UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
LARA CLARISSE DE LIMA SILVA
ASSOCIAÇÃO ENTRE OS HÁBITOS ALIMENTARES E AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DAS VITAMINAS A E E COM OS PREDITORES DE PROGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DO CARCINOMA
PAPILÍFERO DA TIREOIDE
Natal/RN 2018
LARA CLARISSE DE LIMA SILVA
ASSOCIAÇÃO ENTRE OS HÁBITOS ALIMENTARES E AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DAS VITAMINAS A E E COM OS PREDITORES DE PROGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DO CARCINOMA
PAPILÍFERO DA TIREOIDE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obter o título de mestre em Nutrição.
Orientação: Profª. Drª. Vivian Nogueira Silbiger
Co-orientação: Camila Xavier Alves
Natal/RN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Silva, Lara Clarisse de Lima.
Associação entre os hábitos alimentares e as concentrações séricas das vitaminas A e E com os preditores de prognóstico histopatológico do carcinoma papilífero da tireoide / Lara Clarisse de Lima Silva. - 2018.
168f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Nutrição. Natal, RN, 2018.
Orientador: Vivian Nogueira Silbiger. Coorientador: Camila Xavier Alves.
1. Glândula Tireoide - Neoplasias. 2. miRNA. 3. Consumo de alimentos. 4. Vitamina A. 5. Vitamina E. I. Silbiger, Vivian Nogueira. II. Alves, Camila Xavier. III. Título.
Aos 79 pacientes que ofereceram sua atenção, sua paciência e seu sangue à esta pesquisa. e, ao meu avô, Francisco das Chagas Sobrinho (in memoriam), que traria os aplausos mais amorosos e sinceros de toda a minha platéia.
AGRADECIMENTOS
Agradecer: verbo; oferecer graças, reconhecer, retribuir, manifestar gratidão.
Este verbo eu direciono, primeiramente, à professora Vivian. Primeiro por aceitar o desafio em trabalhar com uma aluna de mestrado que, sequer havia passado pela iniciação científica. Uma aluna que não tinha um currículo impressionável, nem grandes publicações e, menos ainda, domínio de Biologia Molecular. Eu lhe tenho gratidão por ser ímpar em cada uma de suas atitudes. Por, mesmo sendo uma professora universitária, saber segurar na minha mão, como uma tia do jardim de infância, e me ensinar a dar os primeiros passos dentro do laboratário; por muitas vezes ser mãe, ser amiga e nos conferir palavras de conforto; e por tantas outras abdicar de seus filhos de sangue, pra cuidar de seus alunos, os filhos do coração. Obrigada, Vivian por me orientar neste mestrado e na vida.
Agradeço aos alunos do Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular, por sempre estarem ao meu lado ajudando com as inúmeras dúvidas que tinha sobre tudo. Agradeço especialmente aos alunos Diego Marques e Jéssica Nayara, que me acolheram na oncologia e me orientaram em cada detalhe que foi necessário, dos mais simples aos mais complexos. Foram pequenas atitudes que nem todas as palavras do mundo poderiam expressar a minha gratidão.
Agradeço à MARAVILHOSA equipe do Hospital Dr. Luiz Ântonio, desde os médicos, que muitas vezes permitiram que eu coletasse sangue e informações dos pacientes dentro do centro cirúrgico, minutos antes da cirurgia; aos técnicos de enfermagem, os quais, mesmo contrariando regras, muitos não se negavam a coletar sangue para esta pesquisa; agradeço a Mirza e Michelle, que independendo do horário, local e circunstância sempre recebiam a mim e aos meus pacientes com um carinho imensurável, e quando necessário, realizavam 3999 tentativas de tirar o sangue deles até que desse certo; agradeço à equipe da internamento e Secretaria de Cabeça e Pescoço, que passavam semanalmente agenda dos pacientes para cirurgia, especialmente ao SOS Robson, que me atendia a qualquer hora que houvesse
necessidade para ajudar na melhor estratégia de recrutamento à cada dia; agradeço todo o pessoal da recepção, tanto da unidade do Luiz Antônio quanto do Cecan, que me dava aquela “força no grito” para encontar os meus pacientes de retorno; e, agradeço a todos da equipe da patologia, responsáveis pelas pitadas de estímulo, quando eu chegava demasiado cansada ou desestimulada. Sobretudo, encontrei no Hospital Luiz Antônio uma nova família, e os levarei para sempre, para onde quer eu vá.
Tenho imensa gratidão as alunas de iniciação científica que estiveram comigo na luta dária por cada paciente, comemorando cada conquista e me ajudando a suportar as frustrações (que não foram poucas). Dentre elas, agradeço em especial à Thaísa Cristina, que do começo ao fim esteve comigo, caminhando lado a lado, apoiando e sendo apoiada, em cada tijolinho que serviu para a construção dessa pesquisa.
Agradeço aos 79 pacientes que cederam seu tempo, sua paciência e seu sangue, para que todo esse trabalho fosse realizado. Foi por vocês e para vocês!
Por fim, e não menos importante, a minha auto graditão. Por todas as imensuráveis vezes em que pensei desistir. Por ter encontrado forças e invisíveis para lutar contra cada dor física e emocial que surgiram ao longo desses dois anos. E, sobretudo, agradeço a Deus, por ter organizado cada detalhe desses dias, cada coisa que daria errado para que outras tantas serem perfeitas e permitir-me ser Mestre em Nutrição.
Minha sincera gratidão a todos que contribuíram para que estas páginas não estivessem em branco.
LISTA DE ABREVIATURAS AJCC AR BIA CDT CFT CLAE CPT CT EDTA GC GV HLA IARC IMC INCA QFA ROH SPSS TCLE TNM TOH TSH UICC
do inglês, American Joint Comission on Cancer Ácido Retinóico
Bioimpedância Elétrica
Carcinoma Diferenciado da Tireoide Carcinoma Folicular da Tireoide
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Carcinoma Papilífero da Tireoide
Câncer de Tireoide
Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético Gordura Corporal
Gordura Visceral
Hospital doutor Luiz Antônio
Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer Índice de Massa Corporal
Instituto Nacional do Câncer
Questionário de Frequência Alimentar
Retinol
do inglês, Statistical Package for Social Sciences
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Do inglês, Tumor, Node, Metastasis
α-tocoferol
Do inglês, Thyroid-stimulanting Hormone
RESUMO
O câncer da glândula tireoide (CT) é o câncer mais comum do sistema endócrino. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA) esta neoplasia deverá atingir 9610 pessoas no Brasil até o final de 2018, esperando-se que, o maior número de casos, na região nordeste, ocorram no Ceará, Paraíba e Rio Grande do Norte. O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) corresponde a mais de 70% dos casos de CT e as diferentes incidências desse tipo câncer nas diversas partes do mundo, sugerem que os fatores etiológicos modificáveis podem desempenhar um papel importante na carcinogênese do CT. Alterações na expressão de microRNAs (miRNAs) podem fazer parte dos fatores de risco do CT, assim como o consumo frequente de alguns alimentos e o status bioquimíco das vitaminas A e E, também podem consistir em potenciais biomarcadores da gênese e progressão da doença. Desse modo, esse estudo buscou compreender o conhecimento atual sobre a modulação induzida pelas vitaminas A e E na expressão de miRNAs no CT, e as associações entre os hábitos alimentares e concentrações séricas de retinol e α-tocoferol com os fatores de prognóstico histopatológico (invasão, extensão, multifocalidade, tamanho do tumor e metástases linfonodais) do CPT. Para tanto, foi realizada uma revisão sistemática seguindo as diretrizes “The Prisma”, bem como a investigação dos hábitos alimentares pré-diagnóstico, por meio de Questionário de Frequência Alimentar (QFA), além de dosagens bioquímicas das concentrações séricas de retinol e α-tocoferol, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, em 3 momentos, sendo 1 pré e 2 pós tireoidectomia, em pacientes com CPT. Os resultados mostraram que os registros sobre alterações na expressão de miRNAS induzidas pelas vitaminas A e E no CT são escassos, no entanto, a vitamina A parece ser relevante na modulação de miRNAs em outros tumores. Além disso, o consumo alimentar semanal > 1x/semana de cuscuz/farofa e/ou margarina/creme vegetal esteve positivamente associado ao risco de pacientes com CPT apresentarem extensão extratireoideana (p=0,021 e 0,004 respectivamente), bem como a ingestão de carne bovina superior a 1x/semana foi positvamente associado a presença de extensão extratireoideana (p=0,040) e metástases linfonodais (p=0,046). No que diz respeito as as concentrações séricas de retinol e α-tocoferol, níveis séricos de retinol mais elevados podem estar associados a
uma menor predisposição em se desenvolver invasão angiolinfática, metástases linfonodais (p=0,027 e 0,015 respectivamente), e os pacientes com extensão extratireoideana ou invasão angiolinfática tenderam a apresentar concentrações de α-tocoferol mais reduzidas em relação aos que não tiveram esses desdechos histopalógicos nos momentos pós tireoidectomia. Deste modo, concluímos que estudos futuros sobre a modulação de miRNA’s em CT induzida pelas vitaminas A e E podem ser relevantes e necessários para melhor elucidar novas estratégias de controle de risco, prevenção e tratamento do CT. Ademais, sugerimos que tanto o consumo alimentar quanto o status bioquímico das vitaminas A e E podem ser relevantes na predição de desfechos histopatológicos do CPT.
Palavras chave: neoplasias da glândula tireoide, miRNA, consumo de
ABSTRACT
Thyroid cancer (TC) is the most common malignancy of the endocrine system. According to last estimates from the Brazilian National Cancer Institute (INCA), this neoplasm is expected to reach 9610 people in Brazil by the end of 2018, and the largest number of cases is expected to occur in the Northeast region (Ceará, Paraíba and Rio Grande do Norte). Papillary thyroid carcinoma (PTC) accounts for about 70% of TC cases, and considering that the rate of incidence varies in different parts of the world, modifiable risk factors may play an important role in TC carcinogenesis. Moreover, alterations in microRNAs (miRNAs) expression may also be part of TC risk factors. In addition, the frequent consumption of certain foods has also been associated with the progression of malignant tumors. Experimental and clinical studies have shown that antioxidant vitamins can inhibit the development and progression of cancer, thus the biochemical status of vitamins A and E have emerged as potential markers of risk for genesis and evolution of the disease. Therefore, the present study aimed to investigate the current knowledge on modulation of miRNA expression induced by vitamins A and E in TC, and the association of dietary habits and serum concentrations of vitamins A and E with histopathological prognostic factors of CPT. For this, a systematic review was conducted following the guidelines "The Prism: Statement for Reporting Systematic Reviews and Meta-Analyzes of Studies That Evaluate Health Care Interventions: Explanation and Elaboration". Furthermore, weekly eating habits before TC diagnosis were evaluated using a Food Frequency Questionnaire (FFQ) developed by the Elsa-Brazil study. Serum retinol and serum α-tocopherol were measured in three times liquid chromatography: one before thyroidectomy and two after thyroidectomy of PTC patients. The results showed that evidence of changes in miRNA expression induced by vitamins A and E in TC are scarce, however, vitamin A appears to be relevant in the modulation of miRNAs in other tumors. In addition, weekly food intake > 1/week of couscous/farofa and/or margarine/vegetable cream may increase the risk of CPT patients present extrathyroidal extension (p = 0.021 and 0.004 respectively), while beef intake > 1/week may increase risk of extrathyroidal extension (p = 0.040) and lymph node metastases (p = 0.046). Regarding
serum concentrations of retinol and α-tocopherol, high serum retinol levels may be associated with a lower predisposition to develop angiolymphatic invasion, and lymph node metastases (p = 0.027 and 0.015 respectively), and PTC patients with extrathyroidal extension or angiolymphatic invasion tend to have post-operative vitamin E concentrations lower than the preoperative. We suggest that both food intake and vitamin A status and may be relevant in predicting histopathological outcomes of CPT. Thus, future studies on the modulation of miRNAs induced by vitamin A in TC are necessary.
Keywords: thyroid neoplams, papillary thyroid carcinoma, miRNAs, food
SUMÁRIO 1.0 INTRODUÇÃO ... 11 2.0 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ... 14 3.0 OBJETIVOS ... 15 3.1 OBJETIVOS GERAIS ... 15 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 15 4.0 REVISÃO DE LITERATURA ... 16 4.1 miRNA E CÂNCER ... 16
4.2 MODULAÇÃO NUTRICIONAL DOS miRNA’s NO CÂNCER ... 17
4.1 CARCINOMA PAPILÍFERO DA TIREOIDE (CPT): CARACTERÍSTICAS E PROGNÓSTICO ... 18
4.2 PADRÕES DIETÉTICOS E O CÂNCER DA TIREOIDE ... 19
4.3 VITAMINA A E CÂNCER ... 22
4.4 VITAMINA E E CÂNCER ... 23
5.0 METODOLOGIA ... 26
5.1 REVISÃO SISTEMÁTICA ... 26
5.1.1 Estratégia de busca ... 26
5.1.2 Seleção dos estudos ... 26
5.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO EXPERIMENTAL ... 26
5.3 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 27
5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTADIAMENTO DO TUMOR ... 27
5.5 DESENHO DO ESTUDO ... 28
5.5 AVALIAÇÃO DO CONSUMO ALIMENTAR HABITUAL ... 28
5.7 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DO MATERIAL BIOLÓGICO ... 29
5.8 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DAS VITAMINAS A E E ... 30
5.8.1 Condições cromatográficas ... 30
5.8.2 Categorização dos resultados ... 31
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 31 6.0 ARTIGOS CIENTÍFICOS ... 33 6.1 REVISÃO SISTEMÁTICA ... 33 6.2 ARTIGO EXPERIMENTAL 1 ... 64 6.3 ARTIGO EXPERIMENTAL 2 ... 72 7.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 86
REFERÊNCIAS... 87 APÊNDICES ... 95 ANEXOS ... 97
1.0 INTRODUÇÃO
O câncer é um problema de saúde pública e espera-se que, até 2020, o número de casos dessa doença na população mundial corresponda a mais de 17 milhões, dos quais mais de 342 mil corresponderão ao câncer de tireoide (CT)1.
O CT é a neoplasia maligna do sistema endócrino mais comum e ocupa a oitava posição na classificação dos cânceres que mais acometem as mulheres no mundo2. No Brasil, para o ano de 2018, aponta-se a ocorrência de cerca de 600 mil
casos novos de câncer, estimando-se que, aproximadamente, 9610 serão da glândula tireoide2.
Na região Nordeste, se desconsiderarmos os tumores de pele não melanoma, o câncer de tireoide é o 12º que mais afeta homens e o 5º mais frequente em mulheres, sendo o Rio Grande do Norte o 3º estado da região com maior incidência da doença, posterior ao Ceará e Paraíba2.
A neoplasia da tireoide origina-se a partir de células epiteliais foliculares, possuindo diferentes tipos de fenótipos: papilar, folicular, medular e anaplásico3. As
variantes papilar e folicular são classificadas como câncer de tireoide bem diferenciado (CDT) e possuem um melhor prognóstico, com as taxas de sobrevivência global de 10 anos em torno de 93% e 85% dos casos, respectivamente4. No entanto, aproximadamente 30% dos pacientes com CDT
desenvolvem metástases em nódulos linfáticos, 10% apresentam recorrência em linfonodos e 1-25% metástases em órgãos distantes5.
O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) é o tipo mais comum, representando mais de 70% das neoplasias da tireoide. Ocorre com maior frequência em mulheres, e o maior fator etiológico associado a essa neoplasia é a radiação ionizante, no entanto, a suscetibilidade genética e fatores externos também podem contribuir para o desenvolvimento da doença5.
As diferentes incidências desse tipo câncer em diversas partes do mundo sugerem que os fatores etiológicos modificáveis, incluindo os padrões dietéticos podem desempenhar um papel importante na carcinogênese da tireoide6,7,8,9,10.
Alterações genéticas em oncogenes, genes supressores de tumor e, os mais recentemente descobertos, microRNAs (miRNAs) também podem fazer parte dos fatores de risco para a carcinogênese da tireoide17.
Os miRNAs consistem em um filamento único de RNA, em média 22 nucleotídeos, provenientes da transcrição de íntrons ou de regiões do genoma não codificantes18, os quais agem ligando-se ao RNAm, diminuindo sua expressão19. Por regularem a expressão gênica, os miRNAs também participam da modulação de oncogenes, genes que ativam o ciclo celular, e supressores tumorais, que suprimem a divisão celular, sendo mais um fator na patogênese dos tumores20 .
Evidências recentes vêm relatando a capacidade de nutrientes essenciais, fitoquímicos, e outros compostos bioativos presentes em alimentos para modular a expressão de miRNAs em células de diferentes tipos de cânceres21. Esses estudos examinam os efeitos de vários padrões alimentares, incluindo alterações nos conteúdos e macro e micronutrientes sobre a expressão e função dos miRNAs21. Adicionalmente, estudos in vivo que examinam a influência dos nutrientes e padrões alimentares sobre a expressão e função de miRNAs podem fornecer ideias promissoras em nutrição e prevenção do câncer21.
Os micronutrientes também desempenham papéis essenciais na prevenção, prognóstico e tratamento do câncer, e seus efeitos estão envolvidos em várias vias relacionadas com a tumorigênese11. Além disso, pesquisas recentes, realizadas em diferentes países, revelaram que o status de micronutrientes pode estar notavelmente ligado a gênese no câncer11.
Concernente, estudos experimentais e clínicos vêm mostrando que as vitaminas antioxidantes podem inibir a formação e a progressão do câncer12. Nesse sentido, os status das vitaminas A e E vêm emergindo como fatores de riscos para a doença13.
A vitamina A e seus metabólitos são conhecidos por seu efeito antiproliferativo, de indução e diferenciação, e assim têm-se um interesse substancial em seu impacto sobre o crescimento de células tumorais14. Do mesmo modo, a vitamina E e seus análogos, também vem demonstrando exercer um forte efeito anticancerígeno15, independente da sua atividade antioxidante16.
Portanto, observações epidemiológicas que envolvam o monitoramento de padrões alimentares, bem como do status das vitaminas A e E precisam ser enfatizadas quando se trabalha com pacientes portadores de câncer, podendo favorecer achados que levem a biomarcadores relevantes nos processos de prevenção, diagnóstico, prognóstico e tratamento do carcinoma papilífero da tireoide. Além disso, conhecer a maneira pela qual o consumo de alimentos e
status bioquímico das vitaminas A e E podem modular a expressão dos miRNAs levando a supressão ou promoção da oncogênese, pode ser relevante no manejo dietético da prevenção e tratamento do câncer.
2.0 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
O câncer de tireoide representa de 2% a 5% dos cânceres femininos e menos de 2% dos cânceres masculinos. Em função de melhorias no diagnóstico durante as últimas décadas, é observado um padrão de crescimento das taxas de incidência na maioria dos países (cerca de 1% ao ano)22.
Um levantamento realizado pela equipe do Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular (LBBM) do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), em parceria com o Laboratório de Patologia do Hospital Doutor Luiz Antônio - HLA (Natal/RN), observou que no estado do Rio Grande do Norte os números de casos de câncer da tireoide vêm aumentando a cada ano, tendo-se registrado 2061 novos casos no período de 2003 a 2011, dos quais 88,5% representam carcinoma papilífero da tireoide (CPT), 9,3% carcinoma folicular da tireoide (CFT) e 2,2% outros subtipos23.
Embora nossos registros apresentem um número de casos relevantes, o que se observa na literatura é que existem diferenças na incidência em populações distintas, fato que sugere existir influência de vários fatores na gênese dessa neoplasia, em especial os que envolvem interações genéticas e ambientais3.
Nesse contexto, observações epidemiológicas que abranjam fatores modificáveis, tais como padrões alimentares e o status bioquímico de micronutrientes potencialmente anticarcinogênicos como influenciadores na expressão de oncogenes merecem relevância24. Todavia, no Brasil, não há registros
de pesquisas que envolvam a relação entre esses fatores e a incidência/prognóstico do câncer da tireoide.
Assim, enxerga-se a necessidade de se investigar o padrão de consumo alimentar, bem como o status bioquímico das vitaminas A e E em pacientes com CPT, buscando possíveis associações com os dados da literatura referindo-os como agentes moduladores da expressão de miRNA’s e suas consequências no prognóstico histopatológico do tumor.
3.0 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Este projeto contempla dois objetivos gerais:
I) Conhecer as informações disponíveis na literatura a respeito da possível influência das vitaminas A e E na modulação de miRNAs em células neoplásicas.
II) Associar os hábitos alimentares e as concentrações séricas de retinol e α-tocoferol com os peditores de prognóstico histopatológico (invasão, extensão, multifocaidade, tamanho do tumor e metástases linfonodais) do carcinoma papilífero da tireoide.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
▪ Realizar uma revisão sistemática a fim de conhecer os possíveis papéis das vitaminas A e E como agentes moduladores da expressão de miRNA’s em células neoplásicas.
▪ Conhecer os resultados histopatológicos do tumor dos indivíduos com CPT. ▪ Analisar o consumo alimentar habitual retrospectivo (últimos 12 meses) em
pacientes com CPT.
▪ Determinar as concentrações séricas de retinol (ROH) e α-tocoferol (TOH) em pacientes com carcinoma papilífero da tireoide antes e após tiredectomia.
▪ Analisar as associações entre os hábitos alimentares e o as concentrações séricas de retinol e α-tocerol com os parâmetros histopatológicosdo CPT.
4.0 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 miRNA E CÂNCER
Os miRNAs são uma importante classe de RNAs não codificantes, que regulam a expressão do gene pós transcricionalmente21, representando cerca de 1% do genoma humano, sendo altamente conservados em quase todos os organismos25. Esses nucleotídeos regulam a transcrição de 30% de todos os genes codificadores de proteínas através de sequências específicas ligadas ao RNA26. Cada miRNA liga-se à região 3’ do mRNA alvo e suprime a sua expressão afetando a estabilidade do mesmo e/ou direcionando-o para a degradação, controlando a expressão de cerca de um terço de mRNAs humanos26, o que pode culminar em modificações epigenéticas do DNA (ampliações genômicas e deleções), estresse celular e inflamação27.
Tendo em vista que participam da regulação de quase todos os processos celulares que têm sido investigados, as alterações na expressão desses nucleotídeos têm sido relacionadas a muitas doenças humanas, incluindo o câncer28. Os padrões de expressão de miRNAs são exclusivos para tecidos individuais e diferem entre as células do câncer e os tecidos normais29, sendo alguns miRNAs sobre-expressos ou reprimidos, exclusivamente, ou preferencialmente, em certos tipos de cânceres30, com seus níveis de expressão proporcionais à gravidade da doença31.
Os perfis de expressão dos miRNAs presentes no sangue, e também em outros fluidos corporais (soro, urina, expectoração) associados a tumores, foram detectados como marcadores relacionados ao seu desenvolvimento, progressão e metástases32, e assim compreendeu-se que a avaliação dos vários níveis de expressão de miRNAs, podem ser utilizados como marcadores, prevendo com precisão o prognóstico nos diferentes tipos de neoplasias33.
Atuando nestas perspectivas, os miRNAs foram observados afetando as características do câncer, incluindo a manutenção de sinalização proliferativa, síntese de supressores de crescimento, resistência a morte celular, permissão da imortalidade replicativa, indução de angiogênese, e ativação de invasão e metástase34,35,36, sendo sua expressão e/ou desregulação considerados alvos
moleculares potenciais para a prevenção do câncer, bem como biomarcadores de sua fase inicial36,37.
4.2 MODULAÇÃO NUTRICIONAL DOS miRNA’s NO CÂNCER
É irrefutável que a exposição dietética pode contribuir para alterações fenotípicas38, assim, logo após a conclusão do primeiro rascunho do Genoma humano em 200139, a nutrigenômica emergiu como nova área de pesquisa em Ciências da Nutrição40 .
Os estudos nutrigenômicos visam compreender como a nutrição e o estilo de vida influenciam as vias metabólicas e o controle homeostático, e como esta regulação funciona nas fases iniciais da doença40. Como consequência, os biomarcadores nutrigenômicos podem apoiar estratégias de intervenções dietéticas para restaurar a saúde e para a prevenção de doenças relacionadas à dieta40.
Os nutrientes têm múltiplas conhecidas, e provavelmente desconhecidas, ações fisiológicas não estão associadas um único gene, proteína ou metabólito40. Evidências crescentes mostram efeitos da nutrição como mediadores de mecanismos epigenéticos cruciais para o desenvolvimento de doenças crônicas41. A ação desses componentes têm implicações em muitas vias envolvidas na carcinogênese, incluindo apoptose, controle do ciclo celular, inflamação, angiogênese, e a reparação do DNA42. Adicionalmente, os miRNAs também desempenham um papel central no controle destes processos celulares43 e as diferenças em suas expressões podem estar relacionadas a fatores diretos e indiretos sendo intuitivo que alterações qualitativas na dieta podem agir cooperativamente com estes nucleotídeos na regulação do processo da gênese tumoral44.
Estudos realizados nos últimos anos demonstraram que compostos dietéticos tais como aminoácidos, carboidratos, ácidos graxos e vitaminas podem levar a alterações nas expressões de miRNAs afetando suas funções45 . De acordo com Witwer44, os fatores dietéticos podem modular o padrão de expressão de miRNAs circulantes em até 3 maneiras: influenciando indiretamente a produção de miRNAs endógenos; incorporando novos miRNAs exógenos de origem dietética
(xenomiRs); e promovendo alterações em mecanismos homeostáticos capazes de manter a concentração e transporte de miRNAs circulantes.
A primeira evidência da modulação dietética de miRNAs está relacionada a vitamina A e ao Zn21,42,46 e o que se tem reportado em vários estudos é que alterações na dieta resultam em mudanças na expressão de miRNas específicos44 . Além disso, algumas vitaminas e seus derivados têm sido relatados como moduladores da expressão de miRNAs em diversos modelos experimentais45, mostrando efeitos protetores em diferentes estágios de formação de células de câncer42, destacando-se as vitaminas A (VitA) e E (VitE).
4.3 CARCINOMA PAPILÍFERO DA TIREOIDE (CPT): CARACTERÍSTICAS E PROGNÓSTICO
O Carcinoma Papilífero da Tireoide (CPT) é a variante histológica mais comum entre os tumores malignos que afetam a glândula tireoide47, com um
aumento no registro de incidência que praticamente dobrou nos últimos 30 anos48,
atualmente corresponde a 80-90% dos casos de CT49.
O CPT afeta principalmente pessoas jovens e múltiplos fatores de risco para a sua etiologia foram identificados50, tais como exposição à radiação ionizante,
doença nodular da tireoide e história familiar de CT49. As mulheres costumam ser
quatro vezes mais susceptíveis que os homens51, no entanto, estes costumam
apresentar tumores mais agressivos e com maiores indíces de mortalidade48. O
tratamento do CPT foca-se na remoção cirúgica, que para tumores primários inclui a tireoidectomia parcial (podendo ser preservado parte do tecido) e tireoidectomia total (remoção de todo tecido tireoideano)50.
Os fatores de prognóstico histopatológico relacionados a essa neoplasia são o grau histológico, a presença de multifocalidade, extensões extracapsulares, tamanho do tumor e o desenvolvimento de metástases linfonodais e/ou à distância50,52. Sua principal classificação é feita pelo sistema de estadiamento
Tumor-Nódulo-Mestástase (TNM) recomendado pela UICC (do inglês, Union for International Cancer Control) e AJCC (do inglês, American Joint Comission on Cancer)50,51.
O CPT apresenta diferentes subtipos, sendo os mais comuns as variantes clássica e folicular53. Macroscopicamente, o CPT é bastante variável, com lesões
que podem aparecer em qualquer parte da glândula, lobos direito e esquerdo ou istmo, de tamanhos geralmente variando entre 2 e 3 cm, embora possam existir tumores demasiado maiores52. Sobretudo, trata-se de um tumor considerado
indolente, com um excelente prognóstico na maioria do casos48, no entanto, a
recorrência da doença continua sendo um problema significativo em 30% dos pacientes54.
Os tumores de CPT podem ainda invadir vasos linfáticos, levando a presença de multifocalidade e/ou metástases linfonodais. A invasão venosa, que leva às metástases hematogênicas (fora da região do pescoço) é incomum, no entanto, pode existir em até 7% dos casos52.
O conhecimento atual sugere que a presença de metástases é o fator central para o aumento de risco de recidiva local e sobrevida global47, estando a
relevância das metástases linfonodais associada à recorrência da doença, e as metástases hematogênicas (ossos e pulmão) à sobrevida dos pacientes50.
As metástases linfonodais no CPT são bastante comuns (mais de 50% dos casos)52, entretanto, a predisposição para metastáses hematogências é reduzida50.
As metástases linfonodais podem surgir em linfonodos recorrentes, jugulares, espinhais, supraclaviculares e gânglios linfáticos mediastinais superior e médio, sendo estes últimos menos frequentes50. Sun et al.48 propõem que alguns fatores de
risco para a presença de metástase linfonodais podem ser a idade, presença de tireoidite de Hashimoto, níveis alterados do hormônio tireoide estimulante (TSH, do inglês, Thyroid-stimulanting Hormone), tamanho do tumor primário, e multifocalidade tumoral48.
Dados da literatura demonstram que os mecanismos precisos para predição dos agravantes histopatológicos do CPT ainda permanecem incertos49,
desse modo, a compreensão de aparatos subjacentes pode ser essencial para identificação de novos biomarcadores e alvos terapêuticos para a doença.
4.4 PADRÕES DIETÉTICOS E O CÂNCER DA TIREOIDE
A ingestão dietética vem sendo estudada como fator de risco para a ocorrência de diversos tipos de cânceres55. A esse respeito, estudos
epidemiológicos indicaram que os hábitos alimentares podem desempenhar um papel relevante na gênese do carcinoma da tireoide7,56.
Pesquisas recentes evidenciaram que compostos bioativos encontrados, especialmente, em frutas, verduras57 e especiarias podem exibir propriedades
quimiopreventivas e terapêuticas contra vários tipos de tumores, modulando diferentes tipos de alvos oncogênicos, tais como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e transcrição, bem como enzimas15. Ademais, outros componentes
específicos da dieta56, como os micronutrientes, possivelmente, também possuem
relação com a carcinogênese tireoidiana7.
Devido ao seu papel na formação dos hormônios tireoidianos, o iodo é o fator dietético mais comumente investigado nos distúrbios benignos e malignos da glândula tireóide.7 Os dois principais subtipos histológicos de carcinoma da tireoide
são o papilífero e folicular e, curiosamente, possuem associações distintas com a ingestão dietética de iodo, estando associados a dietas ricas e deficientes em iodo, respectivamente8. Deste modo, o interesse em pesquisas que relacionem o
consumo de alimentos ricos em iodo tais como, peixes e frutos do mar e a gênese de neoplasias malignas da tireoide vem crescendo substancialmente58.
Em um estudo realizado na Polinésia Francesa, região de alta incidência de câncer de tireoide, Cléro et al.55 observaram que uma diminuição no risco da
doença foi associada ao alto consumo de peixes, mariscos e outros frutos do mar. Da mesma, Xhaard et al.59 conduziram um estudo na mesma região e consideraram
uma baixa ingestão de frutos do mar como um fator de risco significativo para o desenvolvimento do câncer de tireoide. Por outro lado, Daniel et al.60, observando
uma população americana, não encontraram qualquer associação entre o consumo de peixe e o risco do carcinoma da tireoide. Numa análise conjunta de vários estudos, Choi et al.58 concluíram que o consumo de peixe não foi associado com
risco de câncer de tireoide, mas um possível papel protetor pode estar relacionado a sua ingestão em regiões deficientes de iodo 58.
Além do iodo, muitos estudos vem demonstrando uma ligação entre vários fatores dietéticos e câncer da tireoide incluindo os vegetais crucíferos56, frutas e
hortaliças, as quais podem conter micronutrientes e compostos bioativos com atividade antioxidante que ajudam a proteger contra o câncer58.
Os vegetais crucíferos (couve de bruxelas, couve flor, brócolis, rúcula, repolho, entre outros) e a mandioca59 contêm uma forma degradada de
tioglicosídeos que podem aumentar o risco de câncer de tireoide por inibirem o transporte de iodo para a glândula58. A esse respeito, Truong et al.61 encontraram
uma associação positiva entre o aumento do risco de câncer de tireoide e o alto consumo de vegetais crucíferos. Em contrapartida, a revisão de estudos realizadas por Dal et al.6 concluiu que o consumo desses vegetais esteve inversamente
relacionado ao risco de CT. No entanto, no estudo de Cléro et al.55, em
concordância com os resultados das metanálises de Liu e Lin62 e Cho e Kim8,
nenhuma associação entre a ingestão de vegetais crucíferos e risco carcinoma tireoide foi encontrada. No tocante a mandioca, Cléro et al.55 observaram que a alta
ingestão desta pode estar associada com o maior risco de desenvolver o CT.
A cerca de outros alimentos de origem vegetal, uma metanálise que incluiu 19 estudos do tipo caso-controle sobre fatores dietéticos e o risco de CT, encontrou uma fraca associação inversa com a ingestão de hortaliças e nenhuma associação com a ingestão de frutas57. Em se tratando de sucos de frutas, Xiao et al.9 sugeriram
uma associação positiva entre o consumo de sucos cítricos e o risco de CT. Enquanto isso, Zamora-Ros et al.57 não observaram nenhuma associação entre a
ingestão total de frutas e verduras e o risco de carcinoma da tireoide papilífero ou folicular.
Ao cozinhar carne vermelha em altas temperaturas, compostos orgânicos potencialmente carcinogênicos são formados e a proliferação de células cancerígenas pode ser promovida58. A carne suína, também foi associada
positivamente com risco de câncer de tireoide60, todavia, Truong et al.61 e Park et al.63 não encontram associação significativa entre o consumo de carnes e a gênese
do CT.
Uma das preocupações de saúde pública atual é exposição aos nitratos e nitritos de ingestão dietética64. Algumas investigações mostram que a alta exposição
aos nitratos e nitritos pode atrapalhar a captação de iodo da glândula tireoide64. Um
estudo de coorte nos Estados Unidos, conduzido por Park et al.63 associou
positivamente o consumo de 124 alimentos ricos em nitratos ao risco de carcinoma papilífero da tireoide em homens, mas nenhuma associação significativa foi encontrada em mulheres. De maneira complementar, o consumo de vegetais ricos em nitratos como o espinafre e a alface também foi associado ao risco do CT em uma população de mulheres chinesas63.
Considerando que os estudos anteriores foram realizados em regiões diferentes, com cultura alimentar e disponibilidade de alimentos distintos, a associação entre o risco de CT e o consumo de peixes e frutos do mar, bem como
dos vegetais crucíferos e outros vegetais, pode ser variável, conforme a oferta e consumo de outros alimentos que venham suprir as necessidades individuais de iodo, sendo relevante conhecer o consumo alimentar da população com CT da maneira ampla, abrangendo o maior de número de aspectos dietéticos da população estudada que seja possível. Portanto, a investigação do consumo alimentar e os mecanismos pelos quais os alimentos podem interferir na carcinogênese da tireoide precisam ser melhor esclarecidos e assim, mais estudos epidemiológicos sobre este assunto são requeridos.
4.5 VITAMINA A E CÂNCER
A importância dos compostos derivados da vitamina A para homeostase e fisiologia normal já é bem estabelecida, no entanto, seu papel na prevenção de doenças crônicas ainda não se encontra completamente elucidado65. A esse
respeito, ensaios clínicos recentes sugerem um fator protetor da vitamina A para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e câncer65, e assim surge um
interesse substancial no seu efeito protetor na quimioprevenção de neoplasias malignas13.
As funções chaves da vitamina A incluem o crescimento, desenvolvimento, diferenciação e apoptose celular, além de exercer forte poder antioxidante65 e
regular a transcrição do DNA através da inibição da atividade da DNA polimerase66.
Desse modo, é plausível observar sua ação na prevenção do câncer pela regulação do crescimento, diferenciação e apoptose de células malignas13.
O Ácido Retinóico (AR), um metabólito ativo da vitamina A, tem sua importância ressaltada na oncogênese pelo seu potente poder de indução, diferenciação67 e regulação de vias de sinalização relacionadas ao processo
inflamatório68 em células de diferentes tipos de neoplasias malignas, em especial, a
leucemia promielocítica67.
Ensaios clínicos observaram que muitos pacientes portadores de leucemia promielocítica atingiam a remissão completa após a administração de AR67.
Ademais, seu efeito antioncogênico in vivo também foi observado no melanoma, câncer de próstata, pulmão e mama67.
Em estudos in vitro, Park et al.69,70 demonstraram que o retinol inibe o
crescimento e a invasão de células de câncer do cólon, assim como Li et al.67,71
observaram uma atividade supressora do crescimento e adesão de linhagens celulares provenientes de diferentes tipos de neoplasias malignas, incluindo células cancerígenas da vesícula biliar, as quais apresentam uma resistência significativa à drogas convencionais já consolidadas no tratamento do câncer. Vale salientar ainda que, o AR tem sido utilizado no tratamento de vários tipos de cânceres, incluindo linfoma, câncer do colo do útero, neuroblastoma, glioblastoma, próstata, e neoplasias de cabeça e pescoço72.
Por causa das funções antioncogêncas já descritas da vitamina A, uma maior ingestão ou circulação deste micronutriente pode desempenhar papel relevante na redução do risco e progressão do câncer73. No entanto, as
observações epidemiológicas ainda são escassas ou inconsistentes, apresentando resultados que, por vezes são imprecisos, resultando em um poder limitado para detectar associações verdadeiras modestas13.
Portanto, é relevante avaliar uma possível relação entre as concentrações séricas dessa vitamina e o prognóstico do CPT, para determinar métodos de tratamento por meio de nutrientes como agentes terapêuticos, semelhante ao que já vem acontecendo em outras neoplasias.
4.6 VITAMINA E E CÂNCER
Desde a sua descoberta, a vitamina E tem sido considerada como um dos antioxidantes mais potentes na neutralização de radicais livres15, por isso, assim
como a vitamina A, vêm-se investigando suas potencias propriedades preventivas na doença cardiovascular e no câncer74.
A vitamina E é principalmente agrupada em duas categorias: os tocoferóis e tocotrienóis75. Todos os tocoferóis e tocotrienóis são poderosos antioxidantes e
podem bloquear danos ao DNA induzidos pelo estresse oxidativo76. Além disso,
suas propriedades anti-inflamatórias promovem o bloqueio do desenvolvimento, invasão, e resistência ao tratamento nos microambientes tumorais de células cancerosas76. Sobretudo, numerosos estudos evidenciaram que tanto os tocoferóis
como os tocotrienóis exibem propriedades quimiopreventivas e terapêuticas contra vários tipos de tumores, modulando diferentes alvos oncogênicos, tais como
citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, enzimas, fatores de transcrição e outros15. Devido à sua atividade antioxidante contra uma variedade de compostos
oxidantes gerados in vivo, o tocoferol e seus isômeros têm um considerável poder contra o câncer e outras doenças relacionadas ao dano oxidativo77. Ademais,
estudos demonstraram que os tocoferóis possuem um potencial protetor contra o câncer de pulmão, mama, próstata, e cólon75.
Enquanto isso, o tocotrienol além de apresentar propriedades antioxidantes, também exerce um efeito anticarcinogênico diferencial16. Através de
suas propriedades anti-inflamatórias, promove uma indução da apoptose, acarretando numa potente atividade antiproliferativa contra vários tipos de neoplasias e reduzindo a proliferação de metástases16. Além do que, pesquisas
emergentes sugerem que os tocotrienóis podem modular a imunidade, o que também pode contribuir para a prevenção do câncer76.
Partindo-se disto, muitos estudos vêm demonstrando que a vitamina E é um forte candidato como estratégia coadjuvante na prevenção do câncer78 e, em
consequência, várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas em função de melhor investigar suas propriedades antioncogênicas79.
Em estudo tipo caso-controle realizado com 12 pacientes recém-diagnosticados com câncer colorretal pareados por idade com 12 indivíduos saudáveis, Koçer e Nazıroğlu77 observaram que a concentração sérica de vitamina
E foi significativamente menor nos pacientes com câncer do que nos controles saudáveis. Além disso, os níveis séricos da vitamina diminuía a medida que a doença progredia, em concomitância com o aumento da inflamação sistêmica em resposta à doença.
Por sua vez, Emami et al.11 observaram que em pacientes com carcinoma
medular da tireoide, os níves de vitamina E estavam reduzidos quando comparados com o grupo controle saudável, e a esse respeito os pesquisadores concluíram que as baixas concentrações circulantes de vitamina E possui correlação significante com maior risco de se desenvolver a doença.
Ainda se tratando de neoplasias da tireoide, Senthil e Manoharan80
parearam por sexo e idade 20 indivíduos em estágio II de carcinoma papilífero da tireoide com 20 indivíduos saudáveis, e observaram que os níveis da vitamina E no plasma de pacientes portadores de CPT foram significativamente inferiores que aqueles encontrados na população saudável.
Embora o papel oncoprotetor atrelado a vitamina E seja sugerido por várias pesquisas clínicas, estudos que envolvam relações entre o seu status bioquímico em pacientes portadores de câncer e a progressão tumoral ainda são escassos, a esse respeito pode ser relevante estabelecer uma relação entre as concentrações séricas de vitamina E a oncogênese do CPT, a fim de que novas concepções de estratégias para prevenção, diagnóstico e tratamento possam ser estabelecidas.
5.0 METODOLOGIA
5.1 REVISÃO SISTEMÁTICA
A revisão sistemática foi escrita de acordo com o “The PRISMA Statement for Reporting Systematic Reviews and Meta-Analyses of Studies That Evaluate Health Care Interventions: Explanation and Elaboration”81.
5.1.1 Estratégia de busca
Múltiplas buscas sistemáticas de publicações realizadas entre 01 de janeiro de 2007 a 13 de março de 2018 foram realizadas na base de dados do PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), utilizando as palavras chaves (miRNA OU microRNA) AND (“retinoic acid” OU, “vitamin A” OU, retinol) OU, tocopherols OU, “vitamin E”) AND (cancer OU, neoplasms OU, tumor). Os manuscritos encontrados foram armazenados em banco de dados e as duplicatas foram removidas. Em seguida, uma checagem inicial foi realizada a partir dos títulos e resumos.
5.1.2 Seleção dos estudos
Foram selecionados estudos escritos em língua inglesa, que analisaram mudanças no perfil de expressão de miRNA’s, induzidas por tratamentos com as VitA ou VitE ou seus derivados, em células neoplásicas. Os critérios de exclusão foram: estudos realizados há mais de 10 anos, outras revisões sistemáticas, manuscritos de análises de bioinformática, short communication e supporting information.
5.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO EXPERIMENTAL
Trata-se de um estudo observacional do tipo longitudinal prospectivo, no qual os indivíduos participantes foram estudados conforme os preceitos da Declaração de Helsinque e do Código de Nuremberg, respeitando as Normas de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (Res. CNS 466/12) do Conselho Nacional de Saúde, com parecer consubstanciado emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Liga Norte Rio-grandense Contra o Câncer (CAAE: 63962016.9.0000.5293) e mediante assinatura de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) pelos indivíduos participantes (Apêndice 1).
5.3 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra foi estabelecida por conveniência e foram incluídos indivíduos adultos ou idosos sem restrição quanto a etnia, sexo ou grau de instrução submetidos à tireoidectomia total ou parcial por suspeita de neoplasia maligna da glândula tireoide no período de abril de 2017 a janeiro de 2018. Os pacientes foram recrutados na Liga Norte Rio-grandense Contra o Câncer, unidade hospitalar Doutor Luiz Antônio (HLA), e tiveram o diagnóstico confirmado após análise histopatológica do tecido tumoral. Pacientes com precedente (t<5 anos) ou diagnóstico concomitante de alguma outra neoplasia foram excluídos.
5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTADIAMENTO DO TUMOR
As análises e classificações citológicas e histopatológicas dos tumores foram realizadas no Laboratório de Patologia do HLA por médicos patologistas como parte da rotina clínica de seguimento dos pacientes. O estadiamento tumoral e estratificação dos pacientes com CPT foi baseado na 8ª edição do sistema de classificação e estadiamento TNM82, recomendado pela UICC (do inglês Union for International Cancer Control) e AJCC (do inglês, American Joint Comission on Cancer) o qual se baseia para o diagnóstico na idade do paciente, extensão do tumor (T), comprometimento de linfonodos regionais (N) e metástase à distância (M)
5.5 DESENHO DO ESTUDO
Depois de atendidos os critérios de inclusão e exclusão e assinatura do TCLE, os procedimentos da pesquisa tiveram seguimento conforme descrito a seguir:
Tempo 0 (T0): correspondeu ao momento da internação pré-operatória em que o paciente foi recrutado, esclarecido e assinado o TCLE, coletado o material biológico e aplicado o Questionário de Frequência Alimentar (QFA).
Tempo 1 (T1): primeiro retorno imediato ao pós-cirúrgico, com intervalo médio de 30 dias após a cirurgia, em que se realizou a segunda coleta de material biológico.
Tempo 2 (T2): segundo retorno pós-cirúrgico com intervalo médio de 60 dias posteriormente a cirurgia, no qual realizou-se a terceira última coleta do material biológico.
5.5 AVALIAÇÃO DO CONSUMO ALIMENTAR HABITUAL
As informações sobre o consumo alimentar habitual retrospectivo (últimos 12 meses) foram investigadas através do QFA semi-quantitativo (Anexo 2) desenvolvido pelo estudo Elsa Brasil83 em sua versão reduzida, que contempla 73
alimentos e bebidas, além de informações adicionais quanto ao consumo de álcool, edulcorantes e gorduras como condimentos ou ingredientes de frituras.
Os alimentos e bebidas que tiveram suas frequências de consumo analisadas foram aqueles previamente relacionados com gênese da neoplasia da tireoide em estudos anteriores55,84, os quais são desctiros a seguir:
mandioca/macaxeira, batata doce, inhame, arroz branco, pães brancos, pão de queijo, bolo simples, biscoito salgado, biscoito doce (com e sem recheio), farofa/cuscuz, farinha de mandioca/farinha de milho, polenta/angu, batata inglesa cozida/ensopada/purê, pizza, macarrão (caneloni, lasanha e ravióli), salgados assados e fritos (quibe, coxinha, esfirra, empada, empanada e pastel), feijões, ervilha, grão de bico, repolho, tomate, couve flor, brócolis, laranja/tangerina,
abacaxi, uva, banana, mamão, maçã/pêra, melão, melancia, manga, peixe, carne bovina, carne de porco, leite, iogurte e queijos, manteiga, margarina/creme vegetal refrigerante (diet/light e normal), café (com açúcar, sem açúcar ou com adoçante) suco natural (com açúcar, sem açúcar ou com adoçante) suco industrializado (caixinha ou garrafa, com açúcar, sem açúcar ou com adoçante) suco artificial em pó (com açúcar, sem açúcar ou com adoçante), cerveja, vinho (tinto e branco) e outas bebidas alcoólicas destiladas. Adicionalmente, também buscamos conhecer a frequência de consumo de alimentos embutidos e ultraprocessados (presuntos e linguiças), os quais já vêm largamente sendo estudados por sua relação com a gênese de doenças crônicas não transmissíveis, incluindo o câncer85.
Para cada item alimentar os participantes deveriam relatar uma frequência de consumo: > 3x/dia, 2x/dia, 1x/dia, 5 a 6x/semana, 2 a 4x/semana, 1x/semana, 1 a 3x/mês, nunca/quase nunca. A caracterização dos hábitos alimentares foi realizada conforme a frequência de ingestão semanal/diária, sendo adotado como ponto de corte o consumo superior a 1x/semana para que o alimento fosse considerado frequente no consumo alimentar semanal dos indivíduos entrevistados. Aqueles alimentos que foram relatados como frequentes no consumo alimentar semanal de pelo menos 50% da população investigada, foram examinados individualmente quanto à associação com os preditores de prognóstico histopatológico do CPT.
Os tamanhos das porções foram estimados e padronizados com auxílio de livreto fotográfico86 desenvolvido pelo Departamento de Nutrição da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte com alimentos e preparações de interesse dietético regional e local.
5.7 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DO MATERIAL
BIOLÓGICO
Após a identificação dos tubos, os participantes da pesquisa foram novamente informados sobre o procedimento a ser realizado, sendo devidamente apresentados ao kit de coleta, e em seguida, instruídos sobre a forma de recebimento do laudo.
Os pacientes foram orientados a posicionar o braço de maneira confortável e que permitisse a coleta com segurança. Depois da realização da assepsia das mãos do responsável pela coleta, o braço do sujeito foi garroteado cerca de 8 cm a
cima da dobra do cotovelo por no máximo 1 minuto, e então foram coletados 4 mL de sangue periférico em tubo desmineralizado sem anticoagulante. A coleta deste material foi realizada em colaboração com a equipe de enfermagem do hospital e alunos do curso de Farmácia do Departamento de Ciências Farmacêuticas/UFRN.
Findada a coleta do sangue periférico, o soro foi obtido após centrifugação em temperatura ambiente a 3400 x g por 10 minutos. Posteriormente, as amostras foram blindadas por papel alumínio, a fim de proteger as vitaminas o retinol e α-tocoferol contra a foto-oxidação, e armazenadas -80 ºC até a data de extração e quantificação.
5.8 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DAS VITAMINAS A E E
A concentração do retinol α-tocoferol nas amostras foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), de acordo com adaptação do método utilizado por Ortega et al87. Nas alíquotas de soro sanguíneo foi adicionado álcool etílico 95% (Sigma Aldrich®) em igual volume ao da amostra, para desnaturação das proteínas. Em seguida, adicionou-se 2mL de hexano (Sigma Aldrich®) como reagente extrativo, agitando a amostra durante 1 minuto para posterior centrifugação a 400 rpm por 10 minutos. A camada hexânica foi então removida para outro tubo e no precipitado foram adicionados mais 2mL de hexano, repetindo-se o processo extrativo por duas vezes. Após evaporação de 4mL da fase hexânica em banho-maria a 37oC, o extrato foi dissolvido em 250μL de etanol absoluto para então serem aplicados no aparelho de CLAE.
5.8.1 Condições cromatográficas
A concentração do retinol e α-tocoferol no sangue foi determinada em cromatógrafo da marca Shimadzu, constituído de bomba LC-20 AT Shimadzu, acoplado a um Detector SPD-20 A Shimadzu UV-VIS, Coluna Shim-pack CLC-ODS (M) 4,6 mm x 25 cm e computador com programa “LC solutions” (Shimadzu Corporation) para processamento dos dados.
A identificação e quantificação das vitaminas nas amostras foi estabelecida por comparação das áreas dos picos obtidos no cromatograma com áreas dos respectivos padrões de cada um. As concentrações dos padrões foram confirmadas pelo coeficiente de extinção específico para cada um deles.
5.8.2 Categorização dos resultados
Os resultados das concentrações séricas de retinol e α-tocoferol foram representados em µg/dL e categorizados de acordo com intervalos interquartis. O P50 foi adotado como ponto de corte para a classificação (acima/abaixo) dos indivíduos quanto as concentrações séricas de retinol e tocoferol conforme realizado em estudos anteriores que avaliaram a relação entre as concentrações séricas de micronutrientes e o prognóstico do câncer12, 73, 79, 88, 89, 90, 91. Indivíduos
que tiveram resultados inferiores a metade do P50, ou superiores ao valor do P50 + 50%, tiveram os procedimentos de extração e aplicação repetidos para a confirmação dos resultados.
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O programa Statistical Package for the Social Science v. 20.0 (SPSS Inc., Illinois, EUA) foi utilizado para a análise estatística. As variáveis categóricas foram apresentadas em frequências relativas e absolutas, enquanto as variáveis contínuas foram apresentadas como mediana e intervalo interquartil.
A variável consumo alimentar frequente (categórica) foi analisada quanto a sua associação com cada um dos parâmetros de prognósticos histopatológicos do CPT (invasão, extensão, multifocalidade, metástases linfonodais e tamanho do tumor) por meio dos testes do qui-quadrado de Pearson e teste exato de Fisher.
Os valores séricos retinol e α-toceferol foram analisados de forma categorizada pela mediana em cada um dos 3 tempos de coleta, e ainda de forma continua por meio de testes não paramétricos, após teste de normalidade de
Kolmogorov-Smirnov. Em ambos os modelos, categórico e contínuo, foi investigado a associação com cada um dos fatores de prognóstico histopatológico do CPT separadamente.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis séricos das vitaminas A e E com cada fator de prognóstico histopatológico do CPT de forma independente. E os testes não-paramétricos de Wilcoxon e Friedman foram utilizados para as comparações pareadas de duas ou mais amostras dos níveis séricos das vitaminas no pré (T0) e pós tireoidectomia (T1 e T2).
A regressão logística, nos modelos uni e multivarido, foi realizada a fim de se obter o valor relativo ao risco daquelas variáveis significativas para os testes de qui-quadrado. Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
6.0 ARTIGOS CIENTÍFICOS
Os resultados obtidos nesta dissertação serão apresentados na forma de 3 artigos científicos, os quais são descritos nas páginas seguintes.
6.1 REVISÃO SISTEMÁTICA
Embora tenha sido objetivo desse estudo investigar as associações entre a modulação da expressão de miRNA’s induzidas pelas vitaminas A e E, só foram encontrados resultados suficientes para se conduzir um estudo de revisão sistemática para o manuscrito referente a vitamina A, visto que, o número de estudos que trabalharam com a vitamina E e seus derivados como agentes moduladores da expressão de miRNA’s não foi satisifatório para se atender o métodos de análise desta pesquisa.
A revisão sistemática “MODULATION OF ALL-TRANS RETINOIC ACID-INDUCED miRNA EXPRESSION IN NEOPLASTIC CELL LINES: A SYSTEMATIC REVIEW” foi submetida para publicação no periódico “Advances in Nutrition”, que possui fator de impacto 6,853, e Qualis A1 da CAPES para Nutrição. O comprovante de submissão encontra-se na página seguinte e as normas de publicação deste periódico no Anexo 3.
Modulation of All-trans Retinoic Acid-induced MiRNA Expression in Neoplastic Cell Lines: A 1
Systematic Review 2
3
Lara Clarisse de Lima Silva1,2, Thaísa Cristina Tavares de Melo², Diego Marques da Costa Santos2, Jéssica 4
Nayara Góes de Araújo2, Isabela Samária Fernandes Leite2, Camila Xavier Alves4, Julieta Genre², and 5
Vivian Nogueira Silbiger1,3 6
7
¹Department of Nutrition, Postgraduate Program in Nutrition, Federal University of Rio Grande do 8
Norte, Natal, Brazil; 9
²Laboratory of Bioanalysis and Molecular Biotechnology, Federal University of Rio Grande do Norte;
10
3Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, 11
Brazil; 12
4Faculty of Health Sciences of Trairi, Federal University of Rio Grande do Norte, Santa Cruz, Brazil.
13 14
Address correspondence to VNS (email: viviansilbiger@hotmail.com) 15
Professor, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do
16
Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Av. General Gustavo Cordeiro de Faria S/N, Petrópolis,
59012-17 570. Natal - RN, Brazil. 18 Telephone: +55 84 3342 9807; Fax: +55 84 3342 9833. 19 20
Word count: 6941 Figures: 1; Tables: 5
21
Running title: ATRA-induced miRNAs in neoplasia: a systematic review 22
Funding: This work had no financial support. 23
Conflict of interest: The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this 24
paper.
25
ABSTRACT 26
Cancer comprises a genetic and epigenetic disease that requires the inactivation of tumor suppressor genes
27
along with proto-oncogene activation. All-trans retinoic acid (ATRA), a retinoic acid derivative, is involved 28
in the onset of differentiation and apoptosis in a wide variety of normal and cancer cells, functioning as an 29
anti-cancer agent for a variety of neoplasms. Several studies have shown that ectopic changes in the 30
expression of certain microRNAs (miRNAs) occur in response to ATRA, leading to phenotypic alterations 31
in neoplastic cell lines. Moreover, the modulation of miRNA patterns upon ATRA-treatment may constitute 32
an effective strategy for chemopreventive and anticancer therapy. Thus, the present systematic review was 33
performed to provide an overview of the modulation of ATRA-induced miRNA expression in different types 34
of neoplastic cells and identify the efficacy of intervention factors (i.e., concentration and time of treatment) 35
and how they influence the expression profile of miRNAs targeting oncogenesis. A systematic search of the 36
published literature was undertaken using the US National Library of Medicine`s MEDLINE/PubMed 37
bibliographic search engine. The search identified 23 experimental studies with human cell lines from four 38
different cancer types (neuroblastoma, myeloid and promyelocytic leukemias, breast and lung cancer) 39
treated with ATRA concentrations ranging between 5 pmol and 10 mmol for 3 to 7 days. The concentrations 40
and time of treatment of cancer cells with ATRA varied widely. The presence of ATRA in culture medium 41
containing cancer cells could modulate the expression of an additional 300 miRNAs, with the changes in 42
miRNA expression profiles potentially resulting in the promotion of apoptosis, growth control, invasion, 43
migration, metastasis, and in some cases, total tumor remission. ATRA may thus be broadly effective for 44
neoplasm treatment and prevention, although these studies may not accurately represent in vivo conditions. 45
Additional studies are required to elucidate the ATRA-induced miRNA modulations during neoplasm 46
treatment. 47
48
Keywords: Cancer, All-trans retinoic acid, MiRNA, Expression modulation 49
50 51 52
Introduction 53
Cancer comprises a genetic and epigenetic disease that requires the inactivation of tumor suppressor genes
54
and the activation of proto-oncogenes (1). Cancer constitutes a public health problem worldwide, with the 55
anticipated impact of this disease on the world population corresponding to over 17 million cases by the year 56
2020 (2). 57
Retinoic acid (RA)3, the major bioactive metabolite of retinol or vitamin A, serves as a potent regulator
58
of cell growth, differentiation, and matrix formation of various cell types during embryogenesis (3, 4). In
59
addition, all-trans retinoic acid (ATRA), a derivative of RA, is involved in the onset of differentiation and 60
apoptosis in a wide variety of normal and cancer cells (5) and has been shown to function as an anti-cancer 61
agent for a variety of neoplasms (6). Notably, several studies have shown that ectopic changes in the
62
expression of certain microRNAs (miRNAs) occur in response to ATRA, leading to phenotypic alterations
63
(7). Thus, a potential role for miRNAs with regard to the anti-tumor action of ATRA has been implied by 64
studies performed in various cellular contexts (8). Moreover, the modulation of miRNA patterns upon
65
ATRA-treatment (9) has been suggested as a potential strategy for chemopreventive and anticancer therapy 66
(6). 67
miRNAs comprise a class of endogenous, small non-coding RNAs that control gene expression by 68
binding to their target messenger RNAs for degradation and/or translational repression (5). These molecules
69
have been extensively associated with the pathology of cancer, as they are involved in the regulation of gene
70
expression and play important roles in regulating biological processes such as development and
71
differentiation, cell proliferation,
72
3 Abbreviations: AML, acute myeloid leukemia; APL, acute promyelocytic leukemia; ATRA, all-trans retinoic acid; miRNA, microRNA; NB, neuroblastoma; RA, retinoic acid
