POR AZOSPIRILLUM SPP EM PLANTAS COM VIA FOTOSSINTÉTICA C3 E C4 1
11. BALDANI 2 , P.A.A. PEREI RA, R.E.M da ROCHA3
e JOHANNA DÓBEREINER 4
RESUMO - Resultados anteriores sobre a especificidade hospedeira na infecção de gramíneas com Arospfrllluni spp foram confirmados no presente trabalho, com maior número de espécies. No solo ocorreram as duas espécies de Arospfritlum - A. brasilense e A. lipoferum - e, ainda estirpes denitri-ficantes (nir) e nio-denitridenitri-ficantes (nif). Os isolamentos de raízes esterilizadas de cereais de clima temperado com via fotossintética C3 (trigo, cevada, aveia e centeio), foram predominantemente da espécie A. brasilense; e os de raízes esterilizadas de gramíneas tropicais com via C 4 foram predominan-temente da espécie A. lipofe4'um. Em ambos os casos parece que as plantas, especialmente as C3, apresentam seletividade para estirpes não denit.rificantes. A única exceção nestas observações foi a cana-de-açúcar, que se comportou como os cereais temperados. For outro lado, a tiririca, uma Cyp era-cea com via C4 , foi infecfada por A. lipoferuin, como as gramíneas com via C 4.
Termos para indexação: especificidade hospedeira, Azospirlilum, cereais C3, gramíneas C4, fixação de nitrogônio, Rhlzocoenosis.
HOST PLANT SPECIFICITV IN THE INFECTION OF C3 AND C4 PLANTS BY AZOSPIRILLIJM SPP
ABSTRACT - The occurence of Azospiritium brasliense and A. tipo ferum and their nir+ and nir variants was determined in soll and in non-steriiized and sterilized roots of the C3 cereais wheat, rye, bariey and oat and of severai C4 grasses. The C3 cereais were pianted in pots with red-yellow podzolic sou and examlned at two growth stages. The C4 forage grasses were coiiected in fields where the respectivo species were predominant. 1 n ali solis A. brasilense seemed te predominate. The proportion of A. brasilense nir- was above 80% in ali C3 cereais when surface steriliized roots were examined. Azospiri/lum isoiates from surface sterulized roots of C4 grasses were predominantly A. tipo ferum bit only in some species (Panicum inaximum, Sorghum vulgare and Brachíaria sp) the nir forms predo: minated. A weed beionging to Cyperaceae (Cyperus rotundus) was also infected by A. tipo festim nir as in the case of other C4 9rasses. The only exception among the C4 Gramineae was sugar cane which seemed to behave liRe the C3 cereais, and ali 24 isolates from surface steriiízed roots were A. brasilense nlr.
Index terms: host plant specificlty, Azospiri/lum, C3 cereais, C4 grasses, nitrogen fixation, rhizocoeno- sis-
INTRODUÇÃO
As associações de gramíneas com bactérias fixa-doras de N2, recentemente denominadas rizoceno-ses (Baldani & Dóbereiner 1979), estão sendo estu-dadas sob diferentes £ngulos. Fatores ligados à interação planta-bactéria receberam enfoque espe-ciaL Entretanto, aspectos como especificidade na infecção das raízes por essas bactérias têm sido pouco explorados. Uma das poucas evidências de
1 Aceito para publicação em 15 de agosto de 1980. 2 Eng? Agr9, M.Sc., SNLCS - EMBRÀPA, km 47, CEP
23.460 . Seropédica, Ri,
3 Alunos da Universidade Federal Rural do Rio de Ja-neiro (UFRRJ) e bolsistas do CNPq.
4 Eng? Agr?, D.Sci., SNLCS - EMBRAPA, kin 47, CE? 23.460- Seropédica, Ri.
especificidade hospedeira em gramíneas foi de-monstrada na rizocenose de um ecótipo de Paspa-luni notatum com Azotobacter paspali (D6berei-ner 1966). Essa associação parece mais restrita ainda que a simbiose das leguminosas, já que se limita a apenas alguns ecótipos de uma espécie (D5bereiner 1970).
Por outro lado, Azospiríllurn spp são cnsidera-das como as principais bactérias fixadoras de N2 em gramíneas forrageiras e de grãos, em clima tro-pical (Day & L%bereiner 1975; Bülow & D'óberei-ner 1975), assim como em algumas regiões de cli-ma temperado (Vlassalc & Reynders 1979; Peder-sen et al. 1978). Com as primeirâs observações de infecção de raízes por Azospirilium spp em Digi-tarja (Dôbereiner & Day 1976), milho (Bülow & Di%ereiner 1975), trigo (Nery et ai. 1977), e com Fesq. agropec. bras., Brasília, 16(3):325-330, maio/jun. 1981
326 J.I. BALDANI et ai. posterior confirmação de infecção da córtex e do
cilindro central em raízes de milho (Patriquin & Dbereiner 1978), grande enfoque tem-se dado a essa estreita interação planta-bactéria.
Motivados por esses aspectos, estudos recentes (Baldani & D'ãbereiner 1979) mostraram especifi-cidade hospedeira em milho, trigo e arroz na infec-ção das raízes por Azospirilium spp. Enquanto trigo e arroz se mostraram mais favoráveis à infec-ção por A. brasilense nir, as raízes de milho pare-cem ser preferencialmente infectadas por A. lipo-ferum. Com o objetivo de ampliar os resultados de
Baldani & Ddbereiner (1979), foi comparada a especificidade de infecção por Azospirillurn spp entre um grupo de gramíneas com via fotossintéti-ca C3, de clima temperado, e outro com via C4, de clima tropical.
MATERIAL E MÉTODOS
Foi conduzido em casa de vegetação um experimento de vasos com os cereais temperados com via fotossintética C3: aveia (Avena sativo), centeio (Secale cereale), cevada
(Hordeum vulgare) e trigo (Tdticum aestivum). O expe-rimento, composto de oito tratamentos, com quatro ce-reais, duas épocas de coletas e sete repetições, no total de 56 vasos, foi disposto em blocos completamente casuali-zados. Solo Podzólico Vermelho-Amerelo série ltaguaí bem homogeneizado, foi uniformente distribuído nos vasos. Adubação básica, constituída de 20 ppm N (CaNO3) e de 60 ppm P (K2HPO4), e elementos menores + Mg (Baldani & Dbbereiner 1979) foram apli-cados em forma de solução. As sementes dos cereais (variedades comerciais) foram esterilizadas com HgCl2 (1500) durante 30 segundos, seguindo-se sucessivas lava-gens com água, antes do plantio nos vasos.
Em condiçôes de campo foi estudada a especificida-de especificida-de infecção em um grupo especificida-de plantas com via fotos-sintética C4, composto de oito gramíneas (Brachiarla sp, Panicum inaxinium, Cynodon dactylon, Pennisetum purpureum, Hemarthria altlssl,na, Digltarla decumbens, Sorghuni vulgare e Saccharum sppj e de uma Cyperaceae
(Cypeus rotundus). Amostras de raízes e de solos pró-ximos das mesmas foram coletadas em cinco locais diferentes, onde cada uma das gramíneas utilizadas mostrava-se predominante Os solos variaram conforme o local. Foram identificados como Planossolo série Agros-tologia e série Ecologia, e como solo Podzólico Vermelho--Amarelo da série Itaguaí.
Azospirillum spp foram isolados de solos e raízes, com ou sem esterilização, em cloramina T (1%), pelo método descrito por Baldani & Dabereiner (1979). A identificação das espécies foi feita de acordo com Tarrand et ai- (1978); e a dos grupos de denitrificação, de acordo com Neyra
et aI. (1977). O tempo máximo de esterilização dependia da resistência das raízes das diferentes espécies para as quais foi determinado em ensaios preliminares.
RESULTADOS
O objetivo básico do primeiro experimento foi verificar a infecção das raízes de cereais de clima temperado por estirpes de Azospiriflum spp nativas do solo, já que os mesmos não são cultivados na área e não foram inoculados com AzospiriIlum
spp-
Observamos, na Tabela 1, que mais de 95% dos isolamentos do solo foram identificados como
A. brasilense, sendo semelhante a percentagem de formas nir+ e nir (nitrito redutase positivos e ne-gativos). A. Iipoferum apresentou-se em baixa
per-centagem apesar de os referidos cereais terem sido plantados nestes solo pela primeira vez.
Houve infecção abundante das raízes. Na maio-ria das vezes, cada pedaço de raiz produziu cultu-ras positivas. A composição da população de Azos-pirillurn spp, observada nas raízes dos cereais de clima temperado, foi como a do trigo plantado no campo (Baldani & Dibereiner 1979): 70 a 80% das estirpes isoladas foram A. brasilense nir As es-tirpes isoladas restantes foram A. lipoferum nir. Não houve, quase, ocorrência de estirpes denitrifi-cantes. O aparecimento de A. lipoferum, que não ocorreu em números aprecilveis no solo e que parece mais acentuado em raízes não esteriliza-das, indica um possível papel desta espécie tam-bém em cereais C 3 , mas não no interior das raí-zes. Observações semelhantes foram feitas com trigo e arroz (também plantas C3) (Baldani & Dbbereiner 1979). Comparando-se o efeito do tempo de esterilização de raízes na percentagem de isolados identificados como A. brasilense nif, verificamos que a esterilização mais prolongada (cinco minutos) favoreceu o isolamento de A. brasilense nir. Patriquin & Dibereiner (1978) observaram que, após tempos crescentes de esteri-liaçâo de raízes com cloramina
7',
efetuada de acor-do com a estrutura das raízes, há eliminação progres-siva da microflora até a parte inferior da córtex e o cilindro central. Isto vem reforçar ainda mais os resultados encontrados por Baldani & Dôberei-ner (1979), onde, com esterilização de raízes de Pesq. agropec. bras., Brasília, 16(3):325-330. maio/jun. 1981trigo e arroz por quinze minutos, mais de 90% dos isolados foram identificados como A. brasitense nir.
No estudo de especificidade de infecção de raí-zes de gramíneas de via fotossintética C4 por Azos-piritium spp, realizado em plantas coletadas no local onde as mesmas predominam, podemos ob-servar a predominincia de A. brasilense nos solos da região. (Tabela 2). Dos isolamentos obtidos, 60% foram identificados como A. brasilense nir; os 40% restantes foram distribuídos entre A tipo. ferum nif - maior percentagem -, e A. brasiten-se nir+. As amostras de soto utilizadas neste traba-
lho foram retiradas das proximidades das plantas, mas não da rizosfera. Amostras de solo da rizos-fera de milho crescido no campo mostraram ocor-rência predominante (84%) de A. lipoferum (lial-dani & Dibereiner 1979).
Apesar da incidência predominante de A. brasitense nir no solo, os isolamentos obtidos de raízes foram predominantemente A. tipoferurn. A discriminação em favor de A. tipoferum foi mais acentuada ainda em raízes esterilizadas. Das nave espécies com fotossíntese C4 estudadas, oito (incluindo a Gyperacea) apresentaram mais de 80% de A. tipoferum, com pouca variação em
TABELA 1. Especificidade na infecção de raízes por Azospirilium spp em gramínea C3 de clima temperado'.
Esterlllzaç5o - % de isolados
Espécies em cloramina N9de
(amostra) T isolados A. lipoferum A. brasilense
(minutos) nir4 nir n i r+ nlr-
Solo O 11 O O O 100 Aveia SoloC O 19 O O 42 58 Raízes O 9 O O O 100 Raízes 0.5 14 O 28 O 72 Raízes 5,0 5 O 20 O 80 Centeio Soloc O 8 O 13 12 75 Raízes 0 6 O 67 O 33 Raízes 0,5 22 O 18 O 82 Raízes 5,0 - - - - - Cevada Soloc o io O O 50 50 Raízes O 16 0 18 O 82 Raízes 0.5 19 O 26 5 69 Raízes 5,0 11 O 18 O 82 Trigo Solac O 10 10 O 30 60 Raízes .0 4 O 50 O 50 Raízes 0,5 15 20 O O 80. Raízes 5,0 4 O 25 O 75
a Sementes esterilizadas de variedades comerciais foram plantadas em sete vasos. Para cada espécie foram tiradas duas amostras, cada jma em épocas diferentes (28 amostras de cada cereal). Nem todos os isolamentos obtiveram sucesso; o número de estirpes realmente isoladas está contido naTabela.
b Amostras de solo retiradas do campo onde foi colhido o solo para preenchimento dos vflos. c Solo dos vasos.
328 J.I. BALDANI et ai.
TABELA 2. Especificidade na lnfecço de gramíneas com fotossíntese C4 por Azo:pfrillum spp.t
Espécie Amostra Tempo de esterilização cioramina T (minutos) N? de Isolados % de Isolados A. Ifpofe,vm A. &asilense nlr+ nlr nirt nir- Solo O 5 O O O 100 BrxhFaHa sp. Raízes O 19 53 21 O 26 Raízes 1 12 17 83 O O Solo O 10 O 0 10 90 Panicum Raízes O 12 42 25 8 25 maxímurn Raízes 0,5 5 0 100 O O Raízes 30 6 16 84 0 O Solo O 4 O 100 O O Cynodon Raízes 0 9 33 45 22 O dxty/on Raízes 0,5 7 86 14 O O Solo 0 6 O O 16 84 Pennisetj,rn Raízes O 14 71 14 7 8 purpureum Raízes 0,5 3 67 33 O O Hemarthrla Solo O 5 O 8 20 O altissima Raízes O 16 19 62 O 19 Digitada Solo O 6 O 100 O O decumbens Raízes O 2 100 O O O Solo O 5 O O O 100 Sorghurn Raízes O 8 25 O O 75 vu/gare Raízes 15 14 64 36 O O Raízes 30 5 20 80 O O Solo O 5 O O 20 80 Saccharum spp Raízes O 4 O 75 O 25 Raízes 1 24 O O O 100 Cyperus Solo O 5 O O O 100 rotundus Raízes 0,25 5 O 100 O O
a Amostras foram coletadas no campo em cinco sítios diferentes, sempre onde a espécie era predominante relação à característica de ser nir+ e nir.
Entre-tanto, com esterilização mais prolongada (30 mi-nutos), raízes de Panicurn e sorgo apresentaram 85% dos isolados como A. lipoferum nir. A espe-cificidade na infecção de raízes de plantas C4 por
A. Iipoferurn, encontrada neste trabalho, confirma e estende os resultados de Baldani & D6bereiner (1979), onde raízes de milho esterilizadas, tanto do campo como de experimento de vasos, seme-lhante ao descrito aqui, renderam quase que ex-clusivamente A. lipoferum. Um exame mais deta-
Pesq. agropec. bus., Brasília, 16(3):325-330, maio/jun. 1981
lhado dos dados de Baldani & D6bereiner (1979) revelou ainda que, em raízes de milho esteriliza-das por tempo mais prolongado (1 h) também houve predominância de formas não denitrifican-tes (nir) (Dbbereiner & De-Polli 1979).
A cana-de-açúcar apresentou-se como exceção em relação à infecção por Aospiri1Ium, uma vez que a espécie encontrada com maior freqüência foi A. brasilense nir. Contudo, há necessidade de um estudo mais detalhado desta planta, visto que a mesma não é prodominante na região.
DISCUSSÃO
Os resultados apresentados confirmam e am-pliam os dados apresentados por Baldani & Dabe-reiner (1979) e evidenciam diferenças básicas entre plantas temperadas com via fotossintética C 3 e plantas com via C4 , em relação
a
infecção porAzospiriflum spp. A cana-de-açúcar, embora seja urha típica planta C 4 , exige estudos mais apura-dos em face da exceção observada. Outros micro-organismos fliadores de N2 foram isolados de raízes de cana (D6beriner 1961; Dóbereiner etal. 1972, Ruschel 1979) e, principalsiente,
Beijerin-ckia spp , mostraram estreita interação com esta planta. Fixação de N 2 no solo da rizosfera da cana (Dibereiner etal. 1972, Ruschel etal. 1978), que não foi observada em outras gramíneas, mos-tra diferença adicional deste sisteffia solo-planta.
A infecção seletiva por A. brasilense nir de vá-rios cereais temperados, que nunca tinham sido plantados nesta região, levanta a questão da origem de bactérias específicas para tais espécies. Na ver., dade, o arroz, outra planta C 3 ,é comumente plan tado na região, mas não há histórico do plantio desta planta no local onde o solo para o experi-mento de vasos foi colhido. Em estudos de reações cruzadas com anticorpos imuno fluorescentes, as estirpes de A. brasilense nir isoladas de arroz e tri-go se mostraram idênticas, e distintas das demais (De-PoIli et aL 1979, De-Poili et al. 1980). Estas observações indicam que há uma diferença pro-nunciada na infecção de plantas C 3 em relação às plantas com via C 4 , mas entre as plantas C 3, pelo
menos, não há especificidade para a espécie. Em outras palavras, os cereais de clima temperado e o arroz parecem ser infectados pelo mesmo tipo de
Azospidilum. Os dados apresentados no presente trabalho não permitem conclusão neste sentido para as plantas com via C 4 , já que parece haver diferenças entre plantas em relação à preferência de estirpes nir e ni? (Tabela 2) e ainda há falta de um grupo homogêneo nos testes com anticor-pos imunofluorescentes (Dóbereiner & De-Polli
1979).
A ocorrência da especificidade hospedeira na infecção da gramínea por Azospirillunt spp indi-ca estreitas interrelações bactéria-planta. Possivel-mente, a preferência por uma oh outra espécie
está ligada a características fisiológicas da planta. A infecção preferencial de plantas com via fotos-sintética C 4 por A. lipoferutn pode ser ligada à dis-ponibilidade de açúcares no sítio onde a bactéria ocorre, isto é, no cilindro central e na córtex inte-rior (Dóbereiner & De-PoIli 1979), já que esta es-pécie, ao contrário de A. brasilense, utiliza gluco-se. A localização da bactéria, que no milho e em algumas outras plantas C 4 é predominantemente no cilindro central, quando a atividade da nitro-genase é elevada (Magalhãest ai. 1979), parece relacionada com a especificidade na infecção. Pouco se sabe até hoje sobre a localização de
Azo:-piriflum nas raízes de plantas C 3 . Observações preliminares com arroz (Baldani & D3bereiner, prelo) indicam eliminação da atividade da nitroge-nase por esterilização superficial das raízes.
É interessante esta obsenação as formas de
Azospiriflum não denitrificantes parecem predo-minar no processo de infecção das raízes especial-mente nos cereais temperadõs. Isto indica diferen-ças, além das características fisiológicas, no uso ou não da glucose, que deterininama especifici-dade. Testes com anticorpos imuno fluorescentes, preparados com quatro destas estirpes, confirmam diferenças dentro das duas espécies relacionadas com a característica de denitrificação (De-Polli et
ai.
1980, Iydbereiner & De-Poili 1979). A sele-ção, tanto por plantas C 3 6omo C4 de formas deAzospirilium não denitrificantes (nir), indica vantagens, no processo evolucionário, que favo-recem a planta, reforçando, assim, a característica simbiótica com vantagens mútuas, tanto da planta como da bactéria nas rizocenoses com
Azospiril-iunt spp. Em vista das possibilidades de perdas de nitratos do solo e dos fertilizantes, é muito impor-tante o conhecimento e possível alteração da ocor-rência, no solo, de formas denitrificantes de Azo:-pirillum spp.
REFERÊNCIAS
BALDAM, V.L.D. & DOBEREINER, J. l-lost plant specificity in the infection of cereais with Ázopl-nikon spp. SoilBioL Biochem. 12:433-39 1980. BALDAN!, V.L.D. & DOEEREI'NER, J. Iïost plant
speclficity in the infection of maize wheat and rice with Azorpfrillum spp. INTERNATIONAL WORK-SI-IOP ON ASSOCIATIVE N2-FIXATION, Pira-cicaba, 1979.
J.I.
UM BALDANI etal.
BULOW, J.F.W. von & DUBEREINER, J. Potential for nhtrogen fixation iii maize genotypes in Brazil. Proc. Nat. 4çad. Sci. USA., 72:2389-93, 1975. DAY, J.M. & DOBEREINER, J. Physiological aspects aí
N2 -Fixation by a Spfrillum from Digitada roots.
Soil Biol. Biochem., 8:45-50, 1975,.
DE-POLLI, H.; BOHLOOL, B.B. & DOBEREINER, J.
Immunofluorescence differentiation of Azospirilium
species belonging to different host plant specfficit groups. INTERNATIONAL WORKSHOP ON AS-SOCIATIVE N,-FIXATION, Piracicaba, 1979. DE-POLLI, It; BOl-ILOOL, B.B. & DÔBEREINER; J.
Serological differentiation of Azospfrillum species
belonging to different host plant specificity groups. Arch. Microbioh, 126:217-22, 1980.
DOBEREINER, J. Azotobabter paspali sp.n, uma
bacté-ria fixadora de nitrogênio na rizosfera de Faspalum.
-. Pe9. agropec. bras., 1:357.65, 1966.
DOBERFINER, J. Further research on Azotobacter
paspali and its variety specific occurrence in the
rhizosphere o! Paspalum Flugge. Zentralbi. Bakt.
Parasitenk 11., 124 :224-30, 1970.
DOBEREINER, J. Nitrogen fixing bacteria of the genus
Bei/erinclçia Derx in the rhizosphere aí sugar cano. Plant Soil, 14:211-7, 1961.
DOBEREINER, J. & DAY, J.M. Assóciative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen fixing sites. In: NEWTON, W.E. & NYMAN, C.J. International Symposium Na fixation. ., Washington State Univ. Press, 1976. p.5l8-38. DOBEREINER, 1.; DAY, J.M. & DART, P1. Nitrogenase
activity of sugar cano and some other tropical grasses. Plant Sou, 37:191-6, 1972.
DOBEREINER, J. & DE.POLLI, H. Diazotrophic rhizo-coenoses. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM NITROGEN FIXATION. Phytochemical Society of Europe, Univ. aí Sussex, 1979.
MAGALHÁES, F.M.M.; PATRIQUIN, D. &
D&BEREI-NER, J. Infection aí field grown maize
withAzospl-dllum spp. Rev. Brasil. Biol., 39387-96, 1979. NERY» ,M.; ABRANTES, G.T.V.; SANTOS, D. dos &
DOBERE1NER, J. Fixação de nitrogênio em trigo. Rev. Bras. CI. Solo, 1:15-20, 1977.
NEYRA, C.A.; D6BEREINER, J.; LALANDE, R. &
ICNOWLES, R. Denitrification by N 2 -fhxing
Spirl-lium lipoferum. Can, J. Microbial., 23:300-5, 1977. PATRIQUIN, D.G. & DÔBEREINER,J. Lightmicroscopy observations aí tetrazolium-reducing bacteria iii the endorhizospherc of maize and other grasses ia - Brazil. Can. 3. Microbial., 24:734-42, 1978.
PEDERSEN, W.L.; CHAKRABARTY, K.; KLUCAS, R. V. & VIDAVER, A.K. ?4itrogen fixation (Acetylene reduction) associative with roots of winter wheat and sorghum on Nebraska. Appl. Environ. Microbial., 35 :1 29-35, 1978.
RUSCHEL, A.P. Associative N -Fixation by sugarcane. In: INTERNATIONAL \JORKSHOP ON ASSO-CIATIVE NrFIXATION, Piracicaba, 1979. RUSCHEL, A.P.; VICTORIA, R.L; SALATI,E. &
HE-NIS, Y. Nitrogen fixation in sugarcane (Saccharum
of/icinarum L.). Ecol. BuIL Stockholm, 26:297-303. 1978.
TARRAND, 1.1.; KRIEG, N.R. & DOBEREINER, J. A
taxonomic study aí the Spirillum lipoferuni group
with descriptions of a new genus, Azospiriiium gen.
nov. and Azospirilium brasilense sp. nov. Can. J.
Microbial., 24:967-80, 1978.
VLASSAK, K. & REYNDERS, L. Agronomic aspects of
biological dinitrogen fixation by AzospirÜlum spp.
in temperate region. INTERNATIONAL WORKS-HOP ON ASSOCIATIVE N 2 -FIXATION, Piracicaba, 1979.
