MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS
Luzia Leiros de Sena Fernandes Ribeiro Dantas
ESTUDO IN VIVO DA TOXICIDADE E DAS ATIVIDADES
ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DO
(Z)-2-(5-CLORO-2-OXOINDOLIN-3-ILIDENO)-N-FENIL-HIDRAZINACARBOTIOAMIDA:
UM DERIVADO DE ISATINA-TIOSSEMICARBAZONA
NATAL- RN 2019
Luzia Leiros de Sena Fernandes Ribeiro Dantas
ESTUDO IN VIVO DA TOXICIDADE E DAS ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DO
(Z)-2-(5-CLORO-2-OXOINDOLIN-3-ILIDENO)-N-FENIL-HIDRAZINACARBOTIOAMIDA: UM DERIVADO DE ISATINA-TIOSSEMICARBAZONA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito necessário para obtenção do título de Doutorado.
Área de concentração: ensaios pré-clínicos e clínicos.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Telma Maria Araújo Moura Lemos
NATAL- RN 2019
Dedico esse trabalho
A minha filha, Helena, que mesmo com sua pureza e inocência de criança, me estimulou a seguir em frente e não desistir.
Ao meu marido, Marcel, que esteve ao meu lado em todos os momentos, com enorme dedicação, companheirismo e paciência.
À minha mãe, Virgínia, meu exemplo de superação e amor, que esteve presente e me ajudou sempre que precisei.
Ao meu pai, Haroldo, que sempre acreditou na minha capacidade de crescer profissionalmente e se orgulhou das minhas conquistas.
AGRADECIMENTOS
A Deus e aos amigos espirituais, por terem me guiado e me dado forças para não desanimar frente a todos os obstáculos que surgiram;
Ao meu marido, Marcel, e minha filha, Helena, pelo amor, paciência e compreensão;
Aos meus pais, Haroldo e Virgínia, e ao meu irmão, João Ricardo, por terem acreditado em mim e me apoiado em todos os momentos;
À minha orientadora, Dra. Telma Maria Araújo Moura Lemos, pelo empenho e dedicação, mesmo com tantas outras obrigações e afazeres;
Aos meus colegas e companheiros de pós-graduação do Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Clínica e Experimental (LPBCE), Aldilane, Ana Celly (in
memorian), Joquebede, Daliane, Rúsia, Shayanne, Fabíola e Marco, pela grande
colaboração, aprendizados e companhia durante essa longa caminhada;
A todos os alunos de iniciação científica que passaram pelo LPBCE e que contribuíram de alguma forma, em especial à Cida, Amina, Emanuel, Lidiane,
Annamairlla, Josi, Natália, Hárgila, Jaziel, Ingrid, Jaíne e Flávia, por tornarem
essa caminhada menos árdua e mais descontraída, com todo o carisma peculiar de cada um;
Aos docentes do programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos (PPgDITM), pelos ensinamentos durante as disciplinas;
Aos colegas e doutorandos do PPgDITM, pelos momentos compartilhados; Aos professores Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa (DFAR/UFRN),
Silvana Maria Zucolotto Langassner (DFAR/UFRN) e Elaine Cristina Gavioli
(DBF/UFRN) e à doutoranda Allanny Alves Furtado (PPgBIOQ/UFRN) pelo apoio e colaboração.
Aos funcionários do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (DACT) e do Biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS), pela atenção, suporte e infraestrutura cedida;
Aos animais utilizados nos experimentos desse estudo, pela valiosa contribuição em favor da ciência.
E finalmente, a todos os familiares, amigos e colegas que, mesmo não mencionados nesse texto, ajudaram direta ou indiretamente para a conclusão desse trabalho.
“Eu pedi forças… e Deus deu-me dificuldades para fazer-me forte. Eu pedi sabedoria… e Deus deu-me problemas para resolver. Eu pedi prosperidade… e Deus deu-me cérebro e músculos para trabalhar. Eu pedi coragem… e Deus deu-me obstáculos para superar. Eu pedi amor… e Deus deu-me pessoas com problemas para ajudar. Eu pedi favores… e Deus deu-me oportunidades. Eu não recebi nada do que pedi… mas eu recebi tudo de que precisava”.
RESUMO
O estudo não clínico é uma etapa primordial do processo de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, garantindo o uso seguro e a eficácia em humanos. Os derivados de isatina têm despertado interesse pela sua diversidade de atividades biológicas (antiviral, antibacteriana, antitumoral, anti-inflamatória, analgésica, etc.), com possibilidade de serem modelos de novos agentes terapêuticos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar, in vivo, a toxicidade e as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva do derivado de isatina-tiossemicarbazona (Z)-2-(5-cloro-2-oxoindolin-3-ilideno)-N-fenil-hidrazinacarbotioamida ou PA-Int6. Camundongos da linhagem Swiss de ambos os sexos foram utilizados para avaliar três doses deste composto, administradas por gavagem: 1,0 mg/Kg (Teste 1); 2,5 mg/Kg (Teste 2) e 5,0 mg/Kg (Teste 3). Uma avaliação prévia da atividade neural central foi feita através dos testes Campo aberto e Rotarod. Ensaios de toxicidade (aguda e subcrônica) realizados foram baseados nos protocolos da OECD (nº 423, 407 e 408). Para avaliar a atividade anti-inflamatória foram usados os modelos experimentais Edema de pata e Bolsa de ar, com os inflamógenos carragenina e zimosan respectivamente. Para a atividade antinociceptiva utilizou-se o Teste da formalina e o Teste de contorções abdominais. Não foi demonstrado comprometimento na atividade locomotora e na coordenação motora dos animais tratados com PA-Int6 (5,0 mg/Kg). Durante os ensaios de toxicidade, não houve óbitos nem alterações físicas e de comportamento. Na toxicidade aguda nenhum parâmetro hematológico apresentou diferença, enquanto que o aumento de Triglicerídeo para os machos foi a única alteração bioquímica. Na toxicidade subcrônica poucos parâmetros bioquímicos tiveram valores aumentados entre machos (Albumina e Proteínas Totais) e entre fêmeas (Triglicerídeo e Albumina). Além disso, na análise histopatológica do tecido hepático foi observada hematopoiese extramedular nos grupos Teste 2 e Teste 3, achado ausente no grupo Controle.O teste de edema de pata demonstrou que desde a primeira hora avaliada todos os grupos Testes apresentaram edema inflamatório abaixo de 50%, mas que na segunda e quarta hora tiveram respostas significativas. Na inflamação induzida pelo modelo de bolsa de ar houve diminuição tanto na migração leucocitária (55%, 50% e 47%) quanto no extravasamento de proteínas (71%, 58% e 71%) para as três doses, respectivamente. Foi observada atividade antinociceptiva para as três doses na segunda fase do Teste da formalina, com redução do tempo de dor na pata de 73,61% (Teste 1), 79,46% (Teste 2) e 73,85% (Teste 3). O número de contorções abdominais diminuiu com o aumento da dose de PA-Int-6, mas apenas com 5,0 mg/Kg ocorreu uma resposta significativa, reduzindo 24,88%. Assim, os resultados deste estudo sugerem que o PA-Int6 é seguro, pois demonstrou poucas e leves alterações, que podem ser revertidas fisiologicamente. Com atividades anti-inflamatória e antinociceptiva, este composto pode ser considerado promissor, com perspectiva de seguir no processo de pesquisa e desenvolvimento como candidato a um novo medicamento.
ABSTRACT
The non-clinical study is a primordial step of the research and development process of new drugs, ensuring the safe use and the efficacy in humans. The isatin derivatives have aroused interest for their diversity of biological activities (antiviral, antibacterial, antitumor, anti-inflammatory, analgesic, etc.), with the possibility of being models of new therapeutic agents. So, the aim of this study was to evaluate, in vivo, the toxicity and the anti-inflammatory and antinociceptive activities of the isatin-thiosemicarbazone (Z)-2-(5-chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)-N-phenyl-hydrazinecarbothioamide or PA-Int6. Swiss mice of both sexes were used to evaluate three doses of this compound, administered by gavage: 1.0 mg/Kg (Test 1); 2.5 mg/Kg (Test 2) and 5.0 mg/Kg (Test 3). A prior assessment of central neural activity was made through the Open Field and Rotarod tests. Toxicity assays (acute and subchronic) performed were based on OECD protocols (Nos. 423, 407 and 408). In order to evaluate the anti-inflammatory activity were used the carrageenan-induced paw edema model and the zymosan-carrageenan-induced air pouch model. For the antinociceptive activity, the formalin test and the acetic acid-induced abdominal writhing test were used.Impairment on locomotor activity and coordination of animals treated with PA-Int6 (5.0 mg/Kg) has not been demonstrated. During the toxicity assays, there were no deaths or physical and behavioral changes. In the acute toxicity, no hematological parameter presented any difference, whereas the increase of Triglyceride for males was the only biochemical alteration. In subchronic toxicity few biochemical parameters had increased values among males (Albumin and Total Proteins) and among females (Triglyceride and Albumin). In addition, histopathological analysis of liver tissue showed extramedullary hematopoiesis in Test 2 and Test 3 groups, which was absent in the Control group.. The paw edema test demonstrated that since the first time evaluated all test groups showed inflammatory edema below 50%, but in the second and fourth hour they had significant responses. On induced inflammation by the airbag model there was decrease both in the leukocyte migration (55%, 50% and 47%) as in the protein extravasation (71%, 58% and 71%) for the three doses, respectively. Antinomyciceptive activity was observed for the three doses in the second phase of the formalin test, with reduction of paw pain time of 73.61% (Test 1), 79.46% (Test 2) and 73.85% (Test 3 ). The number of abdominal writhes decreased with increasing dose of PA-Int-6, but only with 5.0 mg/kg there was a significant response, reducing 24.88%. Thus, the results of this study suggest that PA-Int6 is safe, because it has demonstrated few and slight alterations, which can be physiologically reversed. With anti-inflammatory and antinociceptive activities, this compound can be considered promising, with the prospect of following in the research and development process as a candidate for a new drug.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Pág. Figura 1 - Exemplos de reações que podem ser realizadas na molécula
da isatina ... 21 Figura 2 - Formação de derivados de isatinas da classe de bases de
Schiff ... 22 Figura 3 - Estrutura geral das tiossemicarbazonas ... 23 Figura 4 - Mecanismo de formação e arranjo estrutural das
tiossemicarbazonas ... 23 Figura 5 - Estrutura molecular do PA-Int6 ... 25 Figura 6 - Fluxograma da avaliação da atividade neural central do
PA-Int6 ... 32 Figura 7 - Fluxograma da avaliação da Toxicidade aguda do PA-Int6 .... 33 Figura 8 - Fluxograma da avaliação da Toxicidade subcrônica do
PA-Int6 ... 34 Figura 9 - Fluxograma do modelo de Edema de pata induzido por
carragenina para avaliar a atividade anti-inflamatória do PA-Int6 ... 37 Figura 10 - Fluxograma do modelo de Bolsa de ar induzido por
zimosan para avaliar a atividade anti-inflamatória do PA-Int6 ... 39 Figura 11 - Fluxograma do teste da formalina para avaliar a atividade
antinociceptiva do PA-Int6 ... 40 Figura 12 - Fluxograma do teste de contorções abdominais induzido
por ácido acético para avaliar a atividade antinociceptiva do PA-Int6 ... 41 Figura 13 - Efeito do PA-Int6 na atividade locomotora espontânea de
camundongos durante a avaliação da atividade neural central ... 44 Figura 14 - Efeito do PA-Int6 na coordenação motora de camundongos
Figura 15 - Efeito do PA-Int6 na variação do peso corpóreo de
camundongos durante a avaliação da toxicidade aguda ... 47 Figura 16 - Efeito do PA-Int6 no consumo de água e de ração de
camundongos durante a avaliação da toxicidade aguda ... 48 Figura 17 - Fotomicrografia (200 µm, 20x) dos achados
histopatológicos no tecido hepático de camundongos, corados por hematoxilina-eosina, durante a avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 52 Figura 18 - Fotomicrografia (200 µm, 20x) do achado histopatológico
(Congestão) no tecido renal de camundongos, corados por hematoxilina-eosina, durante a avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 53 Figura 19 - Efeito do PA-Int6 na variação do peso corpóreo de
camundongos durante a avaliação da toxicidade subcrônica ... 53 Figura 20 - Efeito do PA-Int6 no consumo de água e de ração de
camundongos durante a avaliação da toxicidade subcrônica ... 55 Figura 21 - Fotomicrografia (200 µm, 20x) dos achados
histopatológicos no tecido hepático de camundongos, corados por hematoxilina-eosina, durante a avaliação da toxicidade subcrônica do PA-Int6 ... 62 Figura 22 - Efeito do tratamento do PA-Int6 no teste de edema de pata
induzido por injeção subplantar de carragenina na pata traseira direita de camundongos ... 63 Figura 23 - Efeito do tratamento do PA-Int6 na migração leucocitária
(A) e no extravasamento de proteínas (B) durante o teste de bolsa de ar induzido por injeção subcutânea de zimosan na região dorsal de camundongos ... 65 Figura 24 - Efeito do pré-tratamento do PA-Int6 no teste de nocicepção
induzido por injeção subplantar de formalina na pata traseira direita de camundongos ... 67 Figura 25 - Efeito do pré-tratamento do PA-Int6 no teste de contorção
abdominal induzido por injeção intraperitoneal de ácido acético em camundongos ... 67
LISTA DE TABELAS
Pág. Tabela 1 - Peso corpóreo (inicial e final) e ganho ponderal (absoluto e
relativo) dos grupos controles e testes durante a avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 46 Tabela 2 - Parâmetros hematológicos dos grupos controles e testes da
avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 49 Tabela 3 - Parâmetros bioquímicos dos grupos controles e testes da
avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 50 Tabela 4 - Pesos, absoluto e relativo, dos órgãos dos grupos controles
e testes da avaliação da toxicidade aguda do PA-Int6 ... 51 Tabela 5 - Peso corpóreo (inicial e final) e ganho ponderal (absoluto e
relativo) dos grupos controles e testes durante a avaliação da toxicidade subcrônica do PA-Int6 ... 54 Tabela 6 - Parâmetros hematológicos (série vermelha) dos grupos
controles e testes da avaliação da toxicidade subcrônica do PA-Int6 ... 58 Tabela 7 - Parâmetros hematológicos (série branca com plaquetas) dos
grupos controles e testes da avaliação da toxicidade subcrônica do PA-Int6 ... 59 Tabela 8 - Parâmetros bioquímicos dos grupos controles e testes da
avaliação da toxicidade subcrônica do PA-Int6 ... 60 Tabela 9 - Pesos, absoluto e relativo, dos órgãos dos grupos controles
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C - Grau Celsius
ALT - Alanina aminotransferase ANOVA - Análise de Variância AST - Aspartato aminotransferase C2 - Carbono da posição 2
C3 - Carbono da posição 3 C5 - Carbono da posição 5 C7 - Carbono da posição 7
CCS - Centro de Ciências da Saúde
CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais
CHCM - Concentração de hemoglobina corpuscular média Cl - Cloro
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal COX - Ciclooxinagase
CT - colesterol total
DACT - Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas DBF - Departamento de Biofísica e Farmacologia
DFAR – Departamento de Farmácia dL - Decilitro
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucleico
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético FC - Grupo Fêmea Controle
Fl - Fentolitros
FT1 - Grupo Fêmea Teste 1 FT2 - Grupo Fêmea Teste 2 FT3 - Grupo Fêmea Teste 3 g - Grama
GRA - Granulócitos H - Hidrogênio h - Hora
HCl - Ácido clorídrico
HCM - Hemoglobina corpuscular média HCT - Hematócrito HGB - Hemoglobina i.p. - Intraperitoneal IV - Infravermelho Kg - Quilograma LIN – Linfócitos
LOAEL - Lowest Observed Adverse Effect Level
LPBCE - Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Clínica e Experimental LpQM - Laboratório de Planejamento e Síntese em Química Medicinal MC - Grupo Macho Controle
mg - Miligrama min. - Minutos mL - Mililitro mm - Milímetro mmol - Milimol
MON - Monócitos
MT1 - Grupo Macho Teste 1 MT2 - Grupo Macho Teste 2 MT3 - Grupo Macho Teste 3 n - número amostral
N1 - Nitrogênio da posição 1 N4 - Nitrogênio da posição 4 nº - Número
NOAEL - No Observed Adverse Effect Level NOEL - No Observed Effect Level
O - Oxigênio
OECD - Organisation for Economic Co-operation and Development P&D - Pesquisa e Desenvolvimento
PBS - Phosphate buffered saline pg - Picogramas
PLT – Plaquetas
PPgDITM - Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos
PT - Proteínas Totais R - Radical
RDR - Ribonucleosídeo difosfato redutase RDW - Red cell distribution width
RMN13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono RMN1H - Ressonância Magnética Nuclear de Prótons rpm - Rotações por minuto
S - Enxofre
SNC - Sistema Nervoso Central T1 - Grupo Teste 1
T2 - Grupo Teste 2 T3 - Grupo Teste 3 TG - Triglicerídeos
UFPE - Universidade Federal de Pernambuco
UFRN - Universidade Federal do Rio Grande do Norte VCM - Volume corpuscular médio
μL - Microlitro μm - Micrômetro
SUMÁRIO
Pág.
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 17
2.1 Pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos ... 17
2.2 Estudos não clínicos ... 18
2.3 Isatinas ... 20 2.4 Tiossemicarbazonas ... 22 2.5 Inflamação e nocicepção ... 25 3 OBJETIVOS ... 28 3.1 Objetivo geral ... 28 3.2 Objetivos específicos ... 28 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29 4.1 Obtenção do PA-Int6 ... 29 4.2 Ensaios in vivo ... 29 4.3 Análises estatísticas ... 42 5 RESULTADOS ... 43
5.1 Avaliação da atividade neural central ... 43
5.2 Ensaios de Toxicidade ... 46
5.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória ... 63
5.4 Avaliação da atividade antinociceptiva ... 66
6 DISCUSSÃO ... 68
6.1 Avaliação da segurança do PA-Int6 ... 68
6.2 Avaliação de eficácia farmacológica do PA-Int6 ... 74
7 CONCLUSÕES ... 81
REFERÊNCIAS ... 82
ANEXO A ... 98
1 INTRODUÇÃO
A busca por um novo medicamento constitui um processo longo e complexo, que está associado às inovações científicas e tecnológicas, e que inicia com a síntese de uma nova molécula, passa por etapas de testes não clínicos (in
vitro e em animais) e clínicos (em humanos) para, enfim, ser comercializado (GU,
LINEHAN, TSENG, 2015).
Os testes não clínicos são realizados para avaliar potenciais riscos ao ser humano, reduzindo a probabilidade do candidato a fármaco promissor falhar em etapas mais avançadas e onerosas (KOEHN; CARTER, 2005; DESTEFANO et al, 2018). Neste contexto, estão inseridos os ensaios toxicológicos não clínicos, que incluem estudos para avaliação da toxicidade geral de um novo composto (por dose única e repetida), além da avaliação da genotoxicidade, carcinogenicidade, imunotoxicidade e toxicidade sobre a função reprodutora ou fertilidade. Este conjunto de ensaios tem como principal objetivo avaliar a segurança por meio da caracterização dos efeitos tóxicos em órgãos-alvo, da relação dose-resposta e, quando possível, da reversibilidade de determinado efeito. Tais informações obtidas servem para averiguar a dose inicial, o intervalo terapêutico e os potenciais efeitos adversos que poderão ocorrer durante os ensaios clínicos (NUGENT; DUNCAN; COLAGIOVANNI, 2013).
Dentre as estratégias que podem levar à descoberta de novos fármacos, a identificação e o uso de estruturas privilegiadas vêm ganhando atenção particular. Essas estruturas moleculares são ligantes potentes e seletivos, bem como possuem a capacidade de interagir com diferentes alvos biológicos através da modificação de grupos funcionais. O anel indol é considerado uma estrutura biologicamente privilegiada (COSTANTINO; BARLOCCO, 2006; DESIMONE et al., 2004; LEITE et al., 2018).
As isatinas (1H-indol-2,3-diona) são compostos químicos, derivados indólicos, de síntese bastante versátil e muito utilizadas como precursores de compostos heterocíclicos (GREWAL, 2014). Apresentam um anel benzênico ligado a um anel pirrol, onde estão presentes duas carbonilas: uma cetônica e uma amídica (DA SILVA et al., 2010; ROSAS et al., 2013). Seus derivados têm demonstrado diversas atividades biológicas e farmacológicas, tais como: antiviral, antibacteriana,
antitumoral, anticonvulsivante, antioxidante, anti-inflamatória e analgésica (GREWAL, 2014; PAKRAVAN et al, 2013). Além disso, sua estrutura também está sendo relacionada à atividades como inibição da apoptose e atividade ansiolítica (MEDVEDEV et al, 2018).
Outro grupo de compostos que vem despertando a atenção de pesquisadores devido a suas propriedades químicas, biológicas e farmacológicas são os derivados de tiossemicarbazonas. Elas se originam de reações entre aldeídos ou cetonas com tiossemicarbazidas, apresentam boa versatilidade frente a diversos reagentes e são consideradas bons ligantes orgânicos (LOBANA et al., 2009). Muitas das suas atividades já foram estudadas: antiviral (TEITZ et al., 1994; GENOVA et al., 2004), antifúngica (OPLETALOVA et al., 2008), antibacteriana (KASUGA et al, 2003), antimalárica (BERALDO, 2004), antileishimania (PERVEZ et al., 2014) e larvicida (SILVA et al., 2015). Atualmente, devido à ação inibitória sobre a enzima ribonucleosídeo difosfato redutase (RDR), sua atividade antitumoral vem se destacando (TENÓRIO; GOES, 2005).
Reagindo isatinas com tiossemicarbazidas, Karah (2002) obteve tiossemicarbazonas com altos rendimentos e, desde então, muitos trabalhos vêm sendo desenvolvidos com esses derivados (ALI et al., 2014; BAL et al., 2005; KANG et al., 2011; PERVEZ et al., 2008; PERVEZ et al., 2014; PIRRUNG et al., 2005; ZHANG et al., 2015).
A causa do desenvolvimento de patologias é bastante complexa, envolvendo muitos mecanismos, e necessita de terapias cada vez mais diversificadas e eficazes. Por isso, é constante a necessidade de descoberta de novos fármacos que atuem em diversos alvos (LIM et al., 2015; SHETTY et al., 2018).
Presente na maioria das patologias, a inflamação é um processo imunológico que reage contra diversos agentes e tipos de lesões, tendo a dor como uma das características deste processo, considerada como mecanismo de proteção (SERHAN et al, 2015; GIORNO et al, 2016). As recentes terapias farmacológicas para a inflamação e dor devem atuar por vários mecanismos, visando às patologias multifatoriais (GIORNO et al, 2016; SHETTY et al, 2018). Nessa perspectiva, compostos derivados das isatinas-tiossemicarbazonas tem despertado enorme interesse na pesquisa científica, devido à sua versatilidade de obtenção e variabilidade de atividades terapêuticas.
Considerando as características potenciais dos derivados isatinas-tiossemicarbazonas, é imprescindível investigar os efeitos tóxicos e farmacológicos destes compostos. Desse modo, este trabalho teve o objetivo de realizar estudos não clínicos de toxicidade e das atividades anti-inflamatória e antinociceptiva de um derivado de isatina-tiossemicarbazona, na perspectiva de contribuir com a descoberta e o desenvolvimento de um medicamento seguro e eficaz.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos
O processo de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D) de um fármaco é complexo e envolve várias etapas, consecutivas ou não, durando cerca de doze anos. A primeira etapa consiste na descoberta ou síntese de um composto com potencial ativo e a sua correlação com um alvo biológico. Na segunda etapa, são feitos testes in vitro para avaliação das propriedades biológicas e potencial tóxico das moléculas obtidas, além de ensaios in vivo para avaliação do metabolismo, da farmacocinética e farmacodinâmica nos animais, o que é denominado estudo não clínico. Na terceira e última etapa do processo, são realizados os estudos clínicos em humanos, que compreende quatro fases. Neste contexto, estima-se que de cada 30.000 moléculas isoladas ou sintetizadas, 20.000 (66,7%) entram na fase de estudos não clínicos e apenas 200 (0,67%) entram na fase dos estudos clínicos. Porém, somente 9 (0,027%) dessas moléculas são aprovadas pelos órgãos regulatórios e 1 medicamento (0,003%) passa a ser incluído nos protocolos terapêuticos (CALIXTO; SIQUEIRA JÚNIOR, 2008; GU, LINEHAN, TSENG, 2015; GUIDO; ANDRICOPULO; OLIVA, 2010; NASCIUTTI, 2012).
Por anos, a maioria dos compostos avaliados em estudos clínicos era de origem natural ou desenvolvidos por síntese química planejada a partir deles. As plantas, fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias ainda constituem importantes fontes de substâncias naturais bioativas, apesar de serem isoladas em baixas quantidades. Além disso, apresentam alta complexidade estrutural, o que favoreceu o emprego de técnicas de modificações moleculares para introduzir mudanças nas propriedades relacionadas às fases farmacodinâmica e farmacocinética desses compostos (BARREIRO; BOLZANI, 2009; LI; VEDERAS, 2009; NEWMAN; CRAGG, 2012).
Nas últimas décadas, a busca por lucros mais rápidos por parte das indústrias farmacêuticas aliada à grande evolução da área de síntese orgânica, vem aumentando drasticamente o número e a complexidade de novos compostos sintetizados. Dentre eles podem-se incluir vários candidatos a fármacos, além de
muitos reagentes usados para explorar processos biológicos de várias formas (BROCKSOM, 2015; LI; VEDERAS, 2009; SANGI, 2016).
2.2 Estudos não clínicos
O avanço no desenvolvimento de novas moléculas e abordagens terapêuticas tornou-se um desafio para a ciência, pois também exigiu o avanço em técnicas para avaliar a eficácia e a segurança destes compostos, que devem ser definidas antes de sua comercialização. Assim, os estudos não clínicos são realizados principalmente para avaliar potenciais efeitos indesejáveis e evitar riscos para o ser humano, podendo ser agrupados nas seguintes categorias: toxicológicos e farmacológicos (CALIXTO; SIQUEIRA JÚNIOR, 2008; EMA, 2013).
Quanto ao aspecto legal, o Ministério da Saúde, através do Conselho Nacional de Saúde, estabeleceu na Resolução 1 de 15/07/1988, Decreto 93.933, de 01/1987, Capítulo II, Artigo 5, Item II, que: A pesquisa em ser humano deve estar fundamentada na pesquisa experimental prévia, realizada em animais (BRASIL, 1988). A maioria dos códigos internacionais que tratam das normas de pesquisa na área da saúde contém esses princípios.
2.2.1 Avaliação da segurança
Evidências demonstram que toda substância é potencialmente um agente tóxico, dependendo apenas das condições de exposição (dose, tempo, frequência e via de administração). Assim, é imprescindível conhecer o quão seguro é tal substância e estabelecer os possíveis riscos associados a sua exposição (MELLO; LANGELOH; MELLO, 2006; PIRES JR. et al., 2012).
Atualmente, novas áreas como a toxicogenômica e a proteômica, aliadas ao uso de ferramentas científicas como indicadores de toxicidade, vem aumentando o conhecimento sobre o mecanismo de ação de novos compostos e conduzindo a uma redução nos custos do processo de desenvolvimento de novos medicamentos. Portanto, os estudos toxicológicos não clínicos assumem um importante papel nas fases iniciais deste processo por antecipar os riscos e reduzir a probabilidade de um novo fármaco promissor falhar em etapas mais avançadas e dispendiosas, bem
como colocar em risco a saúde do ser humano (CUNNIHGAM, 2000; DORATO; BUCKLEY, 2006).
Os estudos não clínicos de segurança são realizados em uma espécie animal específica, baseando-se na literatura e normas vigentes, antes de testar o candidato a fármaco em seres humanos (CAZARIN; CORRÊA; ZAMBRONE, 2004). Além de estudos em animais, vários testes in vitro também foram desenvolvidos e validados para avaliar a segurança e descobrir o potencial toxicológico dessas substâncias. No entanto, estes ensaios são considerados complementares aos testes in
vivo (ANDRADE, et al., 2016b).
Segundo o guia elaborado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2013), os estudos não clínicos de segurança incluem, dentre outros, ensaios de toxicidade de dose única (Aguda) e de doses repetidas. A partir destes é possível a obtenção de informações sobre: os efeitos tóxicos; os parâmetros hematológicos, bioquímicos, anátomo e histopatológicos (identificação de órgãos alvos); os efeitos na fisiologia do animal; e as indicações do No Observed
Effect Level (NOEL), do No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) e do Lowest Observed Adverse Effect Level (LOAEL).
2.2.2 Avaliação da eficácia
A avaliação da atividade (eficácia) não clínica de um novo candidato a fármaco inclui ensaios in vitro e in vivo, que são essenciais para fornecer o conhecimento básico sobre a farmacodinâmica do composto, além de serem indispensáveis para introduzi-lo nos estudos clínicos. Porém, ainda durante a fase inicial do processo de desenvolvimento não clínico, conhecido como etapa de decisão Go/No-Go (continuar ou não), o composto também precisa passar por estudos farmacocinéticos, para avaliar absorção, biodisponibilidade, distribuição, metabolismo e eliminação (ANDRADE, et al., 2016a; ANDRADE, et al., 2016b).
Embora os testes em modelos animais possam gerar informações relevantes sobre a eficácia não clínica de uma substância, eles não reproduzem todos os sinais e sintomas de doenças humanas, e a prova definitiva da eficácia só pode ser confirmada após a conclusão dos ensaios clínicos de fase II. No entanto, os testes em animais são essenciais para orientar os estágios iniciais de desenvolvimento, particularmente sobre a decisão Go/No-Go (ANDRADE et al., 2016a).
Assim, este conjunto de ensaios tem como objetivo avaliar a segurança através da caracterização dos efeitos tóxicos nos órgãos-alvo (tipo, grau e modo de toxicidade), da relação dose-resposta e, quando adequado, do potencial de reversibilidade ou irreversibilidade de um determinado efeito causado. Estas informações obtidas servem para direcionar os estudos clínicos em humanos com relação a dose inicial, o intervalo terapêutico e os potenciais efeitos adversos que poderão ocorrer (DENNY; STEWART, 2017; NUGENT; DUNCAN; COLAGIOVANNI, 2013; STEVENS; BAKER, 2009).
2.3 Isatinas
Dentre as estratégias que podem levar à descoberta de novos fármacos, a identificação e o uso de estruturas privilegiadas vem ganhando atenção particular. Tais estruturas são classes de esqueletos moleculares capazes de agir como ligantes potentes e seletivos, bem como possuem propriedades versáteis de ligação capazes de interagir com diferentes alvos biológicos através da modificação de grupos funcionais (COSTANTINO; BARLOCCO, 2006; DESIMONE et al., 2004; SANGI, 2016).
No acervo da química medicinal, de 615 estruturas, 41 subestruturas foram consideradas quimicamente privilegiadas e apenas 6, incluindo o anel indol, foram consideradas biologicamente privilegiadas (LEITE et al., 2018). Alguns núcleos heterocíclicos compõem esse grupo de moléculas por estarem presentes em um grande número de produtos naturais bioativos. Assim, muitos compostos têm sido sintetizados usando sequências de reações químicas para promover maior complexidade e diversificação estrutural em torno de esqueletos moleculares privilegiados (SANGI, 2016).
A isatina (1H-indol-2,3-diona) é um derivado indólico que apresenta um anel benzênico passível de reações de substituição eletrofílica aromática nas posições C5 e C7, além de um anel pirrol contendo duas carbonilas com diferentes reatividades, uma do tipo cetona (posição C3) e outra do tipo amida (posição C2). Ainda observa-se um grupamento N–H capaz de sofrer reações de alquilação e acilação (Figura 1) (DA SILVA et al., 2010; ROSAS et al., 2013). Ela foi obtida pela primeira vez por Erdman (1840) e Laurent (1841) como um produto da oxidação do corante índigo pelos ácidos nítrico e crômico, mas também pode ser encontrada em
algumas plantas, micro-organismos, fluidos corporais e tecidos de mamíferos, assim como pode ser isolada como um derivado metabólico da adrenalina em humanos (ALI et al., 2014; GREWAL, 2014; SILVA; GARDEN; PINTO, 2001).
A versatilidade sintética da isatina tem demonstrado um ressurgimento do interesse pela química e bioatividade dos seus derivados, levando à melhoria nos procedimentos de diversas reações já conhecidas e no desenvolvimento de novas metodologias (SINGH; DESTA, 2012; VINE et al., 2009). A aplicação mais fascinante da isatina na síntese orgânica é, sem dúvida, devido à presença da carbonila cetônica em C3 (ou posição β), que é altamente reativa e extremamente suscetível ao ataque nucleofílico (BORAD et al., 2013; LEITE et al., 2018). Quando os nucleófilos são moléculas como hidrazinas, semicarbazidas, tiossemicarbazidas e aminoguanidinas, formam derivados de isatinas pertencentes à classe de bases de Schiff (Figura 2). Estes compostos, caracterizados pela presença da ligação C=N, têm sido bastante investigados na busca de novas moléculas bioativas devido à semelhança estrutural com moléculas biológicas naturais (ZOUBI, 2013).
Na literatura, vários estudos já relataram atividades biológicas e farmacológicas de derivados de isatinas, tais como: antiviral, antibacteriano, antitumoral, anticonvulsivante, antioxidante, anti-inflamatório, analgésico e outros (AKHAJA; RAVAL, 2011; BHASKAR et al., 2012; FENG, et al., 2010; GREWAL, 2014; KARALI et al., 2010; KARTHIKEYAN et al., 2010; SIDDIQUI; ALAM; STABLES, 2011).
Figura 1 - Exemplos de reações que podem ser realizadas na molécula da isatina. Fonte: Martinez e Ferreira (2017).
2.4 Tiossemicarbazonas
As tiossemicarbazonas (R1R2C=NR3) foram relatadas quimicamente pela primeira vez por Freund e Schander (1902), na Alemanha, e são definidas como compostos orgânicos nitrogenados, pertencentes à família das iminas (=C=N–), também conhecidas como base de Schiff. São bastante importantes na química devido a sua versatilidade frente a diversos reagentes, além de serem consideradas bons ligantes orgânicos, uma vez que apresentam átomos doadores de elétrons (nitrogênio e enxofre) em sua estrutura (Figura 3) (LOBANA et al., 2009).
Elas são mais comumente obtidas pela reação de condensação equimolar quimiosseletiva de tiossemicarbazidas com derivados carbonilados (aldeídos e/ou cetonas) em meio alcoólico, catalisada por ácido inorgânico forte. De uma maneira geral, o mecanismo de síntese desses compostos inicia-se com a protonação do
Figura 2 – Formação de derivados de isatinas da classe de bases de Schiff. Fonte: Adaptado de Velasques (2017).
oxigênio da carbonila para formar o intermediário íon oxônio. Em seguida ocorre um ataque nucleofílico do nitrogênio N1 da tiossemicarbazida levando à formação do intermediário hemiaminal protonado, que, por sua vez, perde uma molécula de água e, após neutralização, ocorre a formação da tiossemicarbazona (Figura 4) (LI et al., 2010; TENÓRIO; GOES, 2005).
No estado sólido, as tiossemicarbazonas são geralmente obtidas como misturas de isômeros E e Z (Figura 4). Quando estão em solução, há rearranjo da configuração Z para E devido a sua maior estabilidade termodinâmica. De uma
Figura 3 - Estrutura geral das tiossemicarbazonas. Fonte: Tenório e Góes (2005).
Figura 4 - Mecanismo de formação e arranjo estrutural das tiossemicarbazonas. Fonte: Adaptado de Tenório e Góes (2005).
forma geral, as tiossemicarbazonas derivadas de aldeídos tendem a formar preferencialmente isômeros E, enquanto que para as derivadas de cetonas assimétricas, a proporção dos isômeros irá depender dos substituintes ligados à carbonila (TENÓRIO; GOES, 2005).
Substituições nas posições N1 e N4 das tiossemicarbazonas são bastante comuns, levando a formação de diferentes análogos estruturais com propriedades físicas, químicas e farmacológicas dependentes da posição de substituição (LOBANA et al., 2010; TENÓRIO; GOES, 2005). Quando não há substituinte na posição N4, as tiossemicarbazonas apresentam estrutura quase plana, com o átomo de enxofre em posição anti (isômero E) em relação ao nitrogênio do grupo imina. Este arranjo possibilita a ocorrência de ligação de hidrogênio intramolecular entre o nitrogênio imínico e os hidrogênios da tioamida. Em contrapartida, a presença de substituintes na posição N4 favorece a conformação sin (isômero Z) entre o átomo de enxofre e o nitrogênio imínico (Figura 4) (CASAS; GARCÍA-TASENDE; SORDO, 2000).
A ação farmacológica das tiossemicarbazonas vem sendo estuda desde 1946, quando foi observado seu efeito contra a tuberculose (DOMAGK et al., 1946). Atualmente, apesar de diversas atividades já estudadas e comprovadas (citotóxica, antiviral, antifúngica, antibacteriana, antiparasitária, dentre outras), a atividade antitumoral dessas moléculas vem se destacando devido ao seu mecanismo de inibição da ribonucleosídeo difosfato redutase (RDR), enzima responsável pela manutenção da síntese e reparo do ácido desoxirribonucleico (DNA) (ALI et al., 2014; BERALDO, 2004; TENÓRIO; GOES, 2005).
2.4.1 Novo derivado de isatina-tiossemicarbazona
Em sua pesquisa, Karah (2002) reagiu derivados da isatina com tiossemicarbazidas e obteve tiossemicarbazonas com altos rendimentos. A partir daí, aumentou o interesse científico pelas propriedades químicas, biológicas e farmacológicas das tiossemicarbazonas derivadas de isatina (ALI et al., 2014; BAL et al., 2005; KANG et al., 2011; PERVEZ et al., 2008; PERVEZ et al., 2014; PIRRUNG et al., 2005; ZHANG et al., 2015).
O (Z)-2-(5-cloro-2-oxoindolin-3-ilideno)-N-fenil-hidrazinacarbotioamida é um composto intermediário que foi sintetizado, dentre outros, por Moraes Gomes (2016)
e, por este, denominado de PA-Int6. No seu trabalho, a caracterização estrutural do PA-Int6 foi realizada utilizando-se as técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (RMN1H), Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN13C) e Infravermelho (IV), confirmando a presença de um átomo de cloro no C5 da isatina e de um grupo fenil no N4 da tiossemicarbazona (Figura 5). Além disso, uma avaliação preliminar da atividade antitumoral in vitro deste composto demonstrou que ele foi capaz de reduzir a viabilidade celular de quatro linhagens celulares de câncer: duas linhagens aderentes (T-47D e HeLA) e duas linhagens em suspensão ou hematopoiéticas (HL-60/mx1 e K-562). Esta propriedade despertou o interesse em continuar com os estudos não clínicos com este composto.
2.5 Inflamação e nocicepção
Ao abordar sobre fármacos para o tratamento da dor ou inflamação, são sugeridos protocolos baseados em analgésicos, anti-inflamatórios não esteroides ou opióides. Os efeitos indesejáveis associados ao uso indevido dessas classes de medicamentos têm levado à busca e à síntese de novos agentes terapêuticos mais seguros e eficientes no controle da dor (DHINGRA et al., 2015; GIORNO et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2016; SILVA et al., 2013).
A inflamação pode ser definida como uma resposta complexa do organismo aos danos celulares e tecidos vascularizados, na tentativa de proteger o corpo para
Figura 5 - Estrutura molecular do PA-Int6. Fonte: Moraes Gomes (2016).
remover estímulos nocivos e iniciar o processo de cura. Tais estímulos podem ser de natureza química (toxinas, substâncias cáusticas), física (radiação, trauma, queimaduras) ou biológica (micro-organismos, necrose tecidual e/ou reações imunológicas) (LIMA et al., 2007; BECHARA; SZABÓ, 2006).
O processo inflamatório agudo é a resposta primária do corpo aos estímulos lesivos e está envolvido na resposta vascular e imunológica local, com duração de minutos a dias. É caracterizada por uma série de eventos inter-relacionados: aumento no fluxo sanguíneo e permeabilidade vascular na região afetada; exsudação de fluido; dor localizada; migração e acúmulo de leucócitos inflamatórios dos vasos sanguíneos para o tecido; formação de tecido de granulação e reparo tecidual (CHUNG et al., 2010; LIMA et al., 2007).
Por outro lado, o processo inflamatório crônico é uma condição patológica que está associada à presença de linfócitos e macrófagos, além da proliferação de vasos sanguíneos, fibrose e necrose tissular. Evidências crescentes sugerem o envolvimento de processos inflamatórios crônicos na patogênese de uma variedade de doenças, incluindo câncer, síndrome metabólica, e doenças vasculares (AOKI; NARUMIYA, 2012; COTRAN et al., 2016). Com isso, agentes antitumorais, por exemplo, também são muito usados para tratar doenças inflamatórias, indicando que a eliminação da inflamação pode representar uma estratégia válida na prevenção e terapia do câncer (RAYBURN; EZELL; ZHANG, 2009).
Por sua vez, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso sem levar em consideração o componente emocional, ou seja, engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os receptores específicos (nociceptores) que detectam o estímulo lesivo (físico ou químico). A dor, diferente de nocicepção, é mais que uma sensação, é uma experiência complexa e desagradável, podendo incorporar componentes sensoriais e emocionais com influências pessoais e ambientais importantes. Sendo assim, a dor envolve além de transdução de estímulos ambientais lesivos, o processamento emocional pelo cérebro. Uma vez que os animais não são capazes de expressar verbalmente os elementos subjetivos da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Portanto, termos como dor e analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e antinocicepção são mais utilizados para estudos não clínicos, envolvendo animais (BALIKI; APKARIAN, 2015; FEIN, 2011; SILVA et al., 2013).
De acordo com o local de origem do estímulo lesivo, a dor nociceptiva pode ser classificada em somática ou visceral. A dor somática normalmente é descrita como uma picada ou aperto, podendo ser superficial (pele) ou profunda (músculo, osso) e costuma ter boas respostas frente aos analgésicos. A dor visceral, por sua vez, é geralmente de difícil localização e frequentemente acompanhada por reações autonômicas, podendo ainda ser irradiada (COSTA et al., 2007).
O primeiro passo na sequencia dos eventos que originam o fenômeno sensitivo-doloroso é a transformação dos estímulos ambientais lesivos em potenciais de ação, que das fibras nervosas periféricas são transferidos para o Sistema Nervoso Central. Os nociceptores são terminações nervosas livres, não especializadas, presentes nas fibras finas Aδ e C, existindo em grande número na pele, músculos, periósteo, cápsulas de órgãos internos e paredes de vasos e órgãos ocos. As fibras Aδ são mielinizadas, de condução rápida, responsáveis pela condução da dor aguda e pelo reflexo de fuga. As fibras C são não mielinizadas, de condução lenta e responsáveis pela dor difusa e persistente. Assim, a investigação do potencial antinociceptivo de um composto pode ser avaliado pelo seu poder de aumentar o limiar de excitação dessas terminações nervosas ao estímulo doloroso, ou então, fazer com que os nociceptores não percebam ou não respondam ao estímulo doloroso promovido (FEIN, 2011; SILVA et al., 2013).
Portanto, diante do exposto, este trabalho apresenta os primeiros ensaios não clínicos de segurança in vivo do derivado de isatina-tiossemicarbazona PA-Int6, além da investigação inicial da sua eficácia anti-inflamatória e antinociceptiva em modelos experimentais, com a perspectiva de promovê-lo a um novo promissor candidato a fármaco e seguir com as etapas do processo de P&D.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a toxicidade e as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva do (Z)-2-(5-cloro-2-oxoindolin-3-ilideno)-N-fenil-hidrazinacarbotioamida ou PA-Int6 em camundongos.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar possíveis alterações comportamentais, a nível neural central, provocadas pelo tratamento do PA-Int6, por meio dos modelos experimentais Campo aberto e Rota Rod;
Avaliar a toxicidade aguda do PA-Int6 durante 14 dias do tratamento, por meio da análise sanguínea de parâmetros bioquímicos e hematológicos, além da histopatologia de órgãos específicos;
Avaliar a toxicidade subcrônica do PA-Int6 durante 30 dias de tratamento consecutivo, por meio da análise sanguínea de parâmetros bioquímicos e hematológicos, além da histopatologia de órgãos específicos;
Avaliar a atividade anti-inflamatória do PA-Int6, por meio dos modelos experimentais Edema de pata e Bolsa de ar;
Avaliar a atividade antinociceptiva do PA-Int6, por meio dos modelos experimentais Teste da formalina e Contorções abdominais.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção do PA-Int6
O derivado de isatina-tiossemicarbazona (Z)-2-(5-cloro-2-oxoindolin-3-ilideno)-N-fenil-hidrazinacarbotioamida ou PA-Int6, de fórmula molecular C15H11ClN4OS, foi fornecido pelas equipes do Laboratório de Planejamento e Síntese em Química Medicinal (LpQM) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), coordenado pela Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite, e do Laboratório de Imunomodulação e Novas Abordagens Terapêuticas da UFPE, através do Prof. Dr. Moacyr Jesus Barreto de Melo Rêgo.
O PA-Int6 foi sintetizado em balão de fundo redondo, onde se adicionou a isatina 5-cloroindolina-2,3-diona (5,486 mmols), a tiossemicabazida N-fenil-hidrazinacarbotioamida (5,486 mmols), etanol (20 mL) e HCl (7 gotas), todos obtidos comercialmente. A mistura reacional foi mantida em agitação magnética e refluxo por três horas. A reação foi acompanhada por cromatografia em camada delgada. O precipitado formado foi filtrado para obtenção do produto puro, apresentando rendimento de 79% (MORAES GOMES, 2016).
Devido à baixa solubilidade do PA-Int6, o solvente orgânico Dimetilsulfóxido (DMSO) 2% foi utilizado para preparar as doses que foram avaliadas nos ensaios deste estudo: 1,0 mg/Kg; 2,5 mg/Kg e 5,0 mg/Kg. Estas doses foram determinadas conforme os protocolos das Organisation for Economic Co-operation and
Development (OECDs) nº 423, 407 e 408 para realização os ensaios de toxicidade.
Cada solução foi preparada momentos antes da sua utilização.
4.2 Ensaios in vivo
4.2.1 Animais
Inicialmente, este estudo foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), sendo autorizado para execução através dos números de protocolos 087.008-2018 e 088.007-2018 (Ver anexos A e B).
Foram utilizados 211 camundongos Mus musculus da linhagem Swiss de ambos os sexos (sendo as fêmeas nulíparas e não grávidas). Os animais foram mantidos no biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN, sob condições controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e de temperatura (23 ± 2°C), recebendo água e ração comercial à vontade.
4.2.2 Avaliação da atividade neural central
Alguns testes, já padronizados na literatura, foram realizados no Laboratório de Farmacologia Comportamental do Departamernto de Biofísica e Farmacologia (DBF) da UFRN, coordenado pela Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli, com a finalidade de avaliar a possibilidade de ocorrer danos neurológicos após o tratamento com a maior dose do PA-Int6 (5,0 mg/Kg). Para estes testes foram utilizados 32 camundongos (16 machos e 16 fêmeas), com idade de 8 a 10 semanas (peso médio de 35g), divididos aleatoriamente em dois grupos: Controle e Teste. Uma dose única do composto foi administrada através de gavagem nos animais do grupo Teste, enquanto aqueles do grupo Controle receberam solução de DMSO 2%. Todos foram tratados com mesmo volume (0,5 mL) e utilizando a mesma via de administração.
4.2.2.1 Campo aberto
O teste de campo aberto é um dos mais utilizados em roedores para avaliar a locomoção espontânea, que é considerada a forma de movimento mais conservada do comportamento dos seres vivos, envolvendo mecanismos controlados pelo SNC (GUPTA; DANDIYA; GUPTA, 1971; FERREIRA-PINTO et al., 2018). Foi primeiramente descrito por Hall (1934) e utiliza um aparato feito de madeira, coberto de fórmica impermeável, de cor preta, de formato quadrado e contendo quatro compartimentos (campos) que medem 40cm x 40cm x 40cm cada um, permitindo que quatro animais sejam avaliados simultaneamente, quanto a atividade exploratória, distância percorrida e outros parâmetros (SILVA; BARROS; PENATTI, 2015).
Neste trabalho, cada camundongo foi colocado no centro de um dos campos e lhes foi permitido explorar livremente o novo ambiente. O tempo de imobilidade (em
minutos) e a distância percorrida (em metros) foram registrados por uma câmera de vídeo, a cada 5 minutos, durante um total de 30 minutos. Em seguida, os registros foram analisados pelo software Any-maze (Stoelting, EUA). Ao final de cada avaliação, todo compartimento foi limpo com uma solução de etanol 5%. Durante todo o teste o ambiente foi mantido em silencio, com temperatura constante (22ºC ± 1ºC) e iluminação baixa controlada. O mesmo protocolo foi seguido em três momentos de avaliação: 1 horas, 24 horas e 7 dias após o tratamento.
4.2.2.2 Rotarod
O teste de rotarod, previamente descrito por Rozas e colaboradores (1997), é um método amplamente utilizado para avaliar a coordenação motora, que se trata de um comando comportamental complexo que reflete a força muscular, o equilíbrio e a marcha padronizada (GUPTA; DANDIYA; GUPTA, 1971; FERREIRA-PINTO et al., 2018). Assim, esse teste pode detectar comprometimento neurológico (neurotoxicidade) através da falta de coordenação motora e relaxamento muscular causado por compostos desconhecidos (MATTE; FRANÇA, 2006; PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006). Para isso, o aparelho usado consiste em uma barra de 3 cm de diâmetro que gira no sentido horário em diferentes velocidades, medida em rotações por minuto (rpm). Esta barra é elevada da plataforma de apoio em 22 cm e é dividida em 5 compartimentos, permitindo que mais de um animal seja avaliado simultaneamente.
Primeiramente, cada animal passou por uma sessão de treino, ou seja, eles foram colocados na barra giratória do aparelho, com aceleração de 15 rpm, e permaneceram por 2 minutos. Em seguida, foi realizada a sessão de teste, sob as mesmas condições e tempo (15 rpm durante 2 minutos). Neste momento, foram registrados o número de quedas e o tempo de sustentação na barra (em segundos) de cada animal. As avaliações aconteceram com os mesmos animais e logo após o teste do Campo aberto, ou seja, também foram realizadas em três momentos depois do tratamento com PA-Int6: 1½ hora, 24½ horas e 7 dias.
Após os experimentos, os animais foram eutanasiados com sobredose de Tiopental (120,0 mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg, i.p.), de acordo com as Normativas do CONCEA (BRASIL, 2018) (Figura 6).
4.2.3 Ensaios de Toxicidade
Animais com idade de 6 a 8 semanas (peso médio de 30 g) foram divididos aleatoriamente da seguinte forma: grupos controles e testes (6 machos e 6 fêmeas por grupo) para a avaliação da toxicidade aguda; e grupos controles e testes (5 machos e 5 fêmeas por grupo) para a avaliação da toxidade subcrônica. O número de animais por grupo foi determinado conforme os protocolos experimentais das OECDs nº 423 e 407.
Doses das amostras foram administradas através de gavagem nos animais dos grupos testes, enquanto aqueles dos grupos controles receberam solução de DMSO 2%. Todos foram tratados com mesmo volume (0,5 mL) e utilizando a mesma via de administração.
4.2.3.1 Toxicidade aguda
Para o estudo da toxicidade aguda foi utilizada uma dose única (maior dose) do PA-Int6 (5,0 mg/Kg), conforme orientações da OECD n° 423 (2002).
Todos os camundongos (12 testes e 12 controles) foram observados cuidadosamente durante as primeiras 24 horas (pesquisa de sinais tóxicos imediatos) e diariamente durante o período de 14 dias (pesquisa de sinais tóxicos
Figura 6 - Fluxograma da avaliação da atividade neural central do PA-Int6. Fonte: Elaborado pela autora.
retardados agudos). Os sinais de toxicidade considerados foram: alterações da locomoção, frequência respiratória, piloereção, diarréia, alteração do tônus muscular, hipnose, convulsão, hiperexcitabilidade do sistema nervoso, contorções abdominais e mortes (OECD n° 423, 2002). Ao longo do período experimental, o consumo de ração e água, assim como o peso corporal dos animais, foram medidos à cada 3 dias. No final, todos os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p.) de Tiopental (30,0 a 40,0 mg/Kg) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg) e eutanasiados por exsanguinação por punção cardíaca, de acordo com as Normativas do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) (BRASIL, 2018) (Figura 7).
4.2.3.2 Toxicidade subcrônica
No estudo da toxicidade subcrônica, foram utilizadas três doses diferentes do composto e, por isso, os 40 animais foram divididos em quatro grupos distintos, de acordo com o tratamento: Controle (DMSO 2%); Teste 1 (PA-Int6 1,0 mg/Kg); Teste 2 (PA-Int6 2,5 mg/Kg); e Teste 3 (PA-Int6 5,0 mg/Kg).
Neste ensaio, os camundongos receberam tratamento específico para o grupo, por 30 dias consecutivos. Durante esse período, o consumo de ração e água, assim
Figura 7 - Fluxograma da avaliação da Toxicidade aguda do PA-Int6. Fonte: Elaborado pela autora.
como o peso corporal dos animais, foram medidos à cada 3 dias. Além disso, todos os grupos foram observados cuidadosamente quanto a mudanças no comportamento e ao surgimento de qualquer sinal de toxicidade (alterações da locomoção, frequência respiratória, piloereção, diarréia, alteração do tônus muscular, hipnose, convulsão, hiperexcitabilidade do sistema nervoso, contorções abdominais e mortes) (OECD nº 407 e 408). No final do período experimental, todos os animais foram anestesiados com Tiopental (30,0 a 40,0 mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg, i.p.) e eutanasiados por exsanguinação por punção cardíaca, de acordo com as Normativas do CONCEA (BRASIL, 2018) (Figura 8).
4.2.3.3 Avaliação hematológica
Parte do sangue coletado durante a eutanásia de cada animal foi homogeneizado com o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 1% para a análise de alguns parâmetros hematológicos. Foi utilizado o analisador hematológico automatizado ABX Micros ES60 (HORIBA Medical, Montpellier, França) para obter o número total de eritrócitos, hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), plaquetas (PLT), leucócitos total e contagem diferencial de leucócitos
Figura 8 - Fluxograma da avaliação da Toxicidade subcrônica do PA-Int6. Fonte: Elaborado pela autora.
(Linfócitos, Monócitos e Granulócitos), além dos índices hematimétricos: volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) e red cell distribution width (RDW).
4.2.3.4 Avaliação bioquímica
Alguns parâmetros bioquímicos também foram avaliados para complementar os ensaios de Toxicidade. Para isso, a outra parte do sangue colhido dos animais foi utilizada para obtenção do soro, após coagulação e centrifugação (3000 rpm/10 min.). Com as amostras, foram analisados o perfil lipídico (triglicerídeo e colesterol total), a glicemia, a função renal (creatinina e ureia) e a função hepática (aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase, albumina e proteínas totais) seguindo os métodos dos kits Labtest Diagnóstica específicos para cada analito (enzimático, colorimétrico ou cinético) e apropriados ao analisador bioquímico automatizado Labmax Plenno (Labtest Diagnóstica, Minas Gerais, Brasil).
4.2.3.5 Avaliação dos órgãos e tecidos
Após a eutanásia de cada animal, alguns orgãos (fígado, estômago, baço e rins) foram observados macroscopicamente (aspecto e coloração), cuidadosamente retirados com material cirurgico e pesados em balança analítica digital (EDUTEC, EEQ9003F-B).
Para avaliar a histopatologia desses órgãos, foram feitas lâminas histológicas de fragmentos dos mesmos, após processamento por técnicas de rotina. Inicialmente, todos os órgãos foram fixados em formol tamponado 10% por no mínimo 24 horas. Em seguida, fragmentos de cada órgão foram armazenados em cápsulas histológicas e progressivamente desidratados com banhos de 1 hora de duração em concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 90% e 100%). Feito isso, as amostras foram, primeiramente, diafanizadas com dois banhos (1 hora cada) de xilol e, depois, mergulhadas em parafina a 58-60°C, sendo incluídas nessa substância em formas de blocos. Os blocos foram, então, microtomizados para obter cortes de 5 µm de espessura dos tecidos, que foram aderidos à lâminas, previamente limpas, desengorduradas e banhadas em solução fixadora de albumina. Depois procedeu-se a remoção da parafina através da hidratação dos cortes dos
tecidos. Para isso, as lâminas permaneceram por 24 horas em estufa a 56ºC e em seguida foram submetidas a uma sequência de banhos: em xilol (10 minutos); em álcool etílico 100% (10 minutos), 90% (5 minutos), 80% (5 minutos), 70% (5 minutos); e em água (5 minutos). Para a coloração dos tecidos, as lâminas foram mergulhadas em Hematoxilina de Harris (1 minuto e meio), lavadas em água corrente (30 minutos), mergulhadas em Eosina (30 segundos), lavadas rapidamente em água (3 imersões) e desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 90% e 100%). Por fim as lâminas foram diafanizadas em xilol e montadas utilizando-se bálsamo sintético (Entellan) e lamínula.
A análise microscópica foi realizada em colaboração com a Profa. Ms. Cláudia Nunes Oliveira do Departamernto de Patologia da UFRN. Foi utilizada microscopia óptica para uma visualização panorâmica primária (20x e 100x) e uma observação detalhada (400x) e semiquantitativa dos tipos celulares e possíveis reações ou fenômenos presentes, adotando critérios específicos para cada órgão. No fígado foi avaliada presença ou ausência de apoptose, necrose, degeneração hidrópica, esteatose, colestase, proliferação ductular, fibrose, hematopoiese extramedular e corpúsculo de Mallory. Nos rins foi avaliada a presença ou ausência de congestão, resposta inflamatória, tumefação tubular, perda de polaridade, desprendimento, necrose, apoptose, tubulorrex e cilindros. No baço foi avaliada presença ou ausência de edema e infiltração leucocitária nas polpas brancas (zonas B e T) e vermelhas. No estômago foi avaliada presença ou ausência de alterações das vilosidades, fibrose, resposta inflamatória, dentre outros achados.
4.2.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória
Os modelos experimentais para avliar atividade anti-inflamatória foram desenvolvidos em colaboração com o Prof. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa do Departamernto de Farmácia (DFAR) da UFRN.
4.2.4.1 Edema de pata
Neste estudo foi utilizado o modelo de Edema de pata induzido por carragenina, adaptado de Winter, Risley e Nuss (1962). Para isso, 30 camundongos machos e/ou fêmeas com idade de 6 a 8 semanas (peso médio de 30 g) foram
randomicamente divididos em 6 grupos (n = 5 por grupo): Controle Negativo; Controle Positivo; Padrão; Teste 1; Teste 2; e Teste 3.
Inicialmente, a pata trazeira direita de cada animal foi medida pela primeira vez (medida de base) usando um paquímetro digital (Digemess - 100.174BL). Nestas patas, a inflamação foi induzida por injeção subplantar (50 μL) de lambda-carragenina 1%, exceto nos animais do grupo Controle Negativo, que receberam injeção subplantar (50 μL) de Tampão fosfato-salino ou phosphate buffered saline (PBS). Em seguida, cada grupo recebeu o respectivo tratamento (0,5 mL via gavagem): PBS 10,0 mL/Kg (Controle Negativo e Positivo); Dexametasona 2,0 mg/Kg, solubilizada em PBS (grupo Padrão); PA-Int6 1,0 mg/Kg (Teste 1); PA-Int6 2,5 mg/Kg (Teste 2); e PA-Int6 5,0 mg/Kg (Teste 3).
O volume do edema foi determinado calculando a diferença entre a medida de base e a medida da pata traseira direita em 0 minutos, 1, 2, 3 e 4 horas após os tratamentos. Os resultados foram expressos em porcentagem.
Ao final do experimento, todos os animais foram eutanasiados com sobredose de Tiopental (120,0 mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg, i.p.), de acordo com as Normativas do CONCEA (BRASIL, 2018) (Figura 9).
Figura 9 - Fluxograma do modelo de Edema de pata induzido por carragenina para avaliar
a atividade anti-inflamatória do PA-Int6.
4.2.4.2 Bolsa de ar
O teste da Bolsa de ar foi realizado de acordo com estudos anteriores (FIALHO et al., 2011; TORRES-RÊGO et al., 2016) com algumas modificações. No primeiro dia, 30 camundongos machos e/ou fêmeas com idade de 6 a 8 semanas (peso médio de 30 g) receberam 5,0 mL de ar estéril na região dorsal, por injeção subcutânea, para a formação da bolsa. Após 3 dias, a bolsa foi reforçada com mais 2,5 mL de ar estéril para manter a cavidade. Seis dias depois da primeira injeção de ar, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos (n = 5): Controle Negativo; Controle Positivo; Padrão; Teste 1; Teste 2; e Teste 3. A inflamação foi induzida por injeção subcutânea de 1,0 mL de solução de Zimosan (1,0 mg/mL) na bolsa pré-formada, exceto nos animais do grupo Controle Negativo, que receberam injeção subcutânea de PBS (1,0 mL). Em seguida, cada grupo recebeu o respectivo tratamento (0,5 mL via gavagem): PBS 10,0 mL/Kg (Controle Negativo e Positivo); Dexametasona 2,0 mg/Kg, solubilizada em PBS (grupo Padrão); PA-Int6 1,0 mg/Kg (Teste 1); PA-Int6 2,5 mg/Kg (Teste 2); e PA-Int6 5,0 mg/Kg (Teste 3). Contadas seis horas, os animais foram eutanasiados com sobredose de Tiopental (120,0 mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg, i.p.), de acordo com as Normativas do CONCEA (BRASIL, 2018). Em cada bolsa de ar foi injetado 2,0 mL de PBS e aspirado o conteúdo presente na cavidade. Os exsudatos aspirados foram centrifugados a 1500 rpm durante 10 minutos, a 4ºC.
O sedimento celular foi ressuspendido com 1,0 mL de PBS e diluído em solução de Turk (1:10 v/v). A contagem total de leucócitos foi determinada usando uma câmara de Neubauer e um microscópio Nikon ECLIPSE E200® (Minato, Tóquio, Japão), com aumento de 40x. Os resultados foram expressos como número de leucócitos por mL (FURTADO et al, 2016).
Os sobrenadantes foram separados para a determinação de proteínas totais em placas de 96 poços, na qual foram adicionadas as amostras (10 µL) e 200 µL do reagente de Bradford. A reação foi observada a 595 nm em um leitor de microplacas (BioTek, Winooski, VT, EUA) e os resultados foram expressos como µg/mL (BRADFORD, 1976) (Figura 10).
4.2.5 Avaliação da atividade antinociceptiva
4.2.5.1 Teste da formalina
O teste da formalina foi baseado na metodologia de Dubuisson e Dennis (1977), modificado posteriormente por Hunskaar e Hole (1987). Trinta camundongos machos e/ou fêmeas com idade de 6 a 8 semanas (peso médio de 30g) foram randomicamente divididos em 6 grupos (n = 5 por grupo), de acordo com o tratamento que receberam: Controle (PBS 10,0 mL/Kg); Padrão 1 (Codeína 7,5 mg/Kg); Padrão 2 (Indometacina 25,0 mg/Kg); Teste 1 (PA-Int6 1,0 mg/Kg); Teste 2 (PA-Int6 2,5 mg/Kg); e Teste 3 (PA-Int6 5,0 mg/Kg). Os fármacos usados nos grupos Padrões foram previamente solubilizados em PBS.
Inicialmente os animais foram pré-tratados com 0,5 mL da substância especificada para o Grupo, através de gavagem. Após 1 hora, foi injetada 20 μL de formalina (2,5% em salina 0,9%), por via subplantar, na pata traseira direita de cada animal. Em seguida, eles foram colocados e observados em uma caixa espelhada,
Figura 10 - Fluxograma do modelo de Bolsa de ar induzido por zimosan para avaliar a
atividade anti-inflamatória do PA-Int6.
para cronometrar o tempo (em segundos) que cada animal lambeu, sacudiu e/ou mordeu a pata (indicativo de dor). Esta resposta foi mensurada durante dois intervalos após a injeção da formalina: de 0-5 minutos (fase 1 ou dor neurogênica) e entre 15 a 30 minutos (fase 2 ou dor inflamatória). A redução percentual do tempo de dor na pata foi calculada usando a fórmula [(C-T)/C]x100, onde C é o tempo de dor na pata do grupo Controle e T é o tempo de dor na pata dos grupos de tratamento (Testes ou Padrões).
Após os experimentos, os animais foram eutanasiados com sobredose de Tiopental (120,0 mg/Kg, i.p.) associado a Lidocaína 2% (10,0 mg/Kg, i.p.), de acordo com as Normativas do CONCEA (BRASIL, 2018) (Figura 11).
4.2.5.2 Contorções abdominais
Este modelo experimental foi adaptado de Koster, Anderson e Debeer (1959). Para realiza-lo foram necessários 25 camundongos machos e/ou fêmeas com idade de 6 a 8 semanas (peso médio de 30g), randomicamente divididos em 5 grupos (n = 5 por grupo), de acordo com o tratamento que receberam: Controle (PBS 10,0 mL/Kg); Padrão (Indometacina 25,0 mg/Kg, solubilizada em PBS); Teste 1 (PA-Int-6 1,0 mg/Kg); Teste 2 (PA-Int-6 2,5 mg/Kg); e Teste 3 (PA-Int-6 5,0 mg/Kg).
Figura 11 - Fluxograma do teste da formalina para avaliar a atividade antinociceptiva do
PA-Int6.
