UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO – UFERSA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO
CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA
SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE
BEATRIZ CRISTINA LOPES
MOSSORÓ/RN-BRASIL Março, 2020
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BEATRIZ CRISTINA LOPES
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO
CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA
SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi Árido – UFERSA, Campus de Mossoró, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. Dr. Jean Berg Alves Silva
MOSSORÓ/RN-BRASIL Março, 2020
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LL864 Lopes, Beatriz Cristina.
a ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE / Beatriz Cristina Lopes. - 2020.
44 f.: il.
Orientador: Jean Berg Alves Silva.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Rural do Semi-árido, Programa de Pós-graduação em Produção Animal, 2020.
1. Vibriose. 2. Temperatura. 3. Black spot. I. Silva, Jean Berg Alves, orient. II. Título.
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BEATRIZ CRISTINA LOPES
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO
CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA
SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi Árido – UFERSA, Campus de Mossoró, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
APROVADA EM 31/03/2020
BANCA EXAMINADORA:
5 Dedico este trabalho ao meu Pai Severino (in memorian), meu maior incentivador desde o início. “Deixe ela ser o que quiser”, ele dizia...
6 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO (Litopenaeus
vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE
De Lopes, Betriz Cristina. ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE. 2020. 48f. Dissertação (Mestrado em Produção Animal- Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2020.
RESUMO:
A pesquisa objetivou-se em relacionar as análises bacteriológicas de vibrio com a análise presuntiva indicativa de vibriose no camarão marinho Litopenaeus vannamei cultivado em sistema semi-intensivo de baixa salinidade submetidos a dois ciclos de produção a fim de melhorar os resultados nas fazendas de camarão.O estudo foi desenvolvido em campo, utilizando três viveiros denominados V11, V12 e V13 em dois ciclos de produção em sistema semi-intensivo com baixa salinidade. Com coletas semanais, o experimento teve início em abril de 2019 estendendo-se até outubro de 2019. Foram avaliados a correlação entre a contagem de vibrios sacarose positiva e sacarose negativa com as variáveis da análise presuntiva (Preenchimento dos Túbulos do Hepatopâncreas-P1, Necrose no hepatopâncreas -P2, Deposição de cálcio -P3, Cor do urópodes-P4 e Black spot -P5) e com salinidade, temperatura, pH e Oxigênio Dissolvido (O2) da água. No ciclo I, as bactérias sacarose negativa apresentaram correlação positiva com a temperatura da água, com P2 e com P5. E também uma correlação negativa entre sacarose negativa e P3. Já no segundo ciclo apresentou correlação positiva entre as sacarose negativa com o pH da água, P2 e P5 e um correlação negativa entre sacarose negativa com O2 e P4. Foram identificadas em todos os viveiros e ciclos as bactérias sacarose positiva V. Cholera e V. alginolyticus, e as bactérias Sacarose negativaV. parahaemolyticus e V. Vulnificus. Percebeu-se que a contaminação do camarão próxima a de 104 UFC/g associado à presença de necrose no hepatopâncreas e black spot pode confirmar indicativo de vibriose. Conclui-se que a análiConclui-se presuntiva com índices elevados das características de necroConclui-se no hepatopâncreas e black spot pode suspeitar de vibriose, sendo confirmada pela técnica microbiológica tradicional. Isso irá permitir que os criadores tomem os cuidados de manejo mais rapidamente a partir do exame presuntivo em campo.
7 BACTERIOLOGICAL ANALYSIS OF VIBRIOS AND PRESUMPTIONAL EXAMINATION IN SHRIMP (Litopenaeus vannamei) CULTIVATED IN A LOW SALINITY SEMI-INTENSIVE SYSTEM
De Lopes, Beatriz Cristina. BACTERIOLOGICAL ANALYSIS OF VIBRIOS AND PRESUMPTIONAL EXAMINATION IN SHRIMP (Litopenaeus vannamei) CULTIVATED IN A LOW SALINITY SEMI-INTENSIVE SYSTEM. 2020. 48f. Master Science Degree in Animal Science: - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2020.
ABSTRACT:
The research aimed to relate the bacteriological analyzes of vibrio with the presumptive indicative analysis of vibriosis in the marine shrimp Litopenaeus vannamei grown in a low-salinity semi-intensive system submitted to two production cycles in order to improve the results in the shrimp farms.The study was developed in the field, using three nurseries called V11, V12 and V13 in two production cycles in a semi-intensive system with low salinity. With weekly collections, the experiment started in April 2019, extending until October 2019. The correlation between the positive sucrose and negative sucrose vibrios count with the variables of the presumptive analysis (Hepatopancreas Tubules-P1, Necrosis in hepatopancreas -P2, calcium deposition -P3, color of uropods-P4 and black spot -P5) and with salinity, temperature, pH and dissolved oxygen (O2) in the water. In cycle I, the negative sucrose bacteria showed a positive correlation with water temperature, with P2 and with P5. And also a negative correlation between negative sucrose and P3.In the second cycle, there was a positive correlation between negative sucrose with water pH, P2 and P5 and a negative correlation between negative sucrose with O2 and P4. In all the nurseries and cycles, the positive sucrose bacteria V. Cholera and V. alginolyticus, and the negative sucrose bacteria were identified V. parahaemolyticus and V. Vulnificus. It was realized that contamination of shrimp close to 104 UFC/g associated with the presence of necrosis in the hepatopancreas and black spot can confirm an indication of vibriosis. It is concluded that the presumptive analysis with high indices of necrosis characteristics in the hepatopancreas and black spot may suspect vibriosis, being confirmed by the traditional microbiological technique. This will allow breeders to take care of handling more quickly from the presumptive examination in the field.
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SUMÁRIO
1. REFERENCIAL TEÓRICO ... 9
1.1. Cultivo do Litopenaeus vannamei ... 9
1.2. Vibrio spp ... 11
1.3. Contaminação Provocada por Vibrio spp. e suas Implicações ... 12
1.3.1. Em Humanos ... 13
1.3.2. Em Camarão ... 13
1.4. Métodos de detecção de Vibriose ... 15
Referências ... 17
2. ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO (Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE 22 ANEXO I ... 42
ANEXO II ... 43
9 1. REFERENCIAL TEÓRICO
1.1. Cultivo do Litopenaeus vannamei
Desda década de 1980, o mercado mundial de pescado é abastecido progressivamente por produtos da aquicultura como alternativa economicamente sustentável para a depleção dos estoques pesqueiros e para abarcar o consumo da população que procura alimentos de qualidade, saudáveis, sápidos e de valor acessível (SCHULTER; FILHO, 2017). A aquicultura contribui mais do que a pesca para o fornecimento de alimentos para consumo humano, sendo 52% aquicultura contra 48% da pesca. A previsão é que para 2030 a aquicultura colabore com 60% do pescado para consumo humano.O grupo mais produzido é o de peixes, seguido de algas, moluscos e crustáceos. Entre os crustáceos, o mais cultivado é o camarão marinho Litopenaeus vannamei (FAO, 2018).
O maior número de fazendas de camarão no Brasil está concentrado na região Nordeste e são responsáveis por 99,4% da produção total nacional. Com destaque para o estado do Rio Grande do Norte que ocupa o primeiro lugar nacional, responsável por 43,2% do total da produção de camarão em 2018. Dos 20 municípios considerados maiores produtores de camarão, oito são potiguares: Canguaretama, Arês, Mossoró, Senador Georgino Avelino, Nísia Floresta, Tibau do Sul, Guamaré e Pendências (IBGE, 2018).
A espécie Litopenaeus vannamei é um animal invertebrados pertencentes ao grupo de crustáceos (Valenti, 1998). Seu corpo é coberto exoesqueleto calcificado, segmentado e dividido em duas regiões: o cefalotórax (cabeça e tórax fundidos) e o abdômen. A carapaça que protege os principais órgãos funcionais (as brânquias, o estômago, o coração e hepatopâncreas) estão localizados na região anterior do cefalotórax. Na porção ventral do cefalotórax são encontradas as estruturas de detecção, captura e manipulação do alimento: os maxilípedes e pereiópodos. Seu abdômen é subdividido em segmentos, nessa região localiza-se na parte ventral as estruturas natatórias (os pleópodos e os urópodos) (Figura 1 e 2) (BROCK; MAIN, 1994; NUNES; MARTINS, 2002).
O camarão L. vannamei está associado às águas costeiras rasas e estuarinas: os adultos vivem em ambientes marinhos tropicais, enquanto as pós-larvas passam seus estágios juvenis e pré-adultos em estuários e lagoas costeiras. Crescem através de mudas sucessivas ao longo de seu ciclo de vida e sofrem metamorfose durante sua primeira fase da vida (BROCK; MAIN, 1994).
10 O processo de produção na carcinicultura é dividido em duas fases: a larvicultura, que compreende a produção de pós-larvas em laboratório; e a engorda em sistemas de produção, que consiste no crescimento dos animais até a obtenção de índices aceitáveis para a comercialização (NUNES; MARTINS, 2002). O processo de engorda inclui o crescimento do camarão até atingir o tamanho comercial de 10 gramas. A média é de 12 a 17 gramas, alcançada em 95 a 120 dias após o povoamento. Levando os animais a esses tamanhos, podem ser realizados de 3 a 3,5 ciclos por ano, dependendo das condições dos viveiros (BAIDAL, 2015).
De acordo com Vanwyk (2001) os sistemas de produção na carcinicultura são classificados quanto ao nível de intensificação e o número de fases operacionais. O grau de intensificação do sistema de cultivo considera principalmente o nível tecnológico utilizado pelo produtor. Desta forma, pode se classificar a engorda do camarão marinho em quatro categorias: extensivo (densidade de 0,5 a 5 camarões/m²) quase não utilizando alimento artificial, e dependem da produtividade natural dos viveiros), semi-intensivo (6 a 50 camarões/m2 com uso de alimento artificial, o uso de aeradores e monitoramento da qualidade da água), intensivo (51 a 100 camarões/m2, intensiva utilização de alimento de alta qualidade, forte aeração mecânica, manejo na qualidade da água e mão-de-obra especializada) e superintensivo (O uso de tecnologia bastante sofisticada e altíssimas densidades de estocagem, que variam entre 100 a 3.000 camarões/m2).
Quanto ao número de fases operacionais eles podem ser classificados em monofásico (com a principal característica de povoamento direto das pós-larvas no viveiro de engorda) bifásico (com uma etapa intermediária de criação das pós-larvas em berçários, antes do povoamento no viveiro de engorda) e trifásico (com duas etapas intermediárias de criação das pós- larvas, antes do povoamento no viveiro de engorda).
Os camarões dependem inteiramente do sistema imunológico inato, que carece de anticorpos e memória imunológica para se defender contra patógenos estranhos. A saúde desses animais estar sujeito a sua interação com o ambiente, e os patógenos. Os elementos ambientais envolvem fatores abióticos como as concentrações de
Figura 01- Estrutura externa do camarão marinho l. vannamei.
Figura0 2- Estrutura interna do camarão marinho l. vannamei.
11 pH e temperatura, baixas concentrações de oxigênio dissolvido (BROCK; MAIN, 1994), mudanças abruptas na salinidade (LIU et al., 2006), altas concentrações ou variações de compostos nitrogenados amônia, nitrito e nitrato; proliferação de bactérias oportunistas, protozoários e microalgas; aquisição de pós-larvas infectadas (NUNES; MARTINS, 2002), densidade de estocagem nos viveiros, fatores genéticos, estado nutricional e imunológico dos camarões (LIGHTNER, 1996). A alteração de um ou mais desses fatores, pode levar a uma situação de estresse e suscetibilidade às doenças oportunistas como a Vibriose (CÁRCAMO-ARÉCHIGA et al., 2016).
A Vibriose, também conhecida como “síndrome da gaivota”, são associados a infecções bacterianas causadas pelas espécies Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio campbellii e Vibrio splendidus entres outros (LIGHTNER, 1993; JIRAVANICHPAISAL; MIYAZAKI, 1995) e são geralmente considerados patógenos oportunistas que causam doenças quando camarão está estressado. Esse grupo de bactérias possui um processo de infecção que pode causar diferentes enfermidades. Na fase de engorda podem apresentar os seguintes sintomas: desorientação (natação lenta), letargia (ficam no fundo do viveiro), hemolinfa turva com tempo de coagulação alterado, aglomeração nas margens do viveiro atraindo aves, opacidade da musculatura, coloração avermelhada dos apêndices, flexão do terceiro segmento abdominal, brânquias, cutícula e apêndices melanizados, anorexia e apatia Quando localizada, apresenta lesões melanizadas na carapaça e/ou abscessos pontuais no hepatopâncreas (BROCK; MAIN, 1994; COVARRUBIAS, 2010).
1.2. Vibrio spp
O gênero Vibrio ssp pertencente à classe Gammaproteobacteria, são bactérias Gram-negativas não formadoras de endósporos, possuem formato de bastonete lineares ou curvos, e medem entre 0,5 a 0,8µm de diâmetro e 1,4 a 2,4µm de comprimento. As espécies desse gênero são móveis, anaeróbias facultativas, mesofílicas e quimiorganotróficas, capazes de realizar metabolismo fermentativo e oxidativo (THOMPSON et al., 2007; TORTORA; FUNKE, 2013).
Como são bactérias mesófilas e tendem a se proliferar em águas costeiras tropicais., a temperatura ótima para o seu desenvolvimento está entre 20 e 35°C. Abaixo de 20°C a densidade é diminuída e a 10°C ocorre o seu desaparecimento da coluna d’água. Entretanto, as bactérias são mantidas no sedimento de onde proliferam quando condições favoráveis se estabelecem (HERVIO-HEATH et al., 2002).
O gênero Vibrio totaliza mais de 100 espécies, que exigem cerca de 0,5 a 3% de cloreto de sódio (NaCl) para o desenvolvimento ideal, por isso estão predominantemente associados a uma variedade de habitats marinhos, estuarinos ou outros habitats aquáticos (JANDA, 2015). A exceção limitada a essa regra são as espécies
12 V cholerae, não halofílicas ou que não requerem sal, e Vibrio mimicus, que podem ser encontradas em ambientes de água doce (KAYSNER et al., 2004; JANDA, 2015).
Eles possuem proteínas capazes de degradar e assimilar a quitina (que tem sido relatada como uma das principais fontes de amino-açúcar nos ambientes aquáticos (RIEMANN; AZAM, 2002). Incluindo enzimas quitinolíticas (BASSLER et al., 1991), e proteínas de ligação que possibilitam a adesão do víbrio às superfícies com quitina, como as relatadas em Vibrio parahaemolyticus (GILDEMEISTER et al., 1994) e Vibrio harveyi (MONTGOMERY; KIRCHMAN, 1993; MONTGOMERY; KIRCHMAN, 1994). Constituindo assim, predominantemente, os ambientes ricos em quitina, provenientes de plâncton, crustáceos, insetos ou fungos (GILDEMEISTER et al., 1994).
Os Vibrios são organismos constituintes da flora natural de camarões selvagens e criados em cativeiros, elas estão presentes no trato gastrointestinal dos animais em uma proporção maior que na água, pois no intestino existe maior disponibilidade de matéria orgânica e quitina para sua sobrevivência (RAMAIAH et al., 2000). Como as bactérias produzem enzima quitinase obtém essa relação mutualística no seu processo de digestão (NISHIGUCHI; JONES, 2004). É considerado uma bactéria oportunista, pois aproveitam-se de desequilíbrios no ambiente para se proliferam rapidamente causando infecções denominada vibriose, responsáveis por altas taxas de mortalidade na aquicultura
Várias bactérias desse gênero são patogênicas para homens e animais. É a principal causa de gastroenterite bacteriana consumida em frutos do mar em humanos, podendo variar de casos leves de gastroenterite a situações de risco de vida, como septicemia e infecções invasivas da pele e tecido. O agente etiológico da Cólera, Vibrio cholerae, pertence a esse grupo (FDA, 2004).
1.3. Contaminação Provocada por Vibrio spp. e suas Implicações
Os patógenos mais importantes clinicamente para o homem são Vibrio cholerae (FARUQUE et al., 1998), V. parahaemolyticus (LEVIN, 2006) e V. vulnificus (OLIVER, 2015); no entanto, outras espécies como V. fluvialise V. mimicus também foram associadas a casos clínicos (CHITOV et al., 2009; RAMAMURTHY et al., 2014;). V. cholerae é responsável por vários grandes surtos de cólera, enquanto V. parahaemolyticus, embora seja capaz de causar mortalidade severa em espécies de animais aquáticos (KUMAR et al., 2014; CHONSIN et al., 2016), também é considerado como patógeno humano, uma vez que é uma das principais causas de diarreia grave e gastroenterite aguda humana (LEVIN, 2006). Já o V. vulnificus é o patógeno mais letal transmitido por alimentos nos EUA e possivelmente no mundo (OLIVER, 2015).
Um número comparativamente pequeno de espécies, por exemplo, V. parahaemolyticus e V. vulnificus, causam doenças em animais aquáticos e humanos. No entanto, existe um dilema de que, porque um organismo
13 ocorre em um animal aquático, isso não significa necessariamente que essa é a fonte de infecção em humano (SILVEIRA et al., 2016).
1.3.1. Em Humanos
Vibrio cholerae é encontrado principalmente em fontes de água ou alimentos contaminadas com fezes, embora também possa ser encontrado no rio salobra e nas águas costeiras. Esta espécie é uma das mais estudado devido ao seu impacto na saúde pública e à gravidade da doença da cólera. Os principais fatores de virulência produzidos por esse patógeno são a toxina da cólera que facilita sua colonização no intestino causando diarreia aquosa, geralmente fatal se não tratada (SILVA et al., 2019). É responsável por aproximadamente entre 3-5 milhões de casos e mais de 100.000 mortes a cada ano em todo o mundo, de acordo com o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em 2017.
Vibrio parahaemolyticus causa infecções principalmente após o consumo de mariscos crus ou mal cozidos. Quando infectado, o indivíduo pode apresentar diversos sintomas, como diarreia, dores abdominais, vômito, febre e calafrios. Em casos mais avançados, pode causar disenteria com fezes mucoides e sanguinolentas (AMARO et al., 1994; CERDA-CUÉLLAE et al., 2001).
Vibrio vulnificus é encontrada em ostras, mariscos e águas marinhas mornas; assim, da mesma forma que V. parahaemolyticus, o risco de infecção ocorre quando as pessoas comem frutos do mar crus ou não cozidos ou quando estão tomando banho no mar com um corte ou arranhão. As infecções frequentemente evoluem para septicemia, provocando morte de indivíduos suscetíveis (FDA, 2011).
1.3.2. Em Camarão
As principais espécies do gênero Vibrio que representam risco para o cultivo dos peneídeos são Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. campbellii, V. carchariae, V. harveyi, V. ordalii, V. parahameolyticus, e V. vulnificus (RODRICK, 1991; ALVAREZ et al., 1995; LIGHTNER, 1996;). As mais encontradas associadas a Vibriose são as V. parahameolyticus, Vibrio alginolyticus, V. harveyi e o V. vulnificus As espécies de víbrio possuem a capacidade de fermentar a sacarose quando inoculados em Ágar Tiossulfato Citrato Sais de Bile (TCBS) (Figura 03 e Tabela 01). Elas são identificadas pela coloração amarela das colônias (Sacarose positiva), já as que não fermentam a sacarose são macroscopicamente identificadas pela coloração verde (Sacarose negativa). Mendes et al., (2005) destacam que apenas a capacidade de fermentar ou não a sacarose não está relacionada com a patogenicidade da bactéria e, portanto, a presença de um tipo ou de outro não indica a gravidade da situação.
14 Figura 03: A – Colônias de Vibrio spp. sacarose positiva em ágar TCBS; B – Colônias de Vibrio spp. sacarose negativas em ágar TCBS (MENDES, 2005).
As doenças causadas por bactérias do gênero Vibrio em camarões ocorrem em todos os estágios de vida do animal e são classificadas geralmente como infecções secundárias e oportunistas. O processo de infecção causada por Vibrio spp. em camarão pode ser cuticular, entérico (intestinal) e sistêmico (envolvendo vários órgãos) (REBOUÇAS et al., 2017).
Nas infecções locais ou cuticulares observam-se lesões melanizadas na carapaça, chamadas de “Black spots”. São manchas de coloração marrons ou pretas, que podem ser eliminadas no momento da muda se forem superficiais, porém, se forem profundas o quadro pode progredir para uma vibriose sistêmica. Quando ocorre infecção entérica, na fase inicial podem-se observar opacidade muscular e trato digestivo vazio. Se não diagnosticada a enfermidade progride e encontram-se camarões com expansão dos cromatóforos, necrose nos túbulos do hepatopâncreas e luminescência (BARBIERI; OSTRENSKY, 2001).
Os camarões podem apresentar ainda desorientação, hemolinfa turva com tempo de coagulação alterado, aglomeração nas margens do viveiro, coloração avermelhada dos apêndices do último segmento abdominal (urópodos), flexão do terceiro segmento abdominal, brânquias e apêndices melanizados (MORALES-COVARRUBIAS, 2008).
15 Tabela 01- Coloração de algumas bactérias das espécies de Vibrio, de importância para a carcinicultura, após inoculados em Ágar TCBS. V. anguillarum V. parahaemolyticus V. campbellii V. carchariae V. vulnificus V. alginolyticus V. ordalii V. harveyi Ágar TCBS
Amar Verd Verd Verd Verd Amar Verd Verd
Amar- Colônias amarelas- Sacarose positiva Verd- Colônias verdes- Sacarose negativa.
Aguirre-Guzmán et al., (2001) observaram opacidade do corpo, necrose e letargia como sintomas de vibrioses larvas e pós-larvas de L. vannamei infectadas por V. harveyi e V. parahaemolyticus. Já Soonthornchai et al., (2010) observaram destruição em massa do sistema digestivo, especialmente no hepatopâncreas e intestino anterior nas pós-larvas. Esteve; Herrera (2000) infectaram camarões juvenis e verificaram alterações histológicas no hepatopâncreas dos animais antes da apresentação dos primeiros sinais. Os autores concluíram que a pesquisa de vibrio no hepatopâncreas pode servir de indicador da saúde do camarão. Burgents et al. (2005) relatam que esses patógenos podem se expandir rapidamente e invadir os outros orgões dos animais como guelras, hepatopâncreas, órgão linfóide, coração e hemolinfa. E que as rotas de infecção bacteriana por Vibrio spp. em camarões são influenciados pelas estirpes bacterianas empregadas, dose infectante e pelos protocolos utilizados. O estado de saúde exerce uma filtragem mais forte no sistema intestinal do camarão do que outros fatores (STEPHENS et al., 2016; ZHOU; NING, 2017). Pois a doença do camarão pode ocorrer em momentos diferentes, enquanto a comunidade bacteriana intestinal muda drasticamente junto com o desenvolvimento do camarão (HUANG et al., 2016; RUNGRASSAMEE et al., 2013; XIONG et al., 2017) o que é consistente com os estudos anteriores, sugerindo que o surto da doença provavelmente acompanha a diminuição do intestino (CORNEJO-GRANADOS et al., 2017 ; XIONG et al., 2015, 2017).
16 No Brasil as fazendas de camarão são em sua maioria (75%) de pequeno e médio porte (ABCC, 2019) e os diagnósticos são baseados nas informações obtidas na anamnese, nos achados clínicos e exame presuntivo. O exame presuntivo fundamenta-se na inspeção macroscópica dos animais com posterior realização de exame microscópico, mais detalhado dos camarões (MORALES-COVARRUBIAS, 2008). O exame clínico é utilizado para monitorar o estado de saúde dos camarões e realizar diagnósticos presuntivos no laboratório e no campo. Consiste na dissecação do camarão em todos seus estágios, para observar as alterações e patógenos presentes nos órgãos e tecidos. São coletados para realização deste exame, as brânquias, hepatopâncreas, intestino, músculo e gônadas (MORALES-COVARRUBIAS, 2004).
Dependendo da lucratividade e do nível de tecnologia aplicada nas fazendas, os produtores se utilizam de laboratórios que façam exame histopatológico, microbiológico e técnicas moleculares. Dentre estas, as análises microbiológicas do camarão e da água, com o uso do meio cultura específico Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS) é bem difundida para selecionar e isolar estirpes de Vibrio (TORKY et al., 2016). A análise bacteriológica consiste na determinação da carga microbiana viável e na comprovação da ausência e ou presença de microrganismos nas amostras. No caso de juvenis, pré-adultos ou adultos, a contagem de colônias de 10² a 104UFC/g (Unidade Formadora de Colônias –UFC) de bactérias Sacarose negativa no hepatopâncreas é
considerado seguro e normal em L. vannamei. Os doentes desta espécie mostram contagens de 10³ UFC/mL em hemolinfa e 105 UFC/ g no hepatopâncreas (em ágar TCBS) de camarões cuçtivados no México
(CUÉLLAR-ANJEL, 2013).
Além disso, é importante determinar os potenciais de virulência dessas bactérias, que podem incluir desde produção de enzimas a carreamento de genes específicos (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2014). Porém o método de identificação tradicional de Vibrio através da caracterização fenotípica possui várias limitações: por exemplo, espécies diferentes podem ter fenótipos vagos (por exemplo, o grupo de espécies de V. alginolyticus); cepas de espécies semelhantes também podem ter fenótipos distintos (por exemplo, variação de colônias e atividades enzimáticas); e, às vezes, ocorrem inconsistências nos resultados com a mesma tensão e falta de reprodutibilidade inter laboratorial. A detecção molecular direta utilizando PCR também pode ser aplicada, mas possui algumas limitações em vista do custo e das instalações necessárias para a análise; essas restrições são particularmente significativas para estudos de campo envolvendo um grande número de amostras (CHOOPUN et al., 2002). Amaral et al., (2014) sugeriram que uma alternativa confiável e concebível é adquirir informações fenotípicas diretamente de sequências genômicas inteiras.
17 Referências
ABCC- Associação de Criadores de camarão. 2019. Análise das Principais Tentativas de Importações de Camarão Marinho pelo Brasil: Liminares, Contra Liminares e Decisões da Justiça Federal, Incluindo do STF.p7. AGUIRRE-GUZMÁN, G.; VÁZQUEZ-JUÁREZ, R.; ASCENCIO, F. Differences in the Susceptibility of American White Shrimp Larval Substages (Litopenaeus vannamei) to Four Vibrio Species. Journal Of Invertebrate Pathology, v. 78, n. 4, p.215-219, nov. 2001. http://dx.doi.org/10.1006/jipa.2001.5073.
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22 2. ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO
(Litopenaeus vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE
23 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE VIBRIOS E EXAME PRESUNTIVO NO CAMARÃO (Litopenaeus
vannamei) CULTIVADO EM SISTEMA SEMI-INTENSIVO DE BAIXA SALINIDADE Beatriz Cristina Lopes¹ Jean Berg Alves Silva¹
¹ Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal- LIPOA, Av.
Francisco Mota, 572, Pres. Costa e Silva, CEP 59625-900, Mossoró, RN, Brasil.
(beatriizz.lopes@gmail.com).
INTRODUÇÃO
O camarão Litopenaeus vannamei é a espécie mais cultivada no Brasil e no mundo (FAO, 2017). Isso se deve ao fato dela possuir excelentes características zootécnicas de fácil adaptação ao ambiente ao qual é inserido, tais como: rápido crescimento, em todas as fases do processo produtivo, rusticidade, conversão de dietas artificiais em ganho de peso, desenvolvimento rápido em baixas densidades de estocagem e capacidade de suportar amplitude térmica entre 9-34°C (OTOSHI et al., 2007). Sua habilidade em manter regulação osmótica é a sua principal característica: tolerar larga variação de salinidade (0,5–40 g/L), consagrando-a como a espécie mais popular para a cultura em baixa salinidade já que a faixa de salinidade considerada ideal é entre 15 e 25 g/L (PONCE-PALAFOX et al.,1997).
Porém, a intensificação dos sistemas de cultivo associada aos fatores estressantes gerados por perturbações ambientais pode comprometer o estado de saúde desses animais, deixando-os mais suscetíveis a doenças. Entre as doenças que se destacam por causarem grandes mortalidades nos cultivos estão as causadas por vírus (em especial a Síndrome da Mancha Branca) e por bactérias Gram-negativas do gênero Vibrio denominada Vibriose (BOONCHUEN et al., 2018).
As bactérias do gênero Vibrio spp. ocorrem naturalmente em ambientes aquáticos tipicamente marinho e estuarino, e são uma das bactérias mais comuns durante a criação de camarão, estando presente na água, no solo e na hemolinfa (VANDENBERGHE, et al., 1999; MESSELHÄUSSER et al., 2010 e TALL et al., 2013). Possuem cerca de 126 espécies das quais sete delas representam risco para o cultivo dos peneídeos causando as chamadas Vibrioses, como os Vibrio vulnificus, V. alginolyticus, V. campbellii, V. splendidus, V. damsela, V. parahameolyticus e V. harveyi entre outras (LIGHTNER, 1996). Essas bactérias causam enormes prejuízos na indústria da aquicultura em todo o mundo, sendo essa uma doença responsável por grandes perdas econômicas na carcinicultura (DONG et al., 2017).
Os vibrios possuem características que dependem do meio para seu desenvolvimento. São bactérias Gram-negativas e a maioria das espécies toleram elevadas salinidades, necessitando de sódio (NaCl- 0,5 a 3%) para o
24 crescimento. São mesófilos com tendência a proliferação em épocas mais quentes e facultativamente anaeróbias, crescem melhor sob condições alcalinas (MURRAY et al., 1999; KAYSNER et al., 2004). São capazes de se multiplicar sem hospedeiro em águas marinhas ocorrendo tanto na coluna d’água como na fauna (LIMA, 1997). E fatores como temperatura, pH, e salinidade influenciam na sua presença no ambiente (HUSS et al., 2004).
Esses microrganismos pertencem e dominam a flora natural do camarão marinho (LIGHTNER, 1996) nos quais podem ser patógenos e não patógenos. Os patógenos são oportunistas, se multiplicam nos viveiros facilmente, já que são ambientes estressantes para os animais devido à alta matéria orgânica, flutuações de oxigênio dissolvido, densidade de estocagem excessiva, manuseio inapropriado dos estoques e subalimentação causando mortalidade nos animais (DIREKBUSARARAM et al., 1998; BARBIERI et al., 1999; NUNES; MARTINS, 2002). Os não patógenos desempenham um papel importante na ciclagem de nutrientes dos ambientes aquáticos através do transporte de matéria orgânica dissolvida (THOMPSON et al., 2004).
A colonização por vibrio do hepatopâncreas não é a única fonte possível de vibriose em camarões cultivados. Os vibrios podem penetrar no epitélio e os tecidos dos camarões podem ser colonizados de várias maneiras diferentes, como por via de alimentos contaminados ou lesão de carapaça (MARTINS et al., 2004; VARELA-MEJÍAS, 2018).
O método de detecção e diagnóstico, mais comum e acessível aos produtores, da vibriose é realizado através de análise presuntiva (na maioria das vezes dentro das fazendas de cultivo) e análises bacteriológicas em amostras de hemolinfa e tecidos do camarão (em laboratórios). Conforme Morales-Covarrubias (2008) a análise presuntiva consiste na dissecação do camarão em todos os estágios de desenvolvimento, objetivando observar as principais alterações e patógenos presentes nos órgãos e tecidos. A análise bacteriológica consiste na determinação da carga microbiana viável e na comprovação da ausência e ou presença de microrganismos nas amostras. Em camarões juvenis, pré-adultos ou adultos, a contagem de colônias de 10² a 104UFC/g de bactérias Sacarose negativa no hepatopâncreas é considerado seguro e normal em L. vannamei. Pois os camarões acometidos apresentam a 105UFC/ g no hepatopâncreas e 10³ UFC/mL em hemolinfa (em ágar TCBS) (CUÉLLAR-ANJEL, 2013).
Muitas vezes, entretanto, os sintomas observados nas análises presuntivas são comuns a uma série de enfermidades, não sendo possível, somente através dessa observação, determinar a doença e as medidas auxiliadoras para o combate (MENDES et al., 2019). Em decorrência disso, merece destaque o fato de que esta falta de distinção dos sintomas tem levado alguns técnicos a diagnosticar erradamente, principalmente, as doenças de origem bacteriana, pois a interpretação das lesões observadas e o julgamento dos graus de severidade das amostras podem ser variáveis de acordo com as observações de quem realiza o exame. Sendo assim objetivou-se relacionar as análises bacteriológicas de Vibrio com a análise presuntiva indicativa de Vibriose no camarão marinho Litopenaeus vannamei cultivado em sistema semi-intensivo de baixa salinidade submetidos a dois ciclos de produção a fim de melhorar os resultados nas fazendas de camarão.
25
MATERIAL E MÉTODOS
Área de estudo
O estudo foi desenvolvido na Fazenda Itaueira Agropecuária-SA (-5.489485, -36.854518) localizada na Rod. RN 118, Km 17,5, Zona Rural, Ipanguaçu - RN, Brasil; que disponibilizou três viveiros denominados V11, V12 e V13 (com tamanho de 8 hectare cada) para análises microbiológicas de vibrios e análise presuntiva em dois ciclos de produção em sistema Semi-intensivo com baixa salinidade.
Amostragem
As amostras foram constituídas de camarão e água do viveiro, coletadas durante todo o ciclo de cultivo, do povoamento até a despesca dos animais. O experimento teve início em abril de 2019 estendendo-se até outubro de 2019. As amostragens foram coletadas com frequência semanal, perfazendo um total de 28 coletas, com 72 amostras de água e 59 amostras de camarão, para microbiológica e análise presuntiva. No início do cultivo só foram feitas análises de água, pois não se conseguia capturar as larvas por causa do seu pequeno tamanho.
As amostras de água foram coletadas em garrafas plásticas previamente esterilizadas com capacidade para um 500 mL, próximo a comporta de drenagem e a vala do viveiro. E os camarões foram capturados aleatoriamente com uma tarrafa e acondicionados em recipientes de plásticos esterilizados. Todas as amostras foram transportadas aos laboratórios em recipiente isotérmico. O tempo entre a coleta e o início das análises não excedeu 4 horas. As análises microbiológicas foram processadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA), e as análises presuntivas no laboratório de Sanidade Aquática (LASA), os dois localizados na Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). Os parâmetros físico-químicos dos viveiros: oxigênio, pH, temperatura e salinidade foram cedidos pela empresa Itaueira.
Análise microbiológica
As amostras de água foram homogeneizadas e semeado 0,1 mL por “spread plate” com utilização da alça de Drigalski em placas de Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS). Já as amostras de camarão foram diluídas em solução salina a 1% na proporção de 1:9. A diluição de 10-1 das fases de juvenis e adultos foi obtida
a partir da homogeneização de 25g da amostra em 225mL de solução salina a 1%. A segunda diluição de 10² foi obtida a partir da homogeneização de 1mL da diluição de 10-1 em 9mL de solução salina a 1%, e assim
26 As placas foram incubadas em estufa a 35°C por 18 horas. Após o período de incubação, os resultados foram observados a partir do crescimento de colônias sacarose positivas (amarelas) e negativas (verdes). Para a contagem de colônias sacarose positivas e negativas foram selecionadas as placas que possuíam as diluições com crescimento de colônias entre os limites de 25 a 250 Unidades Formadoras de Colônias – UFC (Downes; Ito, 2001). O procedimento foi realizado em triplicata. O cálculo foi obtido a partir da multiplicação do número de UFC (colônias viáveis) e do valor da diluição correspondente da placa, sendo expresso em UFC/mL para água e UFC/g para camarão. Uma colônia de cada isolado foi inoculada em ágar de soja Trypticase (TSA) suplementado com NaCl 1% a 28 ° C por 24 he incubado para identificação em meio Cromogênico para Vibrio, em seguida realizado coloração de gram.
Após a contagem, o resultado das análises era repassado para os gestores da Fazenda Itaueira Agropecuária, que com base no limite máximo de bactérias sacaroses negativas (105 UFC/g) em camarão estipulado por Jorge Cuéllar-Anjel (2013) realizavam medidas de manejo para sanar os possíveis problemas.
Análise presuntiva
Para a análise presuntiva, foi escolhido apenas os pontos que são utilizados no método para identificar a ação bacteriana. Foi dividida em microscopia óptica: preenchimento dos túbulos do hepatopâncreas (P1), necrose no hepatopâncreas (P2), deposição de cálcio (P3); e análise macroscópica: cor de urópodes (P4) e Black spot (P5). Foi utilizada uma quantidade de 10 animais por amostra, dos quais foram dissecados, e retirados o tecido alvo (hepatopâncreas para P1 e P2, e carapaça para P3), colocado sobre uma lâmina e adicionado solução salina a 1% para análise de microscopia eletrônica.
Na análise de microscopia óptica, recolheu-se como tecido alvo, a carapaça do animal para verificar a calcificação e o hepatopâncreas para analisar o estado de preenchimento de lipídios dos túbulos, a fim de verificar a assimilação de nutrientes e suas estruturas para verificar deformação e lesões: paredes duplas e estrangulamentos. A análise macroscópica consistiu em olhar o animal e avaliar seu aspecto físico quanto sua pigmentação do urópodes e presença de “Black spot”. “Black spot”, são cicatrizes de um processo de lesão quitinolítica causada normalmente por bactérias.
Os aspectos macroscópicos e microscópicos foram caracterizados de acordo com o grau de severidade variando de 0 a 4 baseado na metodologia de Lightner (1996) e Cuéllar-Anjel (2013). Para P1 quanto mais próximo do grau 4, melhor para o camarão, indicando sinais clínicos de boa alimentação. E para P2, P3, P4 e P5 quanto mais próximo do grau 4, pior para o camarão, indicando que o animal não se encontra em estado adequado perante suas condições ambientais.
27 Semanalmente foram capturados com tarrafas de malhas de 8 a 10 mm, animais dos viveiros, com o intuito de realizar as biometrias e quantificar os parâmetros zootécnicos. A sobrevivência, medida em percentual, foi calculada com base na quantidade de animais despescados dividido pelo número de indivíduos estocados e multiplicado por cem. A produção foi obtida por meio da soma de biomassa, em quilogramas, de todos os animais despescados e calculada para a área de um hectare. O Fator de Conversão Alimentar (FCA) foi calculado de acordo com ração total ofertada dividido pela a soma das biomassas finais dos camarões.
Análise estatística
Os dados foram examinados primeiro quanto à normalidade usando o teste Shapiro-Wilk e quanto à homoscedasticidade usando o teste de Levene e foram transformados por log (x + 1), quando necessário. Uma one-way ANOVA usando um modelo linear geral usando o procedimento PROC GLM do Statistical Analysis System (SAS Institute Inc.) foi executado para avaliar o efeito do ciclo de produção sobre as análises microbiológicas e parâmetros da água. A diferença entre os ciclos foi verificada através do teste F. O teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney foi aplicado para avaliar o efeito do ciclo de produção sobre os dados da análise presuntiva. Para determinar as relações entre as cargas bacterianas e análise presuntiva ou características da água, além dos dias de cultivo com as cargas bacterianas, o teste de correlação de Spearman foi aplicado usando o PROC CORR do SAS. Para todas as análises, P < 0,05 foi considerado indicativo de diferença significativa.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os ciclos de cultivo do camarão variaram de 64 a 89 dias, com densidades de 16 a 33 camarões/m², obtendo gramaturas finais para comércio de 9 a 22g (Tabela 01). O fator de conversão alimentar (FCA) foi menor que um, um índice considerado bom na carcinicultura, resultando em diminuição de custos com ração para cada quilograma de animal produzido. Os viveiros da fazenda em estudo possuem um grande aporte de alimento natural (comunidade fitoplanctônica) disponível. No sistema semi-intensivo os animais ainda são dependentes do consumo de organismos vivos. Segundo Nunes et al (1996) a contribuição do alimento natural no sistema semi-intensivo para os camarões pode alcançar até 85% da alimentação.
Os viveiros com menores sobrevivências nos ciclos (Tabela 01) foram acompanhados por provável vibriose. Porém, os viveiros que apresentaram melhores sobrevivências dos animais possuíam uma densidade de estocagem menor. Camarões estocados em altas densidades geralmente crescem menos e apresentam menor sobrevivência do que camarões estocados em baixas densidades. Quanto menor a população de camarão, menor
28 a competição por espaço e/ou por alimento (KRUMMENAUER et al., 2011). O impacto da vibriose é variável, mas em alguns casos pode alcançar até 70% da população cultivada, ficando a cadeia produtora suscetível a epidemias periódicas, seguidas de recuperação que levam longos períodos de tempo, dependendo do conhecimento adquirido em pesquisas e da capacidade técnica (FLEGEL, 2019).
Tabela 01- Variáveis zootécnicas e tempo de cultivo dos viveiros V11, V12 e V13 do camarão Litopenaeus vannamei cultivado em sistema semi-intensivo de baixa salinidade de abril a outubro de 2019, no estdo do RN.
V11 V12 V13 CICLO I CICLO II CICLO I CICLO II CICLO I CICLO II
Tempo de cultivo (dias) 89 64 84 75 87 72
Densidade (Camarão/m²) 30 22 16 33 16,5 33
Peso médio Final (g) 22 9 12 9,2 11,5 11,5
Fator de conversão alimentar
(FCA) 0,84 0,7 0,62 0,96 0,78 0,74
Sobrevivência (%) 43,4 60 84 26,7 69 33
Produtividade (kg/ha) 1.875,88 1035 1600 803,94 1429 1210
Através das análises de vibrios e presuntivas, todos os viveiros apresentaram indicativo de vibriose segundo a metodologia de Cuéllar-Anjel (2013) e Lightner (1996) (Anexo I, II, e III). Durante os cultivos, quando a contagem de vibrios sacarose negativa se aproximava ou ultrapassava o intervalo de 104 UFC/g era observado,
além dos sinais clínicos confirmados em análise presuntiva, mortalidade e garças ao redor dos viveiros. Em seguida aplicavam-se medidas de manejo para sanar o problema. Os intervalos mínimos e máximos de UFC sacarose negativa nas amostras de camarão nos Ciclos I e II foram de valores abaixo do limite da técnica empregada, para os mínimos e 1,25x104 UFC/g, e 2x105 UFC/g, respectivamente. Para Cuéllar-Anjel (2013) a
contagem de UFC sacarose negativa em L. vannamei considerado normal é de até 10³ UFC/g, e o considerado fator de risco são entre 104 e 105 UFC/g.
Não existe legislação específica com padrões microbiológicos do pescado e de produtos derivados de pescado que limitem a quantidade mínima presente de vibrios nesse alimento, tanto para consumo humano, quanto para controle de doença. Com exceção do V. parahaemolyticus onde a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na Resolução N°12 de 02 de janeiro de 2001, resolução no item 22, estabelece um limite de 10³ UFC/g de V. parahaemolyticus/g para pratos prontos para o consumo a base de pescado (Brasil, 2001).
Foram identificadas em todos os viveiros e ciclos as bactérias Sacarose positiva V. cholera e V. alginolyticus, e as bactérias Sacarose negativa V. parahaemolyticus e V. vulnificus. Corroborando com o
29 mencionado por Morales-Covarrubias et al., (2019) que a maior prevalência de doença bacteriana em camarões de cultivo da América Latina é Vibriose associada as bactérias V. harveyi, V. parahaemolyticus e V. alginolyticus. Porém, as bactérias do gênero Vibrio, principalmente do clado Harveyi (família Vibrionaceae, Gammaproteobacteria), possuem características intimamente próximas e só podem ser melhores identificadas através sequenciamento genômico (HOFFMANN et al., 2012; URBANCZYK et al., 2013).
O Vibrio harveyi foi um dos primeiros e mais frequentemente identificado como culpado das Vibrioses, depois vieram o V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, e outros. O camarão juvenil, pré-adultos ou adultos afetados por Vibriose, pode apresentar diferentes sinais clínicos de acordo com o grau de gravidade da infecção; estes podem incluir letargia, natação irregular, perda do reflexo de fuga, natação em direção às margens do lago, anorexia, intestino vazio, coloração avermelhada, urópodes vermelhos, edema nos urópodes, opacidade do músculo intestinal, perfurações do exoesqueleto, melanização da cutícula ou apêndices vermelhos, luminescência, dificuldade no crescimento, má alimentação e baixa sobrevivência (CUÉLLAR-ANJEL, 2013; MURATI et al., 2014).
Nos ciclos de produção acompanhados, verifica-se que as seguintes variáveis: Preenchimento dos túbulos do hepatopâncreas (P1), cor de urópodes (P4) e Black spot (P5) em amostras de camarão; e Sacarose positiva, negativa e totais em amostras de água, não apresentaram diferença significativa (Tabela 02).
TABELA 02- Valores médios e desvios padrão das variáveis analisadas em amostras de água de cultivo e do camarão L. vannamei, em dois ciclos de produção, cultivado em três viveiros (V11, V12 e V13) em sistema semi-intensivo de baixa salinidade de abril a outubro de 2019, no estdo do RN.
Variável Ciclo I Ciclo II Valor de p*
Camarão
Sacarose+ (UFC/g) 3015,5 ± 1657,04 957,47 ± 760,38 0.049
Sacarose - (UFC/g) 2109,3 ± 563,63 1498,63 ± 1339,37 0.023 Sacarose totais (UFC/g) 5124,5 ± 1716,24 2367,94 ± 2020,03 < 0,001 Preench. dos Túbulos do Hepato (P1) 3,61 ± 0,081 3,71 ± 0,09 0,4118 Necrose no hepato (P2) 0,045 ± 0,035 0,52 ± 0,15 < 0,001 Deposição de cálcio (P3) 0,36 ± 0,084 0,71 ± 0,11 0,013 Cor do urópodes (P4) 3,54 ± 0,19 3,33 ± 0,19 0,3932 Black spot (P5) 0,066 ± 0,046 0,09 ± 0,049 0,7224 Água Sacarose+ (UFC/m L) 359,49 ± 97,67 5387,24 ± 1257,98 0.648 Sacarose - (UFC/m L) 450,38 ± 243,26 18941 ± 7090,55 0.869 Sacarose totais (UFC/m L) 798,01 ± 298,74 24328 ± 7045,11 0.583
Temperatura (°C) 28,47 ± 0,23 27,48 ± 0,12 < 0,001
pH 8,8 ±0,062 9,25 ± 0,09 < 0,001
O2 (mg/L) 6,8 ± 0,2 8,19 ± 0,16 < 0,001
30 *Valor de da probabilidade observado pelo Teste F.
Foi verificado uma tendência de aumento para as variáveis salinidade e pH. As variações de salinidade, temperatura da água, pH e Oxigênio Dissolvido se encontram na TABELA 02. Apenas a salinidade estava em desacordo com os parâmetros ótimos para o cultivo do L. vannamei que é de 14,7 a 31,2 g/L, associadas a temperaturas maiores que 26°C com a faixa preferencial termal de 27 a 30 °C, porém essa espécie possui habilidade de tolerar larga variação de salinidade (0,5 a 40 g/L), obtendo bons desempenhos do animal. A faixa ideal do pH para cultivo de L. vannamei varia entre 8,1 e 9,0 (HERNÁDEZ; NUNES, 2001) e a norma inicial para a concentração mínima de oxigênio na carcinicultura é 3 mg/L, com uma meta de 4mg/L (BOYD, 2002).
Para os parâmetros físico-químicos da água: temperatura, pH, oxigênio dissolvido (O2) e salinidade, relacionados as amostras de água e camarão, no Ciclo I (Tabela 03), verificou-se que apenas a temperatura apresentou uma relação positiva significativa com o crescimento das bactérias Sacarose positivas e Sacarose negativas. Por esse motivo, à medida que se elevou a temperatura da água dos viveiros, ocorreu aumento de crescimento dos Vibrios. Segundo Hervio-Heath et al., (2002) os vibrios dependem da temperatura do meio, como são bactérias mesófilas sua temperatura ótima para o seu desenvolvimento está entre 20 e 30°C), estando de acordo com a temperatura média do presente trabalho (28,47°C para o ciclo I e 27,47°C no ciclo II). Randa et al. (2004) também observaram uma correlação positiva entre a população de Vibrios e a temperatura da água nos Estados Unidos, sugerindo que a maior incidência dessa espécie ocorreu nos meses com temperaturas mais elevadas. Assim como Thompson et al. (2004), afirmam que a temperatura foi um fator fundamental para ocorrência de víbrios na água, pois detectaram que a população de víbrio aumentou nos meses onde as temperaturas alcançaram 30°C.
TABELA 03- Valores da correlação entre as bactérias do gênero Vibrio, Sacarose positiva (Sacarose+) e Sacarose negativa (Sacarose-), encontradas nas amostras de camarão e água de cultivo do camarão L. vannamei, em dois ciclos de produção com os parâmetro da água temperatura, pH, oxigênio (O2) e salinidade (Sal).
CICLO I CICLO II
Variáveis Temp pH O2 Sal Temp pH O2 Sal
ÁGUA Sacarose + 0,35* 0,10 -0,31 -0,28 -0,10 -0,14 -0,04 -0,16 Sacarose - 0,33* 0,15 -0,18 -0,15 0,18 0,50* -0,27 -0,32 Sacaroses Totais 0,36* 0,17 -0,27 -0,29 -0,10 0,06 -0,15 -0,05 CAMARÃO Sacarose + -0,06 0,19 -0,01 -0,07 0,21 0,12 -0,06 0,18 Sacarose - 0,25 -0,04 0,02 -0,19 0,19 0,53* -0,45* 0,26 Sacaroses Totais 0,22 -0,01 0,04 -0,27 0,20 0.53* 0,30 0,30 *Valor de p significativo quando P< 0,05
31 Já no segundo ciclo, foi verificado interação positiva entre o pH e o crescimento de Vibrio Sacarose negativa, tanto para amostras de água quanto para camarão. Por isso, quando maior o pH da água, maior a quantidades de bactérias Sacarose negativa. Para Vibrio spp. em geral, a faixa ideal de pH é de 8,0 a 8,8, mas a maioria das espécies de vibrio cresce entre pH 6,5 e 9,0, principalmente as V. parahaemolyticus, V. cholerae, V. vulnificus e V. alginolyticus (KAYSNER; DE PAOLA, 2004).
Sendo apurado também uma correlação negativa entre oxigênio dissolvido e as Sacaroses negativas do camarão, implicando que se ocorre diminuição do oxigênio na água, ocorrerá também aumento das bactérias Sacaroses negativas no camarão. Em nenhum dos cultivos do ciclo II o oxigênio dissolvido foi menor que 7mg/L, porém iniciou com valores acima de 9mg/L, estando dentro dos limites aceitáveis. Diminuições de oxigênio dissolvido no sistema ocasionam um estresse ao animal que o propicia a suscetibilidade aos vibrios oportunistas presentes em sua flora.
Para avaliar a relação entre as analises microbiológica do camarão com as presuntivas indicativas de vibrioses (P1, P2, P3, P4 e P5) (Tabela 04), foi verificado no ciclo I e II uma relação significativamente positiva entre necrose no hepatopâncreas e bactérias sacarose negativa. Então quanto maior o nível de necrose no hepatopâncreas dos camarões maior será a contagem de bactérias Sacarose negativa em amostras de camarão.
A necrose no hepatopâncreas dos camarões (Figura1c) é uma das sintomatologias causadas por presenças de vibrios sacarose negativa, os camarões que são acometidos por vibriose podem exibir lesões da infecção localizada do intestino ou hepatopâncreas e / ou septicemia geral (LIGHTNER, 1993; VENKATESWARA, 2015). Paxton et al., (2020) realizaram identificação genômica, em um surto de vibriose no Texas, no hepatopâncreas da espécie L. vannamei, e chegaram à conclusão que as bactérias sacarose negativas: V. Parahaemolyticus, V. Vulnificus, V. cholerae e V. Alginolyticus foram as causadoras do surto.
TABELA 04- Valores da correlação entre as bactérias do genêro Vibrio, Sacarose positiva (Sacarose+) e Sacarose negativa (Sacarose-), encontradas nas amostras de camarão L. vannamei, em dois ciclos de produção com os parâmetros da análise presuntiva.
CICLO I CICLO II Variáveis P1 P2 P3 P4 P5 P1 P2 P3 P4 P5 CAMARÃO Sacarose + -0,07 -0,02 -0,42* 0,01 0,07 -0,12 0,23 0,09 -0,41* 0,23 Sacarose - 0,04 0,44* -0,06 -0,08 0,37* 0,08 0,42* 0,23 0,15 0,39* Sacaroses Totais 0,02 -0,21 -0,37* 0,03 0,29 -0,07 0,32 0,22 -0,11 0,33
(P1) Preenchimento dos Túbulos do Hepatopâncreas, (P2) Necrose no hepatopâncreas, (P3) Deposição de cálcio, (P4) Cor do urópodes e (P5) Black spot.
