados); B= branco (ausência de FA); (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G, onde os símbolos

representam dados obtidos a 90 (●) e 98 (■) ˚C...65

Figura 19. (a) Imagem digitalizada do μPAD dos testes da avaliação do volume de

agente oxidante FeCl3 na reação de detecção de FA em leite; transferência de

10 μL da mistura reacional de 1,00 mL de leite cru com concentração de FA de 10,0 mg L-1, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1e diferentes volumes de solução de FeCl3

1% (m/v), aquecido à temperatura de ebulição por 1 min; (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G...66

Figura 20. (a) Imagem digitalizada do μPAD da avaliação da adição de 50 e 150 μL

de solução de FeCl3 na reação de1,00 mL de leite cru com diferentes concentrações

de FA e 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1, aquecido à temperatura de ebulição por

1 min; transferência de 10 μL da mistura reacional; B= Branco (ausência de FA). (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G, onde os pontos representam

50 (■) e 150 (▲) L de FeCl3...68

Figura 21. Interface de edição de imagens do programa PixelColor. É possível

observar a grande quantidade de edições possíveis, o que permite a leitura simultânea de todas as zonas reacionais do PAD e possibilidade de análise digital da área total de cada manch...69

Figura 22. (a) Imagem digitalizada do μPAD do ensaio de interferentes na reação de

1,00 mL de leite cru com concentração dos reagentes de 20,0 mg L-1, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1e 50 μL de solução de FeCl3, aquecido por 1 min; transferência de

10 μL da mistura reacional; B: ausência dos reagentes estudados; AA: acetaldeído; BA: benzaldeído; AF: ácido fórmico; AC: ácido acético; AT: acetona; (b) Variação dos valores de AR das componentes R, G e B...70

Figura 23. (a) Imagem digitalizada do μPAD da interferência de acetaldeído 20,0,

50,0 e 100,0 mg L-1 na reação de 1,00 mL de leite cru com FA de 10,0 mg L-1, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1e 50 μL de solução de FeCl3, aquecido à temperatura

de ebulição por 1 min; transferência de 10 μL da mistura reacional; B=branco; AA: acetaldeído (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G...71

Figura 24. (a) Imagem digitalizada do μPAD do teste de interferência de ureia 10,0,

20,0, 50,0 e 100,0 mg L-1 na reação de 1,00 mL de leite cru com concentração de FA de 10,0 mg L-1, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1e 50 μL de solução de FeCl3, aquecido

à temperatura de ebulição por 1 min; transferência de 10 μL da mistura reacional; B=branco; UR: ureia. (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G...71

temperatura de ebulição por 1 min; transferência de 10 μL da mistura reacional; o pH original do leite com FA 10 mg L-1 (pH= 6,8) foi alterado com adição de HCl 0,1 mol L-1 e NaOH 0,1 mol L-1 para os valores de 7,0, 6,4, 6,3 e 6,1, e reajustado para o valor original antes da reação colorimétrica; B=branco (ausência de FA); (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G...72

Figura 26. (a) Imagem digitalizada do μPAD para avaliação da menor concentração

de FA detectável: transferência de 10 μL da mistura reacional de 1,00 mL de leite cru fortificado com diferentes concentrações de FA, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1 e

50 μL de solução de FeCl3, aquecido a ebulição por 1 min; transferência de 10 μL da

mistura reacional; B= Branco; (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G; (c) imagem digitalizada do μPAD com inversão de cores (Paint 6.1)...74

Figura 27. (a) Imagem digitalizada do μPAD da construção da curva analítica;

transferência de 10 μL da mistura reacional de 1,00 mL de leite cru fortificado com diferentes concentrações de FA, 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1 e 50 μL de solução de

FeCl3, aquecido a temperatura de ebulição por 1 min; transferência de 10 μL da

mistura reacional; B= Branco (ausência de FA); (b) Variação dos valores de AR das

componentes R e G...75

Figura 28. Curva analítica para a imagem digitalizada do μPAD (Figura 26a) da

componente G obtidos através programa (a) PixelColor; ARG corresponde à

absorbância refletida para a componente G e C a concentração de FA em leite...75

Figura 29. (a) Imagem digitalizada do μPAD da avaliação da exatidão e precisão

inter-corridas; transferência de 10 μL da mistura reacional de 1,00 mL de leite cru fortificado com concentrações de FA inferior, média e superior (6,0, 13,0 e 20,0 mg L-1 respectivamente), 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1e 50 μL de solução de

FeCl3 1% (m/v), aquecido a temperatura de ebulição por 1 min; transferência de

10 μL da mistura reacional; B= Branco (ausência de FA); Foram realizadas 5 replicatas para cada concentração, cada uma disposta em 3 zonas reacionais sequenciais; (b) Variação dos valores de AR das componentes R e G...79

Capítulo 1. INTRODUÇÃO ... 17

1.1 Miniaturizações de ensaios analíticos ... 18

1.2 Dispositivos microfluidicos ... 18

1.3 Papel como suporte reacional ... 20

1.4 Formaldeído, ocorrência e reações ... 22

1.5 Formaldeído em leite ... 26

1.6 Análise digital de imagens e calibração multivariada ... 28

Capítulo 2. OBJETIVOS ... 32

2.1 Objetivo geral ... 33

2.2 Objetivos específicos ... 33

Capítulo 3 PARTE EXPERIMENTAL ... 34

3.1 Considerações Gerais ... 35

3.2 Equipamentos, materiais e reagentes ... 35

3.2.1 Equipamentos ... 35

3.2.2 Materiais ... 35

3.2.3 Reagentes ... 36

3.2.4 Programas ... 37

3.3 Construção do dispositivo microfluidico em suporte de papel (μPAD) ... 37

3.4 Parâmetros de digitalização de imagens ... 38

3.5 Reação com ácido cromotrópico em solução ... 38

3.5.1 Tipo de ácido ... 38

3.5.2 Concentração de ácido ... 39

3.5.3 Quantidade de ácido ... 39

3.5.4 Quantidade de ácido cromotrópico ... 39

3.5.5 Resumo das condições testadas para ajuste da reação entre FA e CA ... 39

3.5.6 Construção da curva analítica ... 40

3.5.7 Avaliação de μPAD como suporte reacional ... 40

3.6 Reação colorimétrica de formaldeído em Leite ... 41

3.6.4 Avaliação de agente oxidante ... 43

3.6.5 Quantidade de agente oxidante ... 43

3.6.6 Temperatura de reação ... 44

3.6.7 Tempo de aquecimento ... 44

3.6.8 Ensaio de interferentes ... 44

3.6.9 Resumo das condições testadas para ajuste das condições da reação colorimétrica de formaldeído em leite ... 45

3.6.10 Avaliação do limite de detecção e construção da curva analítica ... 47

3.6.11 Avaliação de exatidão e precisão intra-corridas ... 47

Capítulo 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 48

4.1 Reação colorimétrica para formaldeído em solução com ácido cromotrópico .... 49

4.1.1 Seleção do reagente colorimétrico para formaldeído ... 49

4.1.2 Seleção do ácido adequado ... 51

4.1.3 Avaliação da concentração de H2SO4. ... 53

4.1.4 Avaliação da quantidade de H2SO4 concentrado ... 54

4.1.5 Avaliação da quantidade de ácido cromotrópico ... 55

4.1.6 Curva analítica e algumas figuras de mérito do método ... 56

4.1.7 Avaliação do PAD como suporte reacional ... 57

4.2 Análise de formaldeído em amostras de Leite ... 59

4.2.1 Testes preliminares de formaldeído em leite na reação com CA ... 59

4.2.2 Estudo da reação colorimétrica de FA em leite ... 60

4.2.3 Efeito da quantidade de ácido na reação de formaldeído com triptofano ... 63

4.2.4 Tempo e temperatura de aquecimento ... 64

4.2.5 Volume de solução de FeCl3 ... 66

4.2.6 Seleção do programa conversor para os ensaios de interferentes e calibração ... 68

4.2.7 Ensaio de interferentes ... 69

4.2.8 Menor concentração detectável visualmente no μPAD e construção da curva analítica ... 73

4.2.9 Modelo de calibração multivariada para as componentes RGB ... 76

Capítulo 6. PERSPECTIVAS ... 85

Capítulo 7. TRATAMENTO DE RESÍDUOS ... 87

1.1 Miniaturizações de ensaios analíticos

Os trabalhos de Feigl e Anger, em suas obras Spot tests in Inorganic

Analysis (1972) e Spot tests in Organic Analysis (1975) introduziram os spot tests

como ferramenta analítica. Além da simplicidade, spot tests apresentam em geral baixo custo e têm como aspectos favoráveis as características de seletividade que atingem a especificidade em alguns casos e o uso de pequenas quantidades de amostras e reagentes, com limites de detecção muito baixos (Feigl e Anger, 1972).

A identificação de analitos a partir de reações de spot tests ocorre pela mudança de cor da mistura reacional pela formação de produtos coloridos solúveis ou insolúveis. Em geral, há proporcionalidade entre quantidade do produto reacional e a concentração inicial do analito na amostra (Feigl e Anger, 1972), o que potencializa a aplicação de reações de spot tests em aplicações quantitativas.

O avanço das tecnologias de produção de microdispositivos sensores tem repercutido principalmente na química analítica, como, por exemplo, em bioensaios, separações analíticas, síntese de materiais, dentre outras aplicações (Atalay et al, 2011). No início dos anos 1990, Manz et al (1990) introduziram um microssistema para cromatografia em fase líquida, iniciando o desenvolvimento de microdispositivos para ensaios analíticos. A miniaturização de análises permite utilização de baixos volumes de reagentes e uma maior frequência analítica, que são aspectos desejáveis cada vez mais desejáveis (Li, 2010; Manz et al, 1992).

Dentre as vantagens da miniaturização em química analítica, destacam-se o aumento da frequência analítica, a redução de volumes de reagentes e, consequentemente, dos resíduos gerados, e principalmente, a portabilidade para realização de análises em campo (Dornelas, 2013).

1.2 Dispositivos microfluidicos

Dornelas (2013) define microfluidica como a ciência e a tecnologia de sistemas que processam e manipulam pequenas quantidades de líquidos utilizando canais ou regiões com dimensões bem menores que os convencionais em química analítica. As dimensões do sistema variam geralmente de mm² a cm² (Atalay et al, 2011). Sua origem remete aos métodos de separação, como cromatografia gasosa, cromatografia líquida de alta eficiência, eletroforese capilar, dentre outros, que, associadas a métodos de detecção adequados, fornecem sensibilidade e resolução

para análises biológicas e químicas, com baixo consumo de reagentes e produção de resíduos (Whitesides, 2006).

Alguns fatores históricos impulsionaram o desenvolvimento de técnicas microfluidicas. Após a 2a Guerra Mundial, o Departamento de Defesa dos Estados Unidos (DARPA) apoiou diversos estudos para o desenvolvimento de sistemas portáteis de detecção para análise de substâncias que representassem problemas de contaminação químicos e biológicos. Já na década de 80, os estudos do genoma e o sequenciamento do DNA exigiram métodos analíticos de maior sensibilidade, rendimento e resolução. A microeletrônica também contribuiu com a elaboração de sistemas microeletromecânicos, com microchips de silício e vidro. Esses eventos estimularam o crescimento de pesquisas para o desenvolvimento da microfluidica (Whitesides, 2006).

Diversos estudos estão descritos na literatura utilizando microfluidica para análises em bioanalítica (Schemberg et al, 2010; Yang et al, 2010), melhoria da eficiência de processos, como fermentação em biorreatores (Buchenauer et al, 2009) e produção de alimentos (Skurtys e Aguilera, 2008), proteômica (Luk e Wheeler, 2009), além de análises de alimentos (Lee et al, 2008; Shiddiky et al, 2006).

Dentre os substratos ou suportes mais comuns utilizados em dispositivos microfluidicos, destacam-se o vidro, polímeros e papel.

Dispositivos em suporte de vidro apresentam características como transparência óptica e resistência (Becker e Gartner, 2008), embora dispositivos em suporte de vidro apresentem a desvantagem do alto custo para a sua produção.

Por sua vez, a alta disponibilidade de materiais poliméricos de diferentes propriedades, o baixo custo de produção e a fácil manipulação são alguns fatores que contribuem para a seleção de polímeros como substratos de dispositivos microfluidicos (Piccin, 2008). Um dos polímeros mais utilizados é o polidimetilsiloxano (PDMS), que apresenta vantagens como baixa temperatura de cura, excelente transparência óptica, elasticidade, baixa toxicidade e baixo custo (Piccin, 2008).

Dispositivos microfluidicos em suporte de papel (PAD) representam uma alternativa de custo mais baixo em relação a outros substratos citados, além de apresentarem vantagens como alta disponibilidade e facilidade de manipulação,

armazenamento e transporte, tornando-o um potencial suporte para ensaios analíticos (Dornelas, 2013).

1.3 Papel como suporte reacional

Em um estudo sobre as perspectivas de uso de PAD, Martinez e colaboradores (2010) enumeraram algumas características desse suporte que o caracterizam favoravelmente para a realização de ensaios analíticos. É um material de baixo custo (cerca de U$ 6,00 / m² para papel cromatográfico de alta qualidade). É leve (aproximadamente 10 mg cm-2), disponível em espessuras variadas (0,07 a 1 mm) e é constituído por celulose ou polímeros celulósicos, que são compatíveis com ensaios biológicos. É um material que permite modificação química para a introdução de grupos funcionais para interação com substratos específicos, tais como proteínas e outras biomoléculas. Geralmente é branco, o que auxilia na percepção visual de testes colorimétricos devido ao contraste entre a cor formada e o fundo branco. É um material inflamável, facilitando sua eliminação segura após o uso e é facilmente estocado e transportado para análises de campo (Martinez et al, 2010).

A detecção de um analito a partir do produto de uma reação realizada sobre papel envolve, na maioria das vezes, a formação de um produto colorido em uma área irregular ou em várias regiões na superfície do papel. Como a distribuição da massa do produto não é constante na direção da espessura do papel (Pelton, 2009), é interessante limitar a área de teste dentro de um espaço uniforme, que pode ser definido com o auxílio de uma barreira hidrofóbica (Yagoda, 1937), originando uma zona reacional. Com isso é possível realizar ensaios sem perda da capacidade de detecção devido ao espalhamento da mancha colorida sobre uma grande superfície, além de a uniformidade permitir o estabelecimento de relações quantitativas entre a intensidade de cor de cada zona reacional e a concentração do produto colorido, que por sua vez pode ser associada à concentração do analito.

Diversos métodos de criação PAD estão descritos na literatura, como, por exemplo, fotolitografia, impressão em cera, impressão em impressoras a jato de tinta, plotting, plasma etching, dentre outros (Martinez et al, 2010; Li et al, 2012). O uso de cera como barreira hidrofóbica para a construção de microestruturas

apresenta-se como uma opção eficiente, simples, rápida e de baixo custo para a fabricação de µPADs (Lu et al., 2009).

A cera é depositada sobre a superfície do suporte de papel com impressoras comerciais à base de cera e, então, o dispositivo é submetido a uma etapa de aquecimento controlado para que ocorra espalhamento uniforme vertical e lateralmente no papel, o que impede que haja espalhamento lateral de reagentes e/ou produtos da reação envolvida nos testes. Há algumas desvantagens da impressão à cera: a necessidade de utilização de impressoras que possuem um custo elevado em comparação à impressoras comuns com jato de tinta ou a laser, além da necessidade de uma etapa de aquecimento do dispositivo antes da sua utilização (Li et al, 2012)

µPADs possuem aplicações diversas, como para análises ambientais (Jayawardane et al., 2012; Mentele et al., 2012; Apilux et al, 2010), análises biomédicas e de diagnósticos (Bhakta et al, 2014; Li et al, 2011; Dungchai et al; 2011, 2010; Martinez et al, 2007;) e controle de qualidade em alimentos (Nie et al, 2010). Os métodos de detecção mais comuns encontrados na literatura são colorimétricos, eletroquímicos e quimioluminescentes, com exemplos citados na Tabela 1.

Tabela 1. Informações de trabalhos analíticos com PAD.

Método de Detecção Autores, Ano Analito

Colorimétrico

Martinez et al, 2007 Bruzewicz et al, 2008

Glicose Li et al, 2010 (1) Nitrito Li et al, 2010 (2) Ácido úrico Eletroquímico

Dungchai et al, 2009 Glicose Nie et al, 2010 Colesterol

Colorimétrico e

Eletroquímico Apilux et al, 2010 Íons Au

3+

e Fe3+

Quimioluminescente Yu et al, 2011

Glicose Ácido úrico

1.4 Formaldeído, ocorrência e reações

Fomaldeído (FA), também conhecido como formol ou metanal, é um gás inflamável à temperatura ambiente e bastante reativo (US Department of Health and Human Services, 2009). É produzido naturalmente na combustão de gás natural, querosene, cigarros, motores automotivos e em alguns processos biológicos. É largamente empregado na indústria, na produção de fertilizantes, papel e látex, como agente antisséptico na produção de embalagens, resinas a base de ureia-FA (Von Bockelmann e Von Bockelmann, 1986) e poliacetais (Seymore e Kauffman, 1992).

Sintetizado originalmente em 1958 por Aleksandr Mikhailovich Butlerov, o FA é comumente comercializado em solução aquosa a 37 % m/v, (Seymor e Kauffman, 1992). A enorme gama de aplicações desse composto justifica o crescente aumento de sua produção: nos Estados Unidos, de 1995 para 2000, a produção aumentou de 3,62 (Ghana e Xie, 1997) para 4,65 milhões de toneladas (IARC, 1995), respectivamente. Com a ampla utilização, pode ser um importante

poluente atmosférico (Fagnani et al, 2003; Mariano et al, 2010) e um contaminante de recursos hídricos, por oxidação da matéria orgânica ou liberação de produtos que o contenham (Hill et al, 2009).

O FA é um intermediário essencial do metabolismo celular e na biossíntese de purinas, timidina e certos aminoácidos (IARC, 1995). Embora o FA seja facilmente absorvido por vias nasais, orais e epiteliais, ele é rapidamente convertido nos tecidos em compostos menos tóxicos, como CO2 e o íon formiato

(CHOO-). Todavia, concentrações elevadas podem ser irritantes e tóxicas para os tecidos e órgãos, provocando irritações em olhos, faringe e nariz (US Department of Health and Human Services, 2009). Estudos associam o FA e outros aldeídos ao desenvolvimento de câncer de nasofaringe, evidenciado por casos de carcinoma celular na região nasal de pacientes expostos a FA (Halperin et al, 1983; Brandwein et al, 1987). Embora os limites seguros de exposição variem de acordo com a legislação de cada país, estudos indicam que o limite máximo de ingestão diária aceitável é cerca 0,2 mg Kg -1 de massa corpórea (Bianchi et al, 2007; Wang et al, 2012) e de exposição a 0,12 mg m-3 de ar (Lehman e Roffael, 1992). A Tabela 2 apresenta dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA) sobre os efeitos de diferentes concentrações de FA no organismo humano.

Tabela 2. Alguns efeitos à saúde humana e características de exposição de diferentes faixas de concentrações de FA (adaptado de INCA, 2012).

Concentração corpórea de FA (mg Kg-1)

Duração da

exposição Efeitos à saúde humana

0,8 - 1 Exposições

repetidas Percepção olfativa até 2 Única ou repetida

exposição

Irritante aos olhos, nariz e garganta

3 – 5 30 minutos Lacrimação e intolerância por algumas pessoas 10 – 20 Não definido Dificuldade na respiração e

forte lacrimação 25 – 50 Não definido Edema pulmonar,

pneumonia, perigo de vida 50 – 100 Não definido Pode causar a morte A Tabela 3 traz informações de alguns estudos sobre a presença de FA em produtos rotineiramente utilizados.

Tabela 3. Alguns estudos de quantificação de FA em diversas matrizes.

Autores, Ano Produtos LD

a

(mg Kg-1)

Cb (mg Kg-1)

Wang et al, 1994 Sucos industrializados de

tomate, pera e laranja 0,006 0,025 Shin e Lim, 2012 Carne congelada de lula e

bacalhau

c

3 a 49 Kolodziejska et al,

1994 Espécies de peixes marinhos 0,017 1 a 230 Bianchi et al, 2007 Bebidas fermentadas

industrializadas 0,0001 0,1 a 13 Zurek e Karst, 1997 Desinfetantes N.F.c 4,5 a 11 %

(m/m) Doi et al, 2010

Cosméticos (loções, xampu, géis corporais e

condicionador)

N.F.c 2,7 a 876 Stewart et al, 1987 Ar de indústrias que utilizam

FA 0,1

0,03 a 60,77

a. Limite de detecção do método indicado pelos autores. b. Concentração de FA nas amostras analisadas.

c. Dado não fornecido no estudo.

Em diversos produtos, o FA pode ocorrer por adição direta (Shin e Lim, 2012; Zurek e Karst, 1997) ou como subproduto da decomposição de outras substâncias adicionadas (Kolodziejska et al, 1994; Doi et al 2010). É também liberado durante a decomposição de resíduos vegetais e está presente em concentrações variadas em frutos e vegetais (3 a 60 mg kg-1), leite e derivados (cerca de 1 mg kg-1) , carnes (6 a 20 mg kg-1), peixes e frutos do mar (1 a 100 mg kg-1), bebidas alcoólicas (0,02 a 3,8 mg kg-1), dentre outros (WHO, 1989; WHO, 1991).

Grande parte dos métodos para identificação e quantificação de FA baseia-se em reações colorimétricas que podem ser aplicadas com várias técnicas analíticas atingindo diferentes sensibilidades. Alguns reagentes coloridos utilizados são acetilacetona e acetato de amônio (Nash, 1953), reagente cromotrópico (Chrastil e Wilson, 1974; Fagnani et al, 2003), triptofano (aminoácido), H2SO4 concentrado

com catalisador de Fe(III) (Chrastil e Wilson,1975) e 2,4-dinitrofenilhidrazina em solução ácida (Wang et al, 2012; Shin e Lim, 2012). A Tabela 4 traz algumas informações sobre métodos colorimétricos.

Tabela 4. Características de alguns reagentes colorimétricos descritos na literatura para detecção de FA.

Reagente Cor do

produto Interferentes

Acetilacetona, acetato de amônio (Nash, 1953) Amarelo (410 nm) Acetaldeído e aminas Reagente cromotrópico em H2SO4

concentrado (Chrastil e Wilson, 1974; Fagnani et al, 2003)

Violeta

(575 nm) Seletivo para FA Purpald

(4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol em meio básico (Zurek e Karst,

1997)

Violeta (575 nm)

Aldeídos aromáticos e alifáticos Triptofano (aminoácido) na presença de

H2SO4 concentrado e catalisador de Fe (III)

(Chrastil e Wilson,1975)

Violeta

(575 nm) Seletivo para FA 2,4-dinitrofenilhidrazina em solução ácida

(Wang et al, 2012; Shin e Lim, 2012)

amarelo (para aldeídos)

Compostos carbonilados

Weng e colaboradores (2009) quantificaram FA em amostras de alguns alimentos, como cogumelos, carne de porco e camarão, utilizando um dispositivo microfluidico usando como suporte um filme de PDMS e uma reação quimiluminescente (com detecção em 410 nm), conseguindo quantificar concentrações de FA até 2 g mL-1. Fu e colaboradores (2014) utilizaram dispositivos com tripla camada de polimetilmetacrilato (PMMA), formando um canal reacional na forma de uma serpentina, aquecida a 30 ºC. Nesse canal, ocorria uma reação de derivação entre FA e um agente fluorescente (Fluoral-P) cujo produto permitiu quantificar o analito em ervas, com medidas de fluorescência. Estes trabalhos ilustram bons resultados de aplicação de microfluidica para quantificação de FA.

1.5 Formaldeído em leite

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) número 35/2008, proíbe a adição de formol em produtos saneantes (detergentes, desinfetantes, alvejantes, etc.), fundamentada no artigo 5º da Resolução da ANVISA nº 184 de 22 de outubro de 2001, que proíbe o uso de substâncias carcinogênicas, teratogênicas e mutagênicas nas formulações de produtos para o consumo humano (INCA, 2004). Curiosamente, a agência permite que FA seja utilizado como conservante para produtos de higiene pessoal, na concentração máxima de 0,1 % m/m para produtos destinados a higiene oral, 0,2 % m/m para produtos não destinados a higiene oral, como cosméticos, xampus, dentre outros, e 5 % m/m para produtos utilizados como endurecedores de unhas, expresso como FA livre (ANVISA, 2013). Além disso, alguns conservantes e produtos adicionados a produtos de higiene pessoal podem se decompor e liberar FA (Doi et al, 2010), o que pode aumentar sua concentração nesses produtos acima do limite aceitável.

Em 2013 (MP-RS, 2013) e em 2014 (Dornelles e Fraga, 2014), investigações do Ministério Público identificaram adulterações no leite cru fornecido à indústria no estado do Rio Grande do Sul, como adição de água e ureia (MAPA, 2006). Com a diluição do leite, há perda nutricional devido à diminuição da concentração de proteínas em relação a nutrientes essenciais. Com isso, há a consequentemente diminuição do teor de nitrogênio, que é compensado pela adição de fertilizantes à base de ureia, que mascaram o teste para proteínas (baseado no teor de nitrogênio do leite). Estes fertilizantes são conhecidos como de libertação lenta, pois os compostos nitrogenados têm liberação dependente da degradação microbiana do produto de interação da ureia com FA (Zavaschi, 2010). Como a síntese destes fertilizantes é resultado da reação entre FA e excesso de ureia (Magalhães, 2009), resíduos de FA podem contaminar o produto e, por consequência, tornar os lotes de leite impróprios para consumo humano (Informe técnico ANVISA, 2013). A Figura 1 ilustra o esquema da cadeia de adulteração do Leite no estado do Rio Grande do Sul (Jornal Folha de São Paulo, 2013).

Figura 1. Esquema de adulteração de leite no estado do Rio Grande do Sul em 2013 (Folha, 2013)

Sabe-se que FA reage com indols substituídos (anel benzênico acoplado a um anel pirrol) em meio ácido e um agente oxidante, como H2SO4 e íons Fe3+

(Chrastil e Wilson,1975; Ekberg e Silver, 1966; BonnetJr.,1905); HCl e íons Fe3+ (William e Sherman, 1905) e HCl e HNO3 (Shrewsbury e Knapp, 1908), produzindo

um composto violeta, semelhante ao produto da reação com ácido cromotrópico. Outros agentes oxidantes, como H2O2, NO2- e K2S2O8 (Rosenheim, 1906) e KBr

(Fulton,1931) têm efeito análogo. Na ausência de FA, a solução fica castanha devido à degradação de proteínas e outros compostos presentes no leite. A reação colorimétrica de formaldeído com triptofano é muito usada para a identificação deste analito em leite que, naturalmente, contém o aminoácido triptofano (Fulton,1931), cuja estrutura inclui um grupo indol. Esta reação, conhecida como teste de Hehner (Fulton,1931), é adequadamente sensível para identificar a presença de FA em leite, com limites de detecção de até 0,20 mg L-1, com as modificações experimentais adequadas (Shrewsbury e Knapp, 1908).

De acordo com a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), o leite é ligeiramente ácido devido à presença de substâncias como caseína, albumina, e CO2 dissolvido. Naturalmente, o pH de uma amostra de leite

fresco é entre 6,6 e 6,8. Segundo Kartheek (2011), o pH do leite pode diminuir devido à proliferação de microrganismos que produzem ácidos orgânicos durante seu metabolismo. Contudo, a acidez titulável do leite é uma das análises de

qualidade que inviabilizam a comercialização das amostras. Dessa forma, os responsáveis pela produção, armazenamento e processamento do leite podem propositalmente adicionar NaOH para diminuir a acidez. A Tabela 5 apresenta diferentes faixas de pH e as implicações para a qualidade do leite (EMBRAPA, 2007).

Tabela 5. Influência do pH na qualidade e características do leite.

pH Qualidade do leite

6,6 a 6,8 Leite fresco

pH > 6,9 Leite adulterado com água; leite de vaca com mastite ou no final do período de lactação

6,4 Leite que não resiste ao aquecimento a 110 ºC 6,3 Leite que não resiste ao aquecimento a 100 ºC 6,1 Leite que não resiste a pasteurização a 72 ºC

1.6 Análise digital de imagens e calibração multivariada

A digitalização de imagens vem servindo como ferramenta de trabalho para o estabelecimento de métodos para quantificação de diversos analitos, devido a sua simplicidade e rapidez (Zamora et al, 2011). Dar e colaboradores (2012) determinaram a concentração de FA em solução aquosa através da digitalização de placas de cromatografia de camada delgada com a reação colorimétrica de FA com ácido cromotrópico, sendo que os reagentes eram adicionados sucessivamente e as placas submetidas a aquecimento por um determinado período.

A análise digital é realizada com auxílio de um programa conversor da intensidade da cor dos pixels em componentes do sistema de cores RGB (do inglês, Red, Green e Blue), que variam de 0 a 255 (Godinho, 2008). Programas deste tipo permitem relacionar a luz refletida na superfície da imagem com a intensidade da coloração das zonas reacionais em um μPAD (Martinez, 2010). Como a intensidade da cor é proporcional à concentração do analito, a quantificação pode ser realizada sem envolver medidas espectrofotométricas, diretamente a partir da correlação do valor de alguma componente RGB e a concentração do analito.

Os dados são obtidos a partir da luz refletida na superfície do produto colorido presente na zona reacional do μPAD e podem ser utilizados na quantificação de um analito devido à proporcionalidade entre a intensidade da cor e a sua concentração (Castro, 2013), em analogia à Lei de Beer para medidas de absorbância. A Equação 1 apresenta a equação utilizada para o cálculo da absorbância relativa (AR) correspondente aos valores das componentes RGB da

imagem.

(

)

onde: AR = absorbância refletida de cada componente RGB; IR= valor da componente R,G

ou B da amostra e IB= valor médio da componente R,G ou B do branco.

Neste trabalho, foram utilizados dois programas de conversão de intensidade de cor de imagens em dados RGB: PixelColor e Digimage. O Digimage, elaborado por Schimidt (1997) esteve disponível no início do projeto e, devido a questões operacionais, acabou sendo substituído pelo programa PixelColor, elaborado por Rennan Pimentel, em outro trabalho em andamento no Grupo de Pesquisas em Química Analítica e Educação (GPQUAE), com algumas vantagens discutidas no item 4.2.6

Outra forma de considerar a contribuição de dados das componentes RGB envolve calibração multivariada, que correlaciona dados de uma ou mais variável com os valores de concentração. Dentre os métodos de calibração multivariada existentes, podem ser citados a regressão em componentes principais (PCR) (Jackson, 1991), regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) e regressão linear múltipla (MLR). O método MLR, introduzido inicialmente por Sternberg e colaboradores (1960) apresenta a vantagem de realizar a regressão linear a partir do domínio original de dados. Os métodos PCR e PLS, apesar de apresentarem inúmeras vantagens, não permitem interpretações diretas dos resultados por envolverem cálculos com dados transformados (Nunes, 2008).

Com MLR é possível estabelecer uma relação linear entre sinal e concentração, aplicando o método dos mínimos quadrados (Nunes, 2008). No presente trabalho, com os dados obtidos pelos programas conversores, considerou-se a influência de cada componente RGB na intensidade da cor da imagem do

produto colorido presente na zona reacional do μPAD, que por sua vez é proporcional à concentração do analito reagente. O modelo de calibração multivariado MLR descrito por Bruns (2007) envolve um modelo linear (Equação 2), selecionado para descrever o comportamento da resposta (concentração de FA, neste trabalho) em relação aos fatores estudados (componentes RGB da conversão digital das imagens digitalizadas).

onde Ci = concentração de FA em leite (mg L-1) previsto pelo modelo; =

coeficiente de contribuição de cada componente; R, G e B= valores de AR de cada

respectiva componente; e= erro aleatório associado as medidas de R, G e B.

A Equação 2 deve ser ajustada para cada par de valor das componentes RGB e a respectiva concentração do analito estudado. A obtenção dos valores dos coeficientes pode ser realizada resolvendo-se uma equação matricial (Equação 3), na qual as matrizes são definidas de acordo com as Equações 4 e 5.

[

]

[

]

onde = matriz dos valores dos coeficientes de contribuição de cada componente; X= matriz dos valores médios das absorbâncias de cada componente RGB (Ex: R1 corresponde a

média da absorbância da componente R para o primeiro ponto da curva); Xt= matriz X transposta; (XtX)-1 = matriz inversa da matriz multiplicação entre Xt e X; C= matriz dos valores das concentrações estudadas (Ex: C1 corresponde a concentração analítica do

primeiro ponto da curva).

O resultado da Equação 3 fornece uma matriz com os valores dos coeficientes de contribuição de cada componente, que é substituído na Equação 2 para obter a equação que descreve o modelo multivariado.

A qualidade do ajuste pode ser avaliada através da análise da variância. Os valores das médias quadráticas obtidas pela análise de variância podem ser utilizados para avaliação do coeficiente de regressão linear e se a equação de

regressão é estatisticamente significativa, através da comparação com um teste F (Bruns, 2007). Segundo Bruns (2007), uma regra prática é considerar a regressão útil para fins de previsão se o valor de F calculado for, pelo menos, 10 vezes o valor de F crítico para o nível de confiança escolhido.

2.1 Objetivo geral

- Desenvolver um método simples e seletivo para a identificação e quantificação de formaldeído em matrizes aquosas e em leite, a partir de reações colorimétricas, priorizando a utilização de dispositivos microfluidicos de papel e análise de imagens digitalizadas para a obtenção dos resultados.

2.2 Objetivos específicos

- Estudar condições para estabelecer uma reação colorimétrica seletiva (ou específica) para FA em solução que permita aplicação em testes analíticos de identificação e quantificação de FA em leite, além de se testar o uso de papel como suporte reacional visando o uso de μPAD e digitalização de imagens.

- Estudar condições para quantificar FA por digitalização de imagens de PAD, utilizando programas conversores de intensidade de cor em dados RGB e estratégias matemáticas de correlação desses dados com a concentração em calibração univariada e multivariada.

- Realizar testes de seletividade e precisão e exatidão intra-corridas, segundo Resolução 899 para a Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003). Como interferentes, foram testados compostos com estrutura molecular semelhante ao FA e contaminantes de presença já relatada em leite comercializado.

3.1 Considerações Gerais

Este trabalho foi executado em duas fases. A primeira fase compreendeu estudos com a reação colorimétrica entre FA e ácido cromotrópico, com ajuste das melhores condições para os testes em solução para detecção e quantificação espectrofotométrica, seguindo-se da avaliação das condições adequadas para reação em PAD como suporte reacional. A segunda fase envolveu estudos de detecção e quantificação de FA em leite com tratamento matemático das imagens digitalizadas.

A partir deste ponto do texto, incluindo as legendas das figuras, serão utilizadas as seguintes abreviaturas: FA para formaldeído; CA para ácido cromotrópico 5 % (m/v); C para indicar concentração analítica; V para indicar volume dos reagentes, λ para indicar o comprimento de onda no qual os valores de absorbância foram lidos e FeCl3 para indicar solução de FeCl3 1 % m/v; Ar para

absorbância refletida. Estas abreviaturas estão presentes na lista de abreviaturas presente neste relatório. Outras abreviaturas pertinentes são inseridas ao longo do texto.

3.2 Equipamentos, materiais e reagentes

3.2.1 Equipamentos

- Espectrofotômetro Pharmacia Ultrospech 2000.

- Impressora multifuncional com scanner Photosmart C3180 - Impressora a base de cera Xerox Phaser 8560N

- Banho termostizador RC6 Lauda

3.2.2 Materiais

- Vidrarias de uso comum em laboratórios.

- Cubeta de quartzo com caminho óptico de 1 cm (Q4 Biocel). - Papel cromatográfico Whatman nº 1.

- Pipeta automática 5 a 200 L (LABMATEsoft). - Pipeta automática 100 a 1000 L (LABMATEsoft). - Pipeta automática de 1,00 a 10,00 Ml (LABMATEsoft).

- Filme plástico autoadesivo transparente (Vini-Tac). - Secador de cabelo PRO 3000 Professional

3.2.3 Reagentes

- Água deionizada (deionizador MiliPoreMili-Q Plus). - Solução de FA 36,5 % (Vetec).

- Solução padronizada (Bolognesi, 2010) de FA 1000 mg L-1, diluída adequadamente conforme necessário.

- Solução de ureia 1000 mg L-1, diluída adequadamente conforme necessário. - Solução de acetaldeído 1000 mg L-1 em etanol 5 %, diluída adequadamente conforme necessário.

- Solução de benzaldeído 1000 mg L-1 em etanol 5 %, diluída adequadamente conforme necessário.

- Solução de ácido acético 1000 mg L-1, diluída adequadamente conforme necessário.

- Solução de acetona 1000 mg L-1, diluída adequadamente conforme necessário.

- Solução de ácido fórmico 1000 mg L-1, diluída adequadamente conforme necessário.

- Ácido sulfúrico concentrado (Synth).

- Solução de acido sulfúrico na faixa de concentração de 4 a 18 mol L-1. - Ácido clorídrico concentrado (Synth).

- Ácido fosfórico concentrado (Synth). - Solução de ácido fosfórico 20 % (v/v).

- Peróxido de hidrogênio 2,5 10-2 mol L-1 (Merck).

- Solução de ácido cromotrópico 5 % m/v (Sigma-Aldrich). - Solução de cloreto de ferro III 1% m/v (Vetec).

- Dicromato de potássio (Cinética Química)

- Solução padronizada de Tissulfato de sódio 0,1 mol L-1 (Synth) - Solução de iodo 0,05 mol L-1 (Synth)

- Solução de amido (Synth)

- Leite cru, extraído manualmente de animal criado em sítio da zona rural de Campinas-SP, armazenado em frascos de polietileno de 200 mL a -20 ºC.

3.2.4 Programas

- Digimage (Schimdt, 1997)

- PixelColor (elaborado por Rennan Pimentel). - Origin 8.0.

- Excel 2010.

3.3 Construção do dispositivo microfluidico em suporte de papel (μPAD)

O μPAD foi produzido utilizando-se impressão à base de cera (Xerox Phaser 8560N) em papel cromatográfico Whatman nº 1, num design com 96 áreas circulares (zonas de reação) impressas com linha de espessura igual a 0,5 mm, dispostas em um arranjo de 12 colunas por 8 linhas, com diâmetro de 6,8 mm e distância de 9,0 mm do centro de duas zonas. O papel impresso foi levado à estufa a 150 °C por 120 segundos, para a permeação da cera e impermeabilização das zonas de reação, seguindo recomendação de Carrilho et al (2009). Para evitar perda de líquido por vazamento vertical, fixou-se no verso do dispositivo filme plástico autoadesivo transparente, seguindo procedimento proposto por Castro (2013). Cada zona de reação comporta a transferência de 10 L de solução. A Figura 2 ilustra o esquema sequencial de produção do μPAD e sua configuração.

Figura 2. Esquema do procedimento de impressão e secagem para a produção do μPAD padrão utilizado nos testes.

3.4 Parâmetros de digitalização de imagens

A digitalização de imagens do μPAD foi realizada em uma impressora multifuncional com scanner Photosmart C3180, com as configurações padronizadas de 0% de bilho e de contraste. O μPAD era disposto em uma região delimitada por um fita no centro do scanner.

3.5 Reação com ácido cromotrópico em solução

A reação para identificação de FA com CA em meio ácido está descrita na literatura (Chrastil e Wilson, 1974; Fagnani et al, 2003). Inicialmente, neste estudo foram variadas condições como tipo, concentração e volume do ácido, volume de CA, além da presença de interferentes, buscando-se adequar a reação para aplicação analítica pretendida em amostras de leite.

Em todos os ensaios da reação de CA com FA, foram utilizados tubos de ensaio de 10 mL. Além da observação visual do produto da reação, foram obtidos dados espectrofotométricos entre 400 e 800 nm, após 10 min de resfriamento das misturas reacionais diluídas na proporção 1:2 com água destilada, utilizando-se cela de acrílico (Kartell) com caminho óptico de 1 cm no espectrofotômetro Pharmacia Ultrospec 2000. Uma mistura reacional sem adição de FA foi considerada como branco. Os procedimentos foram realizados em duplicata. Para a construção da curva analítica foram realizadas triplicatas.

3.5.1 Tipo de ácido

Avaliou-se a influência de três ácidos na reação. Segundo Fagnani e colaboradores e Gigante e colaboradores, ácido sulfúrico, descrito inicialmente como

o ácido mais adequado para a reação, pode ser substituído por HCl e H3PO4, ambos

concentrados, na presença de H2O2, que atua como agente oxidante. Isso orientou

os testes de uso de cada um desses ácidos na reação para identificação colorimétrica de FA, comparativamente com a reação com CA na presença de H2SO4 concentrado.

Para a reação com H2SO4, foram adicionados 1,00 mL de solução de FA

30,0 e 300,0 mg L-1, 300 L de CA e 3,00 mL de ácido sulfúrico 12,0 mol L-1, seguindo-se aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

O mesmo procedimento foi realizado substituindo-se o volume de ácido sulfúrico por 70 L de solução de H2O2 2,5 10-2 mol L-1 e 3,00 mL de HCl ou H3PO4

(ambos concentrados), seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 90 ºC por 1 h, segundo indicações de Fagnani et al (2003) e Gigante (2004).

3.5.2 Concentração de ácido

Para avaliação da influência da concentração de H2SO4 na reação, foram

adicionados 1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1, 300 L de solução de CA e 1,00 mL de H2SO4 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0 mol L-1 e 18 mol L-1 (concentrado), seguindo-se de

aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

3.5.3 Quantidade de ácido

Foram adicionados 1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1 , 300 L de solução de CA e 0,50; 1,00; 1,50; 2,00 e 3,00 mL de H2SO4 concentrado,

seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

3.5.4 Quantidade de ácido cromotrópico

Foram adicionados 1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1, 1,50 mL de H2SO4 concentrado e 100, 150, 200, e 300 L CA, seguindo-se de aquecimento em

banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

3.5.5 Resumo das condições testadas para ajuste da reação entre FA e CA

A Tabela 6 sumariza a descrição das variáveis testadas para ajustar as condições da reação entre FA e CA.

Tabela 6. Ajuste das condições da reação em solução de CA e H2SO4.

Variável Reagentes e volumes

Tipo de ácido

Teste 1: 1,00 mL de solução de FA (30,0 e 300,0 mg L-1) + 300 L de solução de CA + 3,00 mL de H2SO4 12 mol L-1, seguindo-se de

aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

Teste 2: 1,00 mL de solução de FA (30,0 e 300,0 mg L-1) + 300 L de solução de CA + 70 μL H2O2 2,5 10-2 mol L-1 + 3,00 mL de HCl ou

H3PO4 concentrados, seguindo-se de aquecimento em banho

termostatizado a 90 ºC por 1 h.

Concentração de ácido

1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1 + 300 L de solução de CA + 1,00 mL de H2SO4 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0 mol L-1 e concentrado,

seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

Quantidade de ácido

1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1 + 300 L de solução de CA + 0,50, 1,00, 1,50, 2,00 e 3,00 mL de H2SO4 concentrado,

seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min.

Quantidade de CA

1,00 mL de solução FA 20,0 mg L-1 + 1,50 mL de H2SO4

concentrado + 100, 150, 200, e 300 L CA, seguindo-se de aquecimento em banho termostatizado a 60 °C por 10 min

3.5.6 Construção da curva analítica

Com base nos resultados do ajuste de condições para a reação com CA e alguns indicativos de valores de concentração de FA em leite contaminado, optou-se por construir uma curva analítica com FA nas concentrações entre 1,0 e 25,0 mg L-1.

3.5.7 Avaliação de μPAD como suporte reacional

Paralelamente ao ajuste das condições reacionais em solução,

avaliou-se a utilização de papel no dispositivo microfluidico. Como H2SO4 concentrado

destrói o papel, descartou-se a possibilidade de adição dos reagentes sobre o papel, optando-se pela transferência da mistura reacional para o μPAD, incluindo uma diluição. Avaliou-se a diluição da mistura após a formação do composto violeta que caracteriza o produto formado, uma vez que ao final da reação, o meio ainda é muito ácido e destruiria o papel. Para encontrar a concentração mínima de FA que gerasse produto colorido observável no papel, foram testadas misturas reacionais com

soluções de FA na faixa de 1,0 a 14,0 mg L-1. Em todos os casos, eram transferidos 10 L de mistura reacional para o μPAD usando micropipeta, por se tratar do volume máximo que não rompia a barreira de cera das zonas de reação, trabalhando-se com 8 replicatas.

3.6 Reação colorimétrica de formaldeído em Leite

Para os testes com amostras de leite livre de FA, optou-se por se iniciar os estudos utilizando leite cru. Amostras deste leite cru foram obtidas por extração manual em animal criado em sítio na cidade de Campinas-SP e armazenadas em frascos de polietileno 200 mL a -20 ºC para posterior utilização, sempre após atingir temperatura ambiente.

Os ensaios foram realizados com a adição de 1,00 mL de leite cru em tubos de ensaio de 5 mL, com aquecimento em banho termostizado, com exceção dos testes realizados a temperatura de ebulição da água.

Os resultados foram avaliados pelo tratamento matemático das imagens digitalizadas do PAD contendo o produto de reação, obtidas pela transferência de 10 L da mistura reacional para as zonas reacionais do PAD. Os dados dos componentes RGB de imagem digitalizada foram convertidos com uso dos programas Digimage e PixelColor.

Um volume de 10 L da mistura reacional era transferido para cada zona reacional do PAD com uma micropipeta, seguindo-se uma etapa de secagem em fluxo de ar quente (originado por um secador de cabelos com aquecimento) realizada a 30 cm do PAD por 10 min, para eliminação do solvente e secagem completa do dispositivo.

Todos os ensaios descritos foram realizados em duplicata, e cada mistura reacional originada foi disposta em um total de 3 zonas reacionais sequencias, dentro de uma mesma coluna do PAD. A Figura 3 representa a distribuição da aplicação de duas amostras no dispositivo.

Figura 3. Representação da disposição das amostras no PAD; cada amostra foi adicionada em três zonas reacionais sequenciais para uma melhor reprodutibilidade, e, após a análise digital, a média entre as três era utilizada para avaliação dos resultados.

3.6.1 Destilação das amostras de Leite

De acordo com o Manual do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008), as amostras de leite deveriam previamente destiladas, com adição de H3PO4 para a posterior

reação colorimétrica de identificação de FA. Dessa forma, seguiu-se este procedimento (IAL, 2008), adicionando-se em um balão de destilação de 250 mL, 50 mL de leite e 80 mL de H3PO4 20 %(v/v). Destilou-se a amostra até obtenção de

aproximadamente 40 mL de destilado, seguindo-se de armazenamento a -20 ºC até o momento do uso.

3.6.2 Estudo das reações colorimétricas de formaldeído em leite

Originalmente, o teste de Hehner (Fulton, 1931) para identificação de FA em leite é realizado com a adição H2SO4 concentrado (cautelosamente para evitar

mistura das soluções) e um agente oxidante, com a formação de uma coloração violeta na interface dos líquidos. A reação entre FA e triptofano, com posterior oxidação em meio fortemente ácido gera um composto de coloração violeta (Rosenheim, 1907). Diversas modificações do teste de Hehner são propostos na literatura, como a utilização de H2SO4 11 mol L-1 e KBr ou solução de bromo como

agente oxidante (Fulton,1931), HCl e agente oxidante, como íons Fe3+ (William e Sherman, 1905) e HNO3 (Shrewsbury e Knapp, 1908), com LD variando de 0,3 a 4,0

foram avaliados diferentes meios reacionais (ácido e agente oxidante) para a reação colorimétrica de FA em leite.

Foram adicionados leite com concentração de FA de 1,0, 5,0, 10,0 e 15,0 mg L-1, 100 L de FeCl3 e 1,00 mL de H2SO4 12 mol L-1 ou HCl concentrado ou

H3PO4 concentrado, com posterior aquecimento em banho termostatizado à 90 °C

por tempo suficiente para formação da cor na solução.

3.6.3 Quantidade de ácido

Foram adicionados leite com concentração de 20,0 mg L-1 de FA, 100 L de FeCl3 e 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 e 2,00 mL de H2SO4 12 mol L-1, seguido de

aquecimento em banho termostatizado à 90 °C por 2 min.

3.6.4 Avaliação de agente oxidante

Avaliou-se 2 agentes oxidantes para a reação colorimétrica de FA em leite: Fe3+ e HNO3 1% em HCl (v/v) . Primeiramente, foram adicionados leite com

concentração de FA de 1,0; 5,0; 10,0 e 15,0 mg L-1, 100 L de FeCl3 e 1,00 mL de

H2SO4 12 mol L-1, aquecendo-se em banho à 90 °C até aparecimento de cor na

solução. No segundo ensaio, foram adicionados leite com as mesmas concentrações de FA do ensaio anterior, 100 L de solução 1 % de HNO3 em HCl (v/v) e 1,00 mL

de HCl concentrado, seguindo de aquecimento em banho termostatizado à 90 °C por tempo suficiente para formação da cor na solução.

3.6.5 Quantidade de agente oxidante

Com os resultados obtidos, avaliou-se a influência da adição de diferentes quantidades do agente oxidante selecionado (Fe3+). Foram adicionados ao leite com 10 mg L-1 de FA, 0; 50; 100; 150; 200, 250 e 500 L de FeCl3 e 0,75 mL de H2SO4 12

mol L-1 , seguindo de aquecimento por 1 min em água em ebulição. Um segundo ensaio foi realizado com a adição de leite com 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mg L-1 de FA, 50 e 150 L de FeCl3 e 0,75 mL de H2SO4 12 mol L-1, seguindo-se as mesmas