CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, HEMATOLÓGICAS E
DO PERFIL DE EXPRESSÃO ANTIGÊNICA DE PACIENTES COM
LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
NORTE
JULIANA MENDONÇA FREIRE
NATAL/RN 2015
ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, HEMATOLÓGICAS E
DO PERFIL DE EXPRESSÃO ANTIGÊNICA DE PACIENTES COM
LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
NORTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
ORIENTADOR: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior
NATAL/RN 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Freire, Juliana Mendonca.
Análise das características clínicas, hematológicas e do perfil de expressão antigênica de pacientes com leucemia mielóide aguda do
estado do Rio Grande do Norte / Juliana Mendonca Freire. - 2015. 84f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde. Natal, RN, 2015. Orientador: Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.
1. Leucemia Mielóide Aguda - Dissertação. 2. Imunofenotipagem - Dissertação. 3. Citometria de fluxo - Dissertação. I. Cavalcanti Júnior,
Geraldo Barroso. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.155.392
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, HEMATOLÓGICAS E
DO PERFIL DE EXPRESSÃO ANTIGÊNICA DE PACIENTES COM
LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
NORTE
Aprovada em: ____/____/_____
Banca Examinadora:
Presidente da Banca:
Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior – UFRN
_________________________________________________
Membros da Banca:
Prof. Dra. Amália Cinthia Meneses do Rêgo
_________________________________________________
Prof. Dra. Maria Goretti Nascimento Santos
_________________________________________________
A minha família, por ter me ensinado que o estudo é a maior riqueza que uma pessoa pode ter.
Aos meus pais, Hermes e Leda, e meu irmão, Italo, que sempre estiveram ao meu lado, dando apoio, amor, carinho e incentivo para enfrentar os desafios.
Meu alicerce, exemplos de integridade, humildade e bondade.
Ao querido Orientador Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior, pela dedicação e confiança em mim. Meu mentor desde a graduação, passando
seus valiosos ensinamentos.
Aos diretores do laboratório DNA Center, Andrea, Gioconda e Roberto, pelo apoio, orientação e carinho.
As bioquímicas Themis, Taissa, Erica e Flávia, sempre disponíveis para ajudar e confortar com suas palavras.
As professoras da banca de qualificação, Dra. Tereza Neuma e Dra. Ana
Claúdia Freire, que contribuíram muito com suas sugestões, com intuito de
engrandecer o trabalho.
Prof.ª Dra. Tereza Neuma, pela sua importante contribuição nas análises estatísticas.
Ao laboratório de Hematologia do Hemocentro Dalton Cunha Barbosa, Natal/RN, onde foi desenvolvida a tese sob a orientação do Prof. Dr. Geraldo
Barroso Cavalcanti Júnior, bem como aos pacientes pela colaboração no estudo.
As leucemias agudas são um grupo heterogêneo de doenças hematológicas, cujo diagnóstico se baseia na análise dos aspectos citomorfológicos e imunofenotípicos permitindo identificar a linhagem hematopoiética de origem, aspecto de grande relevância para o diagnóstico e tratamento destas patologias. O objetivo deste trabalho foi Investigar um grupo de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda, baseado em critérios citomorfológicos e imunofenotípicos através da citometria de fluxo. Os pacientes assinaram o TCLE e suas amostras foram submetidas a análise hematológica, citomorfológica e imunofenotípica. Utilizou-se painel de anticorpos monoclonais a fim de diferenciar as leucemias linfoides e mieloides agudas, assim como classificar os subtipos de LMA. Dos 338 investigados, 182(53.8%) eram do sexo masculino e 156(46.2%) do sexo feminino. A idade variou de 1 a 90 anos. A manifestação clínica mais frequente foi a esplenomegalia com 270(79.9%) pacientes. Com relação aos dados laboratoriais, 204(60.3%) apresentaram leucometria acima de 50.000/mm3 e em 302(89.3%) a contagem de plaquetas mostrou-se abaixo de 100.000/L. Sobre a classificação FAB, o subtipo LMA-M1 foi mais presente, com 110(32.5%) casos. O marcador linfoide mais presente foi o CD7 em 34(10.06%) dos pacientes. A análise da incidência mundial dos subtipos de leucemia mostrou variações significativas em relação com a distribuição geográfica, sexo e idade, sugerindo que existem vários fatores etiológicos. Através desses dados foi possível caracterizar os subtipos de LMA e correlacionar com dados clínicos e laboratoriais, a fim de proporcionar um melhor tratamento bem como a monitorização dessa neoplasia.
DESCRITORES: Leucemia Mieloide Aguda, Imunofenotipagem, Citometria de
Fluxo.
CD Clusters of Differentiation
DRA Doença Residual Mínima
EGIL European Group for the Immunological Classification
of Leukemias
FAB French-American-British
FITC Fluorescein isothiocyanate
FL Fluorescência
FLT3 FMS-like tyrosina kinase 3
HLA-DR Human leukocyte antigen-DR
LCR Líquido Cefaloraquidiano
LLA Leucemia Linfóide Aguda
LMA Leucemia Mielóide Aguda
MGG May-Grunwald-Giemsa mL Mililitro µL Microlitro MO Medula óssea MPO Mieloperoxidase SP Sangue Periférico
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Phosphate-buffered Saline
PE Phycoerythrin
RPM Rotações por minuto
SMD Síndrome Mielodisplásica
SNC Sistema Nervoso Central
TCTH Transplante de células-tronco hematopoiéticas
TdT Terminal deoxinucleotidil transferase
FIGURA 1 - Distensão de MO corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M1...75
FIGURA 2 - Perfil imunofenotípico de uma LMA-M1...76 FIGURA 3 - Distensão de SP corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M2...77
FIGURA 4 - Perfil imunofenotípico de uma LMA-M2...78 FIGURA 5 - Distensão de MO corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M3...79
FIGURA 6 - Perfil imunofenotípico de uma LMA-M3...79 FIGURA 7 - Distensão de MO corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M4...80
FIGURA 8 - Distensão de SP corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M5...80
FIGURA 9 - Perfil imunofenotípico de uma LMA-M5a...81 FIGURA 10 - Distensão de MO corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M6...82
FIGURA 11 - Distensão de SP corada pelo corante May-Grünwald-Giemsa de
uma LMA-M7...82
TABELA 1 – Painel de Anticorpo Monoclonal utilizado para
caracterização imunofenotípica, através da Citometria de Fluxo...25
DEDICATÓTIA...05
AGRADECIMENTOS...06
RESUMO...07
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...08
LISTA DE FIGURAS...10
LISTA DE TABELAS...11
1INTRODUÇÃO...14
1.1 LEUCEMIAS AGUDAS...14
1.1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS...14
1.2 LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA...15
1.2.1 ETIOLOGIA E EPIDEMIOLOGIA...15
1.2.2 ASPECTO CLÍNICO-LABORATORIAL...17
1.2.3 IMUNOFENOTIPAGEM...17
1.2.4 CARACTERIZAÇÃO DOS SUBTIPOS DE LMA...18
1.2.5 FENÓTIPOS ABERRANTES...19 1.2.6 TRATAMENTO...20 2 JUSTIFICATIVA...21 3 OBJETIVOS...22 3.1 OBJETIVO GERAL...22 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...22 4 MÉTODOS...23 4.1 CASUÍSTICA...23
4.2 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR...24
4.3 HEMOGRAMA E ESTUDO CITOMORFOLÓGICO...24
4.4 IMUNOFENOTIPAGEM...24
4.4.1 MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS DE SUPERFÍCIE...25
4.4.2 MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS INTRACITOPLASMÁTICOS E NUCLEARES...26
4.4.3 LEITURA E ANÁLISE NO CITÔMETRO DE FLUXO...27
5.1 Immunophenotyping characterization by flow cytometry in acute myeloid
leukemia……….28
5.2 Frequency and clinical significance of P-Glycoprotein and Multidrug Resistance-Associated Protein-1 expressions in leukemic cells from Acute Myeloid Leukemia……….….45
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES...71
7 REFERÊNCIAS...72
8 APÊNDICE...75
9 ANEXOS...83
1 INTRODUÇÃO
1.1 LEUCEMIAS AGUDAS 1.1.1 Considerações Gerais
As leucemias agudas são um grupo heterogêneo de doenças hematológicas, caracterizadas por uma rápida e anômala proliferação dos precursores sanguíneos na medula óssea. São diagnosticadas de acordo com a análise dos aspectos citomorfológicos de aspirados de medula óssea (MO) e/ou sangue periférico (SP), cuja caracterização permite identificar a linhagem hematopoiética, aspecto de grande relevância para o diagnóstico e tratamento destas patologias 1-3.
À medida que se acumulam na medula óssea as células leucêmicas suprimem a expansão das células progenitoras hematopoéticas normais, refletindo as manifestações clínicas que vão desde falência da medula óssea, como anemia, neutropenia e trombocitopenia, até infecções ou hemorragias, resultantes da infiltração de órgãos com células leucêmicas 4.
A classificação das leucemias agudas têm se tornado cada vez mais complexas. Tradicionalmente são classificadas com base no tipo celular envolvido e no estágio de maturação das células leucêmicas, cuja finalidade primordial da classificação morfológica é diferenciar a Leucemia linfóide aguda (LLA) da Leucemia mielóide aguda (LMA), principalmente quando os blastos apresentam pouca ou nenhuma diferenciação celular 5.
Tradicionalmente, as leucemias agudas têm sido classificadas de acordo com o grupo FAB (Franco-Americano-Britânico) através de critérios que permitem classificar as leucemias agudas mielóides e linfóides em subtipos de acordo com as características morfológicas e citoquímicas visualizadas em distensões de aspirado de MO e\ou SP, corados com corantes hematológicos. Este grupo estabeleceu critérios de classificação baseado em scores quanto à relação de tamanho do núcleo, citoplasma, presença de nucléolos, regularidade de membrana nuclear, assim como, características tintoriais do núcleo e citoplasma, como a presença de vacúolos, granulações azurófilas e bastonetes de Auer 6,7.
De acordo com o grupo FAB, as leucemias mieloides agudas foram classificadas em: M0 – LMA sem diferenciação morfológica, M1 – LMA com mínima diferenciação morfológica, M2 – LMA com diferenciação (componente monocítico <20%), M3 – LMA promielocítica, subdividida em hipergranular e hipogranular, M4 – LMA mielomonocítica (células monocíticas > 20%), M5a – LMA monoblástica (sem diferenciação, blastos > 80%), M5b – LMA monocítica (com diferenciação, blastos < 80%), M6 – eritroleucemia, M7 – LMA megaloblástica8.
Posteriormente, surgiu a classificação EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias) baseada em critérios imunológicos, através da análise da expressão de antígenos na superfície celular utilizando painéis de anticorpos monoclonais 9.
Muitos avanços foram realizados, nas últimas décadas, afim de melhor definir e subclassificar as leucemias agudas, com o desenvolvimento de metodologias que reconheçam a linhagem celular dos diferentes tipos de células hematopoiéticas. Dentre os mais importantes avanços, a imunofenotipagem por citometria de fluxo, uma técnica essencial na determinação da linhagem celular, dado bastante útil não apenas no acompanhamento do curso da doença como também no tratamento mais específico do paciente 10-12.
1.2 Leucemia Mielóide Aguda 1.2.1 Etiologia e epidemiologia
Estudos epidemiológicos sugerem que fatores ambientais, ocupacionais e genéticos sejam importantes na patogênese da LMA. A incidência de pacientes com leucemia mielóide aguda é de 3,6 por 100000 pessoas por ano, com uma média de idade no momento do diagnóstico de 66 anos. A resposta ao tratamento, dos pacientes com menos de 60 anos, tem melhorado ao longo das últimas décadas. As principais razões da existência de falhas para alcançar a cura são refratariedade primária da doença à quimioterapia inicial ou a incapacidade de manter a remissão completa que foi alcançada (recidiva). De fato, com a exceção de uma minoria de pacientes com subtipos específicos de LMA (por exemplo, leucemia promielocítica aguda), a recaída está associada a um prognóstico
extremamente pobre, e este tem sido o grupo de pacientes mais visados em estudos clínicos de novos agentes e abordagens terapêuticas. Estudos recentes têm demonstrado que a recidiva está associada à presença de mutações as quais não estavam presentes ao diagnóstico 13.
Vários são os mecanismos que levam a célula progenitora mielóide leucêmica a perder o controle da proliferação celular, ocasionando a expansão do clone leucêmico. Todos os subtipos de LMA provavelmente compartilham alterações nas vias comuns que regulam a proliferação, diferenciação e morte celular. Estes incluem mutações que transmitem sinais de proliferação e sobrevivência, e as mutações que impedem a diferenciação ou auto-renovação. A primeira categoria inclui as lesões que constitutivamente ativam proteínas quinases, tais como FLT3 e c-kit, enquanto que o segundo compreende fusões de genes que são comumente geradas por translocações cromossômicas, tais como t(8;21). A análise de todo o genoma tem sido utilizado para determinar de forma completa as lesões genéticas necessárias para leucemogênese, perfil genômico das alterações no número de cópias de DNA e da perda de heterozigose, bem como o completo sequenciamento dos genes da LMA, indicam que a LMA contém uma quantidade de alterações genéticas menor quando comparada com outras doenças malignas 14.
Fatores genéticos também têm sido implicados no surgimento da LMA por seu envolvimento em síndromes caracterizadas por anormalidades ou instabilidades cromossômicas. Crianças com Síndrome de Down tem um maior risco (10 a 20 vezes) de desenvolvimento de leucemia, apresentando um risco maior para adquirir LMA e LLA, principalmente nos 4 primeiros anos de vida 15. Outras síndromes congênitas como a anemia de Fanconi e Síndrome de Bloom, também estão relacionadas ao maior risco de adquirir LMA 16,17.
Fatores ambientais têm sido implicados na patogênese da LMA. O benzeno, um poluente ambiental, causa leucemia mielóide aguda (LMA) e alterações sanguíneas relacionadas, incluindo síndromes mielodisplásicas (SMD). Sua hematotoxicidade é conhecida, porem os mecanismos ainda não são bem esclarecidos 18.
Altas doses de radiação ionizante é também leucemogênica, porém o risco das baixas dosagens, como as que são recebidas a partir de procedimentos de diagnóstico, ainda é pouco conhecido 19.
1.2.2 Aspecto Clínico-Laboratorial
O diagnóstico de LMA inicia-se a partir de uma suspeita clínica e na avaliação do SP e/ou MO, tendo como base a presença de células blásticas, as quais devem constituir cerca de 20% na contagem diferencial de 200 células no SP ou 500 células na MO, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) 20.
Em condições normais, a hematopoiese é hierarquicamente organizada começando pelas células tronco pluripotentes, que são capazes de perpetuar-se através da auto-renovação e, através do processo de diferenciação, gerar uma célula mais madura. Evidências experimentais recentes têm mostrado que a LMA surge a partir de células hematopoiéticas imaturas transformadas, seguidos de acumulação de múltiplas mudanças graduais genéticas e epigenéticas das células-tronco hematopoéticas 21. A infiltração dessas células da MO, é frequentemente acompanhada de neutropenia, anemia e plaquetopenia, levando frequentemente a tríade sintomatológica clássica: febre, anemia e hemorragia/sangramentos comumente observada nestas leucemias22. A infiltração leucêmica em vários órgãos pode levar a hepatomegalia, esplenomegalia, linfoadenopatia, hipertrofia das gengivas, podendo eventualmente, ocorrer infiltração de pele, olho e comprometimento do sistema nervoso central (SNC) 3,8,23,24.
1.2.3 Imunofenotipagem
A imunofenotipagem, realizada por citometria de fluxo, consiste na identificação de epítopos específicos de antígenos celulares através de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos. A aplicação dessa técnica, nas leucemias, desempenha papel essencial na identificação da linhagem celular leucêmica, seu estágio de maturação e detecção de doença residual mínima (DRM). Vários avanços na citometria de fluxo, incluindo a disponibilidade de uma ampla gama de anticorpos e fluorocromos, e melhores estratégias de análise multiparamétrica, têm melhorado consideravelmente a capacidade de identificar populações celulares normais e reconhecer fenótipos
aberrantes, mesmo quando presentes em pequena proporção em relação às células analisadas 25.
1.2.4 Caracterização dos subtipos de LMA
A LMA-M0 é definida como uma leucemia de blastos muito indiferenciados, dificultando o seu diagnóstico. Apresenta uma população blástica com coloração citoquímica negativa, mas com positividade para antígenos da linhagem mielóide como CD13, CD33, HLA-DR, CD34, CD54, CD117 e MPO16.
Na LMA-M1 estão presentes blastos indiferenciados em mais de 30% das células analisadas. São blastos com pouca maturação celular apresentando tamanho mediano, elevada relação núcleo-citoplasma (N/C), cromatina frouxa com presença de um ou vários nucléolos e podem apresentar bastonetes de Auer. A imunofenotipagem mostra positividade para HLA-DR, CD13, CD33 e MPO, podendo apresentar CD34 26,27 (Figuras 1 e 2).
Classificada como uma LMA com maturação, a M2 apresenta blastos indiferenciados, superior a 30%, com diferenciação até promielócito (< 20%). Seu citoplasma pode apresentar grânulos azurófilos e bastonetes de Auer. Apresentam os antígenos MPO, CD13, CD15, CD33, CD34, CD56, CD65, CD117 e HLA-DR 26,27 (Figuras 3 e 4).
A LMA-M3 é definida como promielocítica por apresentar em sua maioria promielócitos. São células hipergranulares, com intensa coloração azurófila e presença de bastonetes de Auer. O núcleo tem aspecto reniforme com perfil bilobulado. São HLA-DR negativos e positivos para CD13, CD33, MPO, CD15, CD65 e CD117 26,27 (Figuras 5 e 6).
A leucemia mielomonocítica, LMA-M4, possui componentes monocítico e granulocítico, os quais cada um representa mais 20% das células. Os blastos monicíticos são grandes, com moderada relação N/C e basofilia variável. São CD34, CD13, CD15, CD33, CD117, HLA-DR, MPO, CD14, CD11b e CD64 positivos 8,26,27 (Figura 7).
A leucemia monocítica, classificada como LMA-M5, possui dois subtipos: a M5a, definida como monoblástica, apresentam células sem diferenciação; e a M5b, denominada monocítica, cujas células apresentam diferenciação em monócitos e promonócitos 8,27. No subtipo LMA-M5a, os blastos são de grande
tamanho, seu núcleo possui uma cromatina frouxa, com 1-3 nucléolos e citoplasma bastante basofílico. É possível observar também alguns bastonetes de Auer no citoplasma. Na LMA-M5b, os promonócitos apresentam um citoplasma menos basofílico, maior quantidade de granulações que os monoblastos com presença de vacuolizações citoplasmáticas 27. Ambos os subtipos da leucemia monocítica apresentam antígenos CD13, CD33, MPO, HLA-DR e CD14, este apresentando maior percentual de positividade para a LMA-M5b 8,27 (Figuras 8 e 9).
A eritroleucemia, ou LMA-M6, é caracterizada pela proliferação de elementos eritróides e blásticos de origem mielóide. Os eritroblastos estão presentes em mais de 50% da totalidade celular e os mieloblastos ou promonócitos em mais de 30% da celularidade não eritróide. No SP podem ser observadas algumas alterações na morfologia eritrocitária como macrocitose, ponteado basófilo, corpos de Howell-Jolly e anel de cabot. Um antígeno característico desse subtipo é a glicoforina A ou CD235a. Também são CD33, MPO, CD36, CD34 e HLA-DR positivos 8,26,27 (Figuras 10).
A leucemia magacarioblástica, classificada como LMA-M7, caracterizam-se por expressarem antígenos plaquetários e aprecaracterizam-sentarem mais de 30% de células indiferenciadas, do tipo linfoblasto ou megacariócitos. Os blastos apresentam um aspecto morfológico muito imaturo, são bastante polimórficos, possuem um núcleo excêntrico e cromatina frouxa, como 1-3 nucléolos. O citoplasma é basófilo e apresenta projeções. No SP se observam megacariócitos com grande dismorfismo, como plaquetas gigantes. A positividade para os antígenos CD41 e CD61 é característico desse subtipo. São também positivos para CD33, CD13, CD36, CD34 e HLA-DR 8,26,27 (Figura 11).
1.2.5 Fenótipos aberrantes
Adicionalmente a ampla utilização de painel de AcMo empregado no diagnóstico e classificação das leucemias agudas têm revelado a presença de fenótipos aberrantes em LMA. São caracterizados pela co-expressão de antígenos linfóides, como CD7, CD4, CD10, CD19, CD2, CD20, CD22 e CD56. A presença de fenótipos aberrantes na LMA é variável. Um estudo realizado no Estado do Maranhão, Brasil, mostrou que 27% dos casos de LMA
apresentaram fenótipos aberrantes. Enquanto que em um estudo realizado em Buenos Aires, 54% apresentaram pelo menos um antígeno da linhagem linfoide 1,3.
1.2.6 Tratamento
Tratamento da LMA tem evoluído muito ao longo das últimas décadas, com melhorias no transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) bem como a introdução de novos tratamentos, que têm melhorado as perspectivas para pacientes com essa doença hematológica 28,29.
O transplante de células-tronco hematopoiéticas é um tratamento importante e ainda bastante utilizado. Estima-se que 20.000 pacientes recebem TCTH a cada ano, e enquanto este procedimento é única opção potencialmente curativa para o paciente, observa-se que a recaída pós-transplante é comum 28.
Os fatores que influenciam a recaída podem ser classificados como intrínsecos à doença, ao TCTH ou à interação entre a doença e o sistema imune pós-transplante. A recaída após terapia de indução bem sucedida é mais comumente reconhecida pela recaída hematológica com evidente reaparecimento de blastos circulantes, embora possa também ser com o reaparecimento de marcador observado através da citometria de fluxo utilizada na monitorização da doença. Estas formas de recaída são geralmente referidas à DRM 13. As células leucêmicas residuais encontram-se abaixo de 5% das células da medula óssea, podendo multiplicar-se e causar recidivas 26.
2 JUSTIFICATIVA
A análise da incidência mundial dos subtipos de leucemia mostrou variações significativas em relação com a distribuição geográfica, sexo, idade, etnia e status socioeconômico, sugerindo que existem vários fatores etiológicos influenciando essa diversidade 3.
Avanços no tratamento das leucemias agudas têm permitido um aumento da remissão completa da doença proporcionando uma maior sobrevida para estes pacientes. O sucesso do tratamento depende de diversos fatores, entre eles o diagnóstico específico do subtipo de LMA, bem como sua respectiva caracterização.
Portanto, os estudos sobre as frequências dos diferentes subtipos de LMA, caracterização imunofenotípica, presença de fenótipos aberrantes e aspecto clínico-laboratorial são fatores de grande importância para a escolha e acompanhamento da terapia.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar um grupo de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda, baseado em critérios morfológicos e imunofenotípicos por citometria de fluxo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Correlacionar os subtipos de LMA com parâmetros clínicos e hematológicos;
Verificar a frequência dos marcadores imunofenotípicos e correlacionar com os subtipos de LMA;
Correlacionar a expressão dos antígenos celulares com dados clínicos e hematológicos;
4 MÉTODOS 4.1 Casuística
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos do Hospital Universitário Onofre Lopes, protocolo 359/09 (Anexo 1) e a seleção dos pacientes para o estudo foi realizada no Laboratório de Citometria de Fluxo do Serviço de Hematologia do Hemocentro Dalton Cunha – HEMONORTE, sendo efetuada de forma prospectiva com início em 2009 e término em dezembro de 2013. Foram coletadas amostras de sangue periférico e medula óssea de 338 pacientes diagnosticados com LMA “de novo”.
O diagnóstico das leucemias baseou-se em critérios clínicos e laboratoriais. Esses últimos incluíam o hemograma, mielograma e imunofenotipagem celular para a identificação e classificação da LMA. Os dados clínicos dos pacientes foram obtidos por análise dos prontuários ou por informações obtidos pelos médicos responsáveis.
Um modelo pré-definido para a coleta de dados incluiu etnia, sexo, idade, subtipo FAB para a classificação das leucemias agudas, mielograma, dosagem de hemoglobina, contagem de plaquetas, leucometria global e contagem diferencial dos leucócitos, imunofenotipagem, como também o envolvimento extra-medular da doença (SNC, baço, fígado e gânglios linfáticos, massa mediastinal e infiltração de pele).
Para a detecção de envolvimento do SNC, empregou-se contagem de células totais do líquido cefalorraquidiano (LC) realizado em câmara de Fuchs-Rosental e a diferencial obtida a partir de líquido cefalorraquidiano. Neste caso, 100µL do LC sem conservante foi centrifugado em uma citocentrífuga (Cytospin, Shandon, Inglaterra) por 5 minutos a 50 rotações por minuto (RPM). Considerou-se envolvimento no SNC quando havia mais que 5 células/mm3 e as mesmas apresentaram características de células blásticas quando coradas pelo Leishman.
Para o diagnóstico laboratorial das leucemias agudas seguiu-se o critério da observação da presença de mais de 20% de células blásticas no SP ou no
aspirados de MO, cuja avaliação morfológica seguiu os critérios adotados pela classificação FAB.
4.2 Teste de viabilidade celular
As células mononucleares foram incubadas em solução de azul de trypan (Merck) a 0,5% em solução salina tamponada com fosfatos (PBS, pH 7,4) (phosphate buffered saline, Sigma Chemical Co, ST. Luis, CA, USA), na proporção de 9:1. Após homogeneização, a mistura foi observada ao microscópio óptico com objetiva de 20x, sendo descartadas as amostras com viabilidade inferior a 80%.
4.3 Hemograma e Estudo Citomorfológico
Estudos citomorfológicos de distensão de SP e MO, coradas pelo Leishman, foram realizados em microscópio óptico, inicialmente com objetiva de 40x e, posteriormente, com objetiva de 100x. A avaliação morfológica para as leucemias agudas seguiu os critérios do grupo FAB conforme os subtipos M0 até M7 para a LMA.
A leucometria, determinação das concentrações de hemoglobina e contagem de plaquetas foram realizadas no analisador hematológico micros 60 (ABX, USA).
4.4 Imunofenotipagem
As amostras de sangue periférico ou de medula óssea foram submetidas à imunofenotipagem por citometria de fluxo utilizando-se um painel de anticorpos monoclonais (AcMo) diretamente conjugado com fluorocromos como o isotiocianato de fluoresceína ou FITC do inglês fluoresceinisothiocyanatee / ou Phicoeritrina (PE) e/ou proteína Peridinin chlorophyll (PerCP), correspondentes as fluorescências verde, laranja e vermelha respectivamente, possibilitando a dupla ou tripla marcação em uma única etapa.
Para análise de amostras procedentes de sangue periférico, utilizou-se a mesma amostra colhida para o hemograma rotineiro. Quando o material analisado foi medula óssea, utilizou-se para tal, aspirado de medula óssea em seringa previamente heparinizada (Liquemine-Roche).
A imunofenotipagem foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se um painel de anticorpos monoclonais (Becton Dickinson, San José CA, USA) apresentado na tabela 1.
Tabela 1. Painel de Anticorpo Monoclonal utilizado para caracterização
imunofenotípica, através da Citometria de Fluxo.
Linhagem Marcadores Mielóide CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD117, CD36, CD65, CD66b, MPO, CD235(eritróide), CD41/CD61 (plaquetário)
Linfóide (Linfócitos T e Natural Killer) CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 e
CD8, CD16-56
Linfóide (Linfócitos B) CD10, CD19, CD20, CD22, CD79,
anti-IgM
Não específica HLA-DR, CD34, CD38, CD123, TdT
Para melhor caracterização do perfil imunofenotípico das leucemias agudas foi necessário a montagem de um painel combinando os diferentes AcMo, de acordo com a especificidade e conjugação dos mesmos conforme o esquema descrito a seguir.
4.4.1 Marcação de Antígenos de Superfície
A reação de imunofluorescência foi realizada em 50 microlitros (μL) de suspensão de células totais (MO e/ou SP) previamente homogeneizadas, as quais foram incubadas com 20 μL de AcMo específico por 30 minutos ao abrigo da luz em temperatura ambiente. Após esta etapa, a suspensão foi novamente homogeneizada e acrescentada à mesma cerca de 2 mililitros (mL) de solução de lise, havendo nova incubação por mais 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após este período, a suspensão celular foi centrifugada por 5 minutos a 2000 rotações por minutos (RPM), o sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em PBS e novamente centrifugado a 1.500 RPM por 5 minutos, sendo esta última etapa realizada mais 2 vezes consecutivas. Ao final desta etapa, o sedimento foi então ressuspenso em 1mL de solução de PBS/ formaldeído a 1% e estocado ao abrigo da luz, sob refrigeração, até o momento
da análise. Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação inespecífica, empregando-se para tal, imunoglobulina inespecífica conjugada ao FITC, PE e PerCP diluídas conforme as especificações do fabricante.
4.4.2 Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos e Nucleares
Por se tratar de antígenos cujos epítopos se encontram localizados no citoplasma, foi necessária a prévia permeabilização celular, possibilitando dessa forma o direcionamento e reatividade do AcMo para os seguintes antígenos: TdT e MPO, sendo também necessário esta metodologia na investigação intracitoplasmática para o CD13 (cCD13), CD22 (cCD22), CD79a e (cCD79a). Para este procedimento foi utilizado o protocolo, empregando solução de lise (Becton-Dickinson´s FACS lysing solution, San José CA, USA) para a permeabilização celular.
Cerca de 50μL de amostra de suspensão celular de SP e ou MO por tubo foi incubada com solução de lise previamente diluída a 10% em água destilada por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma centrifugação a 1.500 RPM por 7 minutos, descarte do sobrenadante e homogeneização do sedimento. Após ressuspender o sedimento em 2 mL de solução de Tween-20 diluído a 0.5% em PBS (Tween-20 / BHD, England), esta mistura foi centrifugada 2 vezes a 1.500 RPM.
Após o descarte do sobrenadante, o sedimento foi homogeneizado e adicionado sobre o mesmo 10μL do AcMo anti-p53, seguida de uma incubação por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após esta etapa, o sedimento foi homogeneizado em 2 mL de solução de PBS/Tween-20, seguida de centrifugação a 1.500 RPM por 5 minutos, desprezado o sobrenadante e o sedimento ressuspendido e submetido a mais uma lavagem com solução de PBS/Tween-20. Após o descarte do sobrenadante, ao sedimento final foi adicionado 1 mL de solução de formaldeído diluído a 1% em PBS e estocado na geladeira ao abrigo da luz até o momento da leitura no citômetro de Fluxo.
Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação inespecífica, empregando-se para tal, imunoglobulina inespecífica conjugada ao FITC, PE e PerCP diluídas conforme as especificações do fabricante.
4.4.3 Leitura e Análise no Citômetro de Fluxo
A aquisição e análise das amostras foram realizadas em citômetro de fluxo de 3 cores FACscScalibur (Beckton Dickinson) em plataforma machintosh (Apple). Para aquisição e análise foi utilizado o programa Cell Quest software (Beckton Dickinson), empregando o eixo de dispersão lateral (SideScatter – SSC) com aquisição de um total de 20.000 células, levando-se em conta os parâmetros ForwardScatter (FSC) em escala linear que avalia o tamanho celular, SideScatter (SSC) também em escala linear, o qual avalia a complexidade e granulosidade celular, FL1 e FL2 em escala logarítmica que detectam a fluorescência verde e laranja ou seja a reação antígeno anticorpo conjugado ao FICT e PE, respectivamente. Para cada amostra analisada, foram empregados controles isotípicos de marcação inespecífica, os quais serviram de referencial para calibração do citômetro de fluxo.
As imunofenotipagens foram consideradas positivas por ambas as técnicas quando ocorreram mais que 25% de células blásticas positiva aos AcMo, com exceção do CD34 e TdT, cuja positividade foi considerada acima de 10%. Os resultados foram fornecidos na forma de dotplot em percentagens da população celular com reação positiva ou negativa e intensidade de fluorescência.
Para melhor caracterização do perfil imunofenotípico das leucemias agudas foi necessário a montagem de um painel combinando os diferentes AcMo, de acordo com a especificidade e conjugação dos mesmos.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foram realizados testes Qui-quadrado, Man Whitney e Krushkal-Wallis através do software estatístico Statistic Pack for Social Sciences (SPSS for Windows versão 9.0; Copyright ® SPSS, INC) para variáveis contínuas e independentes. Foram considerados estatisticamente significativos, p valor < 0,05.
5 ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 O artigo foi submetido ao periódico Journal of Clinical Laboratory
Analysis que possui fator de impacto 1.356 e qualis B2 da CAPES para área Medicina II.
Immunophenotyping characterization by flow cytometry in acute myeloid leukemia
ABSTRACT
Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of clonal disease of hematopoietic tissue, characterized by abnormal proliferation of progenitor cells of the myeloid lineage. The aim of this study was to perform immunophenotyping by flow cytometry of patients with acute myeloid leukemia, to correlate with clinical data, laboratory and epidemiological these patients. For this, samples of bone marrow aspirate and/or peripheral blood of 338 patients ,182(53.8%) male and 156(46.2%), were collected, using a panel of monoclonal antibodies specific for acute leukemia. In relation to the age, we found a higher number of cases in adult patients. According to clinical data, splenomegaly and hepatomegaly were present in most cases. The immunophenotyping demonstrated a characteristic profile of AML with expression of CD13 and CD33 in all cases and CD34 and CD117 in most cases. The CD14 was reactive in monocytic leukemia, and also observed negativity for lymphoid antigens such as CD19, CD10 and CD3, except that CD7 was present in 6 cases. Regarding cytomorphology, there was a direct correlation with FAB classification, with the prevalence of type myelo-monocytic (AML - M4). These data demonstrate the importance of immunophenotyping in the differential diagnosis of AML and monitoring of these neoplasms.
INTRODUCTION
The acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of disease of the hematopoietic system, characterized by rapid and abnormal clonal proliferation of progenitor cells of the myeloid lineage (myeloblasts) in the bone marrow (BM) and may, in most cases, to cross for the peripheral blood (PB) or also infiltrate the liver, spleen, lymph nodes and other tissues(1-4).
The first systems of classification of acute leukemias (AL) were based on cytomorphological investigations supplemented by cytochemical staining, allowing initially to distinguish AML from acute lymphoblastic leukemia(1,2,5,6).
The group French American British (FAB) standardized the morphological classification of AML in 9 groups according to cytomorphological characteristics of the leukemic cells obtained from bone marrow aspirates and peripheral blood: i) M0 - AML, ii) M1 – LMA, iii) M2 - AML, iv) M3 – LMA, v) M4 - AML, vi) M5a – LMA, vii) M5b - LMA; viii) M6 – AML, ix) M7 - AML(6-9).
Currently, this system still represents a central model for classification of the acute leukemias, being however incorporated in current classifications systems such as the immunophenotyping by flow cytometric performed using monoclonal antibodies (MoAb) labeled with fluorochromes, which recognize specific epitopes of cellular antigens, allowing a more precise delineation of the lineage of cells involved in leukemogenesis(10-14).
Flow cytometry is a very complex laboratory procedure, essential for the diagnosis of acute leukemia(15). Is performed more frequently to distinguish between myeloid (AML) and lymphoid (ALL) leukemias, and also very important in the post-treatment monitoring of these entities, aiming at the detection of minimal residual disease, contributing to the prognosis and treatment of AML(4,16).
In AML, the immunophenotyping and FAB classification are both important in identifying of leukemic cells with little or no cell differentiation (10-14,17,18). The use of several MoAb such as CD33, CD13, CD117 and anti-myeloperoxidase, allows the characterization and identification of these
leukemias. The simultaneous expression of two or more myeloid antigens characterizes the myeloid lineage under immunological point of view(11-14,17,18).
The immunophenotyping has a important role in the diagnosis of AML difficult to characterize by the cytomorphologic analysis such as AML-M0 and M7, but also in some cases of AML-M5a and in the diagnosis of AML-M3 (especially the hipogranular variant form), characterized by a strong expression of CD13, CD33 and CD117 associated with no expression of CD34 and HLA-DR(11,18,19).
To characterize the other FAB subtypes of LMAs, IF/FC is less important, but corroborates the cytomorphological findings in diagnosis and differentiation between the M1/M2 subtypes(8,11-14,17,18). The expression of monocytic antigens as CD14, CD16 and CD11b were present in the monocyte population, characterizing monocytic leukemia (M4 and M5) and finally, the erythroleukemia (AML-M6) that characterizes by the expression of alpha glycophorin (CD235)(11,18).
The analysis of the worldwide incidence of subtypes of leukemia has shown significant variations in relation with the geographical distribution, gender, age, ethnicity and socioeconomic status, suggesting that there are several etiological factors. Therefore, studies about the frequencies of different subtypes of leukemias are of great importance, especially in regions with different socioeconomic characteristics such as Brazil(3).
The aim of this study was to perform immunophenotyping by flow cytometry of patients with acute myeloid leukemia, to correlate with clinical data, laboratory and epidemiological these patients.
PATIENTS AND METHODS Patients
We studied 338 patients, adult and children, with newly diagnosed AML, attended in the Department of Hematology of Hemocentro Dalton Cunha (HEMONORTE), Natal City located in Northeastern Brazil. Samples of bone
marrow (BM) aspirate and peripheral blood (PB) were collected to hematological analysis.
Diagnosis of AML was initially based on clinical presentation and for laboratory diagnosis followed the criterion for the presence of more than 20% blast cells in the BM, whose morphological evaluation followed the criteria of the FAB classification(6-9). All patients provided a written informed consent according to the Declaration of Helsinki.
METHODS
Hematological analysis from peripheral blood and bone marrow cytomorphology
Hematological analysis was performed with 10 mL of peripheral venous blood collected in blood collection tubes containing EDTA. White blood cell count, hemoglobin dosage, and platelet count were scored in the hematological analyzer (Cell-Dyn 3.000, Unipath Corp., Mountain View, CA). Cytomorphological analysis of blood smear in which 100 leukocytes were counted in optical microscope in 20, 40 and 100x increase lens (Zeiss Microscope, Gütting, Germany) and the result scored in percentage and cytomorphological alterations were also recorded (Figure 1).
Bone marrow aspirate smears were stained with May-Grunwald-Giemsa (MGG) for morphological analysis and FAB classification. Cytomorphological analysis from BM smear was performed on optical microscope in 100x increase lens (Zeiss Microscope, Gütting, Germany).
Clinical data were collected from medical records filled by a doctor according to the anamnesis.
Flow cytometry analysis of immunological profile
The immunophenotyping was performed on BM or PB samples collected in EDTA using panels of monoclonal antibodies (MoAb) based on the European Group for the Immunological Characterization of Leukemia (EGIL) and Euro Flow Group recommendation(11,20).
A total of minimum 20.000 events were acquired with Fluorescence Activated Cell Analyzer (FACScan, San Jose, CA, USA) with Cell Quest software (Cell Quest TM Software, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). The panel of conjugated MoAb directly conjugated to fluorochromes and specific for diagnosis of AL, consisted of: antigens associated with T lymphocyte (CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 e CD8), B cells (CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a, IgM), myeloid cells (CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD117, CD41, CD61, CD36, CD235, CD65, CD66b and MPO), Natural Killer lineage (CD16 and CD56), and not specific lineage (CD45, CD34, CD38, CD123, HLA-Dr). All the MoAbs were coming from Becton Dickinson (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA), and the immunostaining and reading the FC performed according to protocols established by the literature(17,21). The results are provided in the histograms form as percentages of cell population positive or negative reaction, and fluorescence intensity (Figure 2).
Statistical analysis
A statistical analysis was performed through Kruskal Wallis, Mann-Whitney and Chi-square tests. Kruskal Wallis and Mann-Mann-Whitney tests were used for independent samples to see if there were differences statistically significant (p<0.05). The chi-square test shows whether there is an association. The significance level also was taken to be 5% (p<0.05).
RESULTS
We studied 338 patients, 182(53.8%) were male and 156(46.2%) were female. The age of the analyzed group ranged from 1 to 90 years old and were distributed as follows: i) children (≤ 18 years old) with 69(20.5%) cases, ii) adults (> 18-60 years old with 228(67.45%) cases and iii) elderly patients (> 60 years old with 41(12.2%) cases (Table 1).
In relation the laboratory data, the white blood count ranged from 900/mm3 to 790.000/mm3, and the children group presented the higher mean, with 82.312/mm3. The hemoglobin dosage was less than 12g/dL in all the cases (from 2.5-12g/dL), with the children group presenting the lowest mean
(7.79g/dL). Platelet count ranged from 7.000/mm3 to 391.000/mm3, and the lowest mean (58.178/mm3) was found in the children group. This group also presented the higher mean (82%) of peripheral blast cells percentage (range 5-100%) (Table 1).
Clinical data was also investigated, such as splenomegaly, hepatomegaly,lymphadenopathy, skin infiltration and tumoral mass. Of these, splenomegaly and hepatomegaly were the most frequently observed, occurring in 270 and 196 cases, respectively. Correlating with the age, all the clinical manifestations were most present in the adult group (Table 1).
About the FAB classification, of the 338 patients, 4(1.2%) were AML-M0, 110(32.5%) were AML-M1, 82(24.3%) AML-M2, 38(11.2%) AML-M3, 53(15.7%) AML-4, 35(10.3%) AML-M5, 9(2.7%) AML-M6 and 7(2.1%) AML-M7 Analyzing the monoclonal antibodies expression with FAB group, we found that more than 50% of blasts cells were positive for: i) MPO, CD13, CD33, CD117, CD65, HLA-Dr and CD34 in AML-M0; ii) MPO, CD13, CD33, CD117, HLA-HLA-Dr, CD34 and CD123 in AML-M1; iii) MPO, CD13, CD33, CD117 and HLA-Dr in AML-M2; iv) MPO, CD13, CD33, CD117 and CD123 in AML-M3; v) MPO, CD11b, CD13, CD14, CD33, CD117, HLA-Dr, CD34 and CD123 in AML-M4; vi) MPO, CD11b, CD13, CD14, CD33, HLA-Dr and CD123 in AML-M5; vii) CD13, CD235 and CD36 in AML-M6; viii) CD13,CD33, CD41, CD61, CD117, HLA-Dr, CD34 and CD38. Of 338 patients, the markers most present in AML were MPO, CD13, CD33, CD117, HLA-Dr, CD34 and CD123 (Table 2).
The statistical analysis showed the presence of all myeloid markers was significant (p<0.05) in all the FAB subgroups, except the CD66b that was no expressed in all cases. In relation lymphoid markers, the positivity for CD19, CD3, CD5, CD7 and CD8 were statistically significant (p<0.05), and the AML-M7 presented the higher positive rate 28.57% for CD7, and the AML-M2 showed for CD19 a positive rate 9.76%. On the other side, the absolute number of the cases that more expressed CD19 and CD7 was AML-M1, with 9 and 18, respectively. The markers associated a non specific lineage presented p<0.05 in all them, except TdT (Table 2).
Analyzing the markers with WBC, we evaluated the antigen presence in the three groups: i) low WBC (< 5.000 cel/mm3); ii) high WBC (10.000 – 50.000
cel/mm3); iii) higher WBC (> 50.000 cel/mm3). The antigens more expressed were the same in all the groups (Table 3).
In relation to platelet count and monoclonal antibodies, we divided the cases in three groups: lower platelet count (< 30.000/mm3), low platelet count (30.000 - 100.000/mm3) and normal platelet count (> 100.000/mm3). We observed the antigens HLA-Dr and CD34 were expressed in more that 50% of the cases with low and normal platelet count, being statistically significant (p<0,05) for this parameter. In lower platelet count the expression of theses markers was below 50%. The positive rate for the others markers was similar in all the groups (Table 4).
DISCUSSION
Although the diagnosis and classification of AML are still based on morphological criteria, currently immunophenotyping by flow cytometry has been used in our laboratory aimed at better diagnostic accuracy(11).
In immunophenotypic classification of AML is important to note the inclusion of M0 and M7 subtypes (11). The FAB-M0 subtype lacks the enzyme MPO detectable by conventional cytochemistry, does not express lymphoid antigens, usually is CD33 and CD13 positive and expresses intracytoplasmatic MPO(11,18).
The AML-M7 has no well-defined morphological criteria, being identifiable by MoAb directed against platelet glycoproteins such as CD41 and CD61(8,11,18).
The monocytic AML have their own standard immunophenotypic with reactivity for monocytic antigens associated such as CD14 and CD16, a fact observed in this study(11,18).
The HLA-Dr was expressed in most cases of AML, except in cases of AML-M3, corroborating the literature(11,18,19).
Correlating the results of cytomorphological analysis and flow cytometry, we observed a direct correlation between the FAB classification and
immunophenotyping in all cases investigated, corroborating our results with literature data which relate directly to IF/CF with FAB classification in AML(11).
The CD117 antigen expression was correlated with low platelet count and the presence of hemorrhagic phenomena, being associated with a poor prognosis(22).
Finally it is important to highlight the importance of aberrant expression of lymphoid antigens (CD4 and CD7) in 8(21%) of AML cases, being the CD7 expression more frequent, 15.8% of the patients studied, corroborating with the literature(23).
In the six cases that showed an aberrant expression of CD7 we also observed a strongly expression of CD34, featuring therefore very immature AML. The CD7 is a glycoprotein of molecular weight 40 kDa and represents a membrane antigen associated with T cells. In these cells, his expression precedes the rearrangement of the T cell receptor genes, suggesting that it may be an antigen present on progenitor cells. Although their function as adhesion molecule is not well understood, it is believed that it will play an important role in adhesion and activation of T cells. Some authors, however, believe that the expression of this antigen on progenitor cells could be related in mediating the migration of these cells from the bone marrow to the thymus. Recently this antigen was identified in progenitor cells that can give rise to other cell lines and can thus be observed on some very immature AML, a fact observed in this study(11,18,24).
In conclusion, it is relevant to emphasize the importance of determining the immunophenotypic profile in the differential diagnosis of AML, related to physiopathology events. Thus, our results suggest that immunophenotyping is crucial for diagnosis and treatment monitoring of these neoplasms.
Acknowledgment:
Fundação de Apoio a Pesquisa do Rio Grande do Norte (FAPERN), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Pro-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte and Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE).
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Table 1. Correlation of clinical and laboratorial data with Age. Factors Children (<18 years)
N = 69 (20.5%) Adult (18-60 years) N = 228 (67.45%) Elderly (> 60 years) N = 41 (12.2%) p-values Male-182(53.8%) Female-156(46.2%) 36(10.7%) 33(9.8%) 126(37.3%) 102(30.3%) 20(5.9%) 21(6.2%) 0,995 * WBC (0.9- 790x103cel/mm3) 1-300x103/mm3 Mean: 82.312,9 /mm3 0.9 - 790 x103/mm3 Mean: 74.310 1.3-149 x103/mm3 Mean: 67.719,5 0,394 Hemoglobin (2.5 - 12g/dL) 2.6 – 11g/dL Mean: 7.79 g/dL 2.5 – 12.0g/dL Mean: 8.28g/dL 2.6 – 11.8g/dL Mean: 8.37g/dL 0,174 Platelet count (7.000 - 391.000/mm3) 10-120x103/mm3 Mean: 58.178x103/mm3 7-391x103/mm3 Mean: 65.114x103/mm3 30-215x103/mm3 Mean: 73.463x103/mm3 0,103 PB blast percentage (5-100%) 5 – 100% Mean: 82% 15 – 100% Mean: 81% 7 - 98% Mean: 76% 0,025 Splenomegaly (N=270) Hepatomegaly (N=196) Lymphadenopathy (N=31) Skin infiltration (N=18) Tumoral Mass (N=12) 52 (19.33%) 37 (18.97%) 6 (19.35%) 3 (16.67%) 2 (16.67%) 181 (67.04%) 134 (68.37%) 21 (67.74%) 14 (77.78%) 10 (83.33%) 37 (13.75%) 25 (12.82%) 4 (12.90%) 1 (5.56%) 0 (0%) 0,177 0,745 0,940 0,589 0,366 Note: N (Number of patients); WBC (White blood cell); PB (Peripheral blood). * Mann-Whitney test .
Table 2. Distribution of FAB classification and expression of markers in the
Table 3. Correlation of Monoclonal antibodies and white blood cell count.
MoAb Low WBC count
(<5 x 103 cel/mm3) High WBC count (10-50 x 103 cel/mm3 ) Higher WBC count (>50 x 103 cel/mm3) p-values** Cases: 29 (8.6%) 94 (27.8%) 204 (60.3%) Anti-MPO 20/26 (76.92%) 60/69 (86.96%) 143/169 (84.61%) 0,097 CD11b 4/29 (13.79%) 19/90 (21.11%) 61/202 (30.20%) 0,220 sCD13/cCD13 24/29 (82.76%) 88/94 (93.62%) 196/204 (96.08%) 0,275 CD14 1/29 (3.45%) 17/94 (18.08%) 44/204 (21.57%) 0,007 CD15 4/29 (13.79%) 17/77 (22.08%) 38/180 (21.11%) 0,061 CD33 26/29 (89.65%) 77/93 (82.79%) 175/203 (86.21%) 0,377 CD41/CD61 4/29 (13.79%) 1/94 (1.06%) 1/204 (0.49%) 0,037 CD117 18/25 (72%) 53/84 (63.09%) 119/181 (62.98%) 0,510 CD235 0/29 (0%) 5/92 (5.43%) 4/193 (2.07%) 0,867 CD36 0/7 (0%) 2/19 (10.53%) 11/52 (21.15%) 0,648 CD65 2/13 (15.38%) 10/25 (40.00%) 25/61 (40.98%) 0,089 CD66b 0/9 (0%) 0/15 (0%) 0/47 (0%) 0,173 CD19 3/29 (10.34%) 4/94 (4.25%) 15/203 (7.39%) 0,119 CD10 0/29 (0%) 0/94 (0%) 1/204 (0.49%) 0,985 CD20 1/29 (3.45%) 0/92 (0%) 2/192 (1.04%) 0,133 sCD22/cCD22 1/29 (3.45%) 1/93 (1.07%) 6/204 (2.94%) 0,081 CytCD79a 1/28 (0%) 0/73 (0%) 1/137 (0%) 0,061 sIgM/cytIgM 0/29 (0%) 0/88 (0%) 0/194 (0%) 0,723 CD1a 0/27 (0%) 0/91 (0%) 0/201 (0%) 0,297 CD2 4/29 (13.79%) 0/91 (0%) 3/195 (1.54%) 0,841 sCD3/cytCD3 3/29 (10.34%) 1/94 (1.06%) 8/204 (3.92%) 0,696 CD4 0/29 (0%) 1/94 (1.06%) 1/204 (0.49%) 0,158 CD5 2/29 (6.90%) 0/82 (0%) 4/193 (2.07%) 0,497 CD7 3/29 (10.34%) 8/94 (8.51%) 23/204 (11.27%) 0,787 CD8 0/29 (0%) 0/94 (0%) 1/203 (0.49%) 0,162 CD16-56 4/28 (14.28%) 3/94 (3.19%) 14/202 (6.93%) 0,183 HLA-DR 10/27 (37.04%) 47/93 (50.54%) 108/191 (56.54%) 0,080 CD34 13/29 (44.83%) 60/94 (63.83%) 136/204 (66.67%) 0,011 CD38 11/25 (44%) 25/81 (30.86%) 63/183 (34.43%) 0,608 TdT 1/22 (4.54%) 1/72 (1.39%) 14/181 (7.73%) 0,212 CD123 3/5 (60.00%) 12/20 (60.00%) 26/35 (74.28%) 0,679
Note: WBC (White blood cell); MPO (Myeloperoxidase), TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase), MoAb (Monoclonal antibody). ** Kruskal Wallis Test.
Table 4. Correlation of Monoclonal antibodies and platelet count. MoAb Lower platelet count
(<30 x 103 /mm3)
Low platelet count (30-100 x 103/mm3 )
Normal platelet count
(>100 x 103 cel/mm3) p-values** Cases: 54 248 36 Anti-MPO 45/48 (93.75%) 159/197 (80.71%) 26/28 (92.86%) <0,0001 CD11b 9/54 (16.67%) 67/241 (27.80%) 10/36 (27.78%) 0,413 sCD13/cytCD13 51/54 (94.44%) 234/248 (94.35%) 33/36 (91.67%) 0,001 CD14 5/54 (9.26%) 49/248 (19.76%) 8/36 (22.22%) 0,001 CD15 15/47 (31.91%) 40/215 (18.60%) 6/32 (18.75%) 0,012 CD33 52/54 (96.30%) 204/246 (82.93%) 31/36 (86.11%) 0,014 CD41/CD61 1/54 (1.85%) 5/248 (2.02%) 0/36 (0%) 0,065 CD117 45/53 (84.90%) 134/215 (62.32%) 20/33 (60.61%) <0,0001 CD235 0/54 (0%) 8/235 (3.40%) 1/35 (2.86%) 0,589 CD36 1/6 (16.67%) 11/64 (17.19%) 1/8 (12.50%) 0,628 CD65 4/10 (40.00%) 29/78 (37.18%) 4/11 (36.36%) 0,659 CD66b 0/7 (0%) 0/55 (0%) 0/9 (0%) 1,000 CD19 3/54 (5.55%) 18/247 (7.29%) 1/36 (2.78%) 0,516 CD10 0/54 (0%) 1/248 (0.40%) 0/36 (0%) 0,080 CD20 0/52 (0%) 2/237 (0.84%) 1/35 (2.86%) 0,243 sCD22/cytCD22 0/54 (0%) 6/247 (2.43%) 2/36 (5.55%) 0,003 CytCD79a 0/50 (0%) 1/167 (0.60%) 1/31 (3.22%) 0,424 sIgM/cytIgM 0/51 (0%) 0/238 (0%) 0/31 (0%) 0,565 CD1a 0/51 (0%) 0/242 (0%) 0/35 (0%) 0,858 CD2 1/53 (1.89%) 4/237 (1.69%) 2/34 (5.88%) 0,573 sCD3/cytCD3 2/54 (3.70%) 10/248 (4.03%) 2/36 (5.55%) 0,039 CD4 0/54 (0%) 1/248 (0.40%) 2/36 (5.55%) 0,004 CD5 1/50 (2.00%) 4/232 (1.72%) 1/31 (3.22%) 0,131 CD7 1/54 (1.85%) 27/248 (10.89%) 6/36 (16.67%) 0,341 CD8 0/54 (0%) 1/247 (0.40%) 0/36 (0%) 0,191 CD16-56 4/54 (7.41%) 14/245 (5.71%) 3/36 (8.33%) 0,334 HLA-DR 12/54 (22.22%) 135/235 (57.45%) 24/33 (72.73%) <0,0001 CD34 17/54 (31.48%) 171/248 (69.95%) 25/36 (69.44%) <0,0001 CD38 17/49 (34.69%) 68/218 (31.19%) 14/33 (42.42%) 0,170 TdT 0/40 (0%) 12/217 (5.53%) 4/28 (14.28%) 0,100 CD123 3/3 (100%) 34/50 (68%) 4/7 (57.14%) 0,090
Note: MPO (Myeloperoxidase), TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase), MoAb (Monoclonal antibody). ** Kruskal Wallis Test.
Figure 1: Distension of bone marrow aspirate from AML-M6 case, stained by
Figure 2: AML immunophenotypic profile by flow cytometry. A) representative
histogram of SSC x FSC parameters (Granularity x size) of the opulation analyzed (in red); B) Graphic representation of type "Dot Plot" to characterize the CD117 (68%) and HLA-Dr (18%) expression; C) Myeloid blastics cells (CD13 +/CD65 +); D) Antigen CD123 positive. Source: Collection of the author.
A B
5.2 O artigo foi submetido ao periódico Journal of Clinical Laboratory Analysis
que possui fator de impacto 1.356 e qualis B2 da CAPES para área Medicina II.
Frequency and clinical significance of P-Glycoprotein and Multidrug Resistance-Associated Protein-1 expressions in leukemic cells from
Acute Myeloid Leukemia
Andrea Luciana Araújo da Cunha Fernandes; Juliana Mendonça Freire; Gabriela Vasconcelos de Andrade Alves; Victor Cesar Tavares de Sá Leitão; Gioconda Dias Rodrigues Leão; Taissa Maria Moura de Oliveira; Roberto Chaves de Vasconcelos; Erica Aires Gil (1); Rosana Lucena Tavares de Sá Leitão; James Farley Rafael Maciel; Aldair de Souza Paiva; Valéria Soraya de Farias Sales;Tereza Neuma de Souza Brito; Dany Geraldo Kramer Cavalcanti e Silva; Marcos Dias Leão; Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior
ABSTRACT
BACKGROUND: Despite the advances in the cure rate for acute myeloid
leukemia, a considerable number of patients die from their disease due to the occurrence of multidrug resistance (MDR). Overexpression of the transporter proteins P-glycoprotein (Pgp) and multidrug resistance-associated protein
(MRP) confer resistance to the treatment these leukemias. OBJECTIVE: To analyze the expression of the Gpp and MRP1 in patients with AML by flow cytometry (FC) and to determine the correlation between expression and demographic and also clinical and laboratorial variables. METHODS: Bone marrow and peripheral blood samples from 346 patients with a diagnosis of AML were assessed for the expression of Pgp and MRP1 by FC. RESULTS: The expression of Pgp and MRP1 was found in 111 (32.1%) and 133 (38.4%) patients, respectively, with greater prevalence in older patients and lower in adolescents, observing also a high incidence in patients with refractory disease, recurrence and secondary in comparison with the cases of de novo AML. Regarding the laboratory findings, we observed a higher correlation statistically significant between the expression of Pgp and MRP1 in AML CD34+ and FAB AML M7, M5A and M2 and lower the M3 subtype, not observed statistically significant correlation between the phenotype MDR and other laboratory data such with hemoglobin, leukocyte count, platelet count, aberrant expression of
lymphoid antigens (CD2, CD7 and CD19) and clinical signs related to the disease. CONCLUSIONS: The results showed that the detection of MDR phenotype by flow cytometry can be a molecular marker for prognosis independent patients diagnosed with AML
Key Word: P-Glycoprotein; Multidrug Resistance-Associated Protein-1; Acute
Myeloid Leukemia.
INTRODUCTION
Despite great advances in chemotherapy treatment and the recent discovery for the cure of several hematologic malignancies, there are still some cases, such as relapse and refractory leukemia, with treatment failure. Treatment failure can be partially explained by pharmacokinetic mechanisms which reduce the length of time or the effective exposure level of leukemic blasts to drugs, also known as cell resistance to drugs or multiple drug resistance (MDR) (1-3). MDR is seen as the most significant barrier to effective treatment of malignant tumors, especially acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL) (3-4).
MDR is a multifactorial drug-resistance phenomenon explained by a variety of molecular mechanisms, such as the washout of intracellular cytostatic drugs by drug efflux pumps (extrusion), reduced intracellular uptake, alteration of the molecular-targeted drug and failure of regulatory mechanisms for programmed cell death or apoptosis (1-3).
In the last few years, the most investigated MDR mechanism in patients with leukemia has been the extrusion of chemotherapeutic agents by drug efflux pumps (3), especially P-glycoprotein (Pgp), a plasma membrane protein of 170 kDa, encoded by the MDR1 gene, located in the chromosome 7q211 (1-5). Pgp functions as an energy-dependent efflux pump by expelling cytostatic drugs from the cytoplasm, therefore decreasing their accumulation in the intracellular milieu to sublethal levels (1-5). This protein belongs to the ATP-binding cassette (ABC) superfamily of transporters, also known as ATPases transporters (1-5).
Additionally, other transporters proteins have been implicated in the MDR phenomenon, especially the multidrug resistance-associated protein (MRP) and
