João Manuel Alves de Sousa

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João Manuel Alves de Sousa

Validação de uma metodologia de

cromatografia líquida acoplada a

espetrometria de massa em tandem

(LC-MS/MS) para a monitorização de

micotoxinas emergentes em plantas

Dissertação do 2º Ciclo de estudos conducente ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto

Trabalho realizado sob a orientação de: Orientadora - Doutora Sara Cunha

Coorientador – Professor Doutor José Fernandes

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É autorizada a reprodução integral desta dissertação apenas para

efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado,

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Agradecimentos

Em primeiro lugar gostaria de agradecer à Doutora Sara Cunha, na qualidade de minha orientadora. Foi sem dúvida um ano em que adquiri imensa experiência e conhecimentos, graças à sua disponibilidade e paciência para me ensinar. Agradecer também por todos os momentos de preocupação e o tempo dispensado para me ajudar em tudo o que precisava.

Agradecer também ao Professor Doutor José Fernandes, por ter sido meu coorientador. Pelos momentos de partilha de conhecimento, pela sua disponibilidade e pela sua prontidão em ajudar sempre que necessário.

Não quero deixar passar a oportunidade para agradecer aos meus parceiros de laboratório Carolina, Mónica, Barbara, Lucas e Laura. Primeiro porque seria impossível ter chegado onde cheguei sem o vosso apoio e motivação diária para continuar a trabalhar. Também por todos os momentos em que me ajudaram ao longo de todo o trabalho e por proporcionarem momentos de descontração, durante as pausas para o café.

Deixar também uma nota de apreço para todos os meus amigos, que ao longo do meu percurso académico me marcaram de alguma forma e me fizeram chegar tão longe. Em especial à Rita, à Cláudia, à Ana e ao Pedro. Sem vocês não tinha percorrido metade do caminho. Foi a vossa demonstração de afeto e a forma como sempre estiveram presentes que me levou a acreditar que tudo era possível. Não esquecendo também a Inês e a Catarina, que foram sempre a voz da razão, ora para o bem, ora para o mal.

Por fim, um agradecimento muito especial a toda a minha família. Desde os meus primos, aos meus tios e padrinhos. À Dona Laurinda em especial, que apesar de nunca perceber ao certo o que eu realmente andei a fazer durante estes anos todos, nunca deixou de apoiar o seu neto. À minha irmã, que é sem dúvida a pessoa que mais me apoiou e demonstrou carinho, na sua forma muito peculiar de ser. Aos meus pais, pelo dinheiro e tempo investidos na minha educação. Também por todo o amor e carinho, do qual nunca se descuraram. Dedico esta dissertação a toda a minha família, mas especialmente ao meu avô, porque eu sei que ele teria orgulho daquilo que eu consegui alcançar, graças ao esforço, dedicação e apoio incondicional desta maravilhosa família.

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Resumo

O consumo de chás e infusões tem vindo a ganhar uma importância crescente devido à sua riqueza em compostos benéficos para a nossa saúde, em particular de compostos fenólicos dotados de atividade antioxidante. Estes produtos, contudo, não estão isentos da possibilidade de presença de contaminantes químicos, em particular de um grupo de compostos genericamente designados por micotoxinas.

As micotoxinas são metabolitos secundários produzidos por certas espécies de fungos filamentosos, pertencentes essencialmente aos géneros Fusarium, Aspergillus, Penicillium e Alternaria. Dentro das micotoxinas existe um grupo que é habitualmente classificado como “micotoxinas emergentes”, uma vez que não são estudadas rotineiramente e não se encontram ainda abrangidas pela regulamentação existente. De entre os exemplos mais relevantes encontram-se as Eniatinas (ENs), a Beauvericina (BEA), a Esterigmatocistina (STE), entre muitas outras.

Nesta dissertação, desenvolveu-se uma metodologia analítica para a determinação de diversas micotoxinas emergentes em plantas e infusões. A extração dos compostos baseou-se na técnica de QuEChERS, otimizada de acordo com as especificidades deste tipo de amostras. Para a deteção e quantificação das diferentes micotoxinas foi utilizada a técnica de cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). A metodologia apresentou valores de recuperação próximos de 100%, com percentagens de desvio padrão relativo (%RSD) inferiores a 20,3%. Os limites de deteção e quantificação foram respetivamente 10 e 40 μg/kg para as plantas, e 2 e 2,5 μg/L para as infusões.

Nas 20 plantas estudadas, 19 encontravam-se contaminadas com pelo menos uma micotoxinas emergente (Beauvericina, Eniatinas e Esterigmatocistina). Os teores máximos detetados foram: 181,35; 81,47; 36,12; 313,61; 239,2 e 256,32 μg/kg (BEA, EN-A, EN-A1, EN-B, EN-B1 e STE, respetivamente). No caso das infusões, apenas 6 amostras encontravam-se contaminadas, com concentrações bastante inferiores. STE foi detetada em 4 amostras de infusões diferentes: camomila (6.23 μg/L), capim-limão (5.95 μg/L), boldo (7.84 μg/L) e carqueja (5.77 μg/L). BEA foi detetada numa amostra de infusão de maracujá (4.62 μg/L) e noutra de guaco (4.27 μg/L). Por fim, a EN-A1 foi detetada numa amostra de infusão de capim-limão (4.48 μg/L).

Palavras-chave: plantas, infusões, contaminantes, micotoxinas emergentes, LC-MS/MS, QuEChERS,

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Abstract

The consumption of teas and infusions has gained increasing importance due to its richness in compounds beneficial to our health, in particular phenolic compounds endowed with antioxidant activity. These products, however, are not exempt from the possibility of the presence of chemical contaminants such as mycotoxins.

Mycotoxins are secondary metabolites produced by certain species of filamentous fungi, belonging mainly to the genera Fusarium, Aspergillus, Penicillium and Alternaria. Within mycotoxins there is a group that is commonly classified as “emerging mycotoxins”, since they are not routinely studied and are not yet covered by existing regulations. The most relevant examples are enniatins (ENs), beauvericin (BEA), sterigmatocystin (STE).

In this work an analytical methodology was developed and validated for the determination of several emerging mycotoxins in plants and infusions. The extraction of the compounds was based on the QuEChERS technique, optimized according to the specificities of this type of samples. The detection and quantification of the different mycotoxins was performed by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/ MS). The method showed recoveries for all target substances near 100% with average Relative Standard Deviation (RSD) lower than 20.3%. LOQ and LOD were respectively 10 and 40 μg/kg, for the plants, and 2 and 2.5 μg/L for the infusions.

All the different 19 plants studied were contaminated with at least one of the emergent mycotoxins (Beauvericin, Enniatins and Sterigmatocystin). The maximum levels detected were: 181.35; 81.47; 36.12; 313.61; 239.2 and 256.32 μg/kg (BEA, EN-A, EN-A1, EN-B, EN-B1 and STE, respectively). In the case of infusions only 6 types of contaminated infusions were detected, with lower concentrations. STE was detected in 4 different types of infusions: Chamomile (6.23 μg/L), Lemongrass (5.95 μg/L), Bilberry (7.84 μg/L) and Carqueja (5.77 μg/L). BEA was detected in Passion Fruit infusion (4.62 μg/L) and Guaco (4.27 μg/L). At least EN-A1 was detected in a sample of Lemongrass infusion (4.48 μg/L).

Key words: plants, infusions, contaminants, emerging mycotoxins, LC-MS/MS, QuEChERS

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Índice

Agradecimentos ... i

Resumo ... iii

Abstract ... iv

Índice ... v

Lista de Figuras ... vii

Lista de Tabelas ... viii

Lista de Abreviaturas ... x Capítulo I. Introdução ... 1 1. Micotoxinas ... 3 1.1. Micotoxinas Regulamentadas ... 4 1.2. Micotoxinas Emergentes ... 5 1.2.1. Beauvericina e Eniatinas ... 6 1.2.2. Esterigmatocistina ... 12

2. Infusões de Plantas/Extratos Botânicos ... 15

2.1. Caracterização de Infusões ... 16

2.2. Consumo de Infusões ... 16

3. Técnicas Analíticas ... 18

3.1. Processos de Amostragem ... 19

3.2. Processos Extrativos e de Clean-up ... 20

3.2.1. “QuEChERS” (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) ... 21

3.3. Métodos de Deteção/Quantificação ... 22

3.3.1. Cromatografia Gasosa ... 23

3.3.2. Cromatografia Líquida ... 24

Capítulo II. Objetivos do Estudo ... 27

Capítulo III. Parte Experimental ... 31

1. Reagentes e Solventes ... 33

2. Amostras ... 33

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3. Instrumentação ... 35

3.1. LC-MS/MS ... 35

4. Procedimentos Experimentais ... 36

4.1. Método extrativo para as plantas ... 36

4.2. Método extrativo para as infusões ... 37

4.3. Parâmetros de Validação ... 39

4.4. Estudo de Migração ... 40

Capítulo IV. Resultados e Discussão ... 41

1. Otimização ... 43

2. Plantas/Extratos Botânicos... 44

2.1. Validação do método analítico ... 44

Efeito matriz... 44

Linearidade ... 46

Limites de Deteção e Quantificação ... 47

Exatidão ... 48

Precisão ... 49

2.2. Quantificação das Micotoxinas Emergentes em Plantas ... 50

3. Infusões ... 54

3.1. Validação do método analítico ... 54

3.1.1. Efeito Matriz... 54

3.1.2. Linearidade ... 56

3.1.3. Limites de Deteção e Quantificação ... 57

3.1.4. Exatidão ... 58

3.1.5. Precisão ... 58

3.2. Quantificação de Micotoxinas Emergentes em Infusões ... 59

4. Ensaio de Migração... 62

Capítulo V. Conclusões ... 65

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Lista de Figuras

Figura 1. Estruturas moleculares da Beauvericina, Eniatina A, Eniatina A1, Eniatina B e Eniatina B1 (adaptado: Serrano et al., 2015) ... 7 Figura 2. Estruturas moleculares da Esterigmatocistina (A) e da Aflatoxina B1 (B) (adaptado de: Liu, Du, & Zhang, 2014) ... 13 Figura 3. Frequência do consumo de infusões, em valores percentuais (adaptado: Ribeiro, 2015) ... 17 Figura 4. Tipos de infusões mais consumidos e respetivos números de respostas obtidas, para cada tipo de infusão (adaptado: Ribeiro, 2015) ... 18 Figura 5. Esquema das metodologias QuEChERS, otimizadas para a extração de micotoxinas de plantas/extratos botânicos (esquerda) e infusões (direita) ... 38 Figura 6. Cromatogramas das diferentes micotoxinas, concentração de 0,5 mg/kg de cada micotoxina, em MeOH (de cima para baixo: EN-A, EN-A1, EN-B1, BEA, EN-B, STE e OTAd5) ... 43 Figura 7. Representações gráficas das diferentes curvas de calibração em matriz ou em solvente, das diferentes micotoxinas emergentes estudadas, em extratos de planta ... 45 Figura 8. Diagrama representativo do efeito matriz, em percentagem, das diferentes micotoxinas emergentes, em extratos de plantas ... 46 Figura 9. Representações gráficas das diferentes curvas de calibração em matriz ou em solvente, das diferentes micotoxinas emergentes estudadas, relativos aos extratos de infusões (concentrações expressas em μg/L) ... 55 Figura 10. Diagrama representativo do efeito matriz, em percentagem, das diferentes micotoxinas emergentes, em extratos de infusões ... 56

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Lista de Tabelas

Tabela 1. Características gerais de algumas micotoxinas emergentes (adaptado: Gruber-Dorninger, Novak, Nagl, & Berthiller, 2017; Jestoi, 2008) ... 6 Tabela 2. Quadro resumo de trabalhos relativos à monitorização da BEA em diferentes matrizes alimentares (legenda: n.d. – não definido) ... 8 Tabela 3. Quadro resumo de trabalhos relativos à monitorização de EN, em diferentes matrizes alimentares (legenda: n.d. – não definido) ... 9 Tabela 4. Quadro resumo dos diferentes trabalhos de monitorização da STE ... 14 Tabela 5. Dados referentes às diferentes amostras recolhidas ... 34 Tabela 6. Parâmetros de LC-MS/MS, otimizados para as diferentes micotoxinas emergentes monitorizadas neste trabalho e para o padrão interno (OTAd5). Os tempos de retenção estão expressos em minutos, os iões em razão massa/carga (m/z) e as energias de cone e colisão em volts (v) ... 36 Tabela 7. Coeficientes de determinação das curvas em matriz, das diferentes micotoxinas emergentes estudadas neste trabalho ... 47 Tabela 8. Limites de deteção e quantificação de cada micotoxina emergente estudada, relativo ao processo extrativo em plantas, com as concentrações expressas em µg/kg . 48 Tabela 9. Resultados do ensaio de recuperação para as diferentes micotoxinas, em concentrações de 40, 160 e 320 μg/kg, no que diz respeito à extração em plantas ... 49 Tabela 10. Valores de %RSD, para as diferentes micotoxinas emergentes estudadas, em extratos de plantas, nas concentrações de 40, 160 e 320 µg/kg ... 50 Tabela 11. Resultados da quantificação das micotoxinas emergentes nas diferentes espécies de plantas recolhidas (legenda: “-” – valor inferior ao LOD; “<LOQ” – amostra positiva com concentração inferior ao limite de quantificação) ... 51 Tabela 12. Coeficientes de determinação e limites de deteção e quantificação de cada micotoxina emergente estudada, relativo ao processo extrativo em infusões ... 57 Tabela 13. Resultados do ensaio de recuperação para as diferentes micotoxinas, em concentrações de 10, 20 e 50 μg/kg, no que diz respeito às infusões ... 58 Tabela 14. Valores de %RSD, dentro do mesmo dia ou em dias diferentes, para as diferentes micotoxinas emergentes estudadas, em extratos de infusões, nas concentrações de 10, 20 e 50 µg/L ... 59 Tabela 15. Resultados da quantificação das micotoxinas emergentes, a partir da curva em matriz, nas diferentes infusões, feitas a partir das espécies de plantas alvo deste estudo; concentrações expressas em µg/L (legenda: “-” – “inferior ao LOD”) ... 60

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Tabela 16. Resultados do ensaio de migração, das diferentes micotoxinas estudadas. As concentrações estão expressas em μg/kg (no caso das fortificações) e μg/L (no caso das infusões) ... 63

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Lista de Abreviaturas

%RSD Relative Standard Deviation

A PE/A PI Razão entre a Área do Padrão Externo/Área do Padrão Interno AngM Coeficiente angular da curva em Matriz

AngS Coeficiente angular da curva em Solvente API Atmospheric Ionization Techniques

BEA Beauvericina

d-SPE Dispersive Solid Phase Extraction

EFSA European Food Safety Authority

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EN-A Eniatina A

EN-A1 Eniatina A1

EN-B Eniatina B

EN-B1 Eniatina B1

ENs Eniatinas

ESI Electrospray Ionization

FAO Food and Agriculture Additives

GC Cromatografia Gasosa

IARC International Agency For Research On Cancer

JECFA Joint Expert Committee on Food Additives

LC Cromatografia Líquida

LC-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada a espetrometria de massa tandem

LOD Limite de Deteção

LOQ Limite de Quantificação

m/z Razão Massa/Carga

MeCN Acetonitrilo

MeOH Metanol

MgSO4 Sulfato de Magnésio

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS Espetrometria de Massa

NaCl Cloreto de Sódio

OTAd5 Ocratoxina A deuterada

PI Padrão Interno

QuEChERS Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe

RASFF Rapid Alert System for Food and Feed

STE Esterigmatocistina

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Capítulo I.

Introdução

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1. Micotoxinas

As micotoxinas são compostos resultantes do metabolismo secundário de algumas espécies fúngicas e são potencialmente perigosos para a saúde humana e animal (Scudamore, 2008). No caso das micotoxinas mais comuns, já foram identificados uma série de efeitos tóxicos aos mais diversos níveis, sendo algumas delas classificadas como carcinogénicas, teratogénicas e mutagénicas. Foi demonstrado que algumas são citotóxicas, nefrotóxicas, e que podem ainda atacar o sistema imunitário, o aparelho reprodutor ou o sistema nervoso central (Zain, 2011). Geralmente apresentam uma elevada estabilidade a elevadas temperaturas e por norma não são eliminadas após o processamento de alimentos (Pereira, Fernandes, & Cunha, 2012).

Desde a descoberta das Aflatoxinas, em 1960, as micotoxinas têm sido consideradas um perigo para a saúde humana e animal (Hans P Egmond, Schothorst, & Jonker, 2007). Hoje em dia, encontramos legislações que estipulam o limite máximo para a presença de alguns destes compostos em certos alimentos. A sua presença no meio ambiente é bastante ubíqua, ocorrendo nas mais diversas matrizes alimentares, de elevada importância económica, como cereais, café, especiarias, vinho, plantas medicinais, frutos secos, entre muitos géneros alimentares (Scudamore, 2008). Este tipo de contaminação pode ocorrer nas diferentes etapas do processamento alimentar, desde a produção agrícola, até ao processo de distribuição. As práticas inadequadas de produção, colheita, secagem, manuseamento, armazenamento, embalamento, ou até mesmo nas condições de transporte, podem levar a uma propagação de fungos produtores de micotoxinas. Podem ainda ser encontradas em produtos de origem animal, uma vez que a metabolização destes compostos pode levar a uma acumulação em diferentes órgãos ou tecidos, acabando por contaminar a carne, leite, ovos, ou outros produtos (Abramson, Mills, Marquardt, & Frohlich, 1997; Marín, Ramos, Cano-Sancho, & Sanchis, 2013).

A toxicidade depende das propriedades físico-químicas de cada micotoxina, visto que podem ocorrer metabolizações no organismo, levando a alterações desta, por vezes com perda de toxicidade ou formando metabolitos ainda mais tóxicos. A suscetibilidade do homem e dos animais em relação a estas toxinas depende de vários fatores, entre eles a espécie, a idade, o estado nutricional, o tempo de exposição à micotoxina, entre outros (Cigić & Prosen, 2009). A avaliação dos efeitos destes compostos tóxicos torna-se uma tarefa mais complicada quando se dá a exposição a várias micotoxinas ao mesmo tempo, o que pode levar a efeitos tóxicos aditivos, sinérgicos ou antagónicos (Ficheux, Sibiril, & Parent-Massin, 2012).

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As micotoxinas são produzidas por diferentes espécies fúngicas, sendo os principais produtores os fungos filamentosos pertencentes aos géneros Aspergillus, Penicillum, Fusarium, e Alternaria (Scudamore, 2008). Estes géneros de fungos são responsáveis pela produção de centenas de micotoxinas diferentes, apresentando diferentes graus de toxicidade e prevalência. As mais importantes, devido ao perigo que apresentam para a saúde humana e à frequente presença nos alimentos são as Aflatoxinas, as Fumonisinas, os Tricotecenos, as Ocratoxinas, a Patulina, a Zearalenona e seus respetivos metabolitos. No entanto existe uma longa lista de micotoxinas menos estudadas, entre elas a Beauvericina (BEA), as Eniatinas (ENs), a Moniliformina, a Fusaproliferina, a Esterigmatocistina (STE), entre outras (Cigić & Prosen, 2009).

A presença de micotoxinas em alimentos, sobretudo em cereais e seus derivados, é uma das maiores preocupações dos responsáveis pela segurança alimentar. Na União Europeia (UE), a presença de contaminantes que coloquem em risco a saúde pública é controlada de forma abrangente e sistematizada. Os resultados desse controlo podem ser consultados semanalmente através do “Sistema de Alerta Rápido para Alimentos e Alimentos para Animais” – RASFF (“Rapid Alert System for Food and Feed”). Ao longo da última década, a presença de micotoxinas representa a categoria com maior número de notificações, sendo classificadas como “perigo alimentar”. A Ocratoxina A e as Aflatoxinas representam a quase totalidade das notificações (RASFF, 2016).

A presença deste tipo de contaminantes tem vindo a desencadear uma preocupação crescente, levando à criação de diferentes legislações, relativas ao estabelecimento de níveis máximos permitidos em certos grupos de géneros alimentares ou rações (Pereira et al., 2012).

Na continuação deste capítulo abordar-se-ão diferentes micotoxinas, divididas em dois grupos: i) micotoxinas que se encontram regulamentadas; ii) micotoxinas que são consideradas emergentes, um grupo de micotoxinas pouco estudadas e que para as quais ainda não existe legislação; destacam-se entre elas a Beauvericina (BEA), as Eniatinas (ENs) a Esterigmatocistina (STE).

1.1. Micotoxinas Regulamentadas

A ocorrência de micotoxinas pode dar-se nas mais diversas matrizes, com especial incidência em cereais e derivados. Uma vez que os cereais são uma importante fonte de alimento, tanto para o homem como para os animais usados na alimentação humana, é

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necessário um controlo rigoroso, com o estabelecimento de legislações restritas (Pereira et al., 2012).

A European Food Safety Authority (EFSA) é responsável pela avaliação de riscos associados a contaminações por micotoxinas, a nível europeu. A nível mundial estes contaminantes são controlados pela Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) e pela Food and Agriculture Organization (FAO). Estas entidades fornecem aconselhamento científico e avaliam os potenciais riscos de contaminações, aconselhando o estabelecimento de limites máximos, para os diferentes alimentos.

Na UE estão estabelecidos limites máximos para as Aflatoxinas, a Ocratoxina A, a Patulina, a Zearalenona, o Deoxinivalenol e as Fumonisinas, em diversos géneros alimentares, maioritariamente cereais e seus derivados, através do Regulamento (CE) n.º 1881/2006, de 19 de dezembro de 2006 (Comissão Europeia, 2006a). Na Farmacopeia Europeia e Britânica estão implementados limites restritos para as ervas medicinais, nomeadamente de 2 μg/kg de Aflatoxina B1 e 4 μg/kg para o somatório das Aflatoxinas. Já a Alemanha estabeleceu estes limites para qualquer planta que seja ingrediente de um medicamento (Lei Zhang, Dou, Zhang, Logrieco, & Yang, 2018).

1.2. Micotoxinas Emergentes

O termo “micotoxinas emergentes” não tem uma definição científica precisa, sendo, todavia, frequentemente utilizado na atualidade. Um dos primeiros trabalhos científicos a utilizar esta expressão foi publicado em 2008, referindo-se a metabolitos secundários provenientes de algumas espécies do género Fusarium (Jestoi, 2008). Em 2013, um estudo define micotoxinas emergentes como “micotoxinas que não são determinadas de forma rotineira, nem são reguladas legislativamente; no entanto, evidências da sua incidência tem aumentado rapidamente” (Vaclavikova et al., 2013).

Este conjunto de micotoxinas ainda é pouco estudado, pelo que é natural que não se conheçam muitos dos seus efeitos tóxicos. Tendo em conta esta lacuna, é complicado compreender se estes contaminantes representam de facto um risco para a saúde pública (Pereira, Fernandes, & Cunha, 2014). Existem imensas toxinas que fazem parte deste grupo. Nesta dissertação deu-se especial destaque à Beauvericina (BEA), às Eniatinas (ENs) e à Esterigmatocistina (STE). Na Tabela 1 é apresentado um resumo das características gerais destas micotoxinas.

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Tabela 1. Características gerais de algumas micotoxinas emergentes (adaptado: Gruber-Dorninger, Novak, Nagl, & Berthiller, 2017; Jestoi, 2008)

1.2.1. Beauvericina e Eniatinas

Características Gerais

A Beauvericina (BEA) e as Eniatinas (ENs) têm estruturas moleculares muito semelhantes, esquematizadas na Figura 1. A BEA foi isolada pela primeira vez a partir de uma cultura de Beauverina bassiana (Hamill, Higgens, Boaz, & Gorman, 1969) e as ENs foram descobertas a partir de culturas de Fusarium oxysporum, sendo as mais comuns na natureza as Eniatinas A, A1, B e B1 (Jestoi, 2008). Estas micotoxinas são produzidas por diversas espécies do género Fusarium, e algumas delas podem produzir tanto BEA como ENs, como o caso da Fusarium oxysporum (Gruber-Dorninger, Novak, Nagl, & Berthiller, 2017; Santini, Meca, Uhlig, & Ritieni, 2012).

Uma vez que a BEA e as ENs apresentam estruturas moleculares muito semelhantes, a maioria dos estudos são elaborados com a finalidade de monitorizar estas micotoxinas em simultâneo (Castoria, Lima, Ferracane, & Ritieni, 2005; Logrieco, Rizzo, Ferracane, & Ritieni, 2002; Sifou et al., 2011).

Micotoxina Fórmula Molecular Massa Molecular (g.mol-1₎ Fungos Produtores Géneros Alimentares Beauvericina C45H57N3O9 783 F. proliferatum F. subglutinans F. verticilloides F. oxysporum Cereais e derivados; Plantas Eniatina A C36H63N3O9 681 F. oxysporum F. poae F. tricinctum F. avenaceum Cereais e derivados; Plantas Eniatina A1 C35H61N3O9 667 Eniatina B C33H57N3O9 639 Eniatina B1 C34H59N3O9 654 Esterigmatocistina C18H12O6 324 A. flavus A. parasiticus A. nidulans A. versicolor Queijos; Cereais; Especiarias; Plantas

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Ocorrência

Estas micotoxinas podem contaminar diversos tipos de alimentos, sendo os cereais e seus derivados a principal fonte de exposição (EFSA, 2014). Relativamente à BEA, pode ocorrer de forma geral por toda a Europa, apresentando níveis mais elevados na Europa do Sul. No que concerne às ENs, a informação ainda é limitada, no entanto nota-se uma prevalência da Eniatina B (EN-B) no Norte da Europa, enquanto que na zona mediterrânica é prevalente a Eniatina A1 (EN-A1). A diferença das concentrações e prevalências das diferentes espécies deve-se maioritariamente às diferentes infeções fúngicas nas diferentes áreas (Santini et al., 2012).

Até à data, foram identificadas amostras de plantas medicinais chinesas contaminadas com BEA e com as Eniatinas A, A1, B e B1 (EN-A, EN-A1, EN-B e EN-B1, respetivamente) contendo concentrações médias de 33,0 (BEA); 27,9 A); 28,4 (EN-A1); 32,0 (EN-B) e 33,0 μg/kg (EN-B1) (Hu & Rychlik, 2014).

No que diz respeito aos cereais, um estudo realizado por Streit et al., em 2013, encontrou elevadas concentrações e ocorrências superiores a 87% destas micotoxinas, provenientes de países europeus, nomeadamente Hungria, Áustria e Dinamarca. As concentrações máximas detetadas foram de 2326 μg/kg de BEA, 1745 μg/kg de EN-A, 2216 μg/kg de EN-A1, 780 μg/kg de EN-B e 2690 μg/kg de EN-B1 (Streit et al., 2013). Foram também detetadas elevadas concentrações em amostras de arroz proveniente de Marrocos, em que a concentração máxima detetada foi de 26300 μg/kg de BEA (Sifou et al., 2011). É de destacar ainda um estudo realizado em produtos derivados de cereais,

Figura 1. Estruturas moleculares da Beauvericina, Eniatina A, Eniatina A1, Eniatina

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como a massa, cereais de pequeno almoço, farinhas, arroz, pão e alimentos para crianças. Todas as amostras recolhidas eram de origem portuguesa e foram detetados os quatro isómeros das ENs (EN-A, EN-A1, EN-B, EN-B1), assim como a BEA. Neste estudo a mais prevalente foi a EN-A1, tendo sido encontrada em 32 das 61 amostras analisadas. As concentrações médias obtidas neste estudo foram de 3,2; 13; 56; 49 e 33 μg/kg (BEA, EN-A, EN-A1, EN-B e EN-B1 respetivamente) (Blesa, Marín, Lino, & Mañes, 2012).

Um estudo realizado em chás e infusões apenas encontrou 2 amostras contaminadas de chá verde, com concentrações abaixo do limite de quantificação (0,2 μg/L) (Pallarés, Font, Mañes, & Ferrer, 2017).

Na Tabela 2 e 3 encontram-se alguns dos trabalhos realizados relativamente à monitorização de BEA e ENs, respetivamente. Na generalidade as concentrações estão expressas em μg/kg.

Tabela 2. Quadro resumo de trabalhos relativos à monitorização da BEA em diferentes matrizes alimentares (legenda: n.d. – não definido)

Matriz Origem Amostras

Positivas/Total de Amostras Teores (μg/kg) Referência Cereais e Derivados

Croácia 19/209 13 – 1864 (Jurjevic, Solfrizzo, Cvjetkovic, De Girolamo, & Visconti, 2002)

Finlândia 13/13 640 – 3500 (Logrieco et al., 2002) Finlândia 36/38 <10 – 19 (Jestoi, Rokka, et al., 2004) Itália; Finlândia 17/30 <10 (Jestoi, Somma, et al.,

2004)

Noruega 73/228 <3 – 120 (Uhlig, Torp, & Heier, 2006) Espanha 21/64 510 - 11780 (Meca, Zinedine, Blesa,

Font, & Mañes, 2010) Marrocos 4/68 3700 - 10600 (Mahnine et al., 2011) Marrocos 53/70 5800 - 26300 (Sifou et al., 2011)

Portugal 1/61 3,2 (Blesa et al., 2012) Espanha 20/114 0,1 – 20,96 (Serrano, Font, Mañes, &

Ferrer, 2013)

Suécia 64/125 <1,5 - 12 (Lindblad et al., 2013) Suécia 92/93 <1,7 - 215 (Fredlund et al., 2013) Hungria;

Áustria; Dinamarca

81/83 0,1 - 2326 (Streit et al., 2013)

Itália 9/93 6,7 - 41 (Juan, Ritieni, & Mañes, 2013)

Brazil 104/110 12 - 160 (Lourdes Mendes de Souza et al., 2013)

China 1530 3 - 37 (Zhao et al., 2015) Dinamarca 12/110 <15 - 130 (Svingen et al., 2016)

(23)

Japão 16/207 3,4 – 26,1 (Yoshinari, Suzuki, Sugita-Konishi, Ohnishi, & Terajima, 2016) Bélgica 17/57 n.d. - 209 (Decleer, Rajkovic, Sas,

Madder, & De Saeger, 2016)

Marrocos 3/98 32,6 – 273,6 (Zinedine, Fernández-Franzón, Mañes, & Manyes, 2017)

Roménia 3/133 0,07 – 9,1 (Stanciu, Juan, Miere, Loghin, & Mañes, 2017) Itália 6/58 53,66 – 73,67 (Tolosa et al., 2017) Nigéria 29/84 0,1 – 6,8 (Oyedele et al., 2017)

Plantas Medicinais

China 12/60 <1,2 – 124,8 (Hu & Rychlik, 2014)

Tabela 3. Quadro resumo de trabalhos relativos à monitorização de EN, em diferentes matrizes alimentares (legenda: n.d. – não definido)

Micotoxina Matriz Origem Amostras

Positivas/Total de Amostras Teores (μg/kg) Referência EN-A Cereais e Derivados

Finlândia 10/13 <1,3 - 6900 (Logrieco et al., 2002)

Finlândia 28/38 1 - 950 (Jestoi, Rokka, et al., 2004) Itália; Finlândia 9/30 <0,6 - 10 (Jestoi, Somma, et

al., 2004) Noruega 58/228 <3 - 59 (Uhlig et al., 2006) Espanha 0/64 n.d. (Meca et al., 2010) Marrocos 22/68a _{20 – 29,7} _{(Mahnine et al.,}

2011)

Marrocos 35/70a _{8,8 – 119,5} _{(Sifou et al., 2011)}

Portugal 10/61 2,6 - 71 (Blesa et al., 2012) Espanha 88/114 0,5 – 42,04 (Serrano et al.,

2013)

Suécia 123/125a _{60 – 4281}a _{(Lindblad et al.,}

2013)

Suécia 93/93a _{41 - 862}a _{(Fredlund et al.,}

2013) Hungria; Áustria;

Dinamarca

72/83 0,8 - 1745 (Streit et al., 2013) Itália 12/93 7,2 – 29,8 (Juan et al., 2013) Brazil 1/110 0,1 (Lourdes Mendes

de Souza et al., 2013)

Dinamarca 21/110 <10 - 100 (Svingen et al., 2016)

Finlândia 200/200a _{15 – 14850}a _{(Hietaniemi et al.,}

2016)

Japão 2/207 0,1 – 4,0 (Yoshinari et al., 2016)

Bélgica 0/57 n.d. (Decleer et al., 2016)

Marrocos 41/98 2,6 – 651,7 (Zinedine et al., 2017)

Roménia 11/133 4,5 - 140 (Stanciu et al., 2017)

Itália 19/58 4,25 – 5,09 (Tolosa et al., 2017)

China n.d./60 <0,8 – 354,6 (Hu & Rychlik, 2014)

(24)

Infusões Espanha 0/44 n.d. (Pallarés et al., 2017)

EN-A1 Cereais e

Derivados

Finlândia 38/38 <4 - 2000 (Jestoi, Rokka, et al., 2004) Itália; Finlândia 15/30 <4-20 (Jestoi, Somma, et

al., 2004) Noruega 153/228 <4 - 500 (Uhlig et al., 2006) Espanha 47/64b _{37,47 – 814,42} _{(Meca et al., 2010)}

Marrocos 22/68a _{52 - 688} _{(Mahnine et al.,}

2011)

Portugal 32/61 3,4 - 789 (Blesa et al., 2012) Espanha 75/114 0.25 – 21,89 (Serrano et al.,

2013)

Dinamarca

79/83 5,5 – 2216 (Streit et al., 2013) Itália 16/93 5,3 – 64,3 (Juan et al., 2013) Brazil 15/110 0,3 - 17 (Lourdes Mendes

Dinamarca 82/110 <10 - 140 (Svingen et al., 2016)

2016)

Bélgica 4/57 n.d. -14,6 (Decleer et al., 2016)

China 4/60 <1,1 – 252,5 (Hu & Rychlik, 2014)

Infusões Espanha 0/44 n.d. (Pallarés et al.,

2017)

EN-B Cereais e

Derivados

Finlândia 38/38 <3,8 - 9760 (Jestoi, Rokka, et al., 2004) Itália; Finlândia 29/30 <3,8 - 170 (Jestoi, Somma, et

Marrocos 22/68a _{1,05 – 81,1} _{(Mahnine et al.,}

2011)

2013)

Dinamarca

76/83 11 - 780 (Streit et al., 2013) Itália 20/93 5,5 - 102 (Juan et al., 2013)

(25)

Brazil 52/110 3,21 – 5,0 (Lourdes Mendes de Souza et al., 2013)

Dinamarca 110/110 11 - 3900 (Svingen et al., 2016)

2016)

Japão 137/207 33,4 - 633 (Yoshinari et al., 2016)

Bélgica 20/57 n.d. - 195,5 (Decleer et al., 2016)

Marrocos 94/98 3,0 - 592 (Zinedine et al., 2017)

China 7/60 <1,0 – 290,5 (Hu & Rychlik, 2014)

Infusões Espanha 2/44 <0,2c _{(Pallarés et al.,}

2017)

EN-B1 Cereais e

Derivados

Finlândia 8/13 3,6 - 1900 (Logrieco et al., 2002)

Finlândia 38/38 <10,8 - 5720 (Jestoi, Rokka, et al., 2004) Itália; Finlândia 29/30 <10,8 - 71 (Jestoi, Somma, et

Marrocos 22/68a _{1,05 – 81,1} _{(Mahnine et al.,}

2011)

2013)

Dinamarca

76/83 14 - 2690 (Streit et al., 2013) Itália 5/93 5,47 – 33,1 (Juan et al., 2013) Brazil 33/110 0,1 - 67 (Lourdes Mendes

Dinamarca 109/110 83 - 860 (Svingen et al., 2016)

2016)

Bélgica 15/57 n.d. - 42,5 (Decleer et al., 2016)

Itália 0/58 n.d. (Tolosa et al., 2017)

China 4/60 <1,1 – 40,2 (Hu & Rychlik, 2014)

Infusões Espanha 0/44 n.d. (Pallarés et al.,

2017) a – Somatório das 4 Eniatinas (EN-A; EN-A1; EN-B e EN-B1)

b – Somatório de 3 Eniatinas: EN-A; EN-A1 e EN-B

(26)

Toxicidade

Estas micotoxinas apresentam propriedades ionofóricas, uma vez que conseguem transportar iões através da membrana, perturbando assim o bom funcionamento celular, desregulando as concentrações de iões de potássio e cálcio (Kamyar, Rawnduzi, Studenik, Kouri, & Lemmens-Gruber, 2004; Kouri, Duchen, & Lemmens-Gruber, 2005; Kouri, Lemmens, & Lemmens-Gruber, 2003). Estudos in vitro demonstram que pequenas concentrações destas micotoxinas provocam citotoxicidade em diferentes grupos celulares (Fornelli, Minervini, & Logrieco, 2004; Ivanova, Skjerve, Eriksen, & Uhlig, 2006). A morte celular, induzida por estas toxinas, pode ser mediada por apoptose (Dornetshuber et al., 2009), por via mitocondrial (Tonshin, Teplova, Andersson, & Salkinoja-Salonen, 2010) ou por necrose (Gammelsrud et al., 2012; Wätjen, Debbab, Hohlfeld, Chovolou, & Proksch, 2014). Estudos em ratinhos demonstram igualmente a interação das ENs e da BEA com proteínas (Tomoda et al., 1992) e ainda a inibição da Citocromo P450 aquando de intoxicação por BEA (Mei, Zhang, & Dai, 2009).

1.2.2. Esterigmatocistina

Características Gerais

A Esterigmatocistina (STE) foi isolada pela primeira vez a partir de uma cultura de Aspergillus versicolor, no ano de 1954 (Díaz Nieto, Granero, Zon, & Fernández, 2018). É uma percursora da Aflatoxina B1. Ambas as micotoxinas apresentam estruturas moleculares muito semelhantes, como se pode verificar na Figura 2 (Aleksandrs Veršilovskis, Bartkevičs, & Miķelsone, 2008). Podem ser produzidas por diferentes géneros de fungos, nomeadamente Aspergillus, Bipolaris, Botryotrichum, Chaetomium, Emericella e Humicola. Destacam-se as espécies A. flavus, A. versicolor, A. parasiticus e A. nidulans, uma vez que são as principais espécies produtoras de STE, pertencentes ao género Aspergillus (Brera, De Santis, Debegnach, & Miraglia, 2008; EFSA, 2013).

(27)

Figura 2. Estruturas moleculares da Esterigmatocistina (A) e da Aflatoxina B1 (B) (adaptado de:

Liu, Du, & Zhang, 2014)

Ocorrência

A ocorrência da STE aparenta ser escassa em alimentos, verifica-se um número muito reduzido de estudos realizados na última década, no que toca à sua monitorização (Díaz Nieto et al., 2018). Há estudos que apontam para a contaminação de queijos em diferentes estados de maturação, apresentando concentrações que variavam desde 5 a 600 μg/kg (Abd Alla, Metwally, Mehriz, & Abu Sree, 1996). Foi ainda descrito a presença desta micotoxina em especiarias nomeadamente funcho, pimenta preta e pimenta rosa, contendo 142, 105 e 145 μg/kg, respetivamente, na Índia (Saxena & Mehrotra, 1989). No Egito foram detetadas amostras positivas em pimenta vermelha (10 a 23 μg/kg), em sementes de alcaravia (14 a 18 μg/kg), em cominhos e em manjerona (Kady, El-Maraghy, & Mostafa, 1995). No Sri Lanka e na Bélgica foram encontradas amostras de pimenta com concentrações compreendidas entre 11 a 32 μg/kg (Yogendrarajah, Deschuyffeleer, et al., 2014). Destaca-se ainda um estudo realizado em cervejas, provenientes da Letónia. Foram encontradas 2 amostras contaminadas, num total de 26, com concentrações que variavam entre 4 a 7,8 μg/L (A. Veršilovskis, De Saeger, & Mikelsone, 2008).

No que diz respeito à contaminação de cereais, já foi encontrada em amostras de cevada, aveia e trigo (com concentrações médias de 1 μg/kg, 2,1 μg/kg e 0,1 μg/kg, respetivamente) na Noruega (Uhlig et al., 2013). Também foram descritos diversos cereais contaminados provenientes da Letónia, com concentrações compreendidas entre 0,7 a 83 μg/kg (Aleksandrs Veršilovskis et al., 2008) e na China, com teores médios de 68,9; 32,2 e 13,9 μg/kg, para amostras de trigo, milho e arroz, respetivamente (Tian, Lou, & Du, 1995). Foram ainda detetadas amostras positivas em outros países, entre eles o Japão, a Nigéria,

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Burkina Faso, Moçambique, Itália, Síria, demonstrando uma alargada prevalência em cereais e seus derivados, a nível mundial (Díaz Nieto et al., 2018).

Num estudo realizado a nível europeu, foram encontradas amostras positivas em variados géneros alimentares derivados de cereais, nomeadamente em cereais crus (trigo, centeio, milho, arroz, cevada, aveia), cereais tratados (trigo moído, cevada moída, milho moído, arroz e massa) e cereais que se destinavam à alimentação (cereais de pequeno almoço e alimentos para crianças) (Mo, Pietri, MacDonald, Anagnostopoulos, & Spanjere, 2015).

Por fim, destaca-se ainda um estudo em que foi detetada a presença de STE em produtos medicinais, constituídos por plantas ou extratos botânicos, provenientes da China. Estes produtos eram comercializados em farmácias e hospitais. Neste estudo, esta toxina foi a mais prevalente, tendo sido detetada em 64 das 244 amostras testadas (Zheng, Xu, Wang, Zhan, & Chen, 2014).

Na Tabela 4 encontra resumido os diversos estudos de monitorização da STE, em diferentes tipos de matriz. Na generalidade, as concentrações estão expressas em μg/kg.

Tabela 4. Quadro resumo dos diferentes trabalhos de monitorização da STE

Amostra Origem Amostras

Positivas/Total de Amostras

Teores

(μg/kg) Referência

Queijos Holanda 7/39 5 – 600 (H. P. van Egmond, 1983)

Egipto 35/100 14,9 – 32,8 (Abd Alla et al., 1996)

Especiarias Índia 3/108 105 - 142 (Saxena & Mehrotra, 1989)

Egipto 10/120 10 - 23 (El-Kady et al., 1995)

Sri Lanka; Bélgica 33/86 11 - 32 (Yogendrarajah, Jacxsens, De Saeger, & De Meulenaer, 2014) Sri Lanka 36/82 10,3 - 49 (Yogendrarajah,

Deschuyffeleer, et al., 2014)

Cereais e derivados

Letónia 55/215 0,7 - 83 (Aleksandrs Veršilovskis et al., 2008)

Burkina Faso; Moçambique

12/122 2,2 – 49,2 (Warth et al., 2012) Noruega 57%a _{1,0 – 20,1} _{(Uhlig et al., 2013)}

Camarões 33/125 0,5 – 9,1 (Abia et al., 2013) Itália; Síria 4/83 1,2 – 1,6 (Alkadri et al., 2014) Grécia; Itália; Letónia; Reino Unido; Alemanha, Chipre; Lituana; Polónia; Bélgica 126/1259 0,5 - 33 (Mo et al., 2015)

Coreia do Sul 26/40 0,3 - 10 (Ok et al., 2016) Itália 121/132 0,05 –

15,85

(Bertuzzi et al., 2017) Costa do Marfim 57/238 2,6 - 40 (Manizan et al., 2018) Nigéria 27/78 0,1 - 242 (Ogara et al., 2017)

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Japão 847/1233 0,55 – 9,1 (Nomura, Aoyama, & Ishibashi, 2018)

Cerveja Letónia 2/26 4 – 7,8b _{(A. Veršilovskis et al., 2008)}

China 63/242 0,1 – 28,4 (Zheng et al., 2014)

a – Percentagem máxima de contaminação b – Concentração expressa em μg/L

Toxicidade

Diversos estudos confirmaram que a STE induz tumores em diferentes animais, nomeadamente ratos, macacos e peixes, por diferentes vias de aplicação (oral, interperitoneal, subcutânea e dérmica), podendo originar carcinomas hepatocelulares, hemangiossarcomas do fígado e adenomas pulmonares (EFSA, 2013; Pfeiffer, Fleck, & Metzler, 2014). Pertence ao grupo 2B da classificação da International Agency For Research On Cancer (IARC), ou seja, é classificada como possível carcinogénico para os humanos (Ostry, Malir, Toman, & Grosse, 2017). Também provoca tumores em pele de ratos, após 70 dias de aplicação cutânea (Purchase & Van der Watt, 1973).

Está ainda associada a diversos sintomas clínicos agudos, nomeadamente diarreias sanguinolentas e morte, em bovinos (Vesonder & Horn, 1985). Foram reportados outros efeitos tóxicos ao longo dos anos, desde genotoxicidade, apoptose celular, indução da quebra da dupla cadeia de DNA (Díaz Nieto et al., 2018). A sua atividade mutagénica é varias vezes superior à induzida por hidrocarbonetos aromáticos (Tang & Friedman, 1977).

2. Infusões de Plantas/Extratos Botânicos

Uma infusão é o processo de extração de compostos químicos de plantas ou extratos botânicos pela imersão em água quente, usando o calor como acelerador do processo. A solução líquida resultante também é designada por infusão (Jäger et al., 2011). O termo “chá” refere-se à infusão de folhas da planta Camellia sinensis, mas é vulgarmente utilizada para se referir qualquer infusão de plantas (Guimarães, Barros, Carvalho, & Ferreira, 2011).

O consumo de chás e infusões constituí uma das principais fontes de compostos fenólicos na nossa dieta (Shahidi, 2000; Shikanga, Combrinck, & Regnier, 2010). Este tipo de bebida não alcoólica é das mais populares a nível mundial estando associada a diversos

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efeitos saudáveis (Abd El-Aty et al., 2014; Guimarães et al., 2011). Podem ser retirados das plantas, através do processo de infusão, vários compostos benéficos para além dos compostos fenólicos, nomeadamente fibras, ácidos orgânicos, alcalóides, vitaminas, minerais ou metais. O uso comum e recorrente deste tipo de bebidas, a partir das mais variadas plantas e extratos botânicos, deve-se certamente à forte convicção dos consumidores que estes produtos servem para aliviar e tratar enfermidades (Pohl et al., 2018).

2.1. Caracterização de Infusões

As infusões, tal como já foi exposto, são o resultado do processo de extração de compostos químicos, de qualquer planta. Podem ser feitas infusões a partir de várias partes de plantas, como por exemplo raízes, flores, folhas, ramificações, sementes ou mesmo frutos (Guimarães et al., 2011). Infusões de diferentes plantas misturadas têm geralmente um maior poder antioxidante (Obón, Rivera, Alcaraz, & Attieh, 2014).

Na totalidade existem três formas de infusão, com nomenclaturas diferentes: “chás”, “infusões” e “decocções”. As diferenças residem na planta utilizada, no método do processo extrativo ou no tempo desse processo. Para se fazer “chá” apenas pode ser utilizada a Camellia sinensis, submergida em água previamente aquecida até aproximadamente 100 ºC, até ao máximo de 5 minutos. No caso das “infusões”, pode ser utilizada qualquer planta, parte desta ou até mesmo misturas de plantas. O processo extrativo é idêntico, utilizando água aproximadamente a 100 ºC durante 5 a 10 minutos. Já no que concerne à “decocção” também pode ser utilizada igualmente qualquer planta, mas previamente mergulhada em água e só posteriormente fervida (Guimarães et al., 2011; S. M. Lee et al., 2008).

2.2. Consumo de Infusões

O comércio de chás e infusões constitui uma importante fonte de rendimento para os principais países produtores, incluindo a China, a Índia, o Quénia, o Sri Lanka, a Turquia, o Vietname e o Irão (Abd El-Aty et al., 2014).

Grande parte das espécies de plantas mais utilizadas na Europa para preparação de infusões apresentam propriedades digestivas e anti-inflamatórias. Entre essas espécies destaca-se a Erva-ursa (Thymus serpyllum), o Milefólio (Achillea millefolium) e a Camomila

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(Chamaemelum nobile). A planta mais utilizada na Europa é o Orégão (Origanum vulgare). Num estudo, realizado em 2013, foram identificados mais de 99 géneros de plantas utilizadas para a realização de infusões (Sõukand et al., 2013). Entre eles destacaram-se o Mentha, o Ribes, o Crataegus, o Trifolium, o Primula e o Centaurium. Nesse estudo foi possível demonstrar que o consumo destas bebidas apresenta um maior valor cultural na Europa de Leste, relativamente à Península Ibérica. Em Portugal, as espécies de plantas mais utilizadas em infusões são a Cidreira (Melissa officinalis), a Tília (Tilia platyphyllos), o Funcho (Foeniculum vulgare) e a Camomila (Matricaria recutita) (Sõukand et al., 2013).

Há variados motivos que podem levar ao consumo de chás/infusões, nomeadamente questões culturais, sociais, pelo gosto do aroma ou sabor, mas acima de tudo por questões ligadas ao bem estar e aos benefícios para a saúde (J. Lee & Chambers, 2007). Na sua maioria, as pessoas bebem chá com o intuito de curar problemas de saúde, relaxar ou até para se manterem calmas. Em alguns países da europa, como o Reino Unido, beber chá é algo cultural e quotidiano (Cabrera, Artacho, & Giménez, 2006).

Numa dissertação de mestrado publicada em 2015, na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, foi avaliado o comportamento do consumo português, relativamente a chás e infusões (Ribeiro, 2015). Neste trabalho foi realizado um inquérito, no qual constavam perguntam relacionadas com a compra e consumo de infusões e chás. No que diz respeito ao consumo de infusões, cerca de 25 % dos inquiridos (n=190) respondeu que consumia infusões 1 a 3 vezes por mês. Na totalidade dos participantes do mesmo inquérito, apenas 10% bebe infusões uma vez por dia e 0,5% consome 4 ou mais vezes por dia. Na Figura 3 encontram-se as diversas respostas obtidas à pergunta “Com que frequência consome infusões?”. Na Figura 4 encontram-se as respetivas respostas à pergunta “Que tipo (s) de infusões consome?”, sendo que aquela que obteve maior número de respostas foi a cidreira (25,2%), seguida da camomila (23,3%) (Ribeiro, 2015).

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Figura 4. Tipos de infusões mais consumidos e respetivos números de respostas obtidas, para cada tipo de infusão (adaptado: Ribeiro, 2015)

Ainda no âmbito deste inquérito, cerca de 75% dos inquiridos respondeu que habitualmente consome infusões sob a forma de saquetas, seguido de 23% que preparam infusões a partir de folha solta. Relativamente ao local de compra, verifica-se que as saquetas são adquiridas maioritariamente no supermercado, enquanto que as infusões em folha solta são usualmente compradas em ervanários, mercados ou lojas de infusões (Ribeiro, 2015).

No Inquérito Alimentar Nacional e de Atividade Física referente aos anos de 2015 a 2016, cerca de 56% da população portuguesa consumia infusões e chás. Durante este período verificou-se que era a terceira bebida não alcoólica mais popular a nível nacional, a seguir à água e aos refrigerantes. Apresentava um consumo médio de 77,0 g/dia (Lopes et al., 2017).

3. Técnicas Analíticas

As micotoxinas estão geralmente presentes nos géneros alimentícios em concentrações muito reduzidas e, como atrás referido, nalguns casos a sua presença já se encontra devidamente regulada, estando estabelecidos limites máximos legais variáveis de acordo com o tipo de alimento em causa e a micotoxina em questão. Assim torna-se necessário o desenvolvimento de métodos robustos e seletivos, passíveis de permitir a sua

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deteção e quantificação com elevados níveis de precisão e exatidão (Cigić & Prosen, 2009).

A maioria das técnicas recorrentemente utilizadas para a determinação de contaminantes, e em especial micotoxinas, apresenta diversas etapas em comum. O primeiro passo corresponde à amostragem, a que se segue a homogeneização da amostra, muitas vezes antecedida de um processo de trituração, e a etapa de extração do analíto. Normalmente a extração é seguida de uma etapa de limpeza ou “clean up”, para que se possa reduzir ou eliminar interferentes, que geralmente são componentes indesejados provenientes da matriz. Segue-se a concentração do extrato obtido e por fim as etapas de separação e deteção. Atualmente as técnicas de cromatográficas são as mais utilizadas para este fim, nomeadamente a cromatografia líquida (LC) e a cromatografia gasosa (GC), acopladas a espetrometria de massa (Mass Spectrometry – MS).

Tendo em atenção o grande número de micotoxinas existentes e a necessidade de respostas analíticas céleres tem havido uma tendência crescente para o desenvolvimento de métodos para a deteção de diversas micotoxinas em simultâneo, possibilitando a determinação num único processo de várias toxinas pertencentes a diferentes famílias químicas. A cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é a técnica recorrentemente utilizada com este intuito (Cigić & Prosen, 2009; Pereira et al., 2014).

3.1. Processos de Amostragem

A amostragem é o passo crucial de qualquer método que se destine à determinação e quantificação de contaminantes em alimentos. Esta etapa torna-se difícil em matrizes alimentares devido à sua elevada complexidade. É fundamental que a amostra final, que será posteriormente analisada, seja representativa de toda a matriz primária. (Pereira et al., 2014; Scudamore, 2008).

Uma das técnicas utilizadas é a trituração e mistura de toda a amostra primária, para que a subamostra recolhida posteriormente para análise seja a mais fidedigna e representativa da matriz original. Esta etapa é crucial, uma vez que as micotoxinas podem encontrar-se em locais específicos da amostra, como por exemplo, na zona exterior das sementes (pericarpo) (Pereira et al., 2014; Vidal, Marín, Ramos, Cano-Sancho, & Sanchis, 2013).

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Em 2006, a Comissão Europeia estabeleceu um procedimento de amostragem, para poder reduzir a variabilidade dos resultados analíticos e garantir a sua credibilidade e veracidade, no que diz respeito ao controlo da presença de micotoxinas em géneros alimentares (Comissão Europeia, 2006b). O procedimento foi revisto em 2010, pelo Regulamento (UE) N.º 178/2010 da comissão (Comissão Europeia, 2010) e por fim em 2014, pelo Regulamento (UE) N.º 519/2014 da comissão (Comissão Europeia, 2014).

Os géneros alimentares abrangidos por estes regulamentos são essencialmente cereais, frutos secos e especiarias. Nas disposições gerais do Regulamento de (CE) N.º 401/2006 estão definidos os parâmetros abrangidos por esta legislação, nomeadamente a nível do pessoal, do material a amostrar, das precauções que têm de ser tomadas, da recolha das amostras elementares, do acondicionamento e da selagem e rotulagem das amostras (Comissão Europeia, 2006b).

Para os diferentes produtos abrangidos por esta legislação, o peso da amostra global, que é a junção das várias amostras elementares recolhidas a partir do lote, nunca pode ser inferior a 1 kg. De seguida, de forma geral, a amostra global é misturada e dividida em amostras iguais, que são enviadas para os laboratórios. Quando chega ao laboratório é finalmente triturada e cuidadosamente misturada a fim de garantir uma homogeneização completa (Comissão Europeia, 2006b).

3.2. Processos Extrativos e de Clean-up

Existem diversos processos extrativos e de clean-up que são utilizados habitualmente para obter um extrato com o máximo de analito e com o mínimo de interferentes possíveis. Durante este processo é importante ter em conta que o solvente extrator deverá ter a capacidade de retirar o máximo de analito da matriz (Capriotti, Cavaliere, Piovesana, Samperi, & Laganà, 2012). A escolha das técnicas de extração/cleanup , ou dos solventes a usar, depende de vários fatores, entre eles as propriedades físico-químicas dos diferentes analitos, o tipo de matriz e o tipo de método posteriormente utilizado para a separação e deteção (Pereira et al., 2014).

O uso de técnicas convencionais pode trazer vantagens, apesar de geralmente serem mais trabalhosas e demoradas, uma vez que já se conhecem bem os erros associados e estes podem ser mais facilmente evitados. O uso de uma técnica mais recente exige uma pré-avaliação quanto às suas vantagens e desvantagens. Atualmente, os investigadores procuram técnicas em que o uso de solventes seja o mínimo possível,

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de preferência que não sejam prejudiciais para a saúde ou para o ambiente. (Welton, 2015; Lei Zhang et al., 2018).

3.2.1. “QuEChERS” (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)

QuEChERS foi uma técnica desenvolvida inicialmente em 2003, por Anastassiades et al., para a análise de pesticidas em produtos vegetais. Consiste num processo de extração liquído-liquído geralmente com acetonitrilo (MeCN) acoplado a uma técnica de clean-up, designada por extração dispersiva em fase sólida (Dispersive Solid Phase Extraction – d-SPE) (Anastassiades, Lehotay, Štajnbaher, & Schenck, 2003; Lijin Zhang et al., 2012).

Tal como o nome indica, trata-se de um procedimento rápido, simples, de baixo custo, eficiente, robusto e seguro. Ganhou bastante popularidade nos últimos anos, sendo utilizado para a extração de outros compostos, para além dos iniciais pesticidas, nomeadamente micotoxinas, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, aminas aromáticas e acrilamida (Cunha, Lehotay, Mastovska, Fernandes, & Oliveira, 2010; Sospedra, Blesa, Soriano, & Mañes, 2010; Lijin Zhang et al., 2012).

Este método pode ser adaptado a diferentes matrizes alimentares, modificando assim o procedimento original, obrigando a otimização do processo consoante a amostra a ser analisada. Para a sua aplicação deve-se ter em conta diferentes fatores, nomeadamente escolha dos solventes, dos sais utilizados para promover a extração e a seleção do clean-up adequado.

Seleção do solvente de extração

Na generalidade, as micotoxinas são solúveis em solventes orgânicos, moderadamente polares, destacando-se o MeCN, o clorofórmio, o diclorometano, o acetato de etilo e o metanol (MeOH) (Hina et al., 2018). A adição de água ou de uma solução acidificada (baixa percentagem de ácido acético, fórmico ou cítrico) regra geral aumenta a eficiência da extração, visto que aumenta o poder de penetração do solvente e pode ajudar na quebra de ligações entre a micotoxina e outros constituintes da matriz, como açúcares ou proteínas (Rahmani, Jinap, & Soleimany, 2009). Para além da escolha do solvente mais

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indicado, deve-se ter em conta outros fatores importantes, como temperatura, o tempo do processo extrativo e a razão amostra/solvente (Pereira et al., 2014).

De forma geral o MeCN é o solvente mais utilizado, pois permite uma redução da extração de interferentes da matriz, quando comparado ao MeOH ou à acetona (Juan, Ritieni, & Mañes, 2012).

“Salting out”

Visto que o MeCN é miscível com água, adicionam-se sais inorgânicos para promover a separação das fases e a diminuição da solubilidade dos analitos na fase aquosa. Este efeito é conhecido como “salting out” (Pizzutti et al., 2007). Neste método são utilizados geralmente o sulfato de magnésio (MgSO4) e o cloreto de sódio (NaCl) anidros. Estes sais têm a capacidade de remover a água do meio e assim reduzir o volume de fase aquosa. Acresce ainda o facto de ocorrer uma reação exotérmica aquando da hidratação do MgSO4, resultando num aquecimento da amostra, favorecendo a extração de compostos apolares (Anastassiades et al., 2003).

Clean-up

Esta etapa consiste na limpeza do extrato obtido, através da técnica de d-SPE, como já tinha sido descrito anteriormente. Neste caso, o adsorvente é colocado em contacto com o extrato. Podem ser utilizados adsorventes como o C18 e o Z-Sep, sendo que o C18 irá remover compostos apolares indesejados e o Z-Sep irá remover pigmentos e gorduras (Beyer & Biziuk, 2008; Shimelis, Yang, Stenerson, Kaneko, & Ye, 2007).

3.3. Métodos de Deteção/Quantificação

Existem diversos tipos de métodos para a deteção e quantificação de micotoxinas. Os métodos de “screening” são métodos que apenas nos dão resultados qualitativos, apresentando resultados relativos à presença ou ausência do analito. O método de ensaio imunoenzimático (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA) é o que mais se destaca. No entanto, hoje em dia vão surgindo novos métodos imunoquímicos, ensaios com biossensores, entre muitos outros (Meneely, Ricci, van Egmond, & Elliott, 2011).

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Uma outra metodologia de avaliação qualitativa é a cromatografia de camada fina (Thin Layer Chromatography – TLC). Devido à procura de métodos capazes de apresentar resultados com maior precisão, técnicas de separação e quantificação, como as técnicas de LC, têm vindo a crescer em popularidade, diminuindo a utilização de TLC (Cigić & Prosen, 2009; Lei Zhang et al., 2018).

No caso dos métodos quantitativos, dá-se um especial destaque às técnicas cromatográficas, designadamente a cromatografia gasosa e a cromatografia líquida.

3.3.1. Cromatografia Gasosa

É uma técnica que combina uma notável capacidade de separação com uma série de detetores. Faz uso das chamadas colunas capilares, caracterizadas por um diâmetro interno muito pequeno, em regra 0,25 mm, e um grande comprimento, sendo as mais usadas as de 30 metros. O detetor mais usado é o MS, uma vez que permite a identificação e quantificação de diferentes compostos em simultâneo com elevados níveis de sensibilidade, precisão e exatidão, o que se deve em parte à característica única de permitir a utilização de padrões internos de análogos isotópicos das moléculas em estudo, passíveis de serem separados por massa, apesar de apresentarem tempos de retenção idênticos (Pereira et al., 2014; Zhang et al., 2018).

Devido à baixa volatilidade e elevada polaridade da maioria das micotoxinas, o uso de técnicas de GC requer um passo adicional de derivatização. As abordagens mais comuns são a acilação e a sililação (Langseth & Rundberget, 1998; Orata, 2012; Walton, 1979).

Por norma a deteção de micotoxinas, através de um detetor MS pode ser realizada por impacto de eletrões ou por ionização química em modo positivo ou negativo. Na maioria dos trabalhos publicados, usaram-se instrumentos GC-MS a funcionar por impacto de iões (Ferreira, Fernandes, & Cunha, 2012).

Apesar das suas vantagens, em relação à resolução e sensibilidade, a GC não é uma técnica preferencial para a análise de micotoxinas, devido à exigência da realização da derivatização (Turner, Subrahmanyam, & Piletsky, 2009).

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3.3.2. Cromatografia Líquida

A cromatografia líquida tornou-se a técnica mais utilizada para a monitorização de micotoxinas, nas últimas décadas. Apresenta as vantagens de identificar e quantificar diversas micotoxinas simultaneamente, em baixas concentrações, sem a necessidade do passo de derivatização (Pereira et al., 2014).

Entre os diferentes detetores que podem ser acoplados a esta técnica analítica, destacam-se o detetor de fluorescência e os detetores de espetrometria de massa. A técnica LC-MS/MS é a que aparenta ser mais vantajosa, porque apresenta elevada sensibilidade e seletividade, no entanto é um equipamento muito dispendioso. Apresenta ainda limites de deteção baixos, baixos requisitos quanto à preparação da amostra e a possibilidade de deteção de diferentes compostos, com diferentes polaridades (Hina et al., 2018).

A introdução de técnicas de ionização de pressão atmosférica (Atmospheric Ionization Techniques – API), em particular a ionização por eletrospray (Electrospray Ionization – ESI), marcam um avanço importante na determinação destes contaminantes através de LC-MS. Sulyok et al. demonstraram a capacidade de detetar mais 20 micotoxinas, aproximadamente, usando técnicas de ESI, do que anteriormente, sem o uso desta técnica de ionização (Sulyok, Krska, & Schuhmacher, 2010).

Com o uso de ionização por API são produzidas moléculas protonadas ou desprotonadas. Em relação à ESI, a maior parte dos compostos apenas é ionizado em um dos modos: positivo (ESI+), em que são protonados, ou negativo (ESI-), em que são desprotonados. Contudo existem micotoxinas que são ionizadas em ambos os modos, como é o caso da Ocratoxina A e a Zearalenona (Beltrán, Ibáñez, Sancho, & Hernández, 2009). Na sua maioria, as micotoxinas são ionizadas em modo positivo (ESI+), formando iões moleculares protonados (Sulyok et al., 2010). Esta técnica nem sempre consegue protonar ou desprotonar algumas micotoxinas, surgindo a necessidade de formação de aductos com as moléculas em questão (Herebian, Zühlke, Lamshöft, & Spiteller, 2009; Li, Ma, Scherban, & Tam, 2002). Para aumentar a formação destes compostos é adicionado um modificador químico à fase móvel (como por exemplo ácidos orgânicos, como o ácido acético ou fórmico, ou os seus respetivos sais de amónio). A fase móvel, por sua vez, é geralmente constituída por MeOH/água ou MeCN/água, sendo que a fase em MeOH apresenta melhores respostas aquando do uso de ESI em modo positivo. Isto deve-se à capacidade do MeOH doar um protão, visto ser um solvente prótico, aumentando a resposta das moléculas protonadas (Cavaliere et al., 2005; Ren et al., 2007).

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Atualmente já foi possível detetar um total de 35 micotoxinas diferentes em amostras de plantas medicinais (Han et al., 2012). No entanto, uso de um padrão interno (PI) em métodos de LC-MS/MS torna-se quase obrigatório, uma vez que poderão ocorrer efeitos de matriz que eventualmente influenciarão o sinal analítico. Idealmente o padrão interno deve ser um análogo isotópico da substância que se irá quantificar. Com o uso do PI podem ser compensados possíveis desvios. Estes padrões são dispendiosos e disponíveis para um número reduzido de micotoxinas (Varga et al., 2012).

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Capítulo II.

Objetivos do Estudo

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As plantas e os extratos botânicos desempenham papeis diversificados na sociedade. Acima de tudo, constituem algo que é tido como “produto natural” e “benéfico para a saúde”. Podem ser comercializados das mais diversas formas, no seu estado natural ou depois de algum tipo de processamento. Podem ser ingredientes de suplementos alimentares ou estar confinados a ser usados apenas em infusões. A sua presença no dia-a-dia é inevitável. No entanto, não existe qualquer tipo de legislação vigente a nível comunitário, no que diz respeito à monitorização de contaminantes neste tipo de produtos, como por exemplo as micotoxinas.

Assim, é importante o desenvolvimento de métodos capazes de determinar e quantificar a presença de diversas micotoxinas emergentes, de forma simultânea, neste tipo de amostras, afim de se perceber até que ponto a falta de regulamentação porá em risco a saúde pública. Este facto torna-se mais pertinente para as micotoxinas emergentes, pois os estudos sobre a sua ocorrência são escassos.

O objetivo principal deste trabalho foi o de avaliar a presença de micotoxinas emergentes em amostras de plantas/extratos botânicos usados na preparação de infusões. O trabalho experimental foi dividido em três partes. Inicialmente, procurou-se desenvolver uma metodologia de cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa em tandem (LC-MS/MS), baseada numa extração pelo método de QuEChERS, para monitorizar micotoxinas emergentes em amostras de plantas/extratos botânicos e também em infusões. O método desenvolvido foi alvo de um processo de validação intra-laboratorial que consistia na avaliação da linearidade, precisão e exatidão do mesmo. Posteriormente à validação, procedeu-se à quantificação das micotoxinas emergentes em amostras de plantas e nas suas respetivas infusões. Por fim, foi efetuado um ensaio de migração, com o objetivo de perceber qual a percentagem de micotoxinas extraída da planta, durante o processo de infusão.

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Capítulo III.

Parte Experimental

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