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Caracterização de genes de virulência de Escherichia coli de adesão difusa (DAEC)

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Academic year: 2021

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(1)FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR. CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli DE ADESÃO DIFUSA (DAEC). MARINA HECKMANN BOVE. Orientadora: Prof. Dra. Cynthia Maria Kyaw. Brasília, março de 2010.

(2) MARINA HECKMANN BOVE. CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli DE ADESÃO DIFUSA (DAEC). Dissertação de Mestrado apresentada ao Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Molecular.. Orientadora: Profa. Dra. Cynthia Maria Kyaw. Brasília, março de 2010 ii.

(3) Trabalho desenvolvido no Laboratório de Microbiologia e no Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, com o apoio financeiro do CNPq.. iii.

(4) Dedico este trabalho ao meu avô Miguel (in memoriam), que certamente está orgulhoso de mim.. iv.

(5) AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, um MUITO obrigada à minha querida “chefa” pela oportunidade e pela orientação. Não tenho palavras para agradecer por todos esses anos de ensinamento! Mais que microbiologia e biologia molecular, você me ensinou sobre respeito, humildade, ética, caráter, perseverança e criatividade. Você é meu exemplo de educadora. Obrigada por todo o carinho, por sua confiança e paciência infinita, pela amizade, pelas risadas e pelas inúmeras vezes em que foi, além de orientadora, companheira de bancada. Aos meus pais, pelo amor, incentivo e apoio incondicional. Obrigada pela infância no mato, que me transformou em amante da biologia enquanto eu ainda usava fraldas. Obrigada por me deixarem pisar descalça na grama, correr entre as melancias, alimentar o veado campeiro, subir em árvores, comer amora do pé, resgatar mico-estrela e amar os cachorros. Um muito obrigada aos meus irmãos, que fizeram tudo (ou quase tudo) isso comigo. Às minhas queridas avós, meus grandes exemplos de mulheres batalhadoras! Minha admiração por vocês é incomensurável. Ao meu amado avô Miguel (in memoriam), a maior prova de que a educação pode transformar profundamente a vida de uma pessoa e de todos à sua volta. Obrigada por ter sempre acreditado em mim, incentivado meus estudos e financiado muitos dos meus sonhos. Ao Fabio, por tanto amor, carinho e companheirismo ao longo desses quatro anos. Obrigada pela dedicação, ajuda e paciência de Jó nessa reta final! Te amo! À tia Patrícia, por adorar ouvir minhas estórias sobre bactérias incríveis. Aos meus queridos amigos e companheiros de bancada Gustavo, Márcio, Elisa e Adryelle, por tantas idéias, sugestões, risadas e pelas milhares de vezes em que me compraram com chocolate durante a TPM. Muitíssimo obrigada pela imensa ajuda nos meus experimentos sempre que precisei! Sem vocês o caminho até aqui teria sido bem mais árduo. Aos alunos, professores, estagiários e técnicos da Micro, em especial aos colegas Alex, Heidi, Rosane, Ricardo, Liliam, Maria Inês e aos professores Loreny, Cézar, Beatriz e Marlene, por terem sido sempre tão solícitos. Obrigada pelas contribuições e gentilezas, que tornaram meu trabalho possível e agradável. Aos Sucupira Pedroza, por terem me recebido com enorme carinho em sua família e pelas centenas de almoços que adiantaram meus experimentos. Aos colegas da BioMol por tantos empréstimos, doações e auxílios teóricos e técnicos. Sem sua ajuda certamente não teria chegado onde cheguei. Um muito obrigada especial aos professores Ildinete, Andréa e Marcelo, pelas sugestões e críticas que contribuíram imensamente para a minha aprendizagem, e aos colegas do Lab 4 Thiago, Eveline, Lorena e Marciano, que salvaram minha vida inúmeras vezes com seus favores, doações e ensinamentos. Ao Marcus Teixeira, pelo precioso tempo que dedicou a me ajudar com os sequenciamentos e as árvores filogenéticas. Não tenho palavras para agradecer!. v.

(6) Aos pesquisadores Dr. Luciano Paulino da Silva e Dra. Ana Claudia Guerra Araujo (Cenargen) e Profa. Dra. Sônia Nair Báo (UnB) por terem gentilmente cedido o microscópio de força atômica, o microscópio eletrônico de varredura e o microscópio eletrônico de transmissão. À Ana Cristina Meneses Mendes Gomes, à Débora de Oliveira Cintra e Silva e ao Dr. Luciano Paulino da Silva, pelas imagens de microscopia utilizadas neste trabalho. À Ana, por todas as informações e pela ajuda durante esses dois anos. Aos dez mais, Antônio, Ayeska, Babi, Beto, Bruno, Catilanga, Daya, Elisa, Jaca e Ju, por infinitas risadas, discussões bio-filosóficas, tardes/manhãs/noites de estudo, viagens, abraços, conselhos, elogios e ensinamentos ao longo desses sete anos. Aos queridos amigos de Goiânia Erika, Éricka, Fran, Luciana, Luciano e Thaísa, que mesmo longe estão sempre tão perto. Às queridas companheiras de apartamento Aninha, Ingrid, Bruna, Isabel e Camila, por tantos bons momentos. À eterna professora Carla, a quem devo muito do que sei sobre biologia e cuja voz ecoa em minha mente mesmo depois de tanto tempo. Era verdade!. vi.

(7) “Não podemos compreender a maravilhosa complexidade de um ser orgânico (...). Cada ser vivo deve ser considerado um microcosmo - um pequeno universo formado por uma multidão de organismos que se autopropagam, inconcebivelmente diminutos e tão numerosos quanto as estrelas no céu.” Charles Darwin, 1882.. vii.

(8) ÍNDICE Lista de abreviaturas Lista de figuras Lista de tabelas Resumo Abstract. xii xv xix xxi xxii. Introdução 1. Escherichia coli diarreiogênicas 1.1. Escherichia coli enterotoxigênicas (ETEC) 1.2. Escherichia coli enteroagregativas (EAEC) 1.3. Escherichia coli enteroinvasivas (EIEC) 1.4. Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) 1.5. Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC) 1.6. Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) 2. As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) 2.1. Epidemiologia 2.2. Adesinas Afa/Dr 2.3. Patogenicidade 3. Ilhas de patogenicidade 4. A ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement) 5. O Sistema de Secreção do Tipo Três (TTSS) 6. A regulação da expressão dos genes do TTSS 7. Os genes LEE como indicadores de virulência. 1 1 3 3 3 4 4 5 5 5 6 7 9 11 13 19 19. Objetivos. 21. Materiais e Métodos 1. Linhagens bacterianas 1.1. Linhagens de Escherichia coli de adesão difusa 1.2. Linhagens controle 1.3. Linhagens transformantes 2. Plasmídeos 3. Meios de cultura 4. Soluções 4.1. Soluções de uso geral 4.2. Soluções para a extração de DNA total 4.3. Soluções para a extração e precipitação de RNA 4.4. Soluções para eletroforese em gel de agarose. 22 22 22 22 23 23 24 25 25 25 26 26 viii.

(9) 4.5. Solução de dietilpirocarbonato 4.6. Antibióticos e soluções utilizadas na seleção de clones transformantes 4.7. Soluções para os testes de adesão e de infecção de células HeLa 4.8. Soluções para a Microscopia Eletrônica de Varredura 5. Enzimas 6. Marcadores de massa molecular (MM) 7. Kits utilizados 8. Manutenção da linhagens bacterianas 9. Extração de DNA para a realização de experimentos de PCR 9.1. Cultivo das linhagens bacterianas 9.2. Extração de DNA total 9.3. Extração de DNA plasmidial 10. Extração de RNA 10.1. Cultivo das linhagens bacterianas e indução da expressão dos genes TTSS 10.2. Extração 10.3. Tratamento dos RNAs extraídos com DNase I 11. Ensaios de PCR para a amplificação de prováveis genes TTSS de DAEC 12. PCR dos DNAs plasmidiais extraídos com os iniciadores Universal e Reverso 13. Transcrição reversa dos RNAs extraídos e PCRs empregando o cDNA gerado 13.1. Síntese da fita de cDNA 13.2. Ensaios de PCR para amplificação do cDNA produzido por RT-PCR 14. Análise dos produtos de PCR e das amostras extraídas de DNA total, RNA e DNA plasmidial por eletroforese em gel de agarose 15. Clonagem dos produtos amplificados por PCR no vetor pGEM®-T Easy 16. Transformação de Escherichia coli por choque térmico 16.1. Transformação de Escherichia coli DH5 16.2. Transformação de Escherichia coli XL-10 Gold 17. Sequenciamento automático dos produtos obtidos por PCR utilizando como molde DNA total ou DNA plasmidial extraído dos clones transformados 18. Análises filogenéticas 19. Microscopia Eletrônica 19.1. Cultivo das linhagens bacterianas para Microscopia Eletrônica 19.2. Teste de adesão de células HeLa em meio abiótico 19.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) A. Infecção de células HeLa B. Purificação dos filamentos de EspA C. Processamento das amostras e análise ao microscópio 19.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). 28 28 28 30 31 31 32 32 33 33 33 34 35 35 35 35 36 38 39 39 40 40 40 41 41 41 41 42 43 43 44 45 45 46 46 46 ix.

(10) A. Infecção de células HeLa B. Processamento das amostras e análise ao microscópio 20. Microscopia de Força Atômica 20.1. Cultivo das linhagens bacterianas 20.2. Preparação das amostras 20.3. Análise ao microscópio de força atômica. 46 47 47 47 48 48. Resultados e Discussão 1. Detecção de prováveis genes TTSS de DAEC 1.1. Definição dos genes a serem amplificados 1.2. Síntese dos iniciadores 1.3. Identificação e caracterização do provável gene escD de DAEC 1.4. Identificação e caracterização de prováveis genes espA de DAEC 1.4.1. Provável espA do isolado C39 1.4.2. Provável espA do isolado C40 1.4.3. Provável espA do isolado C74 1.5. Identificação e caracterização de prováveis genes espD de DAEC 1.5.1. Provável espD do isolado C39 1.5.2. Provável espD do isolado C40 1.6. Identificação e caracterização de prováveis genes espB de DAEC 1.6.1. Provável espB do isolado C39 1.6.2. Provável espB do isolado C74 1.7. Identificação e caracterização de prováveis genes cesD2 de DAEC 1.7.1. Provável cesD2 do isolado C39 1.7.2. Provável cesD2 do isolado C74 1.8. Identificação e caracterização de prováveis genes escF de DAEC 1.8.1. Provável escF do isolado C39 1.8.2. Provável escF do isolado C74 1.9. Identificação e caracterização de um provável gene cesA2 de DAEC 1.10. Investigação da região entre os prováveis sepQ e escD de DAEC – busca pelos possíveis efetores de DAEC 1.11. Análise comparativa das identidades entre os prováveis genes TTSS identificados em DAEC e os homólogos depositados no GenBank 2. Construção de árvores filogenéticas empregando as sequências dos prováveis genes TTSS de DAEC 2.1. Árvore filogenética com o provável escD da DAEC C39 2.2. Árvore filogenética com o provável espA das DAEC C39, C40 e C74 2.3. Árvores filogenéticas com os prováveis espD da DAEC C39 e espB das DAEC C39 e C74. 49 49 49 50 51 53 55 56 57 62 65 65 68 70 71 74 74 75 76 78 79 81 82 84 86 86 87 88. x.

(11) 2.4. Árvore filogenética com os prováveis escF das DAEC C39 e C74 2.5. Árvores filogenéticas com os prováveis cesD2 e cesA2 da DAEC C39 2.6. Árvore filogenética consenso, com os prováveis genes TTSS das DAEC C39, C40 e C74 3. Análise da expressão dos prováveis genes TTSS de DAEC por meio de experimentos de transcrição reversa 3.1. Análise da expressão dos prováveis genes TTSS de DAEC sob condições de indução 3.2. Análise da expressão dos prováveis genes TTSS de DAEC na ausência de condições de indução 4. Análise da montagem do suposto complexo-agulha de DAEC por microscopia eletrônica e microscopia de força atômica 4.1. Busca por aparatos de secreção do tipo três na superfície de DAEC por meio de microscopia eletrônica de varredura 4.2. Busca por aparatos de secreção do tipo três na superfície de DAEC por meio de microscopia eletrônica de transmissão 4.3. Busca por aparatos de secreção do tipo três na superfície de DAEC por meio de microscopia de força atômica. 90 91. 105. Conclusões. 107. Perspectivas. 108. Referências Bibliográficas. 109. 92 93 93 99 100 101 103. xi.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS °C - Graus Celsius μg - Micrograma μL - Microlitro μM - Micromolar μm - Micrômetro g - Nanograma m - Nanômetro  - Comprimento de onda A/E - Do inglês attaching and effacing AA - Adesão agregativa AAF - Do inglês aggregative adherence fimbriae Abs660 - Absorbância a 660 m atm - Atmosfera BFP - Do inglês bundle-forming pilus CEACAM - Do inglês carcinoembryonic antigen-related cellular adhesion molecule CF - Fator de colonização fimbrial (do inglês colonization factor) CFA - Do inglês colonization factor antigen DAEC - Escherichia coli de adesão difusa DAF - Do inglês decay-accelerating factor DEPC - Dietilpirocarbonato DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA - Ácido desoxirribonucléico DR - Repetição direta (do inglês direct repeat) cDNA - DNA complementar dNTP - Desoxinucleotídeos 5’-trifosfato EAEC - Escherichia coli enteroagregativa EAF - Do inglês EPEC adherence factor EAST1 - Do inglês enteroaggregative E. coli ST1 EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético EHEC - Escherichia coli enterohemorrágica EIEC - Escherichia coli enteroinvasiva EPEC - Escherichia coli enteropatogênica ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica g - Força gravitacional HC - Colite hemorrágica HM - High DNA Mass Ladder HUS - Síndrome urêmica hemolítica xii.

(13) Hz - Hertz IPTG - Isopropil--D-tiogalactopiranosídeo IS - Sequencia de inserção (do inglês insertion sequence) kb - Kilobases kV - Kilovolts kHz - KiloHertz L - Litro LA - Meio de cultura Luria Bertani ágar LB - Meio de cultura Luria Bertani LEE - Do inglês locus of enterocyte effacement LT - Enterotoxina termolábil (do inglês heat-labile enterotoxin) M - Molar mL - Mililitro MM - Marcador de massa molecular mM - Milimolar NC - Complexo-agulha (do inglês needle complex) orf - Quadro de leitura aberta (do inglês open reading frame) p/v - Peso/volume P.A. - Pureza absoluta PAI - Ilha de patogenicidade (do inglês pathogenicity island) pb - Pares de bases PBS - Solução salina fosfato tamponada PCR - Reação de polimerização em cadeia (do inglês Polymerase Chain Reaction) pH - Potencial hidrogeniônico PMNL - Leucócitos polimorfonucleares RNA - Ácido ribonucléico tRNA - RNA de transferência RNase - Ribonuclease rpm - Rotações por minuto RT - Transcrição reversa (do inglês reverse transcription) ShET1 - Do inglês Shigella enterotoxin 1 ST - Enterotoxina termoestável (do inglês heat-stable enterotoxin) Stx - Toxina Shiga STEC - Escherichia coli produtora de toxina Shiga Tris - Trihidroximetilaminometano TTSA - Aparato de Secreção do Tipo Três (do inglês Type Three Secretion Apparatus) TTSS - Sistema de Secreção do Tipo Três (do inglês Type Three Secretion System) U - Unidade enzimática UnB - Universidade de Brasília. xiii.

(14) UPEC - Escherichia coli uropatogênica v - Volume v/v - Volume/volume X-gal - 5-bromo-4cloro-3indolil--D galactopiranosídeo. xiv.

(15) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Interação dos seis patotipos de Escherichia coli diarreiogênicas com a célula-alvo.. 2. Figura 2. Lesão A/E causada por EPEC e EHEC.. 4. Figura 3. Interação de DAEC com células do epitélio intestinal.. 8. Figura 4. Estrutura de uma PAI típica.. 10. Figura 5. Diagrama do LEE de E2348/69 e de EDL933.. 12. Figura 6. O aparato de secreção do tipo três de EPEC e EHEC.. 14. Figura 7. Aparato de secreção do tipo três de Shigella flexneri.. 15. Figura 8. Micrografias eletrônicas mostrando a adesão de EPEC a células HEL.. 17. Figura 9. Esquema do LEE de EPEC E2348/69, utilizado como molde na síntese dos iniciadores.. 37. Figura 10. Representação esquemática da PAI LEE da EPEC prototípica E2348/69, utilizada como modelo para a identificação de regiões e genes correspondentes em DAEC.. 50. Figura 11. Local de anelamento dos iniciadores escD FOR e escD REV no LEE da EPEC E2348/69.. 51. Figura 12. Perfis eletroforéticos dos produtos de PCR obtidos com o par de iniciadores escD FOR e escD REV.. 51. Figura 13. Local de anelamento dos iniciadores AD3 e espA REV no LEE de EPEC.. 53. Figura 14. Perfis eletroforéticos dos produtos de PCR obtidos com o par de iniciadores AD3 e espA REV.. 54. Figura 15. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação com os iniciadores Universal e Reverso.. 55. Figura 16. Alinhamento dos prováveis genes espA das DAEC C39, C40 e C74 xv.

(16) com os homólogos da EPEC E2348/69, EHEC EDL933 e de Citrobacter rodentium DBS100.. 60. Figura 17. Alinhamento das proteínas EspA preditas de C39, C40, C74, e EspA da EPEC humana E2348/69, da EHEC bovina EDL933 e de C. rodentium DBS100.. 61. Figura 18. Região de anelamento dos iniciadores espD FOR e AD4 no LEE de EPEC.. 63. Figura 19. Perfis eletroforéticos dos fragmentos de PCR obtidos empregando os iniciadores espD FOR e AD4.. 63. Figura 20. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação com os iniciadores Universal e Reverso.. 64. Figura 21. Alinhamento entre os prováveis genes espD parciais de C39 e C40 e os homólogos das linhagens prototípicas EPEC E2348/69, EHEC EDL933 e Citrobacter rodentium DBS100.. 67. Figura 22. Regiões de anelamento dos iniciadores espB FOR e espB REV no LEE de EPEC.. 68. Figura 23. Perfis eletroforéticos dos produtos de PCR obtidos com os iniciadores espB FOR e espB REV.. 69. Figura 24. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação obtidos com os iniciadores Universal e Reverso, empregando os DNAs plasmidiais extraídos das células transformadas.. 70. Figura 25. Alinhamento dos prováveis espB das DAEC C39 e C74 com os genes homólogos das linhagens prototípicas EPEC E2348/69, EHEC EDL933 e Citrobacter rodentium DBS100.. 73. Figura 26. Região de anelamento dos iniciadores escF FOR e escF REV no LEE de EPEC.. 77. Figura 27. Perfis eletroforéticos dos produtos de PCR obtidos com os iniciadores escF FOR e escF REV.. 77. Figura 28. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação com os iniciadores Universal e Reverso, empregando DNAs plasmidiais extraídos das células transformadas.. 78. xvi.

(17) Figura 29. Alinhamento das proteínas EscF preditas das DAEC C39 e C74 e EscF de EPEC E2348/69, EHEC EDL933 e Citrobacter rodentium DBS100.. 81. Figura 30. Região de anelamento dos iniciadores sepQ FOR e escD REV no LEE de EPEC.. 83. Figura 31. Perfil eletroforético dos produtos de PCR obtidos empregando DNA das amostras C39 e C74 de DAEC e do controle positivo EPEC 2348/69, com os iniciadores sepQ FOR e escD REV e a enzima Elongase®.. 83. Figura 32. Árvore filogenética construída a partir da sequência do provável escD da DAEC C39 e alguns homólogos depositados no GenBank.. 87. Figura 33. Árvore filogenética construída a partir das sequências dos prováveis espA dos isolados C39, C40 e C74 de DAEC e alguns homólogos depositados no GenBank.. 88. Figura 34. Árvore filogenética construída a partir do provável espD da DAEC C39 e alguns homólogos depositados no GenBank.. 89. Figura 35. Árvore filogenética construída a partir dos prováveis espB das DAEC C39 e C74 e de alguns de seus homólogos depositados no GenBank.. 89. Figura 36. Árvore filogenética construída a partir das sequências dos prováveis escF dos isolados C39 e C74 de DAEC e alguns homólogos depositados no GenBank.. 90. Figura 37. Árvore filogenética construída a partir da sequência do provável cesD2 do isolado C39 de DAEC e alguns homólogos depositados no GenBank.. 91. Figura 38. Árvore filogenética construída a partir da sequência do provável cesA2 do isolado C39 de DAEC e alguns homólogos depositados no GenBank.. 91. Figura 39. Árvore filogenética construída a partir das sequências dos prováveis genes TTSS das DAEC C39, C40 e C74 utilizadas nas árvores anteriores e de alguns de seus homólogos depositados GenBank.. 92. Figura 40. Perfis eletroforéticos dos RNAs dos isolados C39 e C74 de DAEC e do controle positivo EPEC E2348/69, extraídos após 30 minutos, uma hora, duas horas, três horas e trinta minutos e cinco horas de indução da expressão dos genes TTSS.. 94. Figura 41. Perfil eletroforético dos produtos da PCR confirmatória do tratamento com DNase.. 94. xvii.

(18) Figura 42. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR com o par de iniciadores GAP F e GAP R, empregando como molde cDNA gerado a partir da transcrição reversa dos RNAs da EPEC E2348/69 e dos isolados C39 e C74 de DAEC.. 95. Figura 43. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR com o par de iniciadores GAP F e GAP R, empregando como molde os RNAs extraídos da EPEC E2348/69 e dos isolados C39 e C74 de DAEC.. 96. Figura 44. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR com o par de iniciadores escF FOR e escF REV, empregando cDNA da EPEC E2348/69 e dos isolados C39 e C74 de DAEC.. 96. Figura 45. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR com o par de iniciadores AD3 e espA REV, empregando cDNA da EPEC E2348/69 e dos isolados C39 e C74 de DAEC.. 97. Figura 46. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR com o par de iniciadores espD FOR e AD4, empregando como molde cDNA da EPEC E2348/69 e dos isolados C39 e C74 de DAEC.. 98. Figura 47. Perfis eletroforéticos dos produtos amplificados por PCR, empregando como moldes os cDNAs obtidos a partir dos RNAs extraídos no tempo zero.. 100. Figura 48. Micrografias eletrônicas de varredura de DAEC C39 e C74 (B e C) e do controle positivo EPEC E2348/69 (A) trinta minutos após a infecção de células HeLa.. 102. Figura 49. Micrografias eletrônicas de transmissão da DAEC C39 (A).. 104. Figura 50. Estruturas semelhantes a apêndices se projetando a partir da superfície da Escherichia coli enteropatogênica E2348/69.. 106. Figura 51. Imagens de microscopia de força atômica mostrando flagelos da DAEC C39.. 106. xviii.

(19) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características dos isolados de DAEC utilizados neste estudo.. 22. Tabela 2. Iniciadores utilizados nos experimentos de PCR.. 36. Tabela 3. Componentes utilizados nos ensaios de PCR com a Taq DNA polimerase. 37 Tabela 4. Componentes utilizados nos ensaios de PCR com a enzima Elongase®.. 38. Tabela 5. Componentes utilizados nos ensaios de PCR com os DNAs plasmidiais.. 39. Tabela 6. Componentes utilizados nos ensaios de RT-PCR.. 39. Tabela 7. Linhagens bacterianas cujos genes TTSS foram coletados do banco de dados GenBank para análises de identidade e construção de árvores.. 43. Tabela 8. Análise de identidade do provável gene escD do isolado C39 de DAEC.. 53. Tabela 9. Análise de identidade do provável gene espA do isolado C39 de DAEC.. 56. Tabela 10. Análise de identidade do provável gene espA do isolado C40 de DAEC.. 57. Tabela 11. Análise de identidade do provável gene espA do isolado C74 de DAEC.. 58. Tabela 12. Análise de identidade do provável gene espD do isolado C39 de DAEC.. 65. Tabela 13. Análise de identidade do provável gene espD do isolado C40 de DAEC.. 66. Tabela 14. Análise de identidade do provável gene espB do isolado C39 de DAEC.. 71. Tabela 15. Análise de identidade do provável gene espB do isolado C74 de DAEC.. 72. Tabela 16. Análise de identidade da porção 5’ do provável gene cesD2 da DAEC C39.. 74. Tabela 17. Análise de identidade da porção 3’ do provável gene cesD2 do isolado C39 de DAEC.. 75. Tabela 18. Análise de identidade da porção 3’ do provável gene cesD2 do isolado C74 de DAEC.. 76 xix.

(20) Tabela 19. Análise de identidade do provável gene escF do isolado C39 de DAEC.. 79. Tabela 20. Análise de identidade do provável gene escF do isolado C74 de DAEC.. 80. Tabela 21. Análise de identidade da região 5’ do provável gene cesA2 do isolado C39 de DAEC.. 82. Tabela 22. Média aritmética das identidades dos prováveis genes TTSS dos isolados C39, C40 e C74 de DAEC em relação aos homólogos depositados no GenBank.. 85. xx.

(21) RESUMO Embora as Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) sejam classificadas como um dos seis grupos de E. coli diarreiogênicas, sua patogenicidade ainda é controversa. Diversas linhagens de bactérias intestinais, incluindo Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri e Salmonella enterica, possuem em seu genoma uma ilha de patogenicidade (PAI) contendo genes que codificam um Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), responsável pela transferência de proteínas efetoras do citoplasma da bactéria diretamente para o citoplasma da célula hospedeira. A presença de genes TTSS é, portanto, um forte indicativo de virulência. Tendo em vista tais informações, este trabalho teve como objetivos a identificação e caracterização de potenciais genes TTSS de isolados de DAEC recuperados de crianças diarréicas. Experimentos de PCR utilizando iniciadores direcionados aos genes TTSS escD, espA, espD, espB e escF resultaram na detecção de sete prováveis genes em três isolados de DAEC. Dentre as sequências obtidas, detectou-se a presença dos genes espA, espB e escF completos em dois desses isolados de DAEC. Análises de identidade desses genes em relação aos homólogos de diversas linhagens de enteropatógenos sugerem que os isolados de DAEC são bastante heterogêneos. Além disso, as identidades dos genes TTSS de DAEC em relação aos homólogos de diferentes linhagens de E. coli enteropatogênicas e enterohemorrágicas são bastante elevadas, podendo atingir 100%. A construção de árvores filogenéticas empregando as sequências desses genes confirmou tais resultados e demonstrou que os isolados C39 e C74 são evolutivamente mais próximos entre si que em relação à DAEC C40, agrupada no mesmo clado da EPEC prototípica E2348/69. Ensaios de transcrição reversa utilizando RNA dos isolados C39 e C74 revelaram ainda que alguns dos possíveis genes consistem em genes de fato, uma vez que são transcritos sob indução. Com a finalidade de verificar a expressão dos genes TTSS de DAEC foram também realizados experimentos de microscopia eletrônica e de microscopia de força atômica, porém, as imagens obtidas por meio dessas técnicas foram inconclusivas. Conjuntamente, os resultados apresentados neste trabalho sugerem fortemente a presença de uma PAI contendo genes TTSS em DAEC, e constituem evidências a favor da patogenicidade desse grupo de E. coli.. Palavras-chave: Escherichia coli diarreiogênicas; Escherichia coli de adesão difusa; Virulência; Ilhas de Patogenicidade; Sistema de Secreção do Tipo Três. xxi.

(22) ABSTRACT Although diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) are classified as one of the six pathotypes of diarrheiogenic E. coli, their pathogenicity is still controversial. Several strains of bacteria, including Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri and Salmonella enterica, possess a pathogenicity island (PAI), containing genes that code for a Type III Secretion System (TTSS), dedicated to inject effector proteins directly from the bacterial cytoplasm into the host cell cytoplasm. Therefore, the presence of TTSS genes is considered a strong evidence of virulence of a given microorganism. This work describes the identification and characterization of potential TTSS genes in DAEC isolates recovered from diarrheic children. PCR experiments using primers targeted to the TTSS genes escD, espA, espD, espB and escF resulted in the detection of seven putative genes in three isolates of DAEC. Among the sequences obtained, it was possible to detect the presence of the complete espA, espB and escF genes in two of the DAEC isolates. Identity analyses of these genes with different strains suggest that DAEC isolates are quite heterogeneous. Moreover, the. identities. of. TTSS. genes. of. DAEC. compared. to. enteropathogenic. and. enterohaemorrhagic E. coli are very high, sometimes reaching 100%. The construction of phylogenetic trees using the sequences of these genes confirmed these findings and showed that the isolates C39 and C74 are evolutionarily closer to each other than to the C40 DAEC isolate, which was grouped in the same clade of the prototypical EPEC E2348/69. Tests using reverse transcription of RNA isolated from C39 and C74 also revealed that some of the putative genes consist of true genes, since they were transcribed under induction conditions. In order to analyze the expression of TTSS genes in DAEC, electron microscopy and atomic force microscopy experiments were also carried out, however, the images obtained by these techniques were inconclusive. Together, the results obtained in this work strongly suggest the presence of a PAI containing TTSS genes in DAEC, and constitute evidence for the pathogenicity of this group of E. coli.. Key-words: Diarrheagenic Escherichia coli; Diffusely adherent Escherichia coli; Virulence; Pathogenicity Islands; Type Three Secretion System.. xxii.

(23) INTRODUÇÃO 1. Escherichia coli diarreiogênicas. Escherichia coli é o organismo anaeróbio facultativo predominante da microbiota do cólon humano (Nataro e Kaper, 1998). Essa bactéria é encontrada na camada de muco sobre o epitélio intestinal e geralmente vive em simbiose com o hospedeiro. No entanto, a enorme plasticidade do seu genoma, principalmente associada a processos de transferência horizontal de genes, permite o surgimento de linhagens patogênicas a partir de linhagens comensais. As linhagens patogênicas podem causar infecções do trato urinário, diarréia, septicemia e meningite, devido à presença de fatores de virulência específicos não encontrados nas linhagens comensais (Kaper et al., 1999). Antes da identificação de tais fatores de virulência, análises sorotípicas consistiam na forma predominante de identificação de linhagens patogênicas (Nataro and Kaper, 1998). A sorotipagem é realizada com base nos antígenos de superfície O (lipopolissacarídico), H (flagelar) e K (capsular). No entanto, como a sensibilidade e a especificidade da sorotipagem são limitadas e esse método é dispendioso, outros ensaios para o diagnóstico de E. coli diarreiogênicas se mostraram mais viáveis. Um deles consiste no teste de adesão a células eucarióticas, que permite distinguir os três padrões de adesão observados em E. coli diarreiogênicas: localizado, difuso e agregativo (Scaletsky et al., 1984; Cravioto et al., 1991). Atualmente, técnicas de biologia molecular, tais como hibridização de colônias e PCR, consistem em uma das principais ferramentas utilizadas para identificar fatores de virulência específicos de cada patotipo. Conforme pode ser observado na Figura 1, as E. coli diarreiogênicas são divididas em seis grupos de patogenicidade ou patotipos: E. coli enterotoxigênicas (ETEC), E. coli enteroagregativas (EAEC), E. coli enteroinvasivas (EIEC), E. coli enteropatogênicas (EPEC), E. coli enterohemorrágicas (EHEC) e E. coli de adesão difusa (DAEC) (revisado por Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 1999; Kaper et al., 2004 e Schmidt et al., 2004). Essa classificação é baseada nos determinantes de virulência e no fenótipo de adesão a culturas de células eucarióticas (Scaletsky et al., 1984).. 1.

(24) Figura 1. Interação dos seis patotipos de Escherichia coli diarreiogênicas com a célulaalvo. (A) EPEC aderem a enterócitos do intestino delgado, destróem as microvilosidades e induzem a formação de lesões do tipo attaching and effacing (A/E). 1. Adesão inicial; 2. Translocação de proteínas pelo sistema de secreção do tipo três; 3. Formação do pedestal de actina. (B) EHEC também induzem a formação de lesões A/E, porém, no cólon. Esse patotipo produz a toxina Shiga (Stx), que é liberada na corrente sanguínea podendo causar falência renal. (C) ETEC aderem a enterócitos do intestino delgado e provocam diarréia pela liberação de enterotoxinas termolábeis (LT) e/ou termoestáveis (ST). (D) EAEC aderem ao epitlélio do intestino grosso e delgado, formam um espesso biofilme e secretam citotoxinas e enterotoxinas. (E) EIEC invadem a célula epitelial do cólon, lisam o fagossoma e se movimentam pela célula por meio da nucleação de microfilamentos de actina. (F) As DAEC ativam cascatas de sinalização em enterócitos do intestino delgado, resultando na formação de longas projeções celulares que envolvem a bactéria. AAF: aggregative adherence fimbriae; BFP: bundle-forming pilus; CFA: colonization factor antigen; DAF: decay-accelerating factor; EAST1: enteroaggregative E. coli ST1; LT: heatlabile enterotoxin; ShET1: Shigella enterotoxin 1; ST: heat-stable enterotoxin. Adaptado de Kaper et al., 2004.. 2.

(25) 1.1. Escherichia coli enterotoxigênicas (ETEC) Linhagens de Escherichia coli enterotoxigênicas (ETEC) são a principal causa de diarréia em crianças em processo de desmame e da “diarréia do viajante”. A colonização da mucosa do intestino delgado por essas bactérias é mediada por uma ou mais estruturas de superfície denominadas fatores de colonização fimbrial (CFs), e bactérias desse patotipo produzem pelo menos um membro dos dois grupos definidos de enterotoxinas: termoestável (ST) e termolábil (LT). 1.2. Escherichia coli enteroagregativas (EAEC) Escherichia coli enteroagregativas (EAEC) são definidas como linhagens que não secretam enterotoxinas LT ou ST e que aderem a células HEp-2 em um padrão conhecido como adesão agregativa (AA), em que as bactérias se aglutinam umas às outras em uma configuração semelhante a uma pilha de tijolos (revisado por por Nataro et al., 1998; Kaper et al., 1999 e Schmidt et al., 2004). Esse fenótipo é mediado pelas fímbrias AAF/I e AAF/II, codificadas pelo plasmídeo pAA e relacionadas à classe Dr de adesinas de DAEC. O plasmídeo pAA também codifica a enterotoxina Pet e o homólogo de ST EAST1. A maioria das linhagens de EAEC produz ainda o sideróforo yersiniabactina. As EAEC aumentam a secreção de muco pela mucosa intestinal, o qual aprisiona a bactéria em uma espécie de biofilme. Essas bactérias têm sido associadas a casos de diarréia persistente, de duração igual ou superior a 14 dias. 1.3. Escherichia coli enteroinvasivas (EIEC) Escherichia coli enteroinvasivas (EIEC) são bioquimica, genetica e patogenicamente relacionadas a Shigella spp. Tanto EIEC quanto Shigella spp. secretam enterotoxinas e invadem o epitélio do cólon, onde são capazes de se multiplicar. Além disso, ambas produzem aerobactina, uma proteína de ligação a ferro associada à virulência. Os genes de virulência de origem plasmidial de EIEC e Shigella spp. incluem os que codificam um sistema de secreção do tipo três, cujos efetores estão envolvidos na invasão das células epiteliais e na lise do vacúolo fagocítico.. 3.

(26) 1.4. Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) Linhagens de EPEC são a principal causa de diarréia infantil nos países em desenvolvimento. Essas linhagens causam uma lesão intestinal conhecida como A/E (attaching and effacing), caracterizada por destruição das microvilosidades das células epiteliais intestinais e pelo contato íntimo entre a bactéria e a membrana da célula hospedeira (revisado por Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 1999 e Schmidt et al., 2004). Imediatamente abaixo da bactéria aderida, observa-se o acúmulo de actina polimerizada, o que resulta na formação dos pedestais característicos das lesões A/E (Figura 2). A maioria das linhagens de EPEC associadas à diarréia, conhecidas como EPEC típicas, possui um plasmídeo denominado EAF (EPEC adherence factor); as linhagens que não possuem esse plasmídeo constituem as EPEC atípicas. O plasmídeo EAF possui genes que codificam a proteína BFP, responsável pela agregação intercelular das EPEC, resultando na formação de microcolônias características do padrão de adesão localizada. As EPEC atípicas, que não expressam essa proteína, apresentam padrão difuso de adesão a células eucarióticas.. Figura 2. Lesão A/E causada por EPEC e EHEC. Essa lesão caracteriza-se por contato íntimo entre a bactéria e a membrana da célula-alvo, destruição das microvilosidades dos enterócitos e formação de pedestais de actina. Fonte: Kaper et al., 2004. 1.5. Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC) O patotipo EHEC engloba linhagens que causam um tipo de diarréia sanguinolenta, denominado colite hemorrágica (HC), e a síndrome urêmica hemolítica (HUS), que leva à insuficiência renal aguda e pode resultar em morte. O principal fator de virulência desse patotipo é a toxina Stx, que inibe a síntese protéica. As EHEC também causam lesões do tipo A/E em células epiteliais (Figura 2) mas, ao invés do plamídeo EAF, possuem um 4.

(27) plasmídeo de 93 kb, denominado pO157. Os sorotipos que produzem apenas a toxina Stx como fator de virulência e não causam lesões A/E recebem a denominação geral de STEC (E. coli produtoras de toxina Shiga). 1.6. Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) O termo Escherichia coli de adesão difusa - DAEC - foi inicialmente empregado para designar qualquer linhagem de E. coli que não formasse microcolônias de adesão localizada semelhantes às de EPEC típicas (Scaletsky et al., 1984). As DAEC aderem em um padrão em que as bactérias são homogeneamente distribuídas sobre a superfície da célula hospedeira, denominado adesão difusa. Com a descoberta das EAEC, passou-se a reconhecer as DAEC como uma categoria independente de E. coli potencialmente diarreiogênica (Nataro e Kaper, 1998). No entanto, vários estudos epidemiológicos apresentam resultados conflitantes e, por isso, o papel das DAEC como causadoras de diarréia ainda é controverso. Como esse patotipo é o objeto do presente estudo, será discutido com mais detalhes na próxima seção. 2. As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) 2.1. Epidemiologia Estudos epidemiológicos realizados no México (Girón et al., 1991), em Bangladesh (Baqui et al., 1992), na França (Jallat et al., 1993) e no Chile (Levine et al., 1993) revelaram que E. coli de adesão difusa foram isoladas com uma frequência maior de indivíduos com diarréia que de indivíduos sadios. Por outro lado, estudos epidemiológicos realizados em hospitais da França (Poitrineau et al., 1995; Forestier et al., 1996), da Austrália (Gunzburg et al., 1993) e do Brasil, nas cidades de São Paulo (Gomes et al., 1989; Gomes et al. 1998; Scaletsky et al., 2002b), Natal e São Luís (Scaletsky et al., 2001; Scaletsky et al., 2002a), não encontraram correlação entre a presença de DAEC e a diarréia, uma vez que esse patotipo foi isolado com a mesma frequência dos pacientes e dos grupos-controle. Apesar desses resultados, o estudo realizado em São Luís e Natal por Scaletsky e colaboradores em 2002 demonstrou que, após a estratificação em faixas etárias, a correlação entre infecção por DAEC e diarréia em crianças maiores de 12 meses de idade era significativa. Resultado semelhante foi obtido no estudo realizado por Gunzburg e 5.

(28) colaboradores na Austrália, onde a correlação entre diarréia e a presença de DAEC foi observada apenas em crianças com 18 meses de idade ou mais. No estudo realizado por Levine e colaboradores no Chile, a frequência de isolamento desse patotipo aumentou com a idade. Em alguns dos estudos em que DAEC não foram associadas à diarréia, as crianças envolvidas possuíam menos de dois anos de idade (Forestier et al., 1996; Scaletsky et al., 2001). Um resultado distinto foi apresentado por Piva (1998), ao investigar a incidência dos patotipos de E. coli em crianças e adultos com diarréia em Brasília. Seus resultados revelaram que, embora DAEC tenha sido o patotipo mais frequentemente isolado de adultos com diarréia, estas foram isoladas com frequências semelhantes nas populações de adultos e crianças estudadas (18,6% e 20%, respectivamente), sendo sua incidência independente da idade. Os resultados apresentados pelos estudos epidemiológicos sugerem que as Escherichia coli de adesão difusa não formam um grupo homogêneo. Em conformidade com essa hipótese, os estudos realizados por Girón e colaboradores no México e por Lopes e colaboradores no Brasil verificaram que as DAEC investigadas eram muito heterogêneas em relação ao conteúdo plasmidial e ao sorotipo. O estudo publicado por Lopes em 2005 relatou que metade das linhagens analisadas possuíam o gene do sideróforo aerobactina, e 7% produziam hemolisina, colicina ou apresentavam efeito citotóxico sobre células Vero. Diversas adesinas foram identificadas, incluindo membros da família Afa/Dr e as adesinas agregativas AAF/I e AAF/III. Em algumas linhagens foram encontrados ainda genes que codificam os fatores de virulência EAST1 de EAEC e SheT-1 de Shigella. A maioria das DAEC isoladas apresentou também resistência múltipla a antibióticos e, curiosamente, os genes de resistência e os de adesão difusa estavam localizados nos mesmos plasmídeos conjugativos. Essa heterogeneidade poderia explicar o porquê dos resultados divergentes obtidos nos estudos epidemiológicos, e sugere que nem todas as linhagens classificadas como DAEC são patogênicas, muito embora tal classe seja considerada um grupo de E. coli diarreiogênicas. 2.2. Adesinas Afa/Dr As DAEC possuem adesinas pertencentes a uma família denominada Afa/Dr, cujos receptores são proteínas da superfície de células eucarióticas, e todas atuam como fatores de virulência (Servin, 2005; Le Bouguénec e Servin, 2006). Essa família inclui adesinas fimbriais e afimbriais. As adesinas fimbriais se estendem a partir da superfície bacteriana e 6.

(29) são expressas por linhagens uropatogênicas e diarreiogênicas. Estas incluem a adesina Dr, encontrada em linhagens uropatogênicas, e a fímbria F1845, encontrada em um isolado diarreiogênico denomindado C1845. As adesinas afimbriais consistem em estruturas amorfas associadas à membrana externa. As adesinas Afa/Dr são codificadas por operons compostos por pelo menos cinco genes, cuja organização é bastante similar entre os membros da família. Os genes que codificam proteínas acessórias (reguladores transcricionais, chaperonas, proteínas ancoradoras e invasinas) são altamente conservados, enquanto o gene que codifica a adesina propriamente dita é mais divergente. A proteína reguladora do sistema complemento DAF (decay-accelerating factor) e as proteínas de superfície CEACAM (carcinoembryonic antigen-related cellular adhesion molecule) são receptores das adesinas Afa/Dr, sendo recrutadas para os locais onde as bactérias estão aderidas. 2.3. Patogenicidade Conforme mencionado anteriormente, as adesinas Afa/Dr são consideradas importantes fatores de virulência de DAEC (Figura 3). Essas adesinas induzem o alongamento das microvilosidades dos enterócitos em decorrência do rearranjo da rede de actina nos domínios apical e basal das células (Bernet-Camard et al., 1996), por meio do recrutamento de moléculas de transdução de sinal (Peiffer et al., 1998). A formação de longas projeções a partir da superfície de células HEp-2 também foi observada por Cookson e Nataro, em 1996. Com a progressão da infecção, ocorre a vesiculação das microvilosidades e o arredondamento do enterócito (Bernet-Camard et al., 1996). A infecção de células Caco-2 pela DAEC prototípica C1845 provoca também a alteração da distribuição das proteínas ocludina e ZO-1 associadas às junções compactas, resultando no aumento da permeabilidade paracelular (Peiffer et al., 2000). Uma vez que essa alteração independe do rearranjo do citoesqueleto da célula induzido pela bactéria, possivelmente outros fatores de virulência além da adesina fimbrial F1845 existam nessa DAEC. Além disso, demonstrou-se que as DAEC C1845 e IH11128 prejudicam a atividade enzimática de proteínas associadas às microvilosidades e, paralelamente, diminuem sua biossíntese afetando a taxa de tradução dessas proteínas (Peiffer et al., 2001). Entretanto, quando células Caco-2 são infectadas por linhagens recombinantes de E. coli expressando as adesinas Afa/Dr das DAEC selvagens, os resultados obtidos com C1845 e IH11128 não se repetem, sugerindo mais uma vez a existência de outros fatores de virulência envolvidos na 7.

(30) patogenicidade de DAEC. Além dos efeitos sobre o epitélio intestinal, as adesinas Afa/Dr induzem a diminuição da fagocitose mediada pelos leucócitos polimorfonucleares (PMNLs) e provocam sua agregação e apoptose (Brest et al., 2004), além de aglutinar eritrócitos (Servin, 2005).. Figura 3. Interação de DAEC com células do epitélio intestinal. Inicialmente, as bactérias expressando adesinas Afa/Dr são reconhecidas pelos receptores DAF e CEACAM (1). O reconhecimento recruta moléculas de sinalização celular, como tirosina-quinases, fosfolipase Cγ, fosfatidilinositol 3-quinase, proteína-quinase C e Ca2+, o que dispara vias de transdução de sinal, resultando no rearranjo dos filamentos de actina e na consequente destruição das microvilosidades (2). Alterações na distribuição de proteínas associadas às junções compactas levam ao aumento da permeabilidade paracelular (3). Uma via de sinalização celular dependente de MAP quinase induz a secreção de interleucina 8 (IL-8) pela região basolateral da célula, o que resulta na migração transepitelial de leucócitos polimorfonucleares (4). A migração dos PMNLs ativa a produção das citocinas próinflamatórias TNF-α e IL-1β pelo epitélio (5), as quais provocam o aumento da expressão dos genes que codificam o receptor DAF e moléculas MHC de classe I (6). Após a migração, a taxa de apoptose dos PMNLs é aumentada (7). Adaptado de Le Bouguénec e Servin, 2006. Embora várias alterações morfológicas dependentes do reconhecimento das adesinas Afa/Dr sejam conhecidas, as DAEC continuam pouco caracterizadas em nível molecular. Vários fatores de virulência de diferentes linhagens patogênicas de E. coli, como 8.

(31) hemolisinas e sideróforos, foram observados em DAEC isoladas de pacientes com infecções intestinais e extra-intestinais, mas até recentemente ainda não haviam sido encontrados genes codificadores de sistemas de secreção (Blanc-Potard et al., 2002). A presença de genes de um provável sistema de secreção do tipo três (TTSS) em isolados de DAEC foi inicialmente verificada por Kyaw (2004) e posteriormente por Lorenzoni (2009). O TTSS é encontrado em bactérias Gram-negativas patogênicas, sendo os genes que o codificam localizados em ilhas de patogenicidade, descritas na próxima seção. 3. Ilhas de patogenicidade Os fatores de virulência e os sistemas responsáveis por sua secreção são frequentemente codificados por regiões do genoma denominadas ilhas de patogenicidade (PAIs) (Hacker e Kaper, 2000). PAIs foram inicialmente descritas como regiões cromossomais, mas posteriormente descobriu-se que também são encontradas em plasmídeos e nos genomas de bacteriófagos. O conceito de PAI foi introduzido no final dos anos 80 por Jörg Hacker e colegas, na Universidade de Würzburg, Alemanha, durante uma investigação sobre a base genética da virulência de linhagens uropatogênicas de E. coli (UPEC). O grupo observou que havia ligação genética entre determinantes codificadores de fímbrias e hemolisinas nessas linhagens, e que esse genes ligados poderiam sofrer codeleção. A observação de que um único evento de deleção resultava na perda de dois conjuntos de genes de virulência ligados, bem como de segmentos de DNA distantes mais de 30 kb, levou à definição do conceito de ilhas de patogenicidade. De acordo com Hacker e Kaper (1999 e 2000), Winstanley e Hart (2001) e Schmidt e Hensel (2004) e, conforme ilustrado na Figura 4, PAIs são regiões do genoma que apresentam as seguintes características em comum:. • Estão presentes no genoma de bactérias patogênicas e ausentes do genoma de membros não-patogênicos da mesma espécie ou de espécies proximamente relacionadas. • São relativamente grandes, apresentando de 10 a 200 kb ou mais. • Contêm genes que codificam um ou mais fatores de virulência (Figura 4 A), como adesinas, invasinas, sistemas de captação de ferro, toxinas, e sistemas de secreção dos tipos III e IV. • Diferem do restante do genoma em seu conteúdo G+C (Figura 4 B) e no uso de códons, uma vez que a PAI adquirida por transferência horizontal ainda possui a composição de bases da espécie doadora. 9.

(32) • São associadas a genes de RNA de transferência (tRNA) que, por serem. altamente conservados entre as espécies de bactérias, atuam como sequências-alvo para a integração de DNA exógeno (Figura 4 A). • São flanqueadas por pequenas repetições diretas (DR) de 16 a 20 pb, utilizadas em processos de inserção e deleção (Figura 4 A). • Contêm genes crípticos ou funcionais que codificam fatores de mobilidade como integrases, transposases, ou sequências de inserção (IS) (Figura 4 A). • Frequentemente representam regiões de DNA instáveis. Deleções de PAIs podem ocorrer por meio das sequências DR de suas extremidades ou via elementos IS e bacteriófagos.. Figura 4. Estrutura de uma PAI típica. (A) PAIs são inseridas em sítios específicos, frequentemente genes de tRNA. Elementos móveis como integrases (int) são encontrados no início da ilha, próximo ao locus de tRNA. PAIs possuem um ou mais genes associados à virulência (V1 a V4), que podem estar interespaçados com outros elementos móveis, como IS (ISc, elemento de inserção completo) ou remanescentes de IS (ISd, elemento de inserção defectivo). Os limites da PAI são determinados por repetições diretas (DRs). (B) O conteúdo G+C da PAI difere do conteúdo G+C do genoma do hospedeiro. Adaptado de Schmidt e Hensel, 2004. O conteúdo G+C distinto do restante do genoma, a presença de DRs em suas extremidades, a associação com genes de tRNA, a presença de elementos móveis e a instabilidade genética das ilhas de patogenicidade sugerem a aquisição dessas regiões por 10.

(33) transferência horizontal de genes (Hacker e Kaper, 1999; Schmidt e Hensel, 2004). Coerente com essa hipótese, PAIs ocorrem em um amplo espectro de espécies, a maioria das quais é Gram-negativa. O surgimento de uma PAI é frequentemente iniciado pela integração de plasmídeos, fagos, transposons conjugativos ou combinações desses elementos em genes-alvo específicos, preferencialmente no cromossomo. A transferência de PAIs pode ocorrer por transformação natural, conjugação ou transdução. Um elemento integrado é denominado pré-PAI, pois tem potencial para se desenvolver em uma PAI ao longo do tempo. Pré-PAIs integradas em um determinado genoma podem ser imobilizadas e estabilizadas por deleção e/ou inativação dos genes que codificam integrases e excisases. As PAIs continuam a se desenvolver por mutações adicionais e passam a exibir características semelhantes às do cromossomo cerne, incluindo o conteúdo G+C e uso preferencial de códons. 4. A ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement) Uma ilha de patogenicidade cromossomal de aproximadamente 35 kb, denominada LEE (locus of enterocyte effacement) por conter a maioria dos genes necessários à indução do fenótipo A/E em células epiteliais intestinais, foi descrita em 1995 por McDaniel e colaboradores. Essa PAI não está presente em linhagens avirulentas de E. coli, mas é encontrada nos patotipos EPEC (Elliott et al., 1998) e EHEC (Perna et al., 1998) e em outras espécies que produzem a lesão A/E, como o patógeno de camundongo Citrobacter rodentium (Deng et al., 2004) e Hafnia alvei (McDaniel, 1995). Repetições flanqueadoras e elementos semelhantes a transposons, fagos ou plasmídeos não foram encontrados no LEE de EPEC, sugerindo que a aquisição dessa PAI não é muito recente (McDaniel, 1995). Entretanto, observou-se que o conteúdo G+C de LEE (38,36%) difere significativamente dos 50,80% encontrados no genoma sequenciado da E. coli avirulenta K-12. O sequenciamento completo do LEE da linhagem E2348/69 de EPEC revelou que esta ilha contém 41 orfs (quadros de leitura aberta) arranjadas em cinco operons policistrônicos (Elliott et al., 1998), denominados LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 e LEE5. LEE1, LEE2 e LEE3 codificam componentes de um aparato de secreção do tipo três (TTSA), o complexo macromolecular do TTSS. O operon LEE5 contém os genes eae, tir e cesT, os quais codificam as proteínas intimina, Tir e CesT, respectivamente. A intimina é uma proteína de membrana externa envolvida no processo de adesão ao enterócito, cujo receptor Tir 11.

(34) (Translocated Intimin Receptor) é translocado para a membrana da célula hospedeira e ativado por fosforilação. CesT corresponde à chaperona da Tir. O operon LEE4, por sua vez, engloba os genes das proteínas secretadas pelo TTSA denominadas Esp (E. coli secreted protein), algumas das quais são transferidas do citoplasma da bactéria para o citoplasma da célula-alvo (revisado por Wilson et al., 2001). Perna e colaboradores reportaram, também em 1998, o sequenciamento completo do LEE da linhagem EDL933 da EHEC prototípica O157:H7. Esse sequenciamento revelou que a PAI de EDL933 possui o mesmo ponto de integração cromossomal que o da EPEC E2348/69, e que seu conteúdo G+C (40,91%) também está abaixo da média, quando comparado ao conteúdo da linhagem não patogênica K-12; no entanto, algumas diferenças são observadas entre essas duas LEEs. A ilha LEE de EHEC apresenta 43.359 pb sendo, portanto, maior que LEE de EPEC, que apresenta 35.624 pb. A maior parte da diferença de tamanho é explicada pela presença de um provável prófago no LEE de EHEC (Figura 5), que foi denominado 933L e possui 51,72% de G+C. Das 54 orfs identificadas no LEE de EHEC, 13 correspondem ao provável prófago e 41 correspondem às orfs previamente descritas para o LEE de E2348/69. Conforme pode ser observado na Figura 5, a ordem e o número dos genes LEE de EPEC e de EHEC são conservados, e o valor médio da identidade de nucleotídeos é 93,9% (Perna et al., 1998). Os genes mais variáveis são os que codificam as proteínas secretadas; os que codificam componentes do aparato de secreção, por sua vez, são altamente conservados.. Figura 5. Diagrama do LEE de E2348/69 e de EDL933. Os diferentes padrões das setas grandes indicam a divergência de nucleotídeos entre os genes de EPEC e EHEC. As setas pequenas indicam os operons de LEE. O prófago 933L está presente em EHEC mas não em EPEC. Fonte: Kaper et al., 1999.. 12.

(35) TTSSs também são encontrados em outras bactérias patogênicas (revisado por Winstanley e Hart, 2001; Daniell et al., 2003; Schmidt e Hensel, 2004; Sani et al., 2006), incluindo membros dos gêneros Pseudomonas, Bordetella, Burkholderia, Chlamydia, Erwinia, Ralstonia e Xanthomonas; não há relatos da presença de TTSS em bactérias Grampositivas. Os TTSSs podem ser plasmidiais, como em Yersinia e em Shigella spp., ou cromossomais, como em Salmonella enterica e em EPEC e EHEC. Algumas espécies apresentam mais de um TTSS, incluindo S. enterica e espécies de Yersinia altamente virulentas. Em muitos organismos, o conteúdo G+C dos genes TTSS é inferior ao do restante do genoma hospedeiro, sugerindo que os genes do TTSS ancestral evoluíram em um hospedeiro com menor conteúdo G+C. Um TTSS identificado em Chlamydia psittaci é um candidato potencial para tal papel. 5. O Sistema de Secreção do Tipo Três (TTSS) A maquinaria codificada pelos genes do TTSS forma um complexo responsável pela translocação de proteínas efetoras diretamente para o citoplasma das células do hospedeiro eucariótico. Essas proteínas ativam vias de sinalização celular e podem interferir em uma variedade de funções celulares, incluindo a dinâmica de actina e tubulina, a expressão de genes, o tráfego de vesículas, a produção de citocinas, a morte celular programada e a progressão do ciclo celular (revisado por Kubori et al., 1998; Kimbrough e Miller, 2002; Yip e Strynadka, 2006; Gálan e Wolf-Watz, 2006). Embora os tipos de efetores variem muito nas diferentes espécies, a maquinaria molecular que medeia o processo de transporte dessas proteínas, o aparato de secreção do tipo três (TTSA), também denominado secreton ou complexo-agulha (NC), é estrutural e funcionalmente conservado entre os diferentes TTSSs (Pallen et al., 2005). Mais de 20 componentes protéicos, muitos dos quais apresentam sequências idênticas em linhagens distintas, são requeridos para o funcionamento adequado do TTSA. A maioria dessas proteínas está envolvida na construção do complexo macromolecular que se estende a partir da membrana citoplasmática da bactéria, atravessa o espaço periplasmático, a camada de peptideoglicano, a membrana externa, o espaço extracelular e, finalmente, atinge a membrana da célula hospedeira (revisado por Yip e Strynadka, 2006), conforme pode ser observado na Figura 6.. 13.

(36) Figura 6. O aparato de secreção do tipo três de EPEC e EHEC. A base é ancorada às membranas interna (IM) e externa (OM), atravessando a camada de peptideoglicano (PG). A agulha se projeta a partir da superfície da bactéria e se estende até a membrana da célula hospedeira eucariótica (EM), onde é inserido o poro de translocação. Fonte: Pallen et al., 2005. O NC, inicialmente identificado em Salmonella typhimurium, é composto por uma base formada por dois conjuntos de anéis concêntricos inseridos nas membranas interna e externa da bactéria que ancoram a estrutura ao envelope bacteriano, e por uma projeção helicoidal rígida semelhante a uma agulha, que se estende vários nanômetros a partir da superfície bacteriana (Kimbrough e Miller, 2000; Kubori et al., 2000; Tamano et al., 2000; Blocker et al., 2001; Daniell et al., 2001; Zenk et al., 2007). Uma estrutura cilíndrica interna semelhante a um bastão conecta a agulha à base do TTSA. Análises recentes de NCs purificados de Shigella flexneri (Sani et al., 2006) demontraram que a base do TTSA dessa espécie é composta por sete anéis, conforme pode ser observado na Figura 7. O NC é atravessado por um canal estreito (aproximadamente 2,5 nm de diâmetro), que se estende desde o conjunto inferior de anéis até a extremidade da agulha, através do qual passam as proteínas a serem secretadas (revisado por Kubori et al., 1998; Gálan e Wolf-Watz, 2006; Yip e Strynadka, 2006).. 14.

(37) Figura 7. Aparato de secreção do tipo três de Shigella flexneri. (A) Projeção do NC completo, resultado da combinação de 1.500 imagens de partículas de NCs obtidas por microscopia eletrônica. O alinhamento foi feito em relação à base do NC, uma vez que o comprimento da agulha é variável. (B) Micrografia eletrônica de partículas do complexoagulha purificadas e contrastadas negativamente. NC: complexo-agulha; BB: corpo basal; NR: NC sem os anéis da membrana interna; OMR: anéis da membrana externa. Fonte: Sani et al., 2006. Embora a organização estrutural seja semelhante àquela do flagelo (Aizawa, 2001), a agulha do TTSA é mais delgada que o filamento flagelar (Daniell et al., 2001). A agulha e o flagelo possuem várias proteínas de sequências homólogas e, mesmo quando a identidade entre as sequências é pequena, as propriedades fisico-químicas são semelhantes. Tanto o NC quanto o flagelo bacteriano consistem em anéis localizados nas membranas interna e externa, uma ATPase associada à membrana citoplasmática, estruturas extracelulares em forma de hélice e um interior oco que funciona como um canal para a passagem de proteínas. Além disso, os dois aparatos são considerados TTSA, pois ambos exportam componentes estruturais da maquinaria durante sua montagem (revisado por Kubori et al., 1998; Aizawa, 2001; Alfano e Collmer, 2004; Gálan e Wolf-Watz, 2006; Yip e Strynadka, 2006). Apesar das similaridades, o flagelo provavelmente surgiu antes do complexo-agulha, uma vez que está presente em uma variedade maior de espécies de bactérias, tanto Gramnegativas como Gram-positivas (Aizawa, 2001). A montagem da base do TTSA precede a montagem do bastão interno e da agulha (Sukhan et al., 2001). Assim que é organizada, a base começa a atuar como uma maquinaria de secreção do tipo três, promovendo inicialmente a secreção de componentes estruturais do 15.

(38) TTSS ou de proteínas necessárias para a montagem do bastão interno e da agulha. Assim que a montagem do NC é completada, a maquinaria modifica sua especificidade e se torna competente para a secreção de proteínas translocadoras e efetoras (revisado por Kubori et al., 2000; Kimbrough e Miller, 2002; Gálan e Wolf-Watz, 2006; Yip e Strynadka, 2006). O processo de secreção é hierárquico, e as diferentes proteínas são secretadas em uma ordem pré-determinada. Como a introdução de mutações que alteram a fase de leitura não previne a secreção de muitas delas, acredita-se que o sinal para a secreção possa residir nos mRNAs que as codificam e não nos polipeptídeos propriamente ditos. Especificidade adicional pode ser conferida pelas chaperonas citosólicas, que se ligam a pelo menos algumas das proteínas secretadas pelo TTSA. Alguns estudos sugerem que a estrutura tridimensional da chaperona associada à sua proteína cognata poderia funcionar como um sinal universal conservado para o reconhecimento pelo TTSS, o que condiz com a observação de que a remoção do domínio de ligação à chaperona de algumas proteínas do TTSS previne sua secreção (revisado por Gálan e Wolf-Watz, 2006). Outra função proposta para as chaperonas é prevenir interações prematuras e indesejáveis da proteína cognata a ser secretada com outros componentes da maquinaria de secreção do tipo três. Além disso, estas mantêm o seu domínio de ligação na proteína cognata em uma conformação não globular, sugerindo que uma de suas funções seria preparar as proteínas secretadas para o rápido desdobramento antes da secreção. Isso é necessário porque o canal por onde as proteínas devem passar é muito estreito para a maioria das proteínas globulares, sugerindo que os efetores devem ser parcial ou completamente desdobrados antes da translocação (revisado por Alfano e Collmer, 2004; Gálan e Wolf-Watz, 2006). O TTSS também codifica uma ATPase altamente conservada, cuja atividade é crítica nos processos de recrutamento e desdobramento das proteínas a serem secretadas (revisado por Gálan e Wolf-Watz, 2006). A ATPase interage com a chaperona e facilita a translocação das proteínas, provavelmente por inserir o domínio desdobrado do efetor no TTSA (revisado por Yip e Strynadka, 2006). O NC por si só não é capaz de mediar a injeção de proteínas na célula hospedeira, e requer proteínas translocadoras, também secretadas pelo TTSS. Acredita-se que estas sejam inseridas na membrana da célula hospedeira e formem um canal, através do qual as proteínas efetoras passam. Ide e colaboradores demonstraram em 2001 que as proteínas translocadoras de EPEC, EspB e EspD, interagem entre si in vitro e formam poros com diâmetro externo de 55 a 65 nm na membrana de eritrócitos. O poro apresenta de seis a oito 16.

(39) subunidades e se assemelha a um funil, possuindo uma abertura mais larga que se estreita à medida que penetra na bicamada lipídica. Ensaios de osmoproteção revelaram que o diâmetro mínimo é de 3 a 5 nm. EspD parece ser o componente principal do poro de translocação (Shaw et al., 2001); a distribuição de EspB entre o citosol e a membrana plasmática da célula hospedeira sugere que, além da atividade translocadora, essa proteína apresenta atividade efetora (revisado por Neves et al., 2003). Estruturas acessórias localizadas na extremidade distal da agulha, como o filamento de EspA de EPEC (Knutton et al., 1998) e o complexo formado pela proteína LcrV de Yersinia enterocolitica (revisado por Gálan e Wolf-Watz, 2006; Yip e Strynadka, 2006), atuam como uma ponte que liga a agulha aos translocadores na membrana da célula-alvo, como pode ser observado na Figura 8 A. O filamento de EspA também é encontrado em EHEC, mas as proteínas EspA de diferentes sorotipos de EPEC e EHEC são polimórficas (Neves et al., 2003). Filamentos semelhantes são observados ainda em Pseudomonas syringae e em Ralstonia solanacearum, e podem representar adaptações ao hospedeiro. Patógenos de plantas devem ser capazes de penetrar a parede celular para alcançar a membrana da célula vegetal, enquanto EPEC e EHEC precisam penetrar a barreira mucosa e um glicocálix espesso para atingir os enterócitos (Daniell et al., 2001). A progressão da infecção por EPEC e EHEC leva à formação de lesões A/E maduras, excluindo os filamentos de EspA do sítio de adesão íntima. Entretanto, sua presença na superfície restante da bactéria ainda é visível (Figura 8 B).. Figura 8. Micrografias eletrônicas mostrando a adesão de EPEC a células HEL. Antes da formação de lesões A/E, estruturas de superfície filamentosas podem ser vistas na superfície da bactéria, formando uma ponte entre a bactéria e a célula HEL (A). Os filamentos que interagem com a superfície da célula são muito rígidos e parecem estar embebidos na membrana da célula eucariótica (A, setas). Filamentos também podem ser observados na superfície exposta da bactéria após a formação da lesão A/E madura (B, seta). A barra corresponde a 0,25 µm. Adaptado de Knutton et al., 1998. 17.

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Figura  1.  Interação  dos  seis  patotipos  de  Escherichia  coli  diarreiogênicas  com  a  célula- célula-alvo
Figura 3. Interação de DAEC com células do epitélio intestinal. Inicialmente, as bactérias  expressando  adesinas  Afa/Dr  são  reconhecidas  pelos  receptores  DAF  e  CEACAM  (1)
Figura  4.  Estrutura  de  uma  PAI  típica.  (A)  PAIs  são  inseridas  em  sítios  específicos,  frequentemente genes de tRNA
Figura  6.  O  aparato  de  secreção  do  tipo  três  de  EPEC  e  EHEC.  A  base  é  ancorada  às  membranas interna (IM) e externa (OM), atravessando a camada de peptideoglicano (PG)
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