ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA SƯ PHẠM
BỘ MÔN SƯ PHẠM HÓA HỌC
------KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE
VÀ PHẢN ỨNG TRANSESTE HÓA XÚC TÁC
ENZYM CALLERA TRANS LJP30070
TRÊN NGUỒN DẦU ĂN ĐÃ QUA SỬ DỤNG
Luận văn tốt nghiệp Ngành: Sư phạm Hóa học
Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Phan Thị Bích Trâm Võ Thị Tú Nhi Lớp: Sư phạm Hóa học Khóa 36 MSSV: 2102183
Cần Thơ, 2014
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm luận văn tôi đã học tập và tích lũy được nhiều kiến thức, kinh nghiệm bổ ích làm hành trang vững chắc giúp tôi bước trên con đường sắp tới. Để đạt được những kết quả như ngày hôm nay ngoài nỗ lực bản thân; tôi còn nhận được sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè vào những lúc khó khăn. Vì thế, tôi xin dành trang đầu tiên này để gởi lời cám ơn chân thành đến:
- Cô Phan Thị Bích Trâm đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn này.
- Cô Phan Thị Ngọc Mai, thầy Nguyễn Mộng Hoàng và thầy Nguyễn Điền Trung đã truyền đạt và chỉ bảo tôi nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu.
- Tất cả các thầy cô Bộ môn Sư phạm Hóa học–Khoa Sư Phạm, Trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ cũng như đóng góp những ý kiến giúp luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.
- Gia đình, bạn bè luôn hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn!
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
--- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi iii
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
--- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ... i
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ...ii
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ... iii
MỤC LỤC ... iv DANH MỤC BẢNG ...viii DANH MỤC HÌNH ... ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ... x Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU ... 1 1.1. Đặt vấn đề ... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ... 2
Chương 2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT ... 3
2.1 Enzym lipase ... 3
2.1.1 Định nghĩa ... 3
2.1.2 Cấu trúc lipase ... 3
2.1.3 Cơ chế phản ứng của lipase [14],[15] ... 4
2.1.4 Nguồn thu nhận lipase... 4
2.1.5 Ứng dụng lipase [19] ... 5
2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase ... 6
2.1.6.1 pH ... 6 2.1.6.2 Nhiệt độ ... 7 2.1.6.3 Chất hoạt hóa ... 7 2.1.6.4 Chất kìm hãm ... 7 2.1.6.5 Nồng độ enzym/cơ chất ... 7 2.2 Biodiesel (BDF) ... 8 2.2.1 Khái niệm ... 8
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi v
2.2.2 Ưu và nhược điểm của BDF ... 8
2.2.3 Các phương pháp điều chế BDF ... 9 2.2.3.1 Phương pháp sấy nóng ... 9 2.2.3.2 Phương pháp pha loãng ... 9 2.2.3.3 Phương pháp Crackinh ... 10 2.2.3.4 Phương pháp nhũ tương hóa ... 10 2.2.3.5 Phương pháp transester hóa ... 10
2.2.4 Các phương pháp thực hiện phản ứng transester hóa điều chế BDF ... 11
2.2.4.1 Phương pháp hóa học (khuấy – gia nhiệt) ... 11
2.2.4.2 Phương pháp siêu âm ... 11
2.2.4.3 Phương pháp vi sóng ... 11
2.2.4.4 Phản ứng transester hóa môi trường siêu tới hạn ... 12
2.2.5 Các loại xúc tác trong phản ứng transester hóa ... 12
2.2.5.1 Xúc tác bazơ ... 12
2.2.5.2 Xúc tác axit ... 12
2.2.5.3 Xúc tác enzym ... 13
2.2.5.4 Xúc tác dị thể ... 13
2.2.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới và trong nước ... 13
2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới ... 13
2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trong nước ... 14
2.3 Phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase ... 14
2.3.1 Cơ chế phản ứng transester hóa ... 14
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase …………. ... 16 2.3.2.1 Nhiệt độ ... 16 2.3.2.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu ... 16 2.3.2.3 Tỉ lệ enzym/cơ chất ... 17 2.3.2.4 Hàm lượng nước ... 17 2.3.2.5 Thời gian phản ứng ... 17
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
2.4 Dầu ăn đã qua sử dụng ... 17
2.4.1 Nguồn thu nhận... 17
2.4.2 Thành phần hóa học của dầu ăn đã qua sử dụng ... 18
2.4.3 Tính chất của dầu ăn đã qua sử dụng ... 18
2.4.4 Ưu và nhược điểm của dầu ăn đã qua sử dụng để sản xuất BDF ... 19
2.5 Sắc ký lớp mỏng ... 20
Chương 3 THỰC NGHIỆM ... 22
3.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị ... 22
3.1.1 Nguyên liệu ... 22
3.1.2 Hóa chất ... 22
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ... 22
3.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu ... 22
3.2.1 Xác định chỉ số axit... 22
3.2.2 Xác định chỉ số xà phòng ... 23
3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzym ... 24
3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym ... 25
3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính lipase ... 25
3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase... 27
3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ... 27
3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ... 27
3.3.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt ... 28
3.3.2.4 Ảnh hưởng của dung môi (metanol và etanol) ... 28
3.4 Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase ... 29
3.4.1 Quy trình thực hiện ... 29
3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transeste hóa xúc tác enzym lipase ... 30 3.4.2.1 Nhiệt độ ... 30 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu ... 30
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi vii
3.4.2.3 Tỉ lệ mol metanol/dầu ... 31
3.4.2.4 Thời gian phản ứng ... 31
3.5 Kiểm tra độ sạch của BDF bằng sắc ký bản mỏng ... 32
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 33
4.1 Thành phần nguyên liệu ... 33
4.1.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng ... 33
4.1.2 Hàm lượng protein của enzym ... 34
4.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase ... 35
4.2.1 Ảnh hưởng của pH ... 35
4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ... 36
4.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt theo thời gian ... 37
4.2.4 Ảnh hưởng của metanol và etanol ... 38
4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa ... 39
4.3.1 Nhiệt độ ... 39 4.3.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu ... 40 4.3.3 Lượng enzym xúc tác ... 42 4.3.4 Thời gian phản ứng ... 44 4.4 Kết luận và kiến nghị ... 46 4.4.1 Kết luận ... 46 4.4.2 Kiến nghị ... 46
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Một số ứng dụng của lipase ... 5
Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn ... 25
Bảng 4.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng của dầu ... 33
Bảng 4.2 Hàm lượng protein của enzym Callera Trans LJP30070 ... 34
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Mô hình enzym lipase ... 3
Hình 2.2 Phản ứng thủy phân triglyxerit của lipase ... 4
Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp ester của lipase ... 4
Hình 2.4 Cơ chế xúc tác của enzym lipase trong phản ứng transester hóa ... 15
Hình 3.1 Sắc ký bản mỏng mỡ cá và sắc ký bản mỏng metyl este ... 32
Hình 4.1 Đường chuẩn Albumin ... 34
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase ... 35
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase ... 36
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt theo thời gian của lipase ... 37
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính enzym lipase ... 38
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng ... 39
Hình 4.7 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các nhiệt độ khác nhau ... 40
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ mol metanol/dầu đến hiệu suất chuyển hóa metyl este... 41
Hình 4.9 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các tỉ lệ mol metanol/dầu khác nhau ... 41
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng enzym đến hiệu suất chuyển hóa ... 42
metyl este ... 42
Hình 4.11 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các lượng enzym khác nhau ... 43
Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa metyl este... 44
Hình 4. 13 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các thời gian phản ứng khác nhau ...44
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Asp : Acid aspartic BDF : Biodiesel
BSA : bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò) DO : diesel
FAME : Fatty Acid Metyl ester (metyl este) FFA : Free Fatty Acid
Glu : Glutamin acid residue Gly : Glycine residue His : Histidine residue
HPLC: High Performance Liquid Chromatography ( Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao)
OD : optical density (mật độ quang) Ser : Serine residue
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi xi
TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI
Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác là enzym Callera Trans LJP30070. Trên cơ sở đó thực hiện phản ứng transeste hóa điều chế Biodiesel từ nguồn dầu ăn đã qua sử dụng xúc tác enzym đạt hiệu quả cao nhất. Kết quả đề tài đã xác định được enzym Callera Trans LJP30070 hoạt động tối ưu với cơ chất là nguồn dầu ăn đã qua sử dụng
trong khoảng pH 7÷8, nhiệt độ tối ưu là 70oC, độ bền nhiệt trong khoảng 50÷55oC và
enzym bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của cả metanol và etanol. Khi thực hiện phản ứng transeste hóa nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác enzym Callera Trans
LJP30070 ở nhiệt độ 40oC, tỉ lệ mol metanol/dầu là 6:1, lượng enzym là 3% trong thời
gian phản ứng là 36 giờ thì hiệu suất chuyển hóa metyl este khá cao và sản phẩm thu được tương đối sạch. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa lại thấp hơn hiệu suất ở nhiệt độ
40oC trong 24 giờ khoảng 3,98%.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Năng lượng và môi trường sống từ lâu đã trở thành một nhân tố tác động trực tiếp đến sự phát triển kinh tế và xã hội của hầu hết các quốc gia. Trong các nguồn năng lượng hiện nay thì năng lượng hóa thạch vẫn là nguồn năng lượng chủ yếu trong phát triển kinh tế xã hội loài người. Tuy nhiên, với sự phát triển ồ ạt của công nghiệp hóa, hiện đại hóa như ngày nay thì nguồn năng lượng hóa thạch sẽ ngày càng cạn kiệt. Không những thế việc khai thác và sử dụng năng lượng hóa thạch còn gây ra những tác động xấu đến môi trường như hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm môi trường… Vì vậy, việc tìm ra một nguồn năng lượng mới thân thiện với môi trường để thay thế cho nguồn năng lượng hóa thạch là hết sức cần thiết.[8]
Hiện nay, trên thế giới đã và đang có nhiều công trình nghiên cứu về nguồn năng lượng tái sinh như năng lượng Mặt trời, năng lượng gió, năng lượng thủy triều, năng lượng từ sinh khối… để thay thế cho năng lượng hóa thạch. Trong đó đáng chú ý là nguồn năng lượng từ sinh khối mà đặc biệt là Biodiesel (BDF) hay còn gọi là diesel sinh học. Đây là một loại nhiên liệu xanh thân thiện với môi trường và có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu sẵn có như dầu thực vật, mỡ động vật, các phế phẩm nông nghiệp (rơm, cà phê,…)…
Việt Nam là một nước nông nghiệp có nguồn sinh khối dồi dào nên các nhà khoa học nước ta đã và đang bắt tay vào việc nghiên cứu các phương pháp điều chế Biodiesel từ các nguồn nguyên liệu có sẵn này và thu được nhiều kết quả khả quan. Hơn nữa, Biodiesel có thể được điều chế từ dầu mỡ động thực vật nên nếu ta vận dụng nguồn dầu ăn đã qua sử dụng để tổng hợp BDF thì sẽ giảm được chi phí sản xuất và giảm lượng dầu thải gây ô nhiễm môi trường. Đã có nhiều công trình nghiên cứu việc điều chế biodesel từ nguồn dầu ăn đã qua sử dụng bằng nhiều phương pháp khác nhau [10]. Trong đó phương pháp được sử dung phổ biến nhất là phương pháp transester hóa với nhiều loại xúc tác như bazơ, axit, enzym… Trong đó, việc thực hiện phản ứng transester hóa xúc tác enzym vẫn còn khá mới. Việc sử dụng xúc tác sinh học so với
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 2
xúc tác hóa học có nhiều ưu điểm hơn như điều kiện phản ứng ôn hòa, không có phản ứng phụ, việc tách pha và thu hồi glyxerol dễ dàng, hiệu xuất phản ứng cao, xúc tác có thể tái sử dụng nhiều lần… Với những ưu điểm trên thì việc sử dụng enzym lipase để xúc tác cho phản ứng transester hóa để điều chế Biodiesel là hết sức cần thiết. Chính vì vậy mà đề tài “Khảo sát hoạt tính enzym lipase và phản ứng transester hóa với xúc tác Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định các điều kiện tối ưu về hoạt tính của enzym Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng, trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện để thực hiện phản ứng transester hóa xúc tác enzym Callera Trans LJP30070 đạt hiệu suất cao nhất.
1.3. Nội dung nghiên cứu
1. Khảo sát nguồn nguyên liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng.
2. Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng để điều chế Biodiesel.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Chương 2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT
2.1 Enzym lipase 2.1.1 Định nghĩa
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase EC.3.1.1.3) là enzym xúc tác thủy phân triglyxerit thành điglyxerit, monoglyxerit hoặc glyxerol và các axit béo tiếp diện phân pha dầu nước. Chúng hiện diện rông rãi trong tự nhiên (chiếm 5% trong thị phần enzym thế giới, chỉ đứng sau rotease và cacbohydrat).[17]
2.1.2 Cấu trúc lipase
Hình 2.1 Mô hình enzym lipase
Cấu trúc chung enzym lipase gồm một phiến β ở giữa các nhóm serin hoạt động. Trung tâm hoạt động là bộ ba Ser, His và Asp (hoặc Glu). Trên serin là một khe kỵ nước được hình thành sau hoạt hóa. Cấu trúc ba chiều của lipase đều theo một kiểu chung, trong nếp gấp α, β của enzym có 8 liên kết β song song, chủ yếu được bao quanh bởi xoắn α. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ axit amin. Trong hầu hết cấu
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 4
trúc lipase, đầu serin hoạt động trong chuỗi pentapeptit có trình tự Gly–X1–Ser–X2 –
Gly [10],[17]
2.1.3 Cơ chế phản ứng của lipase [14],[15]
Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học khác nhau, trong đó được quan tâm nhiều nhất là phản ứng thủy phân và phản ứng tổng hợp este.
COOR2 COOR1 COOR3 COOR2 COOH COOR3 COOH COOH COOR3 COOH COOH COOH
R1COOH R2COOH R3COOH
Triglyxerit Diglyxerit Monoglyxerit Glyxerol
lipase lipase lipase
Axit béo Axit béo Axit béo
Hình 2.2 Phản ứng thủy phân triglyxerit của lipase
R1COOH+R2OH lipase R1COOR2 +H2O
Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp ester của lipase
Lipase không tan trong các dung môi không phân cực (dầu) mà chỉ tan trong nước và các dung môi phân cực. Do đó, lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách hai pha dầu-nước, nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính lipase. Để khắc phục hiện tượng này người ta có thể tăng diện tích tiếp xúc bằng cách tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa thích hợp.
2.1.4 Nguồn thu nhận lipase
2.1.4.1 Từ động vật [6],[14]
Nguồn lipase từ động vật được biết đến sớm nhất. Khá phổ biến là lipase từ tuyến tụy của bò, cừu và lợn. Những enzym tuyến tụy này được tiết ra ở tá trạng, xúc tác cho sự thủy phân triglyxerit. Lipase tuyến tụy có thể thủy phân hoàn toàn triglyxerit, phân tử lượng khoảng 45-50 kDa, không có hoặc có rất ít phospholipids và được hoạt hóa ở bề mặt phân chia pha dầu nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
2.1.4.2 Từ thực vật [14],[23]
Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của các hạt có dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng và hạt của các cây cải dầu, cây bông…các lipase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt.
2.1.4.3 Từ vi sinh vật [21],[24]
Lipase từ vi sinh vật có những ưu điểm hơn hẳn lipase từ động vật và thực vật vì thế được quan tâm và sản xuất nhiều nhất. Do vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng enzym lớn trong khoảng thời gian ngắn, hoạt tính của enzym cao hơn hoạt tính của enzym được tổng hợp từ động, thực vật. Lipase thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc,…
Lipase từ vi khuẩn được nghiên cứu khá sớm và đầy đủ. Vi khuẩn được sử dụng trong quá trình tổng hợp lipase thường là Acromobacter sp., Alcaligenes sp.,
Arthrobacter sp., Pseudomonas sp.,Chromobacterium sp.,…
Lipase từ nấm men có nhiều ưu điểm về tính ổn định theo pH và nhiệt độ, tính đặc hiệu với cơ chất và khả năng hoạt động trong dung môi hữu cơ. Lipase thương mại thường được sản xuất bởi Aspergillus niger, Candida cylindracea, Hummicola
lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar,…
Lipase từ nấm mốc tìm thấy ở một số loài như Aspergillus, Rhizopus (tách từ quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa), …
2.1.5 Ứng dụng lipase [19]
Lipase được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp. Một số ứng dụng của lipase được tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 2.1 Một số ứng dụng của lipase Ngành công
nghiệp Phản ứng Sản phẩm hoặc ứng dụng
Chất tẩy rửa Thủy phân chất béo Loại vết dầu mỡ trên vải
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 6
Sữa và thực phẩm từ sữa
Thủy phân chất béo, làm chin phô mai, thay đổi thành
phần bơ sữa.
Tăng cường hợp chất tạo hương vị cho sữa, phô mai và bơ
Bánh kẹo Cải thiện mùi vị Kéo dài thời gian bảo quản
Thức uống Tăng cường hương vị Thức uống
Nước sốt Cải thiện chất lượng Mayonnaise, dressing whippings
Thực phẩm dinh
dưỡng Chuyển hóa ester Thực phẩm dinh dưỡng
Thịt cá Cải thiện mùi vị Sản phẩm thịt cá loại mỡ
Dầu béo Chuyển hóa ester, thủy phân Bơ ca cao, margarine, acid béo,
glyxerol, mono và điglyxerit
Hóa chất Phản ứng tổng hợp đặc hiệu Hợp chất vòng chiral, hóa chất
Dược phẩm Chuyển hóa ester, thủy phân Hỗ trợ tiêu hóa, trao đổi chất
Mỹ phẩm Tổng hợp Chất nhũ hóa, chất làm ẩm
Thuộc da Thủy phân Sản phẩm thuộc da
Giấy Thủy phân Giầy chất lượng cao
2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase
2.1.6.1 pH
pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, phức chất enzym-cơ chất, độ bền và hoạt tính enzym. Phần lớn enzym hoạt động mạnh ở pH trung tính (6÷8). Một số khác hoạt động ở pH axit (1,5÷2) hay pH kiềm (9,5÷10). Mỗi enzym có một giới hạn pH cho hoạt động xúc tác. Giá trị pH mà tại đó khả năng hoạt động của enzym cao nhất được gọi là pH tối ưu. Ngoài pH tối ưu, tốc độ phản ứng của enzym
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
giảm đi nhanh chóng. Giá trị pH tối ưu của enzym không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ.
2.1.6.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzym. Tốc độ phản ứng của enzym không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzym phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường. Phần
lớn enzym hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 35oC÷50oC. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức
nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzym sẽ giảm. Khi đó enzym không có khả năng phục hồi
lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzym bị hạn chế hoạt động rất mạnh nhưng
khi nâng nhiệt độ lên từ từ thì hoạt tính enzym sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
2.1.6.3 Chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzym nên làm tăng tốc độ phản ứng. Chất hoạt hóa thường là:
Các chất hữu cơ phức tạp (cenzyme, vitamin) như NAD+, NADP+,…
Các ion kim loại như K+, Na+, Mg2+, Ca2+,…
2.1.6.4 Chất kìm hãm
Chất kìm hãm là chất làm giảm hoạt tính xúc tác của enzym, nên làm giảm tốc độ phản ứng. Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là ion kim loại, phân tử vô cơ, hữu cơ và protein. Có 2 loại chất kìm hãm: chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh.
2.1.6.5 Nồng độ enzym/cơ chất
Khi nồng độ cơ chất còn ở mức thấp, tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất tiến tới giá trị cực đại thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym.
Khi lượng cơ chất đầy đủ, tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzym. Nồng độ enzym càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất biến đổi càng nhiều bấy nhiêu.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 8 2.2 Biodiesel (BDF)
2.2.1 Khái niệm
Biodiesel (BDF) hay Diesel sinh học là thuật ngữ dùng để chỉ loại nhiên liệu dùng cho động cơ diesel được sản xuất từ dầu mỡ động, thực vật. Về phương diện hóa học thì BDF là các ankyl este, thông dụng nhất là metyl este, thường được điều chế bằng phản ứng transeste chuyển đổi hay este hóa của các triglyxerit, axit tự do với ancol bậc nhất no đơn chức mạch từ C1-C4 [8]
Nhiên liệu sinh học là nguồn năng lượng sạch, thân thiện với môi trường và có thể sản xuất từ các nguồn nguyên liệu có sẵn, nên nhiên liệu sinh học đang là giải pháp của nhiều quốc gia trong việc tìm kiếm nguồn năng lượng mới.
2.2.2 Ưu và nhược điểm của BDF [4],[11],[13]
Ưu điểm
Về môi trường
- Giảm lượng khí thải CO2, CO, NOx,… hạn chế tình trạng ô nhiễm. - Khi cháy ít gây ra khí thải độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe.
- Có khả năng phân hủy và không độc (phân hủy nhanh hơn diesel 4 lần, phân hủy từ 85÷88% trong nước sau 28 ngày).
Về kỹ thuật
- Chỉ số cetan cao hơn diesel.
- Hạn chế việc ăn mòn thiết bị và tạo cặn trong buồng đốt.
- BDF có điểm chớp cháy cao hơn DO, đốt cháy an toàn và an toàn trong quá trình vận chuyển, sử dụng.
- BDF có tính bôi trơn tốt.
- BDF có tính năng tương tự DO và rất linh động nên khi sử dụng BDF để pha trộn với DO thì không cần cải tiến chi tiết động cơ (riêng đối với các hệ thống ống dẫn, bồn chứa làm bằng nhựa thì thay bằng vật liệu kim loại).
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Về kinh tế
- Thúc đẩy ngành nông nghiệp phát triển do việc sản xuất BDF sử dụng các sản phẩm thải của ngành nông nghiệp. Ngoài ra, BDF có thể được tổng hợp từ các loại cây có dầu do đó thúc đẩy việc phát triển nền nông nghiệp trồng trọt các loại cây có dầu tại các vùng trung du, miền núi.
- Hạn chế việc nhập khẩu nhiên liệu diesel tiết kiệm ngân sách quốc gia.
Nhược điểm
- Điểm đông đặc và điểm chảy cao gây khó khăn cho việc sử dụng BDF ở những vùng khí hậu lạnh. Tuy nhiên đối với các nước nhiệt đới như Việt Nam thì ảnh hưởng này không đáng kể.
- BDF có giá trị nhiệt lượng thấp hơn DO.
- Một số nghiên cứu gần đây cho biết khả năng ăn mòn thiết bị của dầu BDF cao hơn so với dầu DO.
- Giá thành BDF gần bằng với giá thành DO.
- BDF không bền, dễ bị oxy hóa gây khó khăn trong việc bảo quản lâu dài.
2.2.3 Các phương pháp điều chế BDF [8],[14],[18]
2.2.3.1 Phương pháp sấy nóng
Phương pháp sấy nóng hạ độ nhớt của dầu và mỡ tương đương với độ nhớt của dầu DO bằng cách gia nhiệt. Tuy nhiên vào mùa đông dầu mỡ bị đông đặc gây khó khăn cho người sử dụng vì phải đốt nóng dầu mỡ trước khi sử dụng. Vì thế, phương pháp sấy nóng ít được sử dụng.
2.2.3.2 Phương pháp pha loãng
Dầu thực vật và mỡ có độ nhớt cao nên không thể sử dụng trực tiếp làm nhiên liệu. Vì vậy, người ta tiến hành pha trộn dầu, mỡ với nhiên liệu DO để tạo một nhiên liệu mới có độ nhớt phù hợp. Tuy nhiên, khi tỉ lệ dầu thực vật và mỡ lớn hơn 50% thì hỗn hợp nhiên liệu thu được vẫn có độ nhớt lớn hơn nhiên liệu DO. Một số nghiên cứu
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 10
cho thấy rằng khi tỉ lệ dầu thực vật và mỡ là 10% thì hỗn hợp nhiên liệu tạo thành có độ nhớt gần bằng với nhiên liệu DO và cho hiệu quả sử dụng tốt cho động cơ Diesel.
2.2.3.3 Phương pháp Cracking
Quá trình Cracking dầu, mỡ cũng gần giống với quá trình Cracking dầu mỏ. Khi tiến hành Cracking dầu mỡ dưới tác dụng của nhiệt và chất xúc tác thích hợp thì mạch hidrocacbon bị cắt ngắn. Sản phẩm thu được là khí (90% hidrocacbon), xăng (chỉ số
octan 86, d=0,75g/cm3), nhiên liệu DO (d=0,82g/cm3) và một số sản phẩm phụ khác.
Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng Cracking dầu mỡ thì cần cung cấp một lượng nhiệt lớn, thiết bị đắt tiền và sản phẩm thu được gồm nhiều dạng nên phương pháp này ít được sử dụng.
2.2.3.4 Phương pháp nhũ tương hóa
Một phương pháp khác để giảm độ nhớt của dầu, mỡ là phương pháp nhũ tương hóa bằng các dung môi ancol như metanol, etanol và 1-butanol. Hệ nhũ tương tạo thành có độ nhớt tương đương nhiên liệu diesel, tỉ lệ ancol càng lớn thì độ nhớt nhũ tương càng nhỏ. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp nhũ tương hóa là việc tạo và duy trì nhũ, lọc nhiên liệu và do ancol có nhiệt độ sôi thấp nên dễ bay hơi cản trở quá trình làm việc của động cơ.
2.2.3.5 Phương pháp transester hóa
Phản ứng transester hóa là phản ứng chuyển hóa các phân tử triglixerit thành các ankyl este của axit béo mạch dài bằng các ancol no, đơn chức mạch ngắn như metanol, etanol… Phản ứng transester hóa có thể được xúc tác bằng nhiều loại xúc tác khác nhau như bazơ, axit và enzym. Transester hóa là phản ứng gồm nhiều phản ứng thuận nghịch nối tiếp nhau. Trong đó, các phân tử triglixerit lần lượt được chuyển hóa thành điglixerit, monoglixerit và cuối cùng là glyxerol.
Transester hóa được lựa chọn là phương pháp để tổng hợp BDF vì nhiều ưu điểm:
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
- Tính chất của ankyl este gần giống với nhiên liệu diesel, mặc khác metyl hay etyl este của các axit béo có thể cháy trong các động cơ diesel mà không cần cải tiến động cơ và không tạo cặn lắng.
- Quy trình thực hiện phản ứng đơn giản nên có thể sử dụng trong quy mô công nghiệp.
- Phụ phẩm glyxerol có nhiều ứng dụng trong công nghiệp.
Tuy nhiên metanol được sử dụng phổ biến hơn etanol vì metanol dễ thu hồi và tái sử dụng hơn etanol vì nó không tạo hỗn hợp đẳng phí với nước (trong khi etanol lại tạo hỗn hợp đẳng phí với nước). Vì vậy, Biodiesel thường là metyl este được tổng hợp bằng phản ứng transester hóa triglixerit với metanol.
2.2.4 Các phương pháp thực hiện phản ứng transester hóa điều chế
BDF[8],[10],[18]
2.2.4.1 Phương pháp hóa học (khuấy–gia nhiệt)
Phương pháp khuấy-gia nhiệt sử dụng máy khuấy cơ học hay máy khuấy có gia nhiệt để khuấy trộn hỗn hợp phản ứng, tăng điều kiện tiếp xúc giữa hai pha (dầu, mỡ và ancol) để thực hiện phản ứng transester hóa. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện nếu xúc tác tốt có thể đạt độ chuyển hóa cao. Tuy nhiên, thực hiện phản ứng transester hóa bằng phương pháp hóa học tốn nhiều thời gian.
2.2.4.2 Phương pháp siêu âm
Phương pháp siêu âm gần đây được sử dụng nhiều trong việc điều chế Biodiesel do thời gian phản ứng được rút ngăn hơn so với phương pháp khuấy-gia nhiệt và độ chuyển hóa của phản ứng cũng tương đối cao.
2.2.4.3 Phương pháp vi sóng
Phương pháp vi sóng sử dụng vi sóng (sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng, có bước sóng trong khoảng 1cm đến 1m) để cung cấp nhiệt cho phản ứng. Vi sóng xuyên thấu vật chất, làm vật chất nóng từ bên trong thay vì làm nóng từ bên ngoài đối với các phương pháp làm nóng thông thường. Sử dụng phương pháp vi sóng
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 12
để thực hiện phản ứng transester hóa cũng cho độ chuyển hóa cao và thời gian phản ứng ngắn.
2.2.4.4 Phản ứng transester hóa môi trường siêu tới hạn
Trong môi trường siêu tới hạn dầu thực vật và mỡ có thể hòa tan một phần hay hoàn toàn ancol do đó thời gian phản ứng transester hóa dầu thực vật và mỡ với ancol được rút ngắn. Đối với các phương pháp tổng hợp BDF truyền thống thì hàm lượng nước và axit béo có tác hại rất lớn nhưng trong phương pháp siêu tới hạn thì nước và axit béo lại ảnh hưởng tích cực đến hiệu suất phản ứng. Tuy nhiên, phản ứng transester hóa trong môi trường siêu tới hạn cần sử dụng các thiết bị hiện đại, chi phí cao vì vậy phương pháp này ít được sử dụng hơn so với các phương pháp truyền thống.
2.2.5 Các loại xúc tác trong phản ứng transester hóa
2.2.5.1 Xúc tác bazơ [10]
Các xúc tác bazơ thường được sử dụng thường là natri hydroxyt (NaOH), kali hydroxyt (KOH). Bazơ được sử dụng khá phổ biến để xúc tác phản ứng transester hóa dầu thực vật, mỡ động vật vì nhiều lý do như: thời gian phản ứng ngắn (30÷90 phút), hiệu suất cao (90÷98%) và nhiệt độ phản ứng tương đối thấp. Tuy nhiên, một hạn chế của việc sử dụng xúc tác kiềm là khi sử dụng với nguồn nguyên liệu có hàm lượng axit béo tự do (FFA) cao và có lẫn nước thì hiệu suất phản ứng và độ tinh khiết của sản phẩm thấp. Chính vì dầu ăn đã qua sử dụng có hàm lượng FFA cao nên xúc tác bazơ ít được sử dụng trong việc tổng hợp BDF bằng phản ứng transester hóa sử dụng nguồn dầu ăn đã qua sử dụng.
2.2.5.2 Xúc tác axit[18]
Axit thường được sử dụng trong phản ứng transester hóa như axit sunfuric (H2SO4), axit clohiđric (HCl). Một ưu điểm của xúc tác axit so với xúc tác bazơ là có thể sử dụng với nguồn nguyên liệu có hàm lượng FFA cao. Tuy nhiên, phản ứng transester hóa xúc tác axit lại không được sử dụng phổ biến trong sản xuất công nghiệp vì thời gian phản ứng chậm (3÷18 giờ), nhiệt độ phản ứng cao (55÷100oC),
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
lượng ancol sử dụng nhiều. Không những thế việc sử dụng xúc tác axit ở nhiệt độ cao và thời gian phản ứng dài sẽ ăn mòn thiết bị.
2.2.5.3 Xúc tác enzym[14]
Trong những năm gần đây, phản ứng transester hóa điều chế BDF từ các nguồn dầu mỡ bằng xúc tác enzym lipase được nghiên cứu rất nhiều. Xúc tác enzym không bị ảnh hưởng bởi hàm lượng axit béo tự do trong nguyên liệu vì vậy hạn chế được tạo việc hình thành xà phòng trong quá trình phản ứng làm cho quá trình tách và lọc sản phẩm dễ dàng, hạn chế chất thải rắn gây ô nhiễm môi trường. Mặt khác, so với xúc tác hóa học thì phản ứng transester hóa xúc tác enzym xảy ra ôn hòa hơn, nhiệt độ phản
ứng thấp (35÷55oC), việc tách pha và thu hồi glyxerol dễ dàng, xúc tác có thể tái sử
dụng nhiều lần. Tuy nhiên, phản ứng xúc tác enzym xảy ra với tốc độ khá chậm, khi hàm lượng ancol cao có thể gây bất hoạt enzym, enzym có tính chọn lọc cao và giá thành enzym cao hơn so với các loại xúc tác hóa học vì thế xúc tác enzym ít được sử dụng trong sản xuất công nghiệp.
2.2.5.4 Xúc tác dị thể [2]
Để khắc phục các hạn chế của xúc tác đồng thể, các nhà khoa học đang có xu hướng dị thể hóa xúc tác. Các xúc tác dị thể thường là các hợp chất của kim loại kiềm hay kiềm thổ mang trên chất mang rắn như Na2CO3/MgO, Na2SiO3/SiO2, Na2CO3/ɤ- Al2O3,… Các loại xúc tác này có độ chuyển hóa cao (trên 90%), hạn chế quá trình tạo xà phòng, xúc tác có giá thành rẻ và có thể tái sử dụng, việc tách lọc sản phẩm dễ dàng… Vì vậy, trong công nghiệp tổng hợp BDF bằng phản ứng transester hóa xúc tác đồng thể đang dần được thay thế bằng xúc tác dị thể.
2.2.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới và trong nước
2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới [22]
Nhằm giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch và để ổn định nguồn cung ứng, các quốc gia trên thế giới đã đặt ra mục tiêu chú trọng phát triển nhiên liệu sinh học . Trong các loại nhiên liệu sinh học thì BDF là nhiên liệu được sản xuất nhiều nhất (chiếm 82% tổng số nhiên liệu sinh học). Hiện nay, EU và Hoa kỳ dẫn đầu về năng
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 14
suất cũng như sản lượng sản xuất BDF hàng năm. Trong đó, EU đứng đầu về tổng sản lượng BDF năm 2008 là 7,8 triệu tấn, tăng 35,7% so với năm 2007 là 5,7 triệu tấn. Hoa kỳ đứng thứ hai, sản lượng tăng từ 946 triệu lít năm 2006 lên 1,7 tỉ lít năm 2007 và khoảng 2,46 tỉ lít năm 2008. Theo ước tính thì thị trường BDF của thế giới sẽ đạt 140 tỉ lít vào năm 2016, tốc độ tăng trưởng hàng năm đạt 42%. Đến năm 2010 đã có hơn 200 nước tham gia nghiên cứu và sản xuất BDF, thúc đẩy thế giới bước vào một thời đại mới, các quốc gia đều tích cực tạo ra nguồn năng lượng xanh phục vụ cho nền kinh tế và sản xuất.
2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trong nước[23]
Trước sự phát triển mạnh mẽ nguồn nhiên liệu sinh học nói chung và BDF nói riêng trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã bắt tay vào việc nghiên cứu và sản xuất BDF ở phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất nhỏ.
Một vài doanh nghiệp ở Cần Thơ, An Giang đã thành công trong việc sản xuất BDF từ mỡ cá basa. Công ty TNHH Minh Tú cũng đầu tư xây dựng dây chuyền sản xuất tự động hoàn toàn và khép kín. Bên cạnh đó, một số viện nghiên cứu và trường đại học ở nước ta cũng có những thành công trong công việc nghiên cứu, sản xuất BDF từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như dầu cọ, dầu dừa, dầu hạt cao su, dầu ăn thải, mỡ cá,…sử dụng các loại xúc tác axit, bazơ, enzym,…
Ngày 20/11/2007 chính phủ đã phê duyệt đề án “ Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn 2020”. Ngoài việc phát triển nhiên liệu xăng pha cồn, đề án còn đề cặp đến việc phát triển nhiên liệu diesel pha với metyl este dầu mỡ động, thực vật (BDF), với mục tiêu đến năm 2015 nước ta sẽ làm chủ được công nghệ sản xuất BDF từ các nguồn nguyên liệu có sẵn trong nước.
2.3 Phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase 2.3.1 Cơ chế phản ứng transester hóa [1],[10],[14]
Toàn bộ cơ chế phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase được mô tả trong hình phía dưới:
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Hình 2.4 Cơ chế xúc tác của enzym lipase trong phản ứng transester hóa
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 16
- Bước đầu tiên (a), là quá trình gắn cơ chất lên tác nhân của enzym-mà trung tâm ái nhân là nguyên tử oxy của nhóm –OH hình thành nên phức hợp enzym-cơ chất.
- Bước thứ hai (b), proton từ axit liên hợp của amin chuyển tới nguyên tử oxy của nhóm alkyl trong cơ chất, hình thành nên nhóm hyđroxyl của điglyxerit, monoglyxerit hoặc glyxerol.
- Bước thứ ba (c), nguyên tử oxi từ phân tử rượu (metanol) được gắn vào nguyên tử cacbon trong liên kết C=O của nhóm acyl-thuộc phức hợp trung gian với enzym-hình thành nên phức hợp acylate enzym–rượu.
- Cuối cùng (d), nguyên tử oxy của nguyên tử enzym trong phức hợp được giải phóng, và một proton được chuyển từ axit liên hợp của nhóm amin đến tạo lại nhóm hyđroxyl. Cùng lúc tạo ra một phân tử metyl ester của axit béo hay còn gọi là Biodiesel.
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase [14],[15]
2.3.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzym và tốc độ phản ứng có enzym xúc tác. Khi nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ tối ưu của enzym thì enzym bị bất hoạt, tốc độ phản ứng giảm từ đó làm hiệu suất phản ứng thấp. Vì vậy, khi thực hiện phản ứng sử dụng xúc tác enzym cần chọn nhiệt độ phản ứng phù hợp với nhiệt độ tối ưu của enzym nhằm thu được hiệu suất phản ứng là cao nhất.
2.3.2.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu
Một vấn đề khá quan trọng trong việc sử dụng enzym lipase trong sản xuất Biodiesel là việc ức chế hoạt động của enzym bởi lượng dư metanol. Metanol là chất ức chế đặc biệt mạnh đối với enzym, đồng thời lượng dư metanol làm phản ứng ester hóa chuyển dịch theo chiều nghịch, làm giảm hiệu suất phản ứng. Để hạn chế ảnh hưởng đó, nhà khoa học Shimada và cộng sự (2002) đã đưa ra biện pháp là chia nhỏ lượng metanol thêm vào phản ứng. Ngoài ra, Kaida, Samukawa, Kondo and Fukuda
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
(2001) đề nghị một biện pháp là thêm nước hoặc một dung môi nào khác để hòa tan lượng dư metanol hạn chế tình trạng ức chế enzym.
2.3.2.3 Tỉ lệ enzym/cơ chất
Tỉ lệ giữa lượng enzym và cơ chất cũng ảnh hưởng nhiều đến tốc độ phản ứng của enzym. Do giá thành của enzym cao nên khi thực hiện phản ứng transester hóa tổng hợp BDF bằng xúc tác cần phải chọn lượng enzym phù hợp để làm giảm giá thành của sản phẩm.
2.3.2.4 Hàm lượng nước
Trong các phản ứng mà enzym không hòa tan được trong chất nền như dầu thì sự có mặt của nước trong phản ứng là rất quan trọng. Nước góp phần duy trì và hoạt hóa hoạt tính enzym. Nước hòa tan enzym và làm tăng khả năng phản ứng của enzym và cơ chất (dầu) tại mặt phân cách dầu–nước. Nói chung, khi tăng hàm lượng nước hiệu suất phản ứng xúc tác enzym tăng. Tuy nhiên, hàm lượng nước quá nhiều có thể làm phản ứng ester hóa chuyển dịch theo chiều nghịch hoặc xảy ra phản ứng thủy phân metyl ester làm giảm hiệu suất tổng hợp BDF. Do vậy, cần điều chỉnh hàm lượng nước trong mẫu khi điều chế BDF.
2.3.2.5 Thời gian phản ứng
Phản ứng xúc tác enzym xảy ra trong khoảng thời gian dài vì thế để tăng hiệu suất chuyển hóa sản phẩm tạo thành cần kéo dài thời gian phản ứng. Tuy nhiên, hoạt tính enzym còn phụ thuộc vào độ bền nhiệt. Khi thời gian phản ứng kéo dài thì hoạt tính enzym giảm. Vì thế, khi thực hiện phản ứng chúng ta cần chọn thời gian phản ứng thích hợp.
2.4 Dầu ăn đã qua sử dụng 2.4.1 Nguồn thu nhận[2]
Nguồn dầu ăn đã qua sử dụng được thu nhận từ các nhà hàng, các quy trình sản xuất thực phẩm, các cửa hàng thức ăn nhanh mỗi ngày. Ước tính hiện tại riêng khu vực phía Nam, lượng dầu ăn đã qua sử dụng thu nhận từ các nhà máy tinh luyện dầu
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 18
thải thu nhận từ các nhà máy sản xuất mì ăn liền, các nhà máy chế biến thực phẩm có sử dụng dầu ăn và các nhà hàng, quán ăn, cơ sở chế biến thực phẩm khoảng 4÷5 tấn/ngày. Do nguồn thu nhận dầu ăn đã qua sử dụng để làm nguyên liệu điều chế BDF rất đa dạng và phổ biến nên việc tổng hợp BDF rất có triển vọng phát triển.
2.4.2 Thành phần hóa học của dầu ăn đã qua sử dụng[2],[10]
Dầu ăn đã qua sử dụng có thành phần hóa học tương tự dầu thực vật với 95÷97% các triglyxerit và các axit béo.
Công thức hóa học chung của triglyxerit:
R
1COOCH
2R
2COOCH
R
3COOCH
2Trong đó: R1,R2,R3 là gốc hidrocacbon của các axit béo. Các gốc hidrocacbon này có thể no hay không no và thường có khoảng 8÷30 nguyên tử Cacbon.
Ngoài ra, trong dầu ăn đã qua sử dụng còn chứa một lượng nhỏ các hợp chất khác như photphatit, chất sáp, chất nhựa, chất màu, chất gây mùi, tạp chất cơ học, cặn cacbon, hàm lượng axit béo tự do tăng và nhiều tạp chất khác. Do vậy, cần tiến hành các biện pháp xử lý nguồn dầu ăn đã qua sử dụng như lọc tách cặn, tách nước, trung hòa để giảm hàm lượng axit béo trước khi đưa vào tổng hợp BDF.
2.4.3 Tính chất của dầu ăn đã qua sử dụng[2],[12]
Dầu ăn đã qua sử dụng có các tính chất vật lý tương tự như dầu thực vật như: không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi không phân cực, nhẹ hơn nước, nhiệt độ sôi cao. Tuy nhiên, quá trình chiên rán ở nhiệt độ cao làm dầu ăn đã qua sử dụng có một số tính chất khác: độ nhớt tăng, màu dầu sẫm hơn, hàm lượng axit béo tự do tăng...
Dầu ăn đã qua sử dụng cũng có các phản ứng hóa học như phản ứng thủy phân, phản ứng transeste hóa, phản ứng xà phòng hóa...
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Phản ứng transeste hóa được ứng dụng để tổng hợp BDF từ nguồn dầu ăn. Khi có mặt xúc tác axit (HCl, H2SO4,…) hay bazơ mạnh (NaOH, KOH,…), các triglyxerit xảy ra phản ứng trao đổi este với các ancol bậc một mạch thẳng như metanol, etanol,.. tạo thành các ankyl este và glyxerol.
Phương trình phản ứng: R1COOCH2 R2COOCH R3COOCH2 + ROH H2C OH HC OH H2C OH + R1COOR R2COOR R3COOR 3 xúc tác
Phản ứng thủy phân và phản ứng xà phòng hóa là hai phản ứng không mong muốn trong quá trình tổng hợp BDF, vì nó làm giảm lượng triglyxerit, giảm hiệu suất phản ứng. Không những thế lượng xà phòng tạo ra còn làm giảm khả năng tiếp xúc các chất, giảm lượng sản phẩm và gây khó khăn trong quá trình tách pha của sản phẩm. Vì thế, cần hạn chế hai phản ứng này trong quá trình điều chế BDF.
Dầu ăn đã qua sử dụng ngoài thành phần chính là este thì còn có một lượng nhỏ các axit béo tự do. Hàm lượng axit béo tự do được đánh giá thông qua chỉ số axit. Khi chỉ số axit trong dầu sử dụng càng cao chứng tỏ hàm lượng axit béo tự do càng nhiều. Nếu sử dụng nguồn dầu này để tổng hợp BDF sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng do tăng quá trình hình thành xà phòng. Vì thế khi chọn nguồn nguyên liệu cần chọn dầu có chỉ số axit phù hợp và có các biện pháp hạ chỉ số axit.
2.4.4 Ưu và nhược điểm của dầu ăn đã qua sử dụng để sản xuất BDF
a) Ưu điểm [10],[12]
Sử dụng dầu đã qua sử dụng làm nguyên liệu sản xuất BDF có nhiều ưu điểm về mặt kinh tế cũng như về kỹ thuật và môi trường.
- Giá thành BDF giảm do sử dụng nguồn dầu ăn đã qua sử dụng.
- Nguồn nguyên liệu sử dụng phổ biến, dễ thu nhận vì thế không phải cạnh tranh với các ngành công nghiệp khác.
- Tái sử dụng nguồn dầu ăn thải hạn chế được tình trạng ô nhiễm môi trường.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 20
- Sản phẩm BDF tổng hợp từ dầu ăn đã qua sử dụng có nhiều ưu điểm: Không độc, dễ phân giải trong tự nhiên
Hàm lượng các hợp chất thơm và lưu huỳnh thấp Thân thiện với môi trường
Giá trị nhiệt cháy và chỉ số cetan cao hơn nhiên liệu diesel Nhiệt độ cháy cao, hạn chế tình trạng cháy nổ
BDF có thể sử dụng trực tiếp cho các động cơ diesel.
b) Nhược điểm [12],[14]
Bên cạnh những ưu điểm thì việc sử dụng nguồn dầu ăn đã qua sử dụng sản xuất BDF thì cũng có những nhược điểm như:
- Độ nhớt cao.
- Độ bay hơi thấp, khó cháy.
- Dễ hình thành cặn lắng làm ảnh hưởng đến chất lượng BDF. - Dễ bị oxi hóa.
- Hàm lượng axit béo cao gây cản trở quá trình chuyển hóa thành BDF.
- Sản phẩm BDF từ dầu thải chiên rán tạo nhiều khí NOx khi sử dụng trên động cơ diesel.
2.5 Sắc ký lớp mỏng [18]
Sắc ký lớp mỏng còn được gọi là sắc ký phẳng, chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như silicagen hoặc oxit alumin.
Dung môi giải ly
Nguyên tắc chọn dung môi giải ly: Chọn dung môi rẻ tiền, có độ tinh khiết cao, tránh có chứa các vết kim loại và dung môi không được quá dễ bay hơi. Thông thường người ta sử dụng dung môi giải ly là hỗn hợp hai dung môi. Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Hiện hình vết sau giải ly: Sau khi giải ly, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không màu, nếu muốn nhìn thấy vết cần sử dụng các phương pháp vật lý hay hóa học.
Phương pháp vật lý
Phương pháp hiện hình vết sắc ký sau giải ly thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) với hai bước sóng 254 nm và 366 nm.
Phương pháp hóa học
- Phương pháp hóa học là phát hiện vết bằng thuốc thử. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo nên các dẫn xuất có màu. Một số thuốc thử thường dùng như : I2, H2SO4, chất chỉ thị phát quỳnh quang, đinitrophenylhidrazin …
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 22
Chương 3 THỰC NGHIỆM
3.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị 3.1.1 Nguyên liệu
Dầu thực vật đã qua sử dụng thu mua tại các quán thức ăn nhanh ở phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, TP. Cần Thơ. Mẫu dầu chợ (làm mẫu đối chứng) mua theo kilogram ở chợ Xuân Khánh, TP. Cần Thơ.
Enzym Callera Trans LJP30070 được đặt mua tại công ty Greentech hãng Novozymes Đan Mạch tại TP. Hồ Chí Minh.
3.1.2 Hóa chất
Gum arbic (Trung Quốc), cồn tuyệt đối (Việt Nam), NaOH rắn (Merck), KOH rắn (Merck), dung dịch đệm photphat, Thymolphtalein (Merck), Metanol (Việt Nam), Etanol (Việt Nam), Clorofom (Trung Quốc), Ete dầu hỏa (Trung Quốc), Tinh thể I2 (Malaysia), Glyxerol lỏng (Trung Quốc).
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
Bể điều nhiệt có lắc Cá từ
Máy chỉnh pH Ống sinh hàn
Máy khuấy từ gia nhiệt Bình lóng
Bể điều nhiệt Phễu lọc
Erlen Cân điện tử
Buret Giấy lọc
Pipet các loại Sắc ký bản mỏng
3.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu 3.2.1 Xác định chỉ số axit
a) Nguyên tắc
Dùng dung dịch KOH để trung hòa những axit béo tự do có trong dầu với phenolphthalein làm chất chỉ thị.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
b) Tiến hành
Dùng erlen 100ml cho vào 5ml cồn tuyệt đối + 5ml đietyl ete (tỉ lệ 1:1), cho thêm 2 – 3 giọt phenolphthalein và dùng dung dịch KOH 0,01N trong ancol để trung hòa hỗn hợp trên đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sau đó thêm vào hỗn hợp vừa trung hòa 0,5g dầu tương ứng. Tiếp tục chuẩn độ hỗn hợp này bằng dung dịch KOH 0,01N trong ancol cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 30 giây. Đọc thể tích trên buret. Mỗi mẫu dầu 3 lần lặp lại và lấy giá trị thể tích trung bình.
Tính chỉ số axit Công thức tính chỉ số axit: Ca a 0,56 m Trong đó: Ca: chỉ số axit a: thể tích KOH đọc trên buret (ml) m: khối lượng dầu đã dùng (g) 3.2.2 Xác định chỉ số xà phòng a) Nguyên tắc
Dùng KOH để trung hòa lượng axit béo tự do và thủy giải ester có trong 1 gam chất béo bằng chỉ thị phenolphtalein.
b) Tiến hành
Cho vào erlen 100ml 0,3 gam dầu ăn đã qua sử dụng và 6ml KOH 0,5N trong etanol. Đun hoàn lưu trong 45 phút. Sau đó để nguội. Cho thêm vào mỗi erlen 2ml nước cất và 3 giọt phenolphthalein, lắc đều. Chuẩn độ erlen bằng dung dịch HCl 0,5N đến khi mất màu hồng. Tiến hành 3 lần để lấy giá trị trung bình. Tiến hành song song mẫu trắng (mẫu không có dầu) để so sánh.
Tính chỉ số xà phòng: a b x (V V ).0, 28 C m
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 24
Trong đó:
Cx: chỉ số xà phòng
Va: thể tích KOH sử dụng ban đầu (ml) Vb: thể tích HCl đọc trên buret (ml) m: khối lượng dầu sử dụng (g)
3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzym [6]
a) Nguyên tắc
Hàm lượng protein trong enzym được xác định bằng phương pháp Lowry dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein. Phương pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc Tyrosin, Trytophan, Hystidin để tạo phức màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm và dựa vào đường chuẩn Protein để xác định hàm lượng protein có trong mẫu. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein.
Dựa vào hàm lượng protein có trong enzym để xác định hoạt tính riêng của enzym.
b) Tiến hành
Chuẩn bị hóa chất Pha các dung dịch sau:
- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N - Dung dịch B1: CuSO4 1%
- Dung dịch B2: Kali – natri tartrat 2% - Dung dịch C = B1:B2:A = 0,5:0,5:50
- Dung dịch BSA gốc 1mg/ml pha trong H2O Xây dựng đường chuẩn BSA
Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ BSA khác nhau theo bảng sau:
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn Nồng độ (µg/ml) 0 40 80 120 160 200 240 280 320 V BSA( µl) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V H2O (µl) 500 480 460 440 420 400 380 360 340 V dd C (ml ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 V TT Folin 1N (µl) 250 250 250 250 250 250 250 250 250
Để yên 30 phút. Tiến hành đo các nồng độ ở bước sóng 750 nm. Tiến hành đo mẫu phân tích.
Tiến hành đo mẫu phân tích tương tự như đo các mẫu ở đường chuẩn.
Phân tích kết quả dựa trên đường chuẩn đã xây dựng. Mỗi mẫu phân tích 3 lần lập lại và lấy kết quả trung bình.
Tính kết quả
Công thức tính hàm lượng protein trong 1ml dung dịch enzym : P= x . k . 10-3 (mg protein/ml)
Với :
P : hàm lượng protein có trong 1ml dung dịch enzym mẫu (mg protein/ml). x : Nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (µg/ml).
k : Hệ số pha loãng.
3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính lipase
a) Nguyên tắc
Hoạt tính enzym lipase được xác định bằng phương pháp định lượng bằng dung dịch NaOH lượng axit béo tự do tạo ra với cơ chất là dầu ăn đã qua sử dụng được nhũ hóa .
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
SVTH: Võ Thị Tú Nhi 26
b) Tiến hành
Chuẩn bị
- Nhũ hóa dầu : Cho vào cốc thủy tinh 500ml : 10 gam dầu ăn đã qua sử dụng + 7,5 gam gum arabic + 60ml dung dịch đệm photphat. Sau đó đánh tan hỗn hợp bằng máy đồng hóa với số vòng 800÷900 vòng/phút trong 15÷20 phút. Hỗn hợp này được sử dụng khi nó không bị phân thành hai lớp sau khi bảo quản trong 1 giờ và ổn định trong 2 ngày ở nhiệt độ 5oC÷10oC.
- Dung dịch enzym pha loãng trong dung dịch đệm. - Dung dịch NaOH 0,1N
- Thymolphtalein 0,1% Tiến hành
Cho 5ml dầu thực vật đã được nhũ hóa vào erlen 50ml, rồi ổn định nhiệt độ dầu trong erlen trên bể điều nhiệt có gắn hệ thống lắc ở nhiệt độ thích hợp khoảng 15 phút. Sau đó thêm 1ml dung dịch enzym đã pha loãng. Lắc đều hỗn hợp trên bể điều nhiệt có gắn hệ thống lắc. Tiến hành phản ứng trong 1 giờ. Trong suốt thời gian phản ứng phải giữ cho pH môi trường luôn ổn định. Sau 1 giờ phản ứng, cho vào hỗn hợp 10ml cồn tuyệt đối để dừng phản ứng. Sau đó chuẩn độ hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị Thymolphtalein 0,1%.
Tiến hành song song mẫu đối chứng (mẫu trắng). Tính toán
Một đơn vị hoạt tính lipase (U) định nghĩa là lượng enzym xúc tác để giải phóng một micromol (µmol) axit béo trong một giờ phản ứng với các điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính lipase (U/ml) được tính theo công thức : A = [(a-b) x 1000 x 0,1] (U/ml) Trong đó :
A : Hoạt tính lipase (U/ml).
a : thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ ở mẫu có enzym (ml).
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
b : thể tích NaOH 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng ( mẫu không có enzym) (ml) Hoạt tính riêng của enzym lipase
Hoạt tính riêng của enzym lipase được tính theo công thức :
AR = A
P (U/mg protein)
Trong đó :
AR : Hoạt tính riêng của enzym lipase (U/mg protein). A : Hoạt tính lipase (U/ml)
P : Hàm lượng protein trong 1ml dịch enzym mẫu (mg protein/ml).
3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase
3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH
a) Mục đích : Xác định giá trị pH tối ưu của enzym lipase. b) Tiến hành thí nghiệm
Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym ở các mức độ pH :6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9 Mỗi giá trị pH lặp lại 3 lần.
Với mỗi nghiệm thức pH, enzym được pha loãng trong dung dịch đệm ở pH tương ứng. Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym tương tự mục 3.3.1. Phản ứng được
tiến hành trong 1 giờ ở 40oC. Trong suốt thời gian phản ứng giữ pH môi trường luôn
ổn định ứng với giá trị pH đang khảo sát.
c) Chỉ tiêu đánh giá : Đơn vị hoạt tính của lipase (U/mg protein). 3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
a) Mục đích : Xác định giá trị nhiệt độ tối ưu của enzym. b) Tiến hành thí nghiệm
Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym ở các giá trị nhiệt độ :35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC, 75oC, 80oC .Mỗi nhiệt độ lặp lại 3 lần.
