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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
ARIELLE JOICE FONSECA LOPES
PRODUÇÃO DE FITAS DE FOSFATO TRICÁLCIO E HIDROXIAPATITA VIA TAPE CASTING
Orientador: Prof. Dr. Wilson Acchar
NATAL – RN Junho de 2020
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ARIELLE JOICE FONSECA LOPES
PRODUÇÃO DE FITAS DE TRICÁLCIO FOSFATO E HIDROXIAPATITA VIA TAPE CASTING
Trabalho de conclusão de curso apresentado no dia 16 de 14 h de 2020 como requisito parcial necessário à conclusão do Curso de Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
NATAL – RN Junho de 2020
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ARIELLE JOICE FONSECA LOPES
PRODUÇÃO DE FITAS DE FITAS DE TRICÁLCIO FOSFATO E HIDROXIAPATITA VIA TAPE CASTING
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Prof. Dr. Wilson Acchar (presidente e orientador)
DFTE/UFRN
___________________________________________ Profa. Dra. Magna Angélica dos Santos Bezerra Sousa
___________________________________________
MSc Luana Barbosa Cruz
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pois sem ele nada sou. Ao orientador Acchar que me deu a oportunidade de fazer esse trabalho e a Luana Cruz pelas tantas vezes que me ajudou. Agradeço a minha família pelo apoio e as pessoas do laboratório que me incentivaram. Obrigada a todos que estão ao meu lado nesses momentos difíceis. Agradeço também a Sheyla, Nívea e Antônio que me ajudaram.
Agradeço a minha família, as duas irmãs que sempre me ajudaram a minha mãe. Agradeço a capes pelo incentivo a pesquisa e a todos que não citei que me ajudaram até aqui. Obrigada a todos por esses momentos difíceis ficaram ao meu lado
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RESUMO
A busca por novos materiais que melhoram a regeneração óssea vem crescendo cada vez mais, o que tem possibilitado o desenvolvimento de dispositivos com o mesmo padrão de cristalinidade do osso, permitindo a substituição, restauração e reestruturação das funções teciduais perdidas ao longo do tempo por traumas. Os fosfatos de cálcio devido à grande semelhança química e biológica com o osso humano tem sido amplamente investigado para melhoria da regeneração óssea, pois apresentam baixa resistência mecânica e são excelentes promotores de neoformação óssea. Alguns íons de carga semelhante ao cálcio podem ser incorporados aos fosfatos de cálcio para formarem associações com as apatitas biológicas. Estudos apontam o uso do manganês como melhorador da biocompatibilidade de hidroxiapatitas e fosfatos tricálcio, além de ativar propriedades magnéticas, uma vez que o elemento é segregado sob a forma de nanodomínios magnéticos. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de membranas cerâmicas de Hidroxiapatita e Tricálcio Fosfato através da técnica de Tape Casting a fim de ser utilizado como curativo em regeneração de tecido ósseo. Para o desenvolvimento destas membranas foram produzidas suspensões cerâmicas à base de polímeros para otimizar as propriedades mecânicas. Dentre esses polímeros, foi utilizado o poli (álcool vinílico) - PVA, o qual é um material sintético de boa biocompatibilidade e baixo custo. Devido a degradabilidade rápida apresentada pelo PVA, foi necessário a adição de um agente reticulante na suspensão cerâmica, uma vez que a interferência negativa na osteogênese celular reduz o tempo de interação entre o material e o osso. As suspensões obtidas foram caracterizadas através de ensaios físico-químicos, tais como análises de reologia, e as fitas submetidas a análises de difração de Raios X (DRX), grau intumescimento, ensaios morfológicos, tais como microscopia eletrônica de varredura (MEV), e ensaios in vitro, tais como bioatividade e citotoxicidade. Avaliou-se o potencial das fitas obtidas como curativo ósseo, para regeneração tecidual. Os resultados demonstraram que as suspensões produzidas apresentaram comportamento pseudoplástico, necessário para a técnica via Tape Casting. As análises de DRX permitiram observar as fases 𝛽- TCP e Hidroxiapatita. O grau de intumescimento e as análises térmicas validaram a presença do ácido cítrico como agente reticulante, pois se mostraram resistentes à água e ao aumento da temperatura do meio. As análises de biocompatibilidade confirmaram a bioatividade da membrana e não tóxico, o que é adequado ao uso em tecido ósseo.
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ABSTRACT
The search for new materials that improve bone regeneration has been growing more and more, which has enabled the development of devices with the same crystallinity pattern of bone, allowing the replacement, restoration and restructuring of lost tissue functions. Calcium phosphates due to the great chemical and biological similarity with bone tissues have been extensively investigated to improve bone regeneration, as they have low mechanical resistance and excellent promoters of new bone formation. Some ions with a calcium-like charge can be incorporated into calcium phosphates to form associations with biological apatites. Studies point to the use of manganese as an enhancer of the biocompatibility of hydroxyapatites and tricalcium phosphates, in addition to activating magnetic properties, since the element is secreted in the form of magnetic nanodomains. The objective of this work was the development of hydroxyapatite and tricalcium phosphate ceramic membranes using the Tape Casting technique to be used as a bone dressing in bone tissue regeneration. For the development of these membranes, ceramic suspensions based on polymers were produced to optimize the mechanical properties. Among these polymers, poly (vinyl alcohol) - PVA was used, which is a synthetic material with good biocompatibility. Due to the rapid degradability presented by PVA, it was necessary to add a crosslinking agent to the ceramic suspension, since the negative interference in cell osteogenesis reduces the interaction time between the material and the bone. The suspensions obtained were characterized by physical-chemical tests, such as rheology analysis, and the tapes subjected to thermal analysis (ATG and ATD), X-ray diffraction (XRD), degree of swelling, morphological tests, such as electron microscopy of scanning (SEM), and in vitro assays, such as bioactivity and cytotoxicity. The potential of the tapes obtained as a bone dressing for tissue regeneration was evaluated. The results showed that the suspensions produced showed a pseudoplastic behavior, necessary for the technique via Tape Casting. The XRD analyzes allowed to observe the phases β-TCP and Hydroxyapatite. The degree of swelling and thermal analysis validated the presence of citric acid as a crosslinking agent, as they were resistant to water and to the increase in the temperature of the medium. Biocompatibility analyzes confirmed the low bioactivity of the membrane and are non-toxic, which is suitable for use in bone tissue.
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O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo. Winston Churchill
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Escala de macro e microestrutura do tecido ósseo...15
Figura 2- Constituição do equipamento de Tape Casting...23
Figura 3- Hidroxiapatita e sua constituição arranjo da célula unitária...30
Figura 4- Equipamento utilizado na colagem de fita, destacando a mesa niveladora e o Doctor Blade ...33
Figura 5- Comportamento das fitas...38
Figura 5- Comportamento reológico das fitas...39
Figura 6- reologia...39
Figura 7- DRX dos pós utilizados...40
Figura 7- Grau de intumescimento das fitas...41
Figura 8- MEV da fita com hidroxiapatita para ensaio de bioatividade a) 0 dia, b)1 dia e c) 7 dias...42
Figura 9- MEV de fita de hidroxiapatita com adição de manganês para ensaio de bioatividade a) 0 dia, b) 1 dia, c) 7 dias...43
Figura 10- MEV de fita de TCP para ensaio de bioatividade a) 0 dia, b) 1 dia, c) 7 dias...43
Figura 11- MEV de fita de TCP com adição de manganês para ensaio de bioatividade a) 0 dia, b)1dia,c)7dias...44
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Constituição de ossos e dentes...16.
Tabela 2- Tipos comuns de fosfato de cálcio e razão (Ca/P)...27
Tabela 3- Composição das fitas...32
Tabela 4- Reagentes utilizados...32
Tabela 5- Composição do PBS...36
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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
PNCs- Proteína Não Colagenosa HA- Hidroxiapatita TCP- Trifosfato de cálcio Ca- Cálcio P- Fosfato Na+- Íon de sódio Mg2+- Íon de magnésio CO32-- Íon de carbonato K+- Íon de potássio Cl-- Íon de cloro F-- Íon de flúor C- Carbono Zn- Zinco
TGF- β- Fator de Transformação do Crescimento TNF- α- Fator de Necrose Tumoral- α
VEGF- Crescimento Vascular Endotelial PLA- Ácido Poliláctico
PMMA- Poli (metacrilato de metila) Ca(OH)2 - Hidróxido de Cálcio
H3PO4 - Ácido Fosfórico
Ca10(PO4)6(OH)2 - Fórmula da Hidroxiapatita
PO43- - Fosfato
OH- - Hidroxila
Mn- Manganês
TCP-Mn- Trifosfato de Cálcio com adição de Manganês HA-Mn- Hidroxiapatita com adição de Manganês
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Mn(NO3)2 - Nitrato de Manganês
Rpm- Rotação por minuto ºC – Graus celsius
DRX- Difração de Raios X s- Segundo
ICDD- Centro Internacional para Dados de Difração PBS- Phosphate Buffered Saline
SBF- Simulated Body Fluid pH- Potencial Hidroxiliônico mL- Milímetros
MEV- Microscopia Eletrônica de Varredura EDS- Espectroscopia por Energia Dispersiva DMEM- Eagle's Minimal Essential Medium CO2 - Gás Carbônico
O2- Gás Oxigênio
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Sumário
1.0 INTRODUÇÃO ... 14 2.0. OBJETIVOS ... 18 2.1.Objetivo Geral ... 18 2.2.Objetivos Específicos ... 18 3.0. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 19 3.1 Biomateriais ... 19 3.2 Cerâmicas ... 20 3.3 Tecido ósseo... 21 4.2 Tape casting ... 22 4.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 24 4.1 Biomateriais ... 24 4.2 Fosfatos de cálcio ... 26 4.3 Fosfato Tricálcio ... 28 4.4 Hidroxiapatita ... 29 4.5 Manganês ... 31 4.6 Tape Casting ... 31 5.0 METODOLOGIA ... 32 5.1 Materiais e Métodos ... 32 5.1.1 Reagentes. ... 325.1.2 Preparo das suspensões e colagens ... 33
5.2 Caracterização das suspensões ... 34
5.3 Ensaio reológico ... 35 5.4 Difração de Raios X (DRX) ... 35 5.5 Grau de Intumescimento ... 36 6.0 RESULTADOS E DISCURSÃO ... 38 6.1 Caracterização reológica... 38 6.2 Difração de Raios X (DRX) ... 40 6.3 Grau de Intumescimento ... 41 6.5 Ensaio de Bioatividade ... 42 6.7 Ensaio de Citotoxicidade ... 46 7.0 CONCLUSÃO ... 47
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8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 48
1.0 INTRODUÇÃO
O contingente populacional mundial vem crescendo cada dia mais, assim como a sua expectativa de vida, com isso tem-se o aumento do número de fraturas e de acidentes com a população idosa e, consequentemente, a necessidade de uma busca por melhoria na regeneração óssea, motivando, desta maneira, as pesquisas em biomateriais de reestruturação (SILVA, 2015).
O sistema musculoesquelético humano é constituído por músculos e ossos, fornecendo sustentação e movimento ao corpo. O osso é um tecido especializado presente nos animais vertebrados, que tem funções de suporte, proteção e locomoção, é um reservatório importante de minerais, com um papel ativo na regulação do equilíbrio orgânico. O tecido ósseo constituído por células ósseas (osteoblastos, osteócitos e osteoclastos) e matriz extracelular, diferenciando-se dos outros tecidos conjuntivos pelo fato dessa matriz ser mineralizada (AFONSO, 1998).
O tecido ósseo é uma unidade especializada de tecido conjuntivo constituído por uma fase mineral, formada basicamente por cristais de fosfato de cálcio, que constitui uma organizada matriz colagênica. A combinação da fase mineral e da fase orgânica confere ao tecido ósseo propriedades únicas, que o tornam muito resistente às solicitações de ordem mecânica. A mineralização da matriz fornece a este tecido uma extrema dureza, dando a ele funções de sustentação e proteção. Enquanto a matriz colagênica proporciona uma certa maleabilidade fornecendo algumas possibilidades de extensão e flexão (JUDAS, 2015). Os ossos são formados pelo tecido conjuntivo calcificado, o qual é responsável pela sustentação dos tecidos mais moles, de tal maneira que auxilia na fixação do músculo, locomoção e órgãos vitais. Na matriz extracelular do tecido ósseo são os canais de Havers e Volkmann que possibilitam a passagem dos capilares, permitindo a distribuição de nutrientes para os osteócitos localizados nas lacunas no interior do tecido formado. Lamelas circunferenciais caracterizam a formação de novos tecidos através da produção de colágeno através dos osteoblastos e da deposição do cálcio na nova matriz formada (SILVA, 2015).
Na sua composição incluem-se 33% de matriz orgânica e 67% de compostos inorgânicos. Os íons mais abundantes são cálcio e fósforo, que formam a hidroxiapatita, de fórmula Ca10(PO4)6(OH)2, tornando a matriz mineralizada. As fibras colagênicas do osso estão envolvidas
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preenchendo os espaços entre as fibrilas dando consistência ao tecido ósseo. Os compostos não colagenosos incluem um vasto conjunto de proteínas, entre as quais se encontram as glicoproteínas, sialoproteínas e fosfoproteínas. As glicoproteínas estão implicadas na transformação do tecido osteóide em osso (AFONSO, 1998).
O osso humano é constituído organicamente por colágeno, principalmente tipo I, proteoglicanas e glicoproteínas adesivas, e a formação inorgânica por íons fosfato, cálcio e, em menor quantidade, bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato. O fosfato de cálcio forma a hidroxiapatita que, associados às fibras colágenas, proporcionam a resistência e dureza características do tecido ósseo. Algumas proteínas não colágenas, típicas dos tecidos mineralizados, como a osteocalcina e a sialoproteína óssea e outras como a osteonectina/SPARC e osteopontina que têm uma distribuição mais generalizada, são liberadas do osso durante a sua desmineralização. Há, ainda, proteínas derivadas do sangue e fluidos teciduais que são concentrados no osso devido à sua afinidade com os cristais minerais, como a albumina, α-2 HS-glicoproteína e imunoglobulinas (ANDIA, CERRI, SPOLIDORIO; 2013). Também estão presentes proteínas não colágenas (PNCs) tais como osteocalcína, osteonectína, sialoproteínas, proteoglicanas, osteopontina, fibronectina e fatores de crescimento (ANSELME, 2000). As PNCs são fundamentais na diferenciação dos osteoblastos e nas atividades celulares durante a mineralização e maturação do tecido ósseo (SILVA, 2015).
A nível microscópico, os ossos são constituídos por cristais de hidroxiapatita (HA) com associação de fibras de colágeno, como é possível observar Figura 1 (STEVENS & GEORGE, 2005).
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Fonte: STEVEN; GEORGE, 2005
O fosfato de cálcio depositado entre as fibras de colágeno é formado por cristais de hidroxiapatita, o que torna a matriz mineralizada, conferindo resistência a mesma. Os cristais de apatita são cerca de 65% da massa óssea total e os compostos inorgânicos depositados nos interstícios das fibras colagenosas conferem a rigidez presente no osso (SILVA, 2015).
Os primeiros relatos de semelhança entre os fosfatos de cálcio e a matriz óssea se deram em 1926, com De Jong, através de uma difratometria de Raios X, o que possibilitou a comparação da fase mineral do osso com a HA e o TCP estequiométricos, através da razão Ca/P e a semelhança entre os cristais. Estão, também, presentes no tecido ósseo íons de Na+, Mg2+, CO32-, K+, Cl-, e F-
(GUASTALDI; APARECIDA, 2010; KAWACHI et al., 2000). Na Figura 2 está representada uma tabela com os constituintes do osso humano.
Tabela 1. Constituição de ossos e dentes
Fonte: GUASTALDI; APARECIDA, 2010; KAWACHI et al., 2000
Diversas células participam da formação do tecido ósseo, elas são divididas em quatro tipos: celulares, células osteoprogenitoras- nas quais estão incluídas as células-tronco, pré-osteoblastos e osteoblastos- envolvidos na formação da matriz óssea, osteócitos e osteoclastos- responsáveis pela reabsorção da matriz mineralizada. A relação entre os osteoclastos e osteoblastos permite estabelecer um equilíbrio na formação e degradação da matriz extracelular, para processos controlados por hormônios e citocinas (SILVA, 2015). As células osteoblástica, que realiza o processo de formação e mineralização da matriz óssea e células osteoclástica, relacionadas com a sua reabsorção (JUDAS, 2015).
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Para a ocorrência da regeneração celular, é necessária a participação de diversas células, tais como as inflamatórias, macrófagos, originárias na região mesenquimal e adjacentes ao tecido lesionado. A regeneração do tecido é composta por três etapas básicas: citocinas pró- inflamatórias, membros de super- família do fator de crescimento transformado- β (TGF- β) e fatores angiogênicos. Quando ocorre uma lesão no tecido ósseo, os macófagos e outras células inflamatórias produzem o fator de necrose tumoral- α (TNF- α), o que promove o recrutamento das células necessárias para a regeneração do tecido afetado e como consequência tem-se diferenciação das células osteogênicas em mesenquimais interleucinas, que são liberadas nas proximidades da lesão e destacadas no processo de cicatrização, possibilitando a produção do calo cartilaginoso primário e induzindo a angiogênese no local da injúria, assim como o crescimento vascular endotelial (VEGF) regido pela diferenciação dos osteoblastos e osteoclastos. Na segunda etapa da regeneração tecidual óssea, tem- se a formação de um calo cartilaginoso, o qual é mineralizado e reabsorvido pelo organismo (SILVA, 2015).
Os componentes da matriz óssea apresentam propriedades mecânicas extremamente diferentes devido a sua múltipla constituição (tanto orgânica, quanto inorgânica), a hidroxiapatita, por exemplo, é rígida e quebradiça, já a fase proteica é mais resistente. Portanto, propriedades ideais dos dois componentes devem ser combinadas para se obter rigidez e dureza na formação óssea, permitindo que o novo constituinte originado apresente uma boa resistência à fratura. Um mecanismo para se obter materiais com propriedades combinadas é a produção de membranas, uma vez que se torna possível associar as melhores propriedades dos materiais utilizados. Para a produção das membranas, diversos métodos podem ser utilizados, tais como o dip- coating, droapcasting, impressoras 3D etc. O método Tape Casting é capaz de produzir membranas de baixa espessura e grande área superficial, além de econômico e não- tóxico. Para isso, mistura-se o pó cerâmico com um solvente, além compostos orgânicos, tais como: dispersante, para que não haja a formação de flocos na fita final, ligante, plastificante e defloculante, os quais darão características diferenciais a fita, mistura-se novamente em um moinho de bolas e espera-se o período de secagem da suspensão, após a conformação através de uma lâmina niveladora denominada Doctor Blade , que controla a espessura da fita. Posteriormente a estas etapas, se obtém um filme cerâmico fino e flexível. Neste contexto, o presente trabalho tem por objetivo a obtenção de membranas cerâmicas de hidroxiapatita e tricálciofosfato pelo método de Tape Casting, com a finalidade de utilizá-las como curativos ósseos de regeneração tecidual guiada.
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2.0. OBJETIVOS
2.1.Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho é a obtenção de fitas cerâmicas flexíveis de Tricálcio Fosfato e Hidroxiapatita pelo método Tape Casting para ser utilizada como curativo ósseo para regeneração tecidual.
2.2.Objetivos Específicos
• Produzir fitas cerâmicas homogêneas e flexíveis pelo método Tape Casting; • Caracterizar o comportamento reológico das suspensões;
• Avaliar a biocompatibilidade e a viabilidade celular das fitas cerâmicas através de ensaios in vitro.
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3.0. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Biomateriais
Os materiais utilizados na restauração ou substituição de tecidos corporais e que entram em contato com fluidos presentes no organismo são denominados biomateriais. Este termo foi inicialmente definido como sendo uma estrutura não viva passível se ser utilizado como dispositivo médico, projetado para interagir e atuar com sistemas biológico. Porém, no ano de 1991, o termo foi definido como um material que tem a possibilidade de interagir com sistemas biológicos para avaliar, tratar, ou aumentar/substituir qualquer tecido, órgão ou função do organismo. Considera- se como todo material que interage com os tecidos nos quais entra em contato, mantendo a sua estrutura e as propriedades do corpo hospedeiro, sem provocar alterações no mesmo (AFONSO, 1998).
É necessário que o material apresente uma série de características, tais como ser biocompatível, não produzir resposta biológica adversa ao sistema hospedeiro, não induzir efeito sistêmico, não ser tóxico, carcinogênico, antigênico ou mutagênico para que tenha bioaplicações. Eles podem ser de origem diversas (naturais ou sintéticos) e se diferenciam por ser metálicos, cerâmicos, polímeros ou compósitos. A escolha varia de acordo com o uso e as propriedades necessárias (AFONSO, 1998).
Os biomateriais variam de acordo com suas origens, os metálicos apesar de apresentarem boa resistência no organismo, se caracterizam por uma liberação de íons que podem provocar reações no corpo hospedeiro com um processo patológico, que decorre da corrosão da liga. De maneira geral, ao se utilizar um biomaterial metálico, é necessário recobrir a sua superfície com um material cerâmico como a hidroxiapatita, por exemplo, para proteger o material contra a corrosão (MORAIS, GUIMARÃES, ELIAS; 2007). Os metais, de maneira geral, apresentam grande resistência mecânica e à fratura, além de serem bons condutores de eletricidade. Por suas propriedades são usados como fios, parafusos e implantes dentários. A esterilização ou o recobrimento da estrutura metálica por outros materiais é importante para evitar respostas adversas, mesmo que alguns metais, como a prata, não sejam facilmente oxidados. Nesse cenário, usa-se com mais frequência metais como aço inox e ligas metálicas (PIRES, BIERHALZ, MORAES 2015).
As cerâmicas são bastante utilizadas como biomateriais. Elas são resultado de uma ligação química entre elementos metálicos e não metálicos. São menos densas, porém, resistentes à
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compressão, entre suas características, estão a fragilidade, dureza e resistência ao desgaste; sendo altamente resistentes a ataques ácidos, estáveis a altas temperaturas e isolantes térmicos e elétricos. São extremamente fundamentais para a substituição de tecidos por serem, em diversos casos, bioinertes, bioativas e bioreabsorvíveis. Entre os tipos de cerâmica, pode-se destacar a alumina, a zircônia e os fosfatos de cálcio (PIRES, BIERHALZ, MORAES 2015).
Os polímeros são formados por um conjunto de moléculas menores denominadas monômeros, que se repetem formando grandes cadeias de carbono, além de hidrogênio, oxigênio. Apresentam facilidade de fabricação, baixo custo e fácil disponibilidade, podendo ser classificados como termorrígidos ou termoplásticos, além de insolúveis em água ou solventes inorgânicos (PIRES,2015). Os polímeros também estão sujeitos a fenômenos de biodegradação, o que dependem da sua composição química, dos monômeros residuais e dos aditivos aceleradores da polimerização. Os polímeros mais usados são o polietileno, o polipropileno, o poliuretano, o ácido poliláctico (PLA) e o poli (metacrilato de metilo) - PMMA (AFONSO, 1998).
O corpo é formado por diversos tecidos que tem características diferentes e são considerados compósitos. Nesse sentido, é possível unir as propriedades dos materiais metálicos, cerâmicos e polímeros para formar compósitos de acordo com as características desejadas com o objetivo de interagir com os tecidos do corpo humano. O compósito deve ser um implante biocompatível e não pode ser ferromagnético, de forma que seja absorvido e degradado no tempo correto para o tecido do hospedeiro, possuindo baixo custo e sendo sustentável (SPANIOL, 2018) 3.2 Cerâmicas
O termo “cerâmica” vem de Keramos palavra usado no grego antigo. Elas apresentam características como alta resistência à temperatura, eletricamente isolantes ou semicondutores, propriedades magnéticas, resistência a deformação, fragilidade à ruptura e grande resistência a ataques químicos. Esses materiais são constituídos por óxidos metálicos, sendo representado por sulfetos, nitratos, carbetos, entre outros (MAZZALI,2005).
As cerâmicas tradicionais são classificadas de acordo com seu uso, origem e características. As vermelhas são usadas para blocos e telhas, as brancas, para azulejos e porcelanas, e as de revestimentos englobam ladrilhos e pastilhas (MOTTA, ZANARDO, CABRAL JÚNIOR 2001). Nas cerâmicas avançadas destaca-se a zircônia, por suas propriedades termomecânicas, eletroeletrônica, quimiobiológicas e outras. Pode-se citar alto ponto de fusão, resistência a
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corrosão e baixa condutividade térmica e alta resistência mecânica como propriedades mais exigidas desses materiais. Ela possui três fases monocíclica, tetragonal e cúbica (SILVA, 2011).
As cerâmicas avançadas são utilizadas para as mais diferentes aplicações, como biomateriais, indústria eletrônica e têm se destacado para trabalhos em altas temperaturas e em meios corrosivos, pois apresentam boa resistência mecânica à temperatura ambiente e ao se elevar a temperatura e são frágeis, o que pode levar a fraturas (BRESSIANI, 1889). Vidros também podem ser considerados cerâmicas e apresentam excelente bioatividade, o que faz com que sejam utilizados para revestir substratos, pois apresentam baixo tempo de resposta quanto em conato com o organismo humano (ANDRADE, DOMINGUES, 2006).
Um tipo específico de cerâmica avançada é a que apresenta bioatividade, conhecidas como biocerâmicas, que podem substituir tecidos no corpo hospedeiro sem reações indesejáveis, entre esses, cita-se os fosfatos de cálcio, em especial o fosfato tricálcio e a hidroxiapatita. Essas cerâmicas induzem a biomineralização em contato com o plasma sanguíneo, ocorrendo a precipitação de fosfato de cálcio seguido por uma camada de hidroxiapatita. Podem ser classificadas como bioinertes, bioativas e bioreabsorvíveis. As cerâmicas bioinertes se caracterizam por manterem as propriedades físicas e mecânicas quando implantadas, as bioativas apresentam a formação de uma ligação entre o osso e sua interface, estimulando uma resposta tecidual mais ágil, enquanto as bioreabsorvíveis são participantes do processo metabólico e absorvidos pelo tecido ósseo, estabelecendo uma reparação (SPANIOL, 2018).
3.3 Tecido ósseo
Os ossos são constituintes dos seres vivos vertebrados, em que cada parte do organismo apresenta diferença de acordo com a necessidade do uso. O tecido ósseo é responsável por locomoção, sustentação, proteção dos órgãos internos e reservatório de minerais, atuando como um regulador do equilíbrio orgânico. É diferenciado dos demais órgãos do corpo por possuir uma matriz extracelular mineralizada (AFONSO, 1998). A mineralização é importante fator que afeta a sustentação e locomoção do corpo, enquanto a matriz rica em colágeno permite a maleabilidade. A matriz óssea é essencial para o processo de homeostase no sangue, promovendo uma reserva metabólica, além de manter os níveis de cálcio no sangue. Os ossos têm a capacidade de crescer e remodelar-se durante toda a vida e para que isso ocorra existem duas linhas de células: osteoblásticas e osteoclásticas. A primeira é responsável pela formação e manutenção da matriz óssea e a segunda é relacionada com a sua reabsorção. (JUDAS, 2012)
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O tecido é formado por constituintes orgânicos e inorgânicos. A constituição orgânica é composta principalmente por colágeno do tipo I e do tipo V, entre outras proteínas como proteoglicanas e glicoproteínas adesivas. Enquanto a parte inorgânica por íons de fosfato e de cálcio, que formam a hidroxiapatita, bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato, em menores quantidades. A hidroxiapatita é associada às fibras colágenas, proporcionando a resistência e dureza, características do tecido ósseo, existem várias proteínas, algumas delas são não colágenas e são liberadas durante a desmineralização, enquanto outras são derivadas dos fluidos teciduais e do sangue. As primeiras são a osteocalcina e a sialoproteína óssea e outras como a osteonectina/SPARC e osteopontina, as liberadas do sangue são concentradas no osso por causa de sua afinidade com os cristais minerais, destas podem-se citar albumina, α2HS-glicoproteína e imunoglobulinas (ANDIA, CERRI & SPOLIDORIO, 2013).
O sistema esquelético é composto por músculos e ossos (SILVA, 2015). A homeostase do sistema é importante para a remodelação óssea equilibrada, de forma que exista uma dinâmica balanceada entre a atividade dos osteoblastos- células de formação óssea- e osteoclastos- células de reabsorção óssea. Este balanço é firmemente controlado por alguns sistemas regulatórios, como o sistema imune (ANDIA, CERRI & SPOLIDORIO, 2013).
Quando ocorre uma fratura, o corpo manda um sinal para que o organismo comece um processo de reparação, por isso as células de fibroblastos são produzidas formando matriz colagenosa, dessa forma, isolam e reparam a área que foi lesionada. Em seguida os osteoclastos degradam e remodelam o tecido ósseo, formando a hidroxiapatita e ocasionando a união óssea do local. Esse fenômeno ocorre porque quando o osso sofre um impacto mecânico proporciona um estímulo elétrico que ativa as células para a remodelação do osso (SPANIOL, 2018).
4.2 Tape casting
A técnica de Tape Casting é uma das mais utilizadas na fabricação de fitas cerâmicas e consiste em um mecanismo de confecção de filmes finos, com uma grande área superficial e uma espessura relativamente pequena (entre 10 e 200 micrometros), é um método economicamente viável e apresenta baixa toxicidade, quando a água é utilizada como solvente. O processo de fabricação das fitas consiste inicialmente na preparação de uma suspensão utilizando um pó cerâmico, solvente, dispersante, ligante e plastificante. A suspensão passa por uma lâmina niveladora denominada Doctor Blade, que se move transportando o substrato, para que que a suspensão seja conformada, em seguida ocorre o processo de secagem, em que se retira o solvente, e no final tem-se uma fita cerâmica que pode ser laminada, cortada, furada e que pode ser usada para diversos fins (HOTZA,
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1997). A Figura 2 demonstra o princípio fundamental do processo de produção de fitas cerâmicas, em que se observa uma lâmina niveladora, um substrato carreador estão presentes.
Figura 2- Constituição do equipamento de Tape Casting
Autor: SPANIOL, 2018
Existem também outros métodos como o Slip Casting (colagem de barbotina) e o Roll Compaction (compactação por rolos). O primeiro se diferencia pelo fato de que a remoção do solvente envolver a ação de um capilar em um molde poroso e o segundo apresenta limitações em relação às dimensões e qualidade da fita. Todas essas fitas feitas por diferentes métodos apresentam muitas utilidades desde capacitores, eletrólitos até os usos na biotecnologia (Hotza, 1997).
Diversos fatores afetam as propriedades das suspensões cerâmicas, devido as interações físico- químicas dos componentes presentes nas suspensões cerâmicas, alguns desses fatores estão relacionados a constituição, natureza e composição dos reagentes presentes. Portanto, a suspensão deve ser ajustada para que a fita produzida apresente boa resistência mecânica, flexibilidade e homogeneidade. A formulação é imprescindível na preparação de uma fita cerâmica, esta etapa começa com as escolhas dos componentes e vai até a determinação das concentrações. Cada componente se relaciona de uma forma diferente e suas proporções são escolhidas de acordo com as propriedades desejadas. A etapa considerada mais importante é a formação de uma suspensão homogênea, com o pó cerâmico (maior de 30% em massa) para evitar elevada retração na secagem (DIAS; DE SOUZA, 2008).
A suspensão passa por uma estabilização eletrostática para a defloculação, pois existe uma dupla camada de íons adsorvidos e partículas com cargas elétricas. Essas camadas seriam uma
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superfície de partículas (camada Stern) e uma camada móvel chamada de camada difusa. Além disso, também existe a estabilização estérica, que é consequência da interação física de cadeias poliméricas de cadeias longas, com isso são adsorvidos partículas dispersas nas barbotinas que interpenetram as cadeias poliméricas ordenando-as paralelamente e mantendo-as isoladas. Ressalta-se que a estabilização eletroestérica é a combinação dos dois primeiros. Essas estabilizações são essenciais para o entendimento da formação de grãos, dos processos que ocorrem com a suspensão e o resultado na fita cerâmica final. (AMADIO et al., 2008).
4.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Biomateriais
O termo biomateriais é utilizado desde a pré-história, pois há 2000 a.C. os egípcios usavam saturas de linha e ouro, enquanto que há 600 a.C. os Maias utilizavam dentes artificiais oriundos de conchas. Aos longos dos anos procurava-se encontrar materiais biocompatíveis, bioativos e biodegradáveis. Esses materiais representaram USS 44 bilhões em 2012 e possuem um mercado crescente (PIRES, BIERHALZ, MORAES; 2015) e com isso, melhorando a qualidade de vida da população.
Esse termo pode definir todos os materiais que entram em contato com o sistema biológico, o que também inclui fluidos biológicos. Como exemplos desses mais variados materiais têm-se os implantes, dispositivos biomédicos, órgãos artificiais (PIRES, BIERHALZ, MORAES; 2015). É importante destacar que os biomateriais podem também ser de origens naturais ou podem ser sintetizados de formas artificiais.
Os tecidos do corpo humano são compostos por compósitos e é fundamental conhecer as interações do corpo com o material, se esse possui corrosão e degradação. As interações podem ser reunidas em tóxica, não- tóxica (muitas vezes chamada de bioinerte), bioativa e biodegradável. Na classificação de bioativo e biodegradável encontram-se os materiais que auxiliam na regeneração dos tecidos no qual os biomateriais possam ser incorporados e absorvidos, fazendo com que ao longo do tempo o tecido passe a substituir o implante, possuindo também propriedades mecânicas semelhantes (PEREIRA; VASCONCELOS ; ORÉFICE, 1999).
A combinação de compostos orgânicos e inorgânicos em níveis manométricos e moleculares com híbridos possibilita a criação de compósitos que se assemelham aos tecidos vivos com propriedades controladas. Como o caso do tecido ósseo em que os compostos orgânicos e
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inorgânicos interagem entre si em diminuta escala, formando nanofases. Dessa forma tem-se a criação de estruturas de nanocompósitos de polímero-cerâmica que se assemelham ao tecido humano (PEREIRA; VASCONCELOS ; ORÉFICE, 1999).
Os biomateriais podem ser classificados bioinertes (não provocam reação e ligam-se ao tecido receptor), biotoleraveis (aceitos pelo tecido receptor e são envolvidos por cápsulas fibrosas), bioativos (formam pontes fixas com o osso envolvente e tem ligação direta, usualmente usam-se íons com cálcio e fósforo) e os reabsorvíveis (lentamente degradáveis e substituem o tecido). Outra classificação é por metais e ligas metálicas, cerâmicos, polímeros, compósitos (GUTIERRES, 2005).
Os metais são classificados por uma boa rigidez, mas possuem alto nível de toxicidade, que pode causar reações inflamatórias e metaloses. São utilizadas normalmente o aço inox, ligas de cobre cobalto e implantes metálicos de titânio. As cerâmicas costumam ser mais estáveis e não reativos, tendo como características frágeis, duras e são boas isolantes (AFONSO, 1998).
As cerâmicas podem ser classificadas em 3 grupos, o primeiro são materiais cerâmicos oxidados (estáveis e inertes) como exemplo encontram-se a alumina, zircônia e magnésio. O segundo grupo são as formadas por materiais como o fosfato de cálcio, que apresentam grande biocompatibilidade e se assemelha ao osso humano, nesse grupo são formadas as apatitas e os compostos como os fosfatos de cálcio. Enquanto isso, no terceiro grupo encontram-se os vidros cerâmicos, esses também apresentam uma grande biocompatibilidade podendo se aderir ao osso, no entanto possui limitações na resistência mecânica (AFONSO, 1998).
Os polímeros são extensas cadeias com ligações repetidas, cada elemento da cadeia se denomina monômeros. Podemos citar o PLA e o PMMA utilizados em implantes, mas em alguns casos são observadas respostas patológicas e podem se biodegradar, fazendo com que seja substituído ao longo do tempo pelo tecido humano. Enquanto os compósitos misturam diversos materiais para possuírem propriedades diferentes, aumentando suas propriedades mecânicas e físico-química, como um exemplo tem-se do tecido ósseo formado por minerais e compostos orgânicos (AFONSO, 1998). As funções dos constituintes das suspensões são descritas abaixo:
• Pós cerâmicos: Os pós cerâmicos são os principais constituintes para a confecção de filmes cerâmicos pelo método Tape Casting, pois participam na produção das propriedades desejadas, como seu tamanho e forma.. Os pós cerâmicos devem apresentar aproximadamente 30% da massa da suspensão para evitar a contração
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durante a secagem do filme cerâmico. Também é preferível um pequeno tamanho de suas partículas gerando alta área superficial. Entre os pós cerâmicos podem-se citar os fosfatos de cálcio alumina, zircônia entre outros (SPANIOL, 2018). • Solventes: Na confecção de fitas cerâmicas torna-se necessário a dissolução do pó
cerâmico criando dessa forma uma barbotina homogênea, em que se tem a evaporação durante o processo de secagem. Existem diversos tipos de solventes, classificando: em orgânicos e de bases aquosas. A grande diferença é que os solventes orgânicos apresentam riscos à saúde e ao ecossistema, enquanto os solventes de base aquosa são mais ecologicamente corretos. Outro fator importante é que os solventes orgânicos possuem mais facilmente suas propriedades desejadas nas fitas cerâmicas. Já os solventes aquosos têm uma tolerância menor em relação a secagem (HOTZA, 1992).
• Dispersantes: Os dispersantes têm a função de evitar a formação de flocos nas fitas cerâmicas e fazer com que o pó cerâmico se espalhe e forme uma solução homogênea, para isso ele separa as partículas primárias e como consequência mantém a viscosidade depois da adição do ligante, fazendo uma secagem rápida evitando grande retração (SPANIOL, 2018).
• Ligantes: Os ligantes conferem às fitas verdes mais resistência, são adicionados no solvente sobre emulsão, normalmente constituída por polímeros de cadeia longa de carbono, conferindo uma melhor homogeneidade da suspensão cerâmica, melhorando a flexibilidade da fita (SPANIOL, 2018).
• Plastificantes: Os plastificantes dissolvem o ligante, causando dessa forma a flexibilidade do filme cerâmico, dessa forma modifica as propriedades mecânicas (SPANIOL, 2018).
4.2 Fosfatos de cálcio
Os fosfatos de cálcio são objetivo de estudo de pesquisas em biomateriais por apresentarem propriedades físico-químicas, mecânica e biológica semelhantes ao tecido ósseo humano. Os materiais estudados se caracterizam por apresentarem função de substituição, restauração ou reparação dos tecidos danficados, dentre eles estão a hidroxiapatita, o tricálcio fosfato, fosfato de
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cálcio amorfo, fosfato de octacálcio. A razão entre cálcio e fosforo (Ca/P) é utilizada para classificar a constituição do material, ajudando a determinar sua fase e solubilidade. Além da razão (Ca/P) para caracterizar os fosfatos de cálcio tem-se a interação com o meio dependendo também de pH e temperatura, de modo que quanto maior a relação Ca/P menor a solubilidade (GUASTALDI, APARECIDA, 2010).
As cerâmicas de fosfato de cálcio tiveram os primeiros estudos datados no final da década de 1960, com a finalidade de melhoramento dos implantes metálicos utilizados na ortopedia. Esses materiais apresentam a capacidade de infiltração no tecido ósseo, estimulando a formação e crescimento de novas células ósseas. São materiais que apresentam semelhança com a fase mineral de ossos, dentes e tecidos calcificados, em que se caracterizam por excelente biocompatibilidade; bioatividade; ausência de toxicidade; taxas de degradação variáveis; osteocondutividade- indicando o caminho para o crescimento ósseo, fazendo que ocorra sobre a superfície ou através dos poros (GUASTALDI, APARECIDA, 2010). Os biomateriais são constituídos de sais de ácido fosfórico ou ortofosfórico e podem ser sintetizados por precipitação a partir das soluções de Ca2+ e PO43- , em condições ácidas e básicas (SPANIOL, 2018), como pode ser observado na Tabela 2:
Tabela 2. Tipos comuns de fosfato de cálcio de acordo com sua razão (Ca/P) e fórmula química
Autor: Costa, 2009
A hidroxiapatita possui uma estrutura semelhante ao osso e dente, por isso pode atuar como seu substituto ideal (PÍRES, et al, 2010). Representa 5% do peso total de um indivíduo adulto, com 55% da composição de ossos, 96% da composição do esmalte dentário e 70% da dentina (GUASTALDI, 2010). É a fase dos fosfatos de cálcio menos solúvel e mais estável, além de ser um material biocompatível, bioativo e atóxico, capaz de estabelecer interação química com o
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tecido ósseo. Tem-se dois tipos de hidroxiapatita: de origem natural ou sintética, esta difere da biológica, já que no tecido ósseo apresenta substituição iônica maior e cristalinidade menor, visto que o material é usado em revestimento de próteses e implantes, permitindo a liberação gradual do composto e por isso tem importante papel na engenharia de biomateriais (PÍRES, et al, 2010). Esse composto é capaz de realizar substituição de aniônicas e catiônicas, dessa forma pode incorporar outros elementos em sua estrutura (GUASTALDI, 2010).
O tricálcio fosfato possui quatro formas alotrópicas, as fases α e β possuem a mesma osteocondução, que é a indução da formação do tecido ósseo, mas a fase β apresenta maior bioatividade, pois ocorre uma maior quantidade de íons cálcio e fosfato trocados no meio biológico e fazem a precipitação dos fosfatos de cálcio (GUASTALDI, 2010). O TCP é uma cerâmica biodegradável, biocompatível e reabsorvível de 6 a 15 semanas dependendo da porosidade, estrutura química e tamanha da partícula. A fase de β-TCP é a que apresenta maior interesse na engenharia de biomateriais por ter estabilidade química, resistência mecânica e taxa de bioabsorção mais adequada (SPANIOL 2018).
A junção do TCP e da HA tem sido estudada na engenharia de biomateriais, podendo determinar a velocidade a reabsorção da HA de acordo com a concentração do TCP, que é um material que apresenta alta biodegradabilidade, esses materiais são utilizados na ortopedia e odontologia como material de preenchimento de cavidades e defeitos ósseos e fixação de tecidos moles (GUASTALDI, 2010).
4.3 Fosfato Tricálcio
O TCP é um composto produzido a partir de hidróxido de cálcio (Ca (OH)2) e de ácido
fosfórico (H3PO4). Ele possui várias fases, entre elas, α- TCP e β- TCP. Destas, a primeira é mais
bioativa devido ao seu arranjo estrutural e a segunda é a que possui maior estabilidade, resistência mecânica e taxa de absorção, possuindo estrutura rombométrica. (SPANIOL, 2018). O TCP possui a razão de Ca/P de 1,5, é estável em soluções aquosas e, em caso de implantes, costuma a ser absorvido em um período de 3 a 15 semanas. Além disso, possui osteocondutividade em ambas as fases (PIRES, BIERHALZ, MORAES, 2013).
O TCP é uma cerâmica bastante utilizada na área de biomateriais por ser bioativa e hidrofílica. Suas aplicações são diversas, entre elas, destaca-se o seu uso na substituição óssea, por suas propriedades de osteoindução, osteocondução, biocompatibilidade, bioabsorção (SANTOS,
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2015). Tendo por base essas propriedades, Santos (2015) o utilizou para realização de cirurgias de reconstrução no joelho, em que o TCP funcionava como “parafuso de interferência”.
Yuan et al. (2001), Santos (2002) e Yamada et al. (2006) destacam outras características do TCP e de outros fosfatos que tornam sua utilização vantajosa para o preenchimento ósseo, tais como a mínima cavidade de preenchimento, a preparação realizada durante o ato cirúrgico, a fácil manipulação, o ótimo contato entre osso e implante, a biocompatibilidade, osteocondutividade e bioatividade, agregado à biodegradabilidade ativa próprio do grânulo β- TCP. Como outros fosfatos, o TCP possui baixa resistência ao impacto e baixa força tênsil. Além de não ter capacidade de induzir a citodiferenciação de osteoblastos. Porém, o TCP possui uma capacidade de cicatrização óssea satisfatória, preenchendo defeitos, orientando novas células a promoverem a neoformação do tecido ósseo. A osteocondução é caracterizada pela produção e regeneração do osso por meio da ligação de células osteocomponentes por meio do condutor, obtendo a reativação dos processos que ocorrem na embriogênese o que é visto no trabalho de Mottin (2009) que estudou o uso do TCP com titânio associados a implantes.
4.4 Hidroxiapatita
A hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) possui razão Ca/P de 1,67 e é utilizada em biomateriais
devido a adsorção de proteínas e de seu potencial osteocondutivo. Ela apresenta também uma rápida adaptação óssea, não formação de tecido fibroso, reduzido tempo de cicatrização e íntima adesão implante/tecido. Em média ela se degrada em questões de anos, estudos apontam que a degradação completa ocorre entre 4 e 5 anos, e em pH neutros é praticamente insolúvel (PIRES, BIERHALZ, MORAES, 2013).
Ela pode ser adquirida a partir de reações de síntese em que se utilizam o carbonato de cálcio e o ácido fosfórico, o que produz o pó cerâmico com fracas ligações, denominado nessa fase de amostras verdes usadas posteriormente para sua sintetização da fita cerâmica (ROSA, SHAREEF, VAN NOORT, 2000). Um dos motivos para sua utilização como substituto ósseo é o fato de que ele representa de 30 a 70% em massa de dentes e ossos, tendo uma estrutura bastante similar. Possuindo biocompatibilidade e osteocondução. Além disso ele é o fosfato de cálcio mais estável e menos solúvel, possuindo uma célula unitária hexagonal (DE MELO COSTA, 2009).
A estrutura da hidroxiapatita pode ser substituída por outros íons (sejam eles cátions ou ânions) alterando dessa forma sua cristalinidade, seus parâmetros de rede, suas dimensões dos cristais, a textura superficial, a estabilidade e a solubilidade da estrutura da hidroxiapatita (DE
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MELO COSTA, 2009). A figura 2 mostra a estrutura cristalina da hidroxiapatita com as suas ligações , em que destaca-se o potássio e o cálcio.
Figura 3- hidroxiapatita e sua constituição arranjo da célula unitária
Fonte: Costa, 2009
A célula unitária da HA é composta 10 átomos de cálcio, 6 tetraedros com 2 grupos de OH -todos organizados em estrutura hexagonal. É possível observar que existe na hidroxiapatita um grupo de tetraedros (PO4 3-) com dois átomos de oxigênio no plano basal e outros dois alinhados com o eixo cristalográfico c. Os tetraedros do grupo (PO43-) estão distribuídos de tal maneira que dão origem a dois tipos de canais, compostos por paredes de ânions de O, perpendiculares ao plano basal. O primeiro canal é ocupado por íons de Ca2+ (cálcio 1), que estão localizados a 0 e ½ do parâmetro cristalino. O segundo canal é ocupado por íons de Ca2+ (cálcio 2), localizados a ¼ e ¾ do parâmetro cristalino. Os íons de cálcio e de fosfato podem ser substituídos por outros íons, no caso do cálcio é mais comum por metais do grupo II A ou com cargas 2+, enquanto os fosfatos podem ser substituídos por carbonatos e os grupos hidroxila por flúor ou cloro. Todas essas substituições trazem modificações nas suas propriedades como: a cristalinidade, os parâmetros de rede, as dimensões cristalográficas, a estabilidade, a bioatividade, a biocompatibilidade, a solubilidade e as propriedades de adsorção da estrutura da hidroxiapatita (FERREIRAI et al., 2017).
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4.5 Manganês
O manganês é um elemento químico fundamental ao corpo humano e seu metabolismo, a carência dele pode contribuir para obtenção de doenças como a osteoporose entre outras. O óxido de manganês em estudos realizados com o B-TCP observou-se uma maior estabilização e maior resistência mecânica e diminuição da porosidade das amostras. (RAMALHO, 2006). Além disso, o manganês também possui propriedades nano magnéticas quando adicionado a hidroxiapatita, diferentes de outros materiais com propriedades magnéticas esses compostos possuem carência de toxicidade. Eles podem ser empregados em tratamentos de hipertermia, ressonância nuclear magnética, controle de medicamentos / genes e regeneração de tecidos (OLIVEIRA et al.,2020),
A hidroxiapatita é muito utilizada na engenharia de biomateriais para substituição e regeneração óssea, a adição de cátions bivalentes e trivalentes incorporadas a sua rede modifica propriedades como biocompatibilidade e aumenta sua instabilidade térmica (MOREIRA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2020).
O manganês é um mediador da adesão de osteoblastos e aumenta consideravelmente a proliferação e diferenciação in vitro. A associação do manganês a hidroxiapatita está relacionada a proteínas de adesão da parede celular que mediam as interações celulares com ligantes extracelulares. A afinidade do ligante aumenta a adesão celular promovida, promovendo a ativação do metabolismo de produção do tecido ósseo, a substituição do cálcio pelo manganês favorece a uma contração da célula unitária, pois induz uma rotação no átomo de fosforo adjacente por causa do Manganês ser menor que o Cálcio (MOREIRA et al., 2011).
4.6 Tape Casting
A técnica de Tape Casting é um método de produção de filmes finos utilizado na produção de fitas de baixa espessura as quais são de grande interesse em diversos ramos da indústria devido a apresentarem grande área superficial, com a espessura na ordem de 1 a 1000μm (MYUNG et al., 2014). Para a produção de uma fita cerâmica, utiliza-se na composição da suspensão pós cerâmicos, solvente, ligante, plastificante entre outros aditivos, tais como espumante, surfactante e dispersante (HOTZA, 1997). Entre os anos de 1950 e 1970, o Tape Casting utilizou como solventes materiais orgânicos para promover a dissolução da fase sólida, fazendo com que a evaporação fosse mais rápida e problemas como a oxidação fosse minimizada. Atualmente, a maioria das suspensões produzidas são de base aquosa, visto que é um solvente atóxico, essa substituição gerou grandes vantagens sob o aspecto de ambiental, principalmente, por reduzir a
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toxicidade da produção das fitas, o que torna o processo menos danoso a quem o utiliza, além de diminuir os custos de produção (CRUZ, 2017).
Este método de produção vem se destacando para aplicações biomédicas devido a versatilidade de utilizações, destacam- se o uso de zircônia, alumina, hidroxiapatita e tricálcio fosfato (SPANIOL, 2018).
5.0 METODOLOGIA
5.1 Materiais e Métodos
5.1.1 Reagentes.
Os reagentes utilizados no preparo das suspensões cerâmicas e suas respectivas funções são descritos na tabela 3.
Tabela 3- Reagentes utilizados
Fonte: Adaptado de Spaniol, 2018
Os materiais usados para a confecção das fitas cerâmicas, foram listados na tabela 3. Foram produzidas quatro fitas: TCP, TCP-Mn, HA e HA-Mn, que foram, respectivamente, produzidas com o pó cerâmico de TCP, o pó de TCP com adição de manganês, pó cerâmico de hidroxiapatita e hidroxiapatita com adição de manganês.
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Fonte: Próprio autor
A tabela 4 caracteriza a função de cada reagente usado na fabricação de fitas cerâmicas, assim como os seus fabricantes. Nela, observa-se que na composição das fitas foram utilizados pós cerâmicos de tricálcio fosfato, hidroxiapatita, manganês, bem como o dispersante triton, auxiliando a não formação de flocos. Os solventes utilizados foram a água e o álcool etílico, que são evaporados após a colagem da fita. Como ligante foi usado o PVA, como plastificante o álcool isopropílico e como surfactante a Cocoamida, como antiespumante o Antifoam e como agente reticulante o ácido cítrico.
5.1.2 Preparo das suspensões e colagens
O método Tape casting foi utilizado para a produção de uma fita cerâmica, seguindo esse método é dividida em duas fases. Na primeira fase, adiciona-se o pó cerâmico, o dispersante e o solvente em uma balança com um recipiente. O uso do dispersante nessa etapa garante com que o pó cerâmico se espalhe completamente no solvente. Em seguida, o recipiente segue para um moinho de bolas a 250 rpm por 24 horas para homogeneizar a mistura.
Na segunda etapa, adiciona-se os aditivos orgânicos, os quais irão conferir as características da fita a verde. São adicionados o plastificante, surfactante, antiespumante a mistura realizada na primeira etapa. Em seguida, segue para um moinho de bolas com uma rotação de 250 rpm e o período de 24 horas. Em seguida, a suspensão passa por uma mesa niveladora à temperatura ambiente e velocidade controlada. formando com isso uma fita. Ela tem sua espessura controlada pelo Doctor Blade. A suspensão passa por um processo de secagem à temperatura ambiente, liberando os solventes utilizados. A figura 4 ilustra a mesa niveladora em que a suspensão é arrastada para a formação da fita.
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Fonte: HUBADILLAH, 2018
Nas primeiras e segunda fitas foi utilizado o pó cerâmico TPC (com adição de magnésio no caso da primeira fita); na terceira e quarta, a Hidroxiapatita, com a adição do magnésio na quarta composição. A água e o álcool etílico foram usados como solvente e o Triton como dispersante. Em seguida, foi realizada a moagem em um moinho de bolas por 24 horas. Na segunda parte, foi usado o PVA como ligante, o álcool isopropílico como plastificante, Antifoam como antiespumante, cocoamida como surfactante, e o ácido cítrico como reticulante. Por fim, realizou-se a homogeneização e a colagem das fitas.
Para a reticulação, foi utilizado o ácido cítrico, que inicialmente foi colocado um recipiente com água em aquecimento. Quando a água destilada alcança a temperatura de 50°C ainda em aquecimento ele é adicionado. Quando a solução alcança 60ºC, adiciona-se o PVA em um recipiente com agitação até obter uma mistura sem aglomerados de PVA e com homogeneização. Depois da segunda etapa, onde é feita a suspensão, utiliza-se o Doctor Blade para definir a espessura da fita e a mistura passa por uma mesa laminadora com velocidade uniforme formando assim uma fita cerâmica. Essa fita fica em temperatura ambiente onde se realiza a secagem com a perda do solvente.
5.2 Caracterização das suspensões
No fluxograma 1 estão descritos os processos de caracterização dos pós cerâmicos utilizados e as análises realizadas nas fitas produzidas. Inicialmente é a caracterização do pó através da técnica de Difração de raios para a observação das fases presentes. A caracterização da suspensão se deu através da análise reológica e as fitas produzidas foram analisadas em termos de bioatividade, citotoxicidade e grau de intumescimento.
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Fluxograma 1- Caracterização de todos os processos utilizados, mostrando cada passo.
Fonte: autor 5.3 Ensaio reológico
O ensaio reológico tem como objetivo analisar o comportamento reológico da suspensão, que podem ser: newtonianos, plastificantes e dilatantes e são diferenciados pelo comportamento de viscosidade enquanto é atuada uma força de cisalhamento. O comportamento necessário para a confecção de fitas é o pseudoplástico, em que a medida que a taxa de cisalhamento aumenta, enquanto a viscosidade diminui e, no final, mantém-se quase constante. Para que o ensaio ser realizado utiliza-se viscosímetro modelo Haake Viscotester da Thermo Fischer Scientific com sistema cone-placa e sensor PP20 utilizando um intervalo de taxa de cisalhamento de 0 s-1 a 400 s-1, à temperatura ambiente.
5.4 Difração de Raios X (DRX)
O Raio X é uma forma de radiação eletromagnética com magnitude dos espaços atômicos. Quando um raio X incide em um material, ele pode ser dispersar em todas as direções de elétrons associados ao átomo. A difração é uma técnica que consiste em partículas finas expostas a esse raio x monocromático. À medida que o contador se move a velocidade angular constante, um registrador plota automaticamente a intensidade do feixe difratado em função do ângulo de difração. O diafametro mostra ângulos em que a difração ocorre em amostras. Os seus usos variam na determinação da estrutura cristalina e as determinações de materiais (CALLISTER,2002).
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Foram analisadas as amostras dos pós cerâmicos utilizados para a produção das fitas cerâmicas através da técnica de DRX, com variação angular de 10°C a 80°C com velocidade de varredura de 1°C/min com passo de 0,02 °/min levando um tempo de 1,2 s. O difratômetro utilizado foi o modelo Miniflex II, da Rigaku utilizando radiação CuKα (λ=1,54056 Å), utilizando radiação CuKα monocromática obtida em 40 kV, com corrente de filamento de 30 mA, de comprimento de onda de λ= 1,54056 Å. Foi usado o banco de dados do Centro Internacional para Dados de Difração (ICDD) pelo método Rietveld, com isso foi possível caracterizar os compostos e suas fases cristalinas.
5.5 Grau de Intumescimento
O grau de intumescimento mostra o perfil de hidratação dos filmes, que ocorre quando as moléculas do solvente penetram na matriz polimérica a partir de seus grupos hidrofílicos, ocupando regiões do interstício da rede polimérica, podendo causar a dissolução ou desintegração dos filmes à medida que aumenta o volume de água entre as cadeias do polímero (PACHECO, 2016).
No ensaio de intumescimento, as fitas cerâmicas foram cortadas em círculos de áreas 0,64mm2 e deixadas na estufa por 24 horas à temperatura de 50°C, logo em seguida as amostras são pesadas e imersas em uma solução de PBS por um período de 24 horas a 37°C. O PBS é composto pela seguinte solução:
Tabela 5- Composição do PBS
Fonte: autor
Ao retirar o excesso de água das amostras, pesando-as novamente, obtém-se o grau de intumescimento pela fórmula a seguir:
% 𝑖𝑛𝑡𝑢𝑚𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 100%
A fórmula 1 tem o objetivo de calcular a percentagem do grau de intumescimento subtraindo a massa final - massa depois de ficar imersa pelo PBS e retirar o excesso de água-, pela
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massa inicial -a massa após a saída da estufa-, dividindo o resultado pela massa inicial e multiplicando por 100%. Esse grau ajuda a saber a porcentagem de água que é absorvida pela amostra em seus interstícios. Alguns fatores podem alterar essa percentagem, como o agente reticulante (ácido cítrico) que foi usado em todas as fitas, a substituição dos íons nos fosfatos de cálcio que modificam a célula unitária e os parâmetros de rede.
5.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura consiste na ampliação da imagem de forma que possam ser vistos os grãs e morfologia analisadas pela sua bioatividade, para isso as amostras foram recobertas com ouro e aderidas no porta- amostra feito com fibras de carbono. Foi utilizado para o ensaio o microscópio de marca ZEISS, modelo Auriga, com uma voltagem de aceleração de 5kV.
5.7 Ensaio de Bioatividade
A bioatividade utiliza uma solução de SBF de pH igual a 7,4. O SBF é uma mistura de compostos que formam uma solução iônica semelhante ao plasma humano. O Simulated Body Fluid é acelular, livre de proteínas e apresenta a seguinte composição (Andrade; 2016).
Tabela 6- Composição do SBF
Fonte: Andrade (2016)
Cerâmicas, quando bioativas, induzem a biomineralização do fosfato de cálcio ao interagir com o plasma sanguíneo, o fosfato, por sua vez, precipita e induz uma nucleação heterogênea, que é seguida pela formação de uma camada de hidroxiapatita (Andrade; 2016).
As amostras foram imersas em 20 mL de SBF por sete dias e foi analisada a formação de hidroxiapatita e, assim, a oocorrência de bioatividade do material. Logo após, as amostras foram lavadas com água destilada e secas para que se pudesse realizar o MEV e o EDS. Todas as amostras
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tinham dimensão de 0,64mm2 e foi utilizado como padrão do MEV: 5kV e do EDS: 15kV com o microscópio JEOL 5700.
5.8 Ensaio de Citotoxicidade
O ensaio de citotoxicidade foi realizado para observar a biocompatibilidade do material em meio biológico, para isso foram esterilizadas as amostras nas condições de 120ºC por 6 horas, em seguida foram imersas em uma solução de DMEM com 10% de Soro de Bovino Fetal e incubadas a 37ºC e colocadas em contato por 30 minutos. As células foram retiradas e incubadas por amostras de 1 mL de DMEM, por 24 h em uma placa de poços sob condições de cultura celular (5% de CO2,
20% de O2, 95% de umidade e 37 ° C). Após 24 horas, retira-se e adiciona-se a solução de MTT e
fica incubado por 3 horas. Em seguida lê-se a absorbância e analisa-se se o controle foi positivo ou negativo. Para o controle positivo é necessário que citotóxico células e Triton x100 e não citotóxico serão usadas células e meio de cultura cultivadas diretamente na placa.
6.0 RESULTADOS E DISCURSÃO
6.1 Caracterização reológica
A figura 5 mostra as curvas de viscosidade das suspensões TCP, TCP- Mn, HA sintética, HA comercial e HA comercial-Mn. Como pode ser visto no gráfico, as amostras apresentaram um comportamento muito similar em relação a sua reologia. As curvas obtidas demonstram uma diminuição brusca da viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento, o que caracteriza um comportamento pseudoplástico das composições. O gráfico mostra que embora as composições sejam de pós cerâmicos diferentes o comportamento reológico é o mesmo para todas. Observando as curvas, de um modo geral, tem-se que no início da colagem de fita, a tensão de cisalhamento tem origem na resistência interna do alongamento das cadeias poliméricas, pois apresentam repulsão eletrostática, e da separação dos aglomerados de partículas, o que resulta em um aumento na viscosidade da suspensão total. O aumento da tensão de cisalhamento afeta a suspensão de modo que ela consegue fluir sem quaisquer obstáculos, diminuindo assim a viscosidade da suspensão (JABBARI et al., 2016). Ao trabalhar com taxas de viscosidades relativamente baixas, obtêm-se uma boa fluidez e maior facilidade para produzir um filme plano e com espessura regular (SPANIOL, 2018). Pode-se relacionar a velocidade de colagem da fita e altura ajustada para aferir a taxa de cisalhamento durante este processo. A velocidade em que as fitas são coladas deve ser alta suficiente para que a taxa de cisalhamento esteja no intervalo do gráfico onde o declive da curva seja menos íngreme. Isso porque, na faixa mais íngreme da curva, pequenas mudanças na
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taxa de cisalhamento geram grandes mudanças na viscosidade e, portanto, nas condições mecânicas da suspensão (BITTERLICH, LUTZ, ROOSEN, 2002).
Figura 5- a) Comportamento das fitas de TCP, HA sintética e HA comercial
Fonte:autor
Figura 5- b) Comportamento das fitas de TCP- Mn e HA comercial- Mn
Fonte:autor
As curvas de reologia que podem ser observadas nas figuras 5 a) e b) demonstram o comportamento pseudoplástico necessário para a produção das fitas cerâmicas, em conformidade com o encontrado por Spaniol,2019. Na figura 6 estão demonstrados os comportamentos reológicos observados em suspensões.
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Fonte: HOTZA, 1997
A reologia da barbotina é determinada pelas características dos seus componentes. Os ligantes, por exemplo, aumentam a viscosidade e mudam o comportamento de escoamento de newtoniano para pseudoplástico (HOTZA,1997). A figura 6 mostra o comportamento da velocidade pela taxa de cisalhamento. À medida que a taxa de cisalhamento aumenta, a sua viscosidade diminui e, no final, mantém-se quase constante. Esse é o comportamento esperado das fitas cerâmicas.
6.2 Difração de Raios X (DRX)
Os padrões de difração de Raios X para os pós cerâmicos estão ilustrados na figura 7, os resultados revelaram a presença da fase β- TCP para o pó de TCP, cuja fórmula é C3(PO4)2, de estrutura
ortorrômbica, segundo ficha padrão (JCPDS 98- 008-2984), conforme encontrado por Spaniol, 2018. É possível observar através dos gráficos obtidos que nenhuma outra fase cristalina é encontrada, para o pó de TCP. Os parâmetros de rede, volume da célula unitária e tamanho de cristalito obtidos da fase β- TCP foram obtidos através do refinamento de Rietveld com o intuito de observar as fases presentes no pó comercial utilizado com o pó comercial com a adição do manganês presente no Nitrato de Manganês, neste difratograma foi possível observar a fase Mn(NO3)2, segundo ficha padrão (JCPDS INSERIR NÚMERO). No difratograma da
Hidroxiapatita foi possível observar a fase Hidroxiapatita, segundo ficha padrão (JCPDS INSERIR NÚMERO) e quando houve uma mistura de reagentes entre a HA e o Nitrato de Manganês, houve a presença da fase Nitrato de Manganês e Hidroxiapatita, como pode ser observado no difratograma presente na figura 7.
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Fonte:autor
6.3 Grau de Intumescimento
O grau de intumescimento é uma medida relacionada tanto à hidrofilicidade quanto à presença de poros e microvazios na rede polimérica. A hidratação dos filmes poliméricos começa a partir dos grupos hidrofílicos mais polares, denominado de hidratação primária. A hidratação secundária são quando as moléculas do solvente, começam a ocupar os interstícios e poros da rede polimérica. Este grau analisa a quantidade de água absorvida por cada amostra (PACHECO, 2016). A inserção de manganês nos fosfatos de cálcio reduz os parâmetros da unidade celular. O manganês faz a diminuição dos parâmetros de rede, tanto no β- tricálcio fosfato da hidroxiapatita que em condições semelhantes encontraram uma diminuição dos parâmetros da rede com a concentração de Manganês (OLIVEIRA, 2020). Essa mudança na célula unitária causa a diferença das amostras sem manganês, que apresentam todos o mesmo comportamento, e com manganês, sendo o fator que este provoca uma mudança no seu grau de intumescimento assim como de sua estrutura. No gráfico 7 é possível ver o grau de intumescimento:
