Subprojeto 28
1. Identificação:Título do subprojeto:
Tratamento de diabetes mellitus tipo 1 com infusão de células-tronco
mesenquimais
País: Brasil
Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq http://www.cnpq.br/areasconhecimento
Área: Medicina Código: 4.01.00.00-6
2. Dados do coordenador do subprojeto Nome completo: Júlio César Voltarelli
Data de nascimento: 17/12/1948 Sexo: Masculino Feminino Nacionalidade: brasileira
Endereço eletrônico: jcvoltar@fmrp.usp.br
3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto
Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Universidade de São Paulo Sigla: USP
Órgão (instituto, faculdade, etc): Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Unidade (departamento, laboratório, etc): Departamento de Clínica Médica, Divisão de Imunologia Clínica Cargo/função: Professor Titular
4. Resumo do subprojeto (Caracterização do problema e Justificativa) Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto.
O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença auto-imune (DAIs) inflamatória, mediada por células T auto-reativas e caracterizadas pela destruição seletiva de células β pancreáticas produtoras de insulina. A suscetibilidade ao DM-1 é determinada por fatores genéticos e ambientais. A doença clínica manifesta-se somente após destruição de aproximadamente 80-90% das células β.1 O processo destrutivo das células β leva à falta do hormônio insulina, que resulta num estado de hiperglicemia e suas complicações agudas e crônicas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à depressão do sistema nervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam de tratamento permanente com insulina exógena para sobrevivência. Entre as complicações crônicas graves estão os problemas vasculares que levam à insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas.
O DM-1 é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina. Ensaios clínicos com imunossupressores, anticorpo monoclonal anti-CD3 e o transplante de ilhotas pancreáticas vêm sendo realizados com resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira.1 Esse cenário estimula novas pesquisas acerca de alternativas terapêuticas, tais como a diferenciação in
vitro de células-tronco humanas em células β pancreáticas para transplante e tratamento do DM-1 com
células-tronco adultas. Nesse contexto, as células-tronco mesenquimais (CTMs) representam uma fonte de células-tronco adultas ideal para terapia celular em virtude de seu fácil isolamento, expansão in vitro e capacidade imunossupressora, imunoreguladora e regenerativa.2
Trabalhos recentes demonstraram um efeito terapêutico satisfatório após infusões de CTMs em modelos animais de diabetes auto-imune3,4 e em pacientes portadores de doença do enxerto-versus-hospedeiro5, doença cujos mecanismos imunológicos assemelham-se aos das doenças auto-imunes. Com base nesses estudos publicados, nossa hipótese é que a agressão auto-imune no pâncreas possa ser controlada através das CTMs, pois após a infusão nos pacientes diabéticos elas migram preferencialmente para o tecido pancreático inflamado, promovem imunossupressão local e estimulam os mecanismos de regeneração locais através de efeitos parácrinos, que envolvem a produção de moléculas anti-inflamatórias e imunoreguladoras e de fatores de crescimento e angiogênicos.
Desse modo, nosso objetivo nesse projeto é avaliar a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão CTMs alogênicas no tratamento de DM-1 recém-diagnosticado em humanos e modelos animais. Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, células T de memória, células NKT e células T CD4+ e CD8+ reguladoras; dosagem de citocinas no soro; repertório de células T; freqüência de células T auto-reativas anti-células β pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs. Paralelamente aos estudos em humanos, propomos avaliar nesse projeto os mecanismos imunológicos detalhados e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica de dois modelos de diabetes auto-imune experimental (um modelo geneticamente determinado e o outro quimicamente induzido) à infusão de CTMs humanas. Avaliaremos nestes modelos a modulação da resposta auto-imune patogênica pelas CTMs, bem como o papel das CTMs na regeneração do tecido pancreático lesado pela agressão auto-imune, na fase inicial da doença.
Os resultados obtidos neste projeto demonstrarão o efeito terapêutico da infusão de CTMs no tratamento do diabetes auto-imune em humanos, bem como elucidarão os mecanismos de ação
imunológicos e regenerativos envolvidos nessa resposta terapêutica através dos estudos em modelos animais de diabetes auto-imune. Se demonstrada uma boa eficácia terapêutica, a infusão de CTMs pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM-1, que constitui uma doença auto-imune associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento crônico.
5. Objetivos
Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto.
Este projeto tem como objetivo geral avaliar a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão de células-tronco mesenquimais (CTMs) humanas no tratamento de diabetes mellitus tipo 1 recém-diagnosticado. Para isso estabelecemos os seguintes objetivos específicos:
Avaliar a segurança (efeitos tóxicos, complicações infecciosas e neoplásicas, mortalidade) da
infusão endovenosa de CTMs alogênicas de doador relacionado em pacientes portadores de
diabetes mellitus tipo 1 recém-diagnosticado;
Avaliar o efeito terapêutico das CTMs sobre a lesão auto-imune no pâncreas endócrino em humanos
(níveis de glicemia de jejum, de peptídeo-C e de hemoglobina glicosilada antes e após a infusão das CTMs; necessidades de insulina exógena antes e após a infusão das CTMs);
Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, células T de
memória, células NKT e células T CD4+ e CD8+ reguladoras; dosagem de citocinas no soro; repertório de células T; freqüência de células T auto-reativas anti-células β pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs;
Avaliar os mecanismos imunológicos envolvidos na resposta terapêutica (modulação da resposta
imune patogênica pelas CTMs no pâncreas e baço dos animais; papel de células T reguladoras) de camundongos diabéticos NOD (modelo de diabetes geneticamente determinado; fase inicial da doença) e C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes induzido quimicamente; fase inicial da doença) à infusão de CTMs humanas;
Avaliar os mecanismos regenerativos envolvidos na resposta terapêutica (papel das CTMs humanas
infundidas na regeneração do tecido pancreático pela análise da fusão das CTMs humanas com células β pancreáticas murinas) de camundongos diabéticos NOD (modelo de diabetes geneticamente determinado) e C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes induzido quimicamente) à infusão de CTMs humanas.
6. Plano de trabalho
Descrever as etapas de execução do subprojeto.
Isolamento, expansão e infusão de CTMs em 14 pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (1º e 2º ano); Avaliação da resposta clínica e laboratorial dos pacientes após a infusão das CTMs(1º, 2º e 3º ano); Avaliação da resposta imunológica dos pacientes após a infusão das CTMs (1º,2º e 3º ano); Padronização e caracterização dos modelos de diabetes auto-imune espontâneo em camundongos NOD e induzido por estreptozotocina em camundongos C57BL/6 (2º ano); Infusão de CTMs humanos nos camundongos diabéticos (2º ano); Avaliação dos mecanismos de ação imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica dos animais diabéticos à infusão de CTMs humanas (2º ano).
7. Metodologia
Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida.
Serão tratados 14 pacientes com DM-1 recém-diagnosticados (há menos de quatro semanas; anticorpo anti-GAD65 positivo) pela infusão de CTMs alogênicas na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Este projeto de pesquisa e respectivo termo de consentimento livre e esclarecido foram aprovados pelo Comitê de Ética em pesquisa local e nacional. O doador de medula óssea (MO) será um familiar saudável do paciente diabético, selecionado conforme a tipagem de HLA. Será optado preferencialmente pelo doador que não apresente HLA diabetogênico (DRB1*03 e/ou *04 e DQB1*0201 e/ou *0302). O doador de MO será submetido à coleta de aproximadamente 100 ml de medula óssea (MO) através de punções de crista ilíaca posterior direita. As amostras de MO dos doadores serão processadas no Laboratório de Terapia Celular do Centro de Terapia Celular (CEPID-FAPESP) do Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP. As CTMs serão cultivadas nesse laboratório em ambiente estéril e com reagentes estéreis, dentro de padrões estritos de controle de qualidade para a produção de componentes celulares para infusão em humanos (padrão GMP,
good manufacturing practice). Serão colhidas amostras MO de outros indivíduos saudáveis (doadores
voluntários de medula) para isolamento de CTMs para infusão nos modelos animais de diabetes. As células mononucleares da MO dos pacientes serão isoladas por centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll HypaqueTM, d=1,077). Para o isolamento e cultura de CTMs, 4x107 células mononucleares da MO serão suspensas em meio de cultura α-MEM com 15% de soro bovino fetal (SBF), plaqueadas em garrafa de 175 cm2, e cultivadas em incubadora a 37°C com 5% de CO2. Após 3 dias, as células não-aderentes
serão removidas e serão adicionados 50 ml de meio de cultura. O meio de cultura será trocado a cada 3-4 dias e quando as células estiverem semi-confluentes, estas serão tripsinizadas e repicadas (primeira passagem). As CTMs serão submetidas a sucessivas passagens (3-5) até que se adquira número de células suficiente para o procedimento (1-2 x106/kg do paciente em cada infusão). Três dias antes da infusão das CTMs no paciente, o SBF do meio de cultura será substituído por soro autólogo (a 5-10%). Serão feitas duas infusões de CTMs, com o mesmo número de células (1-2 x106/kg), separadas por um período de 30 dias. Amostras das CMTs serão separadas antes da infusão para: 1, caracterização imunofenotípica e morfológica ; 2, caracterização citogenética; 3, diferenciação em adipócitos e osteócitos; 4, avaliação da capacidade imunossupressora in vitro. Após a infusão das CTMs, o paciente será monitorado semanalmente até D+60 pós-infusão e depois a cada três meses. O monitoramento será realizado por exames clínicos e laboratoriais (que incluem dosagem dos níveis de glicemia de jejum, níveis de peptídeo-C, níveis de hemoglobina glicosilada). Será colhido sangue periférico dos pacientes para o estudo da resposta imunológica nos dias +1,+2, +7, +14, +30, +60, +180, +270, +360 e em seguida semestralmente, após a infusão das CTMs.
Com o objetivo de estudarmos os mecanismos imunológicos e regenerativos de ação da infusão de CTMs humanas (isoladas de medula óssea) no tratamento do diabetes auto-imune experimental, utilizaremos um modelo de diabetes geneticamente determinado (camundongos NOD, Non-Obese diabetic
mouse) e um modelo de diabete auto-imune quimicamente induzido pela administração de
estreptozotocina (STZ) em camundongos C57BL/6. Os camundongos C57BL/6 (machos, 8 semanas de idade) serão submetidos à administração de 5 doses diárias e consecutivas de STZ. Cinco dias após a última dose de STZ (fase inicial da doença) os camundongos C57BL/6 receberão, por via endovenosa, a infusão de CTMs humanas. Os camundongos NOD fêmeas com 12 semanas de idade (fase inicial da doença) serão infundias com CTMs humanas. Após a infusão das CTMs, os camundongos serão monitorizados 2 vezes por semana em relação à glicemia e ao peso. Após 10, 17, 24, 32 e 60 dias da infusão das CTMs, os animais serão sacrificados e serão coletados o pâncreas, o baço e o soro desses animais para ensaios imunológicos (citometria de fluxo, ELISA, imunohistoquímica, imunofluorescência). Avaliaremos a ocorrência de fusão entre CTM humanas e células β pancreáticas murinas pela técnica de FISH usando marcação concomitante com sondas anti-cromossomo X murino e anti-cromossomo X ou Y humano. Para avaliar se as CTM humanas são capazes de diferenciarem-se em células β pancreáticas produtoras de insulina, será realizada imunohistoquímica usando anticorpos anti-insulina humana. Em alguns experimentos, as CTMs serão infectadas com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ estudos de migração e permanência das CTMs no tecido lesado.
8. Referências
1. Atkinson MA, Eisenbarth GS. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 2001; 358(9277):221-9.
2. Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Reviews Immunology. Advance online 18 August 2008; doi:10.1038/nri2395.
3. Anderson MS, Bluestone, JA. The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annu Rev Immunol. 2005;23:447-85
4. Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, Prockop DJ. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2006 Nov 14;103(46):17438-43.
5. Le Blanc K, Frassoni F, Ball L, Locatelli F, Roelofs H, Lewis I, Lanino E, Sundberg B, Bernardo ME, Remberger M, Dini G, Egeler RM, Bacigalupo A, Fibbe W, Ringdén O. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 2008 May 10;371(9624):1579-86.
9. Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores.
Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento.
Nome CPF Objetivo/Justificativa da atividade Função no projeto Experiências anteriores Titula ção Júlio César
Voltarelli 593859878-87 Coordenação do projeto; tratamento dos pacientes (seleção e seguimento) Pesquisador (Médico hematologista e imunologista) Especialista em imunologia clínica e transplantes de medula Doutor Dimas Tadeu
Covas 005798358-55 Análises dos resultados de caracterização fenotípica, genética e funcional das CTMs Responsável legal pelo Laboratório de Terapia Celular Especialista em células-tronco Doutor Karen Lima Prata 921482986-15 Análises de controle de
de Terapia Celular doutorado) biologia celular e criobiologia Maristela
Delgado Orellana 108986168-08 Expansão das CTMs em laboratório de terapia celular (condições GMP) Pesquisador (Técnica responsável) Especialista em biologia celular e criobiologia Mestre Carlos Eduardo
Couri 011751706-23 Tratamento dos pacientes (seleção e seguimento) Pesquisador (Médico) Especialista em endocrinologia Doutor Maria Carolina
de Oliveira 175398148-45 Tratamento dos pacientes (seleção e seguimento) Pesquisador (Médica - Aluna de doutorado) Especialista em Imunologia clínica Mestre Kelen Cristina R.
M. de Farias 260788318-01 Experimentos de análise da capacidade imunossupressora das CTMs e avaliação da resposta imune dos pacientes tratados
Pesquisador
(Post-doc) Especialista em imunologia celular e aplicada
Doutor
Fábio Morato de
Oliveira 611264201-82 Análises citogenéticas das CTMs por bandamento G e análises dos resultados de FISH (modelos animais)
Pesquisador
(Post-doc) Especialista em citogenética Doutor
Leandra Naira Zambelli Ramalho
144552438-44 Análises histopatológicas
de pâncreas Responsável por Laboratório Especialista em patologia Doutor Patrícia Vianna
Bonini Palma 159952578-03 Análises de citometria de fluxo Pesquisador Especialista em citometria BSc Maria Angélica
Miglino 005423358-59 Infecção das MSCs com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ
Responsável por
Laboratório Especialista em modelos animais Doutor
Patrícia Cristina Baleeiro Beltrão Braga
145996838-76 Infecção das MSCs com
retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ
Investigator
(Post-doc) Especialista em modelos animais e biologia molecular
Doutor
Lindolfo da Silva
Meirelles 926575400-15 Análises dos resultados dos modelos animais Pesquisador (Post-doc) Experiência com modelos animais Doutor Juliana Navarro
Ueda Yaochite 339181138-25 Realização dos experimentos dos modelos animais
Pesquisador
(Aluna mestrado) Experiência com modelos animais BSc 10. Fontes de financiamento
Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados) Fonte de
Financiamento
Título Vigência Valor Relação com a
presente solicitação FINEP (Convênio Nº. 01.04.0042.00 Transplante de células-tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes 2004-2008
(encerrado) R$400.000 Auxílio financeiro à linha de pesquisa do grupo (células-tronco e doenças auto-imunes)
CNPq (Processo Nº. 552266/2005-1)
Transplante de células tronco hematopoéticas para diabete melito do tipo 1 e doenças neuro-degenerativas
2005-final
2008 R$345.000 Auxílio financeiro à linha de pesquisa do grupo (células-tronco e doenças auto-imunes) FAPESP (Processo Nº. 1998-14247-6) CTC-CEPID 2001-atual R$70.000
(por ano) Auxílio financeiro à linha de pesquisa do grupo (células-tronco e doenças auto-imunes)
11. Contrapartida das instituições participantes
Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos (horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens.
Não se aplica
12. Orçamento justificado e adequado com a proposta
Formulário anexo
Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV)
Modalidade Duração Quantidade
DTD II 36 meses 1
14. Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação:
Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras – indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES
