[ APPLICATION NOTE ] Método Rápido E Sensível Para Determinação De Hormônios Esteróides Em Amostras De Soro Humano Por UPLC-Ms/Ms

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SOLUÇÕES WATERS

ACQUITY UPLC® I-Class, Espectrômetro de massas Xevo™ TQ-S, coluna ACQUITY® BEH C18, MassLynx™, TargetLynx™XS, Plate

microeluição OASIS® Prime HLB, Pressão positiva

PALAVRAS-CHAVE

Aldosterona, Androstenediona, Cortisol, Corticosterona, DHEA, Progesterona, Testosterona, 17 alfa-Hidroxiprogesterona, 11-Desoxicorticosterona, microeluição, SPE, Preparo de amostras, Esteróides, LC-MS/

BENEFICIOS DA APLICAÇÃO

Preparo de amostra Simples e Rápido Resultados Precisos e Lineares para todos os analitos

Sem necessidade de evaporação ou reconstituição

INTRODUÇÃO

Esteróides são grandes grupos de compostos lipossolúveis. São lipídeos de cadeia complexa, baseados na estrutura fundamental do colesterol. Os hormônios esteróides são produzidos a partir do colesterol e modificados por uma série de reações químicas, até que um hormônio fique pronto para exercer sua atividade biológica.

O preparo de amosta em estudos bioanalíticos vem se tornando uma das etapas mais importantes em análises por LC-MS/MS.

Esta nota de aplicação detalha o procedimento de extração e um método de UPLC-MS/MS para determinação de Aldosterona, Androstenediona, Cortisol, Corticosterona, DHEA, Progesterona, Testosterona, 17 ⍺- Hidroxiprogesterona e 11-Desoxicorticosterona utilizando o cartucho de extração em fase sólida Oasis PRiME HLB. Grande parte desses compostos são analisados por imunoensaios, porém, esses ensaios necessitam ser executados separadamente, exigindo mais amostras e uma análise individual para cada composto. O método por UPLC-MS/MS proporciona uma análise com alta seletividade e capacidade da determinação de todos esses compostos em um único método de extração e em uma única análise cromatográfica.

Método Rápido E Sensível Para Determinação De Hormônios Esteróides

Em Amostras De Soro Humano Por UPLC-Ms/Ms

Pereira Danilo, Reis Cintia

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[ APPLICATION NOTE ]

DADOS EXPERIMENTAIS

Condições UPLC

Sistema LC: Waters ACQUITY UPLC@

I-Class

Coluna: ACQUITY UPLC BEH

C18 2.1 X 100 mm, 1.7 µm

Temperatura da coluna: 50°C Volume de injeção: 10 µL

Fluxo: 0.5 mL/min

Fase móvel A Água + 0.1% ácido

fórmico

Fase móvel B: Metanol + 0.1% ácido

fórmico

Solução Purge: 55/45 água/metanol

(v/v)

Solução Wash: 10/90 água/metanol

(v/v)

Seal wash: 90/10 água/acetonitrila

Condições MS

Sistema MS: Xevo™ TQ-S

Espectrômetro de Massas

Modo de ionização: ESI+ e ESI -Voltagem do capilar: 3 kV

Voltagem do cone: Otimizado para cada analito Temperatura de dessolvatação: 600 °C Fluxo de dessolvatação: 1200 L/Hr Temperatura da fonte: 150 °C Tempo (min) Fluxo (mL/min) %A %B Curva Início 0.500 55 45 6 2.00 0.500 40 60 6 2.50 0.500 10 90 6 3.00 0.500 10 90 6 3.01 0.500 55 45 6 3.50 0.500 55 45 6

Tabela 1 Método UPLC para análise de esteróides

METODO DE PREPARO

Uma solução-estoque dos padrões foi preparada com todos os esteróides na concentração de 10 µg/mL em 50% metanol. Uma solução-estoque dos padrões internos foi preparada nas concentrações de Aldosterona-d4 400 ng/mL, Androstenediona-d7 30 ng/mL, Cortisol-d4 1000 ng/mL, Corticosterona-d8 100ng/mL, DHEA-d5 2000 ng/mL, Progesterona-d9 30 ng/mL, Testosterona-d3 50 ng/mL, 17 ⍺-Hidroxiprogesterona-d8 25 ng/ mL e 11-Desoxicorticosterona-d5 25 ng/mL em 50% metanol. Uma solução de trabalho foi preparada diluindo 40 vezes a solução estoque dos padrões internos em 25% metanol. Soluções de trabalho foram preparadas a partir da solução estoque de 10 µg/mL nas concentrações de 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 20.0, 50.0, 100.0, 250.0 ng/mL em 25% metanol. Um volume de 20 µL de cada solução de trabalho foi adicionado em 180 µL em amostra de soro para preparo da curva de calibração

PREPARO DE AMOSTRA

As amostras foram extraídas seguindo o procedimento: 20 µL da solução de trabalho PI foi adicionado em 200 µL de soro. Adicionou-se 100 µL de metanol e 550 µL da solução água + 0.05% H3PO4 no soro, agitou-se e centrifugou-se a 10000 RPM por 5 minutos. Carregou-se 700 µL do sobrenadante direto ao cartucho de microeluição Oasis PRiME HLB, lavou-se o cartucho com 200 µL da solução H2O:MEOH (80:20). As amostras

foram eluídas com 50 µL da solução acetonitrila:metanol (85:15) e diluídas posteriomente com 50 µL de água ultrapura. Um volume de 10 µL do extrato foi injetado no sistema UPLC/MS-MS

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A Tabela 2 apresenta os tempos de retenção e os parâmetros de MS para cada esteróide e seu padrão interno monitorado, incluindo modo de ionização, transições de MRM, voltagem do cone e energia de colisão. Foram monitoradas duas transições para cada composto, sendo a primeira de quantificação e a segunda de confirmação.

Figura 1. Cromatograma contendo todos os esteróides utilizando a coluna BEH C18. A concentração desse ponto é de 0.5 ng/mL

CROMATOGRAFIA

A Figura 1 mostra o cromatograma com todos os esteróides monitorados. Todos os compostos foram eluídos antes dos três minutos e a utilização da coluna BEH C18 proporcionou uma eficiência na separação cromatográfica para a maioria os

compostos. Como observado na Figura 1, a separação mais importante apresentada foi entre os compostos Corticosterona e 11-Desoxicorticosterona, pois são isômeros e apresentam um perfil de fragmentação parecido, sendo necessária separação cromatográfica dos mesmos para uma correta quantificação.

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[ APPLICATION NOTE ]

RESULTADOS QUANTITATIVOS

A faixa utilizada na curva de calibração e o seu preparo foram descritos anteriormente em método de preparo. As faixas de trabalho para quantificação de cada esteróide foram de: 0.1-25 ng/mL para Aldosterona, 0.02-10 ng/mL para Androstenediona, 0.05-25 ng/ mL para Cortisol, 0.05-25 ng/mL para Corticosterona, 0.5-25 ng/mL para DHEA, 0.02-10ng/mL para Progesterona, 0.02-10 para Testosterona, 0.05-25 ng/mL para 17 ⍺-Hidroxiprogesterona e 0.02-25 ng/mL para 11-Desoxicorticosterona.

Amostras reais foram estudadas com o método de UPLC-MS/MS aqui descrito, e para as mesmas foram obtidos resultados satisfatórios em relação às análises por imunoensaio.

Todos os compostos apresentaram uma resposta linear sobre toda a faixa de calibração com valores de R2 iguais ou acima de 0.99 conforme apresentado na Tabela 3 e demonstrado nas figuras 2, 3, 4, 5, 6 ,7, 8 ,9 e 10.

Tabela 3. Resumo da curva de calibração

Figura 2 Curva de calibração do composto Aldosterona

R2

Média % de desvio

Aldosterona

0.999

5.30 Cortisol

0.999

4.49 Corticosterona

0.998

6.01 11-Desoxicorticosterona

0.992

6.36 17-alfa-Hidroxiprogesterona

0.998

5.51 Progesterona

0.998

7.44 Testosterona

0.998

5.41 Androstenediona

0.996

6.87 DHEA

0.998

4.18

Compound name: Aldosterone

Correlation coefficient: r = 0.999316, r^2 = 0.998632 Calibration curve: 0.777524 * x + -0.0274958

Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.0 5.0 10.0 15.0 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0

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ng/mL -0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 R es pons e -0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0

Figura 3. Curva de calibração do composto Androstenediona

Compound name: Cortisol

Correlation coefficient: r = 0.999690, r^2 = 0.999380 Calibration curve: 0.0325919 * x + 0.00211281 Response type: Internal Std ( Ref 17 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 ng/mL R es idual -5.0 0.0 5.0 10.0

Figura 4. Curva de calibração do composto Cortisol

Figura 5. Curva de calibração do composto Corticosterona

Compound name: Corticosterone Correlation coefficient: r = 0.999014, r^2 = 0.998028 Calibration curve: 0.421054 * x + -0.004985

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 ng/mL R es idual -15.0 -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0

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[ APPLICATION NOTE ]

Compound name: DHEA

Correlation coefficient: r = 0.998885, r^2 = 0.997771 Calibration curve: 0.121195 * x + -0.00470986

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0

Figura 6 Curva de calibração do composto DHEA

Compound name: Progesterone Correlation coefficient: r = 0.998843, r^2 = 0.997688 Calibration curve: 0.208954 * x + 0.00205386

ng/mL -0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 R es pons e -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0

Figura 7 Curva de calibração do composto Progesterona

Compound name: Testosterone

Correlation coefficient: r = 0.999164, r^2 = 0.998329 Calibration curve: 0.194288 * x + 0.00139982

ng/mL -0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 R es pons e -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0

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Figura 9. Curva de calibração do composto 17 alfa-Hidroxiprogesterona

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.0 5.0 10.0 15.0 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0

Figura 10. Curva de calibração do composto 11-Desoxicorticosterona

Compound name: 11-Deoxy

Correlation coefficient: r = 0.995932, r^2 = 0.991881 Calibration curve: 0.443223 * x + 0.00326886

Response type: Internal Std ( Ref 15 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x^2, Axis trans: None

ng/mL -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 R es pons e -0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 ng/mL R es idual -10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 min % 0 100 F6:MRM of 3 channels,ES+ 352.2 > 100 2016 0808-003 1.079e+007 11-Deoxy D5;2.43;342043.19;10768764 min % 0 100 F6:MRM of 3 channels,ES+ 347.2 > 109 2016 0808-003 1.205e+005 11-Deoxy;2.45;3679.96;113112 2.39 min % 0 100 F6:MRM of 3 channels,ES+ 347.2 > 97 2016 0808-003 1.319e+005 11-Deoxy;2.45;3939.78;122599 2.34 2.39

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Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 U.S.A. T: 1 508 478 2000 F: 1 508 872 1990 www.waters.com

[ APPLICATION NOTE ]

Waters, The Science of What’s Possible, ACQUITY, UPLC, Xevo, MassLynx, and OASIS,

are registered trademarks of Waters Corporation. BEH Technology and TargetLynx are trademarks of Waters Corporation. All other trademarks are the property of their respective owners.

CONCLUSÃO

Esta nota de aplicação apresenta um método completo para a extração e determinação por UPLC-MS/MS de Aldosterona, Androstenediona, Cortisol, Corticosterona, DHEA, Progesterona, Testosterona,

17⍺-Hidroxiprogesterona e 11-Desoxicorticosterona em amostra de soro humano.

A combinação entre preparo de amostras com o cartucho de SPE Oasis PRiME HLB microeluição e a análise por UPLC-MS/MS mostrou ser uma ferramenta importante, contribuindo para o desenvolvimento de métodos complexos e pesquisas clínicas.

Uma das vantagens para utilização desse cartucho envolve a eliminação das etapas de condicionamento do mesmo, simplificando ainda mais o procedimento de extração e economizando no tempo de preparo da amostra. O uso dos cartuchos de microeluição proporcionou a possibilidade de injeções diretas, sem a necessidade do processo de evaporação ou reconstituição.

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REFERÊNCIAS

1. Hauser B., Deschner T., Boesch C. Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of 23 endogenous steroids in small quantities of primate urine. Journal of Chromatography B. 2008; 862:100-112.

2. Danaceau J. P., Chambers E.E. Analysis of Plasma 17-Hydroxyprogesterone, Androstenedione, and Cortisol Using a Novel Solid-Phase Extraction (SPE) Sorbent. Oasis PRiME HLB, for UPLC-MS/MS Analysis in Clinical. Application Note, Waters Corporation, May 2015.References/Footnotes will automatically generate the number 8/10pt.