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Rastreamento de variantes genéticas em neoplasias mieloides familiares por sequenciamento do exoma

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Academic year: 2021

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MOISÉS ALVES FERREIRA FILHO

RASTREAMENTO DE VARIANTES GENÉTICAS EM

NEOPLASIAS MIELOIDES FAMILIARES POR

SEQUENCIAMENTO DO EXOMA

CAMPINAS-SP 2016

(2)

MOISÉS ALVES FERREIRA FILHO

RASTREAMENTO DE VARIANTES GENÉTICAS EM NEOPLASIAS

MIELOIDES FAMILIARES POR SEQUENCIAMENTO DO EXOMA

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Sara Teresinha Olalla Saad

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO

ALUNO MOISÉS ALVES FERREIRA FILHO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLALLA SAAD.

CAMPINAS-SP 2016

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BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

MOISÉS ALVES FERREIRA FILHO

ORIENTADORA: PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLALLA SAAD

MEMBROS:

1. Profa. Dra. Sara Teresinha Olalla Saad

2. Prof. Dr. Raony Guimaraes Correa do Carmo Lisboa Cardenas

3. Prof. Dr. Marcelo Mendes Brandao

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 29/01/2016

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Aos meus pais Paulina e Moisés, às minhas irmãs Talita e Mônica e ao querido sobrinho e afilhado Gabriel, dedico.

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AGRADECIMENTOS

 Aos meus queridos pais, Paulina Carvalho e Moisés Ferreira, pela incansável luta diária em favor das minhas formações humana e profissional. Por acompanharem e viverem comigo cada passo dessa empreitada. Às inúmeras mensagens de apoio e carinho durante o período em que estive a milhares de quilômetros de casa. À compreensão nas despedidas quando precisava retomar meus caminhos em Campinas.

 Às irmãs Talita Ferreira e Mônica Ferreira e ao sobrinho Gabriel Ferreira pelo amor dedicado a mim durante todo o período em que estive fora. Mais que família, vocês são para mim os meus melhores e eternos amigos!

 Especial e imensamente à Profa. Dra. Sara Saad, que me deu a oportunidade de ingressar na pós-graduação, pelo exemplo de mestre e dedicação ao ofício da pesquisa.

 Aos meus grandes e inestimáveis amigos de Teresina, Valdemar Morais, Ricardo Araújo, Ilara Paz, Viviane Ribeiro e Rodrigo Soares, ao provarem que a distância não é empecilho para a perpetuação das boas amizades. Obrigado pelas muitas risadas e pelo carinho.

 Ao Roberto Jossimar Vega, pelos ensinamentos, amizade e companheirismo no primeiro ano dessa jornada. Descobrimos que somos irmãos de países diferentes!

 À Dilmara, Clarisa Ramos e Graziele Pavan pela (ótima) acolhida e ensinamentos no laboratório que serviram de base a todo o conhecimento que adquiri até aqui. À Clarisa também pela amizade e apoio dentro e fora dos limites do laboratório.

 À Tereza Sueko pelo auxílio na viabilização dos insumos. Ao Rodrigo Naoto e à Susely Tada (LaCTAD - Unicamp) pela valiosa ajuda na execução da parte experimental desse projeto. Também ao Leandro Nascimento (LaCTAD) pelas análises em bioinformática.

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 Ao Murilo Borges pelos aconselhamentos em bioinformática, ao Roberto Zulli pelos auxílios em estatística e ao Fernando Marson, pelos conselhos em genética.

 À Dra. Paula Campos pelo auxílio no recrutamento dos dados clínicos dos pacientes desse projeto.

 Ao Dr. Marcelo Brandão, pela disponibilização da sua infraestrutura de análises em bioinformática e à Dra. Renata Dias (ESALQ/USP) pelas predições de estruturas terciárias e interações proteicas.

 Aos amigos da Unicamp e dos laboratórios do Hemocentro: Irene Santos, Gilson Santos, Angélica Silveira, David Anzaldo, Fernando Marson, Cristiane Silva, Natália Mota e Daniela Ribeiro pelo companheirismo e por tornarem tudo mais divertido.

 Aos pacientes, pela compreensão e disponibilidade em participarem desse estudo. Por compartilharem das suas dores e esperanças com a nossa equipe.

 Ao CNPq pela bolsa de pós-graduação e à FAPESP pelos recursos financeiros fornecidos ao desenvolvimento deste trabalho.

 A todos que depositaram em mim orações e votos de bem-aventuranças no decorrer desse percurso.

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“Um homem precisa viajar. Por sua conta, não por meio de histórias, imagens, livros ou TV. Precisa viajar por si, com seus olhos e pés, para entender o que é seu. Para um dia plantar as suas próprias árvores e dar-lhes valor. Conhecer o frio para desfrutar o calor. E o oposto. Sentir a distância e o desabrigo para estar bem sob o próprio teto. Um homem precisa viajar para lugares que não conhece para quebrar essa arrogância que nos faz ver o mundo como o imaginamos, e não simplesmente como é ou pode ser. Que nos faz professores e doutores do que não vimos, quando deveríamos ser alunos, e simplesmente ir ver”.

Amyr Klink (Mar sem fim, Companhia das Letras, 2000)

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RESUMO

Até recentemente, as alterações genéticas relacionadas à patogênese das síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas e leucemia mieloide aguda eram em grande parte desconhecidas. A introdução das tecnologias de sequenciamento de nova geração na investigação dessas doenças tem fornecido valiosas contribuições na identificação de novos biomarcadores moleculares, no estabelecimento de classificações de risco mais precisas, acompanhamento da evolução clonal das células neoplásicas e seleção de intervenções terapêuticas mais específicas. Este trabalho teve como objetivo identificar, por meio de sequenciamento do exoma, variantes genéticas específicas em casos de neoplasias mieloides com apresentação atípica ou com mais de uma ocorrência na mesma família. Pacientes de três diferentes famílias foram selecionados para o estudo: no caso 1, duas irmãs com mielofibrose primária e histórico de exposição de longa data a agrotóxicos do tipo DDT; no caso 2, uma paciente diagnosticada aos 21 anos de idade com síndrome mielodisplásica (SMD – CRMD), doença esta com idade média de apresentação aos 70 anos de idade; e no caso 3, um pai com SMD de alto risco prognóstico e dois filhos com trombocitopenia periférica e atipias celulares na medula óssea.

Para a pesquisa de variantes nesses pacientes, procedeu-se ao sequenciamento completo do exoma na modalidade estrito, em plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc.), de amostras de DNA provenientes de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (CD34+) e células de linhagem germinativa do sangue periférico (linfócitos T CD3+). As análises em bioinformática dos dados do sequenciamento foram conduzidas segundo protocolo estabelecido pelo LaCTAD – Unicamp, com o auxílio das seguintes ferramentas: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK e ANNOVAR. Tais programas foram aplicados, respectivamente, na filtragem das leituras por qualidade, alinhamento das leituras, remoção de duplicatas dos resultados de alinhamento, identificação e anotação de variantes. As variantes anotadas em conjuntos de genes implicados direta ou indiretamente na patogênese das doenças neoplásicas mieloides foram filtradas de acordo com a sua localização no genoma e com os valores de cobertura atingidos. Após as filtragens, as variantes remanescentes foram avaliadas quanto ao potencial deletério por meio do programa SIFT e quanto à patogenicidade pelo software

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PolyPhen2 e selecionadas para investigação futura de acordo com critérios de patogenicidade e baixa frequência em todas as populações combinadas (global minor allele frequency < 1%).

No caso 1, filtragens em genes implicados na patogênese das neoplasias mieloides identificaram as variantes GATA1 Thr263Met na medula óssea (MO) e no sangue periférico (SP) de ambas as pacientes (III-2 e III-3) e JAK3 Val718Leu na medula óssea da irmã mais jovem (III-3). Foram identificadas ainda três variantes em genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop e CYP2B6 Thr67Met. A alteração em GATA1, particularmente, não contém registro em bancos de dados de variantes até o momento. Por isso, predições moleculares da proteína GATA1 foram conduzidas e demonstraram que a treonina (T263) afetada pela inserção da variante está localizada no domínio dedo de zinco C-terminal e, portanto, em região funcional e altamente conservada dessa proteína.

No caso 2, três variantes obedeceram aos critérios de seleção para investigação futura: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala e FANCB Gly335Glu (neste último, GMAF = 3,66%), todas presentes na MO e SP da paciente II-1, o que sugere que estas alterações tenham sido herdadas. Essas três variantes foram detectadas em três genes distintos que têm em comum função de reparo de danos ao DNA, de modo que mutações neles localizadas podem estar relacionadas a um risco aumentado para SMD e outros distúrbios mieloides. No caso 3, apenas duas variantes foram selecionadas para validação: ATM Ser333Phe, presente na MO e SP dos três pacientes sequenciados e PAPD5 Val572insSer (ou Val525insSer), na MO do pai (I-2) e do filho mais jovem (II-3) e no SP do pai. Tais resultados apontam que apenas a ATM Ser333Phe foi herdada nos pacientes avaliados do caso 3.

Todas as variantes selecionadas serão validadas por meio de testes como sequenciamento de Sanger e estudos funcionais. Estudos de ligação familiar (linkage) nos demais indivíduos das famílias contempladas por este estudo também serão conduzidos.

(11)

ABSTRACT

Until recently, the genetic changes related to the pathogenesis of myelodysplastic syndromes, myeloproliferative neoplasms and acute myeloid leukemia were largely unknown. The introduction of next generation sequencing technologies in research of these diseases has provided valuable contributions on the identification of new molecular biomarkers, establishing more accurate risk ratings, the monitoring clonal evolution of cancer cells and selection of more specific therapeutic interventions. This study aimed to identify, through exome sequencing, specific genetic variants in cases of myeloid neoplasms with atypical or with more than one occurrence in the same family. Patients from three different families were selected for the study: in the case one, two sisters with primary myelofibrosis and history of longtime exposure to pesticides DDT type; in the case 2, one patient diagnosed at 21 years old with myelodysplastic syndrome (MDS - RCMD), a disease whose average age of presentation is 70 years old; and in case 3, a father with SMD high risk prognosis and two brothers with peripheral thrombocytopenia and atypical cells in the bone marrow.

To investigate the variations in these patients, we proceeded to complete sequencing of the exome in strict mode at HiSeq 2500 platform (Illumina, Inc.) from DNA samples of hematopoietic stem cells from bone marrow (CD34 +) and germline cells from peripheral blood (CD3 + lymphocytes). The bioinformatics analysis of sequence data were conducted according to the protocol established by LaCTAD - Unicamp, with the help of the following tools: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK and ANNOVAR. Such programs were applied, respectively, for the filtering of reads by quality, alignment of the reads, removal of duplicates from alignment results, identification and annotation of variants. The variants annotated in groups of genes involved directly or indirectly in the pathogenesis of myeloid neoplasms were filtered according to their location in the genome and the achieved coverage values. After filtering, the remaining variants were evaluated as to their deleterious potential by SIFT and to the pathogenicity by PolyPhen2 software and selected for further investigation in accordance with pathogenicity criteria and low frequency in all the combined populations (global minor allele frequency <1%).

(12)

In the case 1, filterings of genes implicated in the pathogenesis of myeloid neoplasms identified the GATA1 Thr263Met variant in bone marrow and peripheral blood of both patients (III-2 and III-3) and JAK3 Val718Leu in the bone marrow of the younger sister (III-3). They also identified three variants in genes encoding drug-metabolizing enzymes: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop and CYP2B6 Thr67Met. The change in GATA1, particularly, contains no record in variants of databases to date. Therefore, GATA1 molecular predictions of protein were conducted and showed that Threonine (T263) affected by the insertion of the variant is located in the C-terminal zinc finger domain and therefore, in functional and highly conserved region of this protein.

In the case 2, three variants comply with the selection criteria for future research: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala and FANCB Gly335Glu (in the latter, GMAF = 3.66%), all present in BM and PB of the patient II-1, which suggests that these changes have been inherited. These three variants were detected in three different genes that have a common function in the repair of DNA damage, so that mutations located there can be associated with an increased risk of MDS and other myeloid disorders. In the case 3, only two variants were selected for validation: ATM Ser333Phe present in BM and PB of the three sequenced patients and PAPD5 Val572insSer (or Val525insSer), the father MO (I-2) and younger son (II-3) and the parent SP. These results indicate that the only ATM Ser333Phe was inherited in the evaluated patients of the case 3.

All selected variants will be validated through testing as Sanger sequencing and functional studies. Family linkage studies in other individuals of families covered by this study will also be conducted.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMKL Acute megakaryoblastic leucemia (leucemia megacarioblástica aguda) COSMIC Catalogue of Somatic Mutations in Cancer

DDT Diclorodifeniltricloroetano

DNA Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)

FACS Fluorescence-activated cell sorting (separação de células ativada por fluorescência)

FISH Fluorescent in-situ hybridization (hibridização fluorescente in-situ) GATA1 Globin transcription factor 1

GMAF Global minor allele frequency

HLA Human leukocyte antigen (sistema antígeno leucocitário humano) IPSS International Prognostic Scoring System for Evaluating Prognosis in

Myelodysplastic Syndromes JAK2 Janus kinase 2 (Janus quinase 2) LMA Leucemia mieloide aguda LMC Leucemia mieloide crônica

MAPK Mitogen activated protein kinase (proteinoquinase ativada por mitógenos) MFP Mielofibrose primária

MO Medula óssea

NMP Neoplasias mieloproliferativas OMS Organização Mundial de Saúde

PI3K Phosphotidylinositol 3-kinase (fosfatidilinositol 3-quinase)

PV Policitemia vera

RNA Ácido ribonucleico

SIFT Sorting Intolerant from Tolerant (web server) SMD Síndromes mielodisplásicas

SMD/NMP Síndrome mieloproliferativa/ mielodisplásica

SNP Single nucleotide polymorphism (polimorfismo de nucleotídeo único)

SP Sangue periférico

STAT Signal transducers and activators of transcription (transdutores de sinal e ativadores de transcrição)

TE Trombocitemia essencial

TMD Transient myeloproliferative disorder (doença mieloproliferativa transitória) TMO Transplante de medula óssea

(14)

VCF Variant call format (formato de chamada de variante)

WES Whole exome sequencing (sequenciamento completo do exoma) WGS Whole genome sequencing (sequenciamento completo do genoma)

(15)

SUMÁRIO

PÁG

INTRODUÇÃO 17

Neoplasias Mieloproliferativas 17

Síndromes Mielodisplásicas e Leucemias Mieloides Agudas 18

Mutações Recorrentes em Neoplasias Mieloides 19

Patogênese Genética e Molecular das Neoplasias Mieloproliferativas 20 Alterações Genéticas em Síndromes Mielodisplásicas e Leucemias

Mieloides Agudas

22

Sequenciamento de Nova Geração 23

Exoma 25

Sequenciamento do Exoma em Neoplasias Mieloides 26

OBJETIVOS 28

Objetivo Geral 28

Objetivos Específicos 28

CASUÍSTICA E MÉTODOS 29

Casuística 29

Coleta das Amostras e Separação de Células 38

Extração e Controle de Qualidade do DNA de Partida 39

Preparo de Bibliotecas de DNA para Sequenciamento do Exoma 43

Sequenciamento 47

Análises em Bioinformática 47

Seleção de Variantes para Validação e Investigação Futuras 54 Predição da Estrutura Terciária da Proteína GATA1 após Inserção da

Variante T263M

54

RESULTADOS 56

Dados Gerais do Sequenciamento 56

Variantes Identificadas no Caso 1 58

Variantes Identificadas no Caso 2 62

Variantes Identificadas no Caso 3 67

(16)

DISCUSSÃO 78

Variantes Identificadas no Caso 1 79

Variantes Identificadas no Caso 2 82

Variantes Identificadas no Caso 3 83

CONCLUSÕES 85

REFERÊNCIAS 86

APÊNDICES 101

ANEXO I - Parecer Final do Comitê de Ética em Pesquisa 104

ANEXO II - TCLE para participantes com neoplasia mieloide 110

ANEXO III - TCLE para participantes sadios 113

(17)

INTRODUÇÃO

As neoplasias mieloides são doenças clonais de células-tronco hematopoiéticas ou de células progenitoras hematopoiéticas que resultam de alterações genéticas e epigenéticas que perturbam os processos-chave de autorrenovação, proliferação e diferenciação celulares [1, 2]. Compreendem tanto doenças de fase crônica, a exemplo das neoplasias mieloproliferativas (NMP) e síndromes mielodisplásicas (SMD), como aquelas de estágio agudo, isto é, as leucemias mieloides agudas (LMA) [3]. Ao longo dos anos, a investigação genética dessas doenças revelou consideráveis desafios para a compreensão da sua patogênese, incluindo o fato de que são raramente hereditárias [4].

Os primeiros sistemas de classificação para as neoplasias mieloides resultaram da identificação e caracterização de translocações cromossômicas recorrentes por clonagem e sua associação com fenótipos clínicos específicos [5]. Estudos recentes têm demonstrado que as desordens clonais nessas doenças provêm de mutações somáticas adquiridas em diferentes estágios da hierarquia hematopoiética [6]. Com a elucidação e publicação da sequência inicial do genoma humano em 2001 [7, 8], o desenvolvimento e aplicação de tecnologias de sequenciamento massivo do DNA vêm permitindo identificar alterações genéticas até há pouco tempo desconhecidas nessas neoplasias, o que tem favorecido um refinamento do diagnóstico, melhores estratificações de risco, o acompanhamento da evolução clonal da doença e um aprimoramento das intervenções terapêuticas [9, 10].

Neoplasias Mieloproliferativas

As neoplasias mieloproliferativas (NMP) compreendem um grupo de doenças hematopoiéticas clonais caracterizado pela expansão de uma ou mais das linhagens mieloides (granulocítica, eritrocítica, megacariocítica ou mastocítica), que resulta em hipercelularidade da medula óssea com maturação hematopoiética eficaz e aumento na contagem de granulócitos, eritrócitos e ou plaquetas no sangue periférico [11]. São predominantemente neoplasias de adultos, cujo pico de frequência ocorre entre a quinta e a sétima década de vida, embora também

(18)

possam ser diagnosticadas em indivíduos jovens, particularmente se houver predisposição familiar [12].

Apesar de demonstrarem um início insidioso, as NMP têm potencial de progredir gradualmente até culminar em insuficiência da medula óssea, que pode ser devida à mielofibrose, hematopoiese ineficaz ou transformação para uma fase blástica aguda (transformação leucêmica) [11]. As manifestações clínicas comuns incluem esplenomegalia devido à hematopoiese extramedular, predisposição a eventos trombohemorrágicos e complicações vasculares, caquexia, perda de peso e sintomas constitucionais [13]. Historicamente, as opções de tratamento têm sido limitadas e focadas principalmente em terapias paliativo-sintomáticas e na prevenção da disfunção orgânica [13].

A quarta edição da classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) para os tumores de tecidos hematopoiético e linfoide inclui oito entidades clínico-patológicas sob a categoria de neoplasias mieloproliferativas: leucemia mieloide crônica (LMC) BCR-ABL1 positiva, policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE), mielofibrose primária (MFP), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica crônica, mastocitose e neoplasias mieloproliferativas não-classificáveis [11].

Síndromes Mielodisplásicas e Leucemias Mieloides Agudas

Anormalidades genéticas adquiridas somaticamente levam às principais características que definem as síndromes mielodisplásicas (SMD): alterações displásicas na medula óssea, hematopoiese ineficaz que resulta em citopenias periféricas e risco aumentado de progressão para leucemia mieloide aguda [14]. Com uma idade média de apresentação entre 70 e 75 anos, a incidência de SMD nos EUA e em outros países ocidentais aumenta à medida que a população envelhece [15]. As SMD mostram heterogeneidade clínica impressionante, desde as condições indolentes com uma expectativa de vida quase normal a formas que se aproximam da leucemia mieloide aguda [16]. Em 2008, a OMS, baseada na classificação Franco-Americana-Britânica (FAB) de 1982, subdivide essas síndromes em oito subtipos (que não serão detalhados neste trabalho) de acordo com a percentagem de blastos, sideroblastos em anel e número de linhagens de células displásicas na medula óssea [11].

O prognóstico dos pacientes com SMD é muito heterogêneo e, portanto, torna-se necessária a utilização de sistemas de prognósticos que permitam a estratificação de risco e auxiliem na escolha da terapia [17]. Nas duas últimas décadas, o sistema prognóstico mais

(19)

comumente utilizado em SMD foi o IPSS (International Prognostic Scoring System for Evaluating Prognosis in Myelodysplastic Syndromes), estabelecido em 1997 [18] e substituído pela sua revisão atualizada, o R-IPSS, em 2012 [19]. Ambos adotam escores prognósticos (ou pontuações) baseados na análise de citopenias periféricas, percentagem de blastos na medula óssea e características citogenéticas [17].

Nas leucemias mieloides agudas (LMA), por sua vez, ocorre alta taxa de proliferação de células imaturas que resultam da transformação clonal de precursores hematopoiéticos através da aquisição de rearranjos cromossômicos e múltiplas mutações genéticas [20]. De acordo com a American Cancer Society[21], a LMA é considerada o segundo tipo mais comum de leucemia, de modo que sua taxa de incidência corresponde a 3,6 por 100mil, com cerca de 13.000 novos casos diagnosticados anualmente nos Estados Unidos [22]. É mais comum no sexo masculino e representa 90% dos casos de leucemia aguda no adulto, com idade média ao diagnóstico de 67 anos [23]. Normalmente, os pacientes apresentam sinais e sintomas de fadiga, hemorragia, infecções e febre devido à diminuição da quantidade de células vermelhas, plaquetas ou glóbulos brancos, respectivamente [24].

Mutações Recorrentes em Neoplasias Mieloides

São diversos os genes implicados na fisiopatologia das neoplasias mieloides (NMP, SMD e LMA), de modo que podem ser agrupados em seis categorias funcionais bem definidas (Figura 1): (I) genes que codificam fatores de sinalização celular, (II) fatores de transcrição, (III) genes que atuam como fatores de splicing do RNA (isto é, a formação de um transcrito maduro derivado dos éxons), (IV) reguladores epigenéticos, (V) genes que codificam componentes do complexo coesina e (VI) genes que codificam proteínas que atuam na regulação do ciclo celular [10].

Várias das mutações nesses genes servem como biomarcadores nessas neoplasias. A estreita associação de lesões genéticas somáticas específicas com fenótipos clínicos e hematológicos deve estimular grandes avanços no diagnóstico e categorização das doenças malignas mieloides [25].

(20)

Figura 1. Categorias funcionais de genes afetados por mutações recorrentes em neoplasias mieloides (NMP, SMD e LMA) [10]. Reprinted from Matynia AP, Szankasi P, Shen W, Kelley TW.

Molecular genetic biomarkers in myeloid malignancies. Arch Pathol Lab Med. 2015;139(5):594-601 with permission from Archives of Pathology & Laboratory Medicine. Copyright 2015 College of American Pathologists.

Patogênese

Genética

e

Molecular

das

Neoplasias

Mieloproliferativas

O cenário genético da maioria das neoplasias mieloproliferativas é complexo e a sua plena compreensão ainda é incipiente (o que não é o caso da LMC), embora notável progresso na elucidação de novas mutações implicadas nas NMP BCR-ABL1 negativas tenha ocorrido a partir de 2005 [26, 27].

A fisiopatologia da LMC se baseia na presença do cromossomo Philadelphia (Ph), detectado em 90 a 95% dos casos de LMC ao diagnóstico. O cromossomo Ph resulta de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 [28], mais precisamente descrita como translocação t(9;22)(q34;q11) ou rearranjo molecular dos genes BCR e ABL1 [29]. A consequência molecular dessa translocação t(9;22) é a criação da proteína de fusão

Neoplasias

mieloides

FLT3 KIT JAK2 MPL KRAS/NRAS PTPN11 NF1 CSF3R CEBPA RUNX1 GATA1/GATA2 PHF6 ETV6 SF3B1 SRSF2 ZRSR2 U2AF1 DNMT3A TET2 IDH1/IDH2 ASXL-1 EZH2 STAG2 SMC1A SMC3 RAD21 TP53 NPM1 Sinalização celular Fatores de transcrição Fatores de splicing do RNA Reguladores epigenéticos Componentes do complexo coesina Reguladores do ciclo celular

(21)

BCR-ABL, uma tirosina quinase citoplasmática constitutivamente ativa responsável pela ativação de várias vias de transdução de sinal [30]. Três mecanismos principais estão implicados na transformação maligna promovida por essa proteína quimérica na LMC: adesão diminuída das células leucêmicas progenitoras às células do estroma da medula óssea e da matriz extracelular, ativação constitutiva de vias de sinalização mitogênicas (por ex., JAK-STAT, MAPK, PI3K e MYC) e inibição da apoptose [31].

A policitemia vera (PV), a trombocitemia essencial (TE) e a mielofibrose primária (MFP) constituem as neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1 negativas, devido à ausência dessa proteína de fusão, e são caracterizadas pela presença de mutações mutuamente exclusivas nos genes JAK2 (Janus quinase 2), CALR (calreticulina) e MPL (myeloproliferative leukemia virus) [32].

Esse subgrupo das NMP compartilha uma alta incidência da mutação pontual adquirida V617F no gene JAK2 (JAK2V617F). Essa alteração ocorre em aproximadamente 96% dos pacientes com policitemia vera, 55% das trombocitemias essenciais e 65% dos casos de mielofibrose primária [33], mas é também encontrada em alguns pacientes com síndrome mieloproliferativa/mielodisplásica e, raramente, na leucemia mieloide aguda primária, SMD ou LMC [34-37]. As neoplasias mieloproliferativas JAK2V617F-positivas foram associadas à idade avançada ao diagnóstico (TE e MFP), níveis mais elevados de hemoglobina (TE e MFP), leucocitose (TE e MFP) e menor contagem de plaquetas (TE) [38].

A mutação JAK2V617F foi descoberta em 2004 e seus primeiros relatos surgiram no início do ano de 2005 [39-42], representando um novo e promissor alvo terapêutico para o tratamento das neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1 negativas. A JAK2V617F é uma variante de nucleotídeo único localizada no éxon 14 do gene JAK2 que resulta da troca de uma guanina por uma timina na posição 1849 e leva à substituição de uma valina por uma fenilalanina no códon 617, dentro do domínio não catalítico pseudoquinase (JH2) da JAK2 quinase, uma tirosinoquinase citoplasmática constitutivamente ativa que transduz sinais mediados por citocinas através da via JAK-STAT, importante na proliferação hematopoiética [43]. Essa mutação resulta em uma JAK2 citoplasmática constitutivamente ativa que incita vias de sinalização (STAT, MAPK e PI3K) para promover a transformação e proliferação de progenitores hematopoiéticos [44].

Mutações nos genes CALR e MLP são específicas para casos de trombocitemia essencial e mielofibrose primária que não apresentam JAK2 mutado [45]. Inserções e deleções no éxon 9 do gene CALR representam o segundo tipo de mutação mais frequente em TE (15-32%) e MFP (25-35%), enquanto mutações no gene MPL (éxon 10) ocorrem com frequência

(22)

mutacional de 4% em TE e ~ 8% em MFP [33, 46-49]. Por sua vez, aproximadamente 10 a 15% dos pacientes com TE ou MFP não expressam mutação em JAK2, CALR ou MLP e, por isso, são referidos como “triplo negativos” [45]. Estas mutações podem ser acompanhadas de outras mutações que são menos específicas para neoplasias mieloproliferativas, mas que são prognosticamente relevantes, tais como em ASXL1 (Additional Sex Combs-Like 1) [32].

Outras mutações relevantes em NMP incluem alterações nos genes TET2 (TET oncogene family member 2) (em diversos éxons), CBL (Casitas B-lineage lymphoma protooncogene) (éxons 8 e 9), IDH1 (Isocitrate dehydrogenase) (éxon 4), IDH2 (éxon 4) e IKZF1 (IKAROS family zinc finger 1) (deleções de vários éxons) [50].

Alterações Genéticas em Síndromes Mielodisplásicas e Leucemias

Mieloides Agudas

O cariótipo é um dos mais importantes critérios para a classificação das SMD, uma vez que aproximadamente 50% dos pacientes demonstram anormalidades cromossômicas clonais [51]. As alterações cromossômicas mais comuns são a perda de 5q (5q-), perda de 7 ou 7q (-7 ou 7q-), trissomia do 8 (+8), a perda de 20q (20q-) e perda do Y (-Y).Além das alterações citogenéticas, outras lesões genéticas conhecidas em SMD incluem as alterações no número de cópias (amplificações genéticas ou deleções), as mutações que alteram a sequência ou a expressão de genes individuais e as anormalidades epigenéticas [52].

Durante os últimos 12 anos, o conhecimento sobre a patogênese molecular das SMD tem aumentado dramaticamente, principalmente através da identificação das principais vias funcionais afetadas por mutações somáticas recorrentes nessas neoplasias [53]. Tais mutações ocorrem não somente em vias previamente bem definidas (vias de transdução de sinais e fatores de transcrição), mas também em vias recém-identificadas, o que inclui genes reguladores epigenéticos, tais como TET2, IDH1/2, DNMT3A, ASXL1 e EZH2, além de vários componentes da maquinaria de splicing do RNA (SF3B1, U2AF1, SRSF2 e ZRSR2) [53, 54] (Figura 1).

Um estudo realizado com 944 pacientes com SMD revelou que 89,5% continham pelo menos uma mutação (mediana de três mutações por paciente), quarenta e sete genes mostraram-se significativamente mutados e os genes TET2, SF3B1, ASXL1, SRSF2, DNMT3A e RUNX1 sofreram mutação em mais de 10% dos casos [53].

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Citogeneticamente, as LMAs podem ser classificadas em grupos de risco prognóstico favorável, intermediário ou desfavorável de acordo com o seu cariótipo [55].Nas LMAs com citogenética normal (LMA-CN), alterações nos genes FLT3, NPM1 e CEBPA tornaram-se importantes fatores prognósticos e, de acordo com a 4ª edição da classificação dos tumores de tecidos hematopoiético e linfoide da OMS [11], devem ser usadas para estratificar o risco nesse subgrupo. As mutações predominantemente detectadas no gene FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3) são dos tipos pontuais no domínio quinase (TKD) ou duplicações internas em tandem no domínio justamembrana (ITD) [56]. A mutação FLT3-TKD é encontrada em 6-10% dos pacientes com LMA e mostra-se mais prevalente nos pacientes com LMA-CN, no entanto, ainda não foi confirmada como um marcador de prognóstico [23]. A FLT3-ITD ocorre em 20-35% dos pacientes com LMA, confere um prognóstico desfavorável e está relacionada com a evolução de síndrome mielodisplásica para LMA secundária [57, 58].

Pacientes com mutação no gene NPM1 (nucleophosmin) e sem mutação FLT3-ITD são classificados em um grupo favorável e estão associados com um cariótipo normal [59]. A proteína multifuncional codificada pelo gene NPM1 liga-se a diversas outras proteínas e regula a função do gene TP53 em resposta a fatores de estresse celular [59]. Mutações no fator de transcrição CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein alpha) também são importantes preditores da evolução clínica em LMA. O CEBPA é um dos fatores de transcrição cruciais para o desenvolvimento celular mieloide e apenas duplas mutações nesse gene (dos tipos N- e C-terminais), mas não mutações únicas, estão associadas com um prognóstico favorável [60].

Sequenciamento de Nova Geração

Na última década, a eficiência na detecção de mutações somáticas foi incrementada de forma expressiva pelo uso de tecnologias de sequenciamento de nova geração (do inglês, next-generation sequencing ou NGS) [61]. Esse conjunto de metodologias tem em comum a capacidade de leitura massiva e simultânea de milhões de fragmentos-clone de DNA associada a poderosas ferramentas de paralelização, automação e informatização dos dados[62]. Além disso, proporcionam grande economia de tempo e custo por base sequenciada, alta cobertura de sequenciamento (isto é, capacidade de gerar várias leituras de um mesmo fragmento) e a possibilidade de análise detalhada da totalidade do genoma, do transcriptoma ou de suas frações [63].

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É provável que um dos principais impactos da revolução tecnológica provocada pelos métodos de NGS seja a elucidação dos mecanismos de patogênese do câncer, levando a melhorias no diagnóstico e à seleção de tratamentos mais assertivos. Graças a essas técnicas, tornou-se viável sequenciar os genes expressos (transcriptomas), éxons conhecidos (exomas) e genomas completos de amostras de câncer [64] (Figura 2).

Figura 2. Estratégias para sequenciamento de nova geração em câncer. O sequenciamento completo do genoma avalia o genoma inteiro e inclui tanto as regiões codificantes de genes como as regiões não codificantes. O sequenciamento completo do exoma utiliza iscas para capturar e hibridizar regiões correspondentes do genoma, com foco nas regiões codificantes; pode incluir todo o exoma (cerca de 20.000 genes) ou, como alternativa, pode se concentrar em um painel de genes (dezenas de genes ou mais). O sequenciamento à base de amplicons utiliza produtos de amplificação de PCR para isolar uma região menor para o sequenciamento. O RNA-Seq ou sequenciamento do transcriptoma avalia o RNA expresso e pode ser utilizado para medir a expressão gênica, variantes de splicing e detectar fusões de genes candidatos [65]. Número da licença: 3796541035639. Data da licença: 26 Jan 2016. Editor de conteúdo licenciado: Nature Publishing Group. Título: Implementing personalized cancer genomics in clinical trials.

Apesar dos inúmeros benefícios, os métodos de NGS têm suscitado alguns desafios de curto prazo na sua execução e análise, tais como a necessidade de boa infraestrutura para armazenamento e manutenção da volumosa quantidade de dados, protocolos robustos para a geração de bibliotecas de sequenciamento e ferramentas efetivas para a análise dos resultados [65, 66].Portanto, colaborações multidisciplinares são imprescindíveis para o sucesso dessa empreitada.

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Exoma

O genoma humano compreende aproximadamente 3 x 109 bases, constituído por sequências codificantes e não-codificantes. Cerca de 3 x 107 pares de base (1% ou 30Mb) do genoma são sequências codificantes, fração esta que define o exoma [67]. Menos que 10% da sequência completa do genoma é caracterizada e conhecimento clínico especialmente insuficiente é adquirido a partir do sequenciamento do genoma completo (whole-genome sequencing ou WGS) [68]. Por outro lado, estima-se que 85% das mutações causadoras de doenças estejam localizados em regiões codificantes e funcionais do genoma [69].

O sequenciamento completo do exoma (whole-exome sequencing ou WES) é uma aplicação do sequenciamento de nova geração para determinar variantes em todas as regiões codificantes de proteína (éxons) de genes conhecidos [67]. Fornece cobertura de mais de 95% dos éxons, tem demonstrado ser uma estratégia eficaz na identificação de mutações funcionais raras [70] e seu custo ainda é substancialmente menor que o sequenciamento completo do genoma (cerca de 5 vezes menor) [71]. Além disso, a análise dos dados provenientes de WES é mais simples que aquela gerada por WGS, a profundidade de cobertura das leituras é significativamente maior com uma melhora correspondente na qualidade dos dados [72].

A aplicação do método de WES no estudo de doenças humanas apresenta alguns vieses que ainda não foram contornados, a saber:

 O conhecimento atual sobre todos os éxons codificantes de proteínas do genoma humano ainda está incompleto, o que implica dizer que as sondas de captura disponíveis só podem atingir os éxons que foram identificados até o momento;

 A eficiência de captura das sondas que hibridizam em regiões exônicas varia consideravelmente e, por isso, algumas regiões-alvo são insatisfatoriamente atingidas;

 Nem todos os fragmentos são sequenciados com a mesma eficiência. Consequentemente, nem todas as leituras (reads) conseguem ser alinhadas ao genoma de referência de modo a permitir a interrogação das bases [73];  O sequenciamento do exoma (especialmente na modalidade estrito) não

contempla satisfatoriamente variantes com potencial patogênico em regiões do DNA que fazem referência a RNA noncoding de íntrons, regiões intergênicas e intrônicas e regiões UTR 3’ e 5’.

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Sequenciamento do Exoma em Neoplasias Mieloides

Quantidade substancial dos pacientes com neoplasias mieloides carece de anormalidades genéticas específicas que tenham significância prognóstica. Além disso, há uma heterogeneidade significativa nos resultados para os pacientes individuais dentro de cada grupo de risco. O estudo dessas doenças por sequenciamento completo do exoma tem contribuído na identificação de novos biomarcadores moleculares associados à patogênese, no estabelecimento de classificações de risco mais precisas, além de servir amplamente como banco de dados para investigações futuras [74].

Em estudo recente conduzido por Papaemmanuil e colaboradores [75], 738 pacientes com SMD ou neoplasias estreitamente relacionadas foram avaliadas com as técnicas de WES e sequenciamento-alvo de 111 genes implicados na patogênese do câncer. Tal estudo aponta que 78% dos pacientes tiveram uma ou mais mutações oncogênicas e que os genes que participam da via de splicing do RNA constituem o grupo de genes mais comumente mutado em SMD [75]. O estudo demonstra ainda que os fatores de splicing SF3B1 e SRSF2 se encontram geralmente mutados no início da evolução das SMD [75].

Noutro estudo, realizado por Churpek e colaboradores [76], amostras de 26 casos de SMD/LMA familiais assintomáticos foram avaliadas numa combinação de sequenciamento completo do exoma e sequenciamento-alvo de painéis de genes. O mesmo estudo permitiu: (I) identificar mutações do tipo frameshift (mutações por mudança de matriz de leitura) recorrentes no gene PDS5B, que codifica um fator associado ao complexo coesina, recentemente associado à patogênese das doenças mieloides [77], (II) confirmar a ocorrência de mutações somáticas no gene ASXL1 associadas a mutações germinativas em GATA2 e (III) detectar hematopoiese clonal em 67% dos portadores assintomáticos de mutações no gene RUNX1 com idade inferior a 50 anos, o que representaria um biomarcador potencial que poderia ser utilizado para o acompanhamento clínico nestas famílias de alto risco.

Nos casos de leucemia mieloide aguda com citogenética normal (LMA-CN), a utilização do sequenciamento do exoma e de outros métodos de NGS têm contribuído notavelmente no conhecimento do perfil molecular desses pacientes. Após a identificação de mutações nos genes IDH1 e DNMT3A [78, 79], esses métodos conduziram recentemente à descoberta de dois genes homólogos, BCOR e BCORL1, recorrentemente mutados em LMA [80, 81]. A observação de que cerca de metade dos casos com BCOR mutado também são portadores de mutações do gene DNMT3A sugeriu que estas duas mutações podem atuar

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sinergicamente para induzir a LMA, possivelmente interferindo com mecanismos epigenéticos [82].

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OBJETIVOS

1. Geral

Identificar, por meio de sequenciamento completo do exoma, variantes genéticas específicas em casos de neoplasias mieloides com apresentação atípica ou com mais de uma ocorrência na mesma família.

2. Específicos

• Investigar a presença de variantes genéticas raras e potencialmente patogênicas nos casos estudados por meio de análises em conjuntos de genes implicados direta ou indiretamente na fisiopatologia das doenças neoplásicas mieloides;

• Detectar prováveis alterações genéticas ainda não descritas nessas doenças em conjuntos de genes conhecidamente relacionados ao desenvolvimento dessas neoplasias;

• Verificar o impacto de variantes identificadas por sequenciamento do exoma na proteína correspondente por meio de programas de predição estrutural proteica.

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CASUÍSTICA E MÉTODOS

Casuística

Seis pacientes de três famílias distintas foram selecionados para o sequenciamento completo do exoma. Esses pacientes foram localizados após consulta clínica com médico hematologista no ambulatório do Centro de Hematologia e Hemoterapia da Unicamp (Hemocentro) e os critérios de inclusão nesta pesquisa compreenderam: (I) ter diagnóstico concluso de neoplasia mieloide ou ser parente direto desses pacientes e apresentar sinais clínicos que sugiram neoplasia mieloide familiar, (II) ter idade igual ou superior a 18 anos e (III) concordância e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE, Anexos II e III). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (Parecer de número 1.174.525 – Anexo I). As características clínicas de cada família são descritas a seguir.

 CASO 1

Foram selecionadas duas irmãs de 39 e 38 anos (III-2 e III-3, Figura 3) com diagnóstico de mielofibrose primária em fase celular, histórico de exposição de longa data a DDT (diclorodifeniltricloroetano) durante a infância e sem histórico de câncer ou radioterapia. Em ambas as pacientes, a biópsia de medula óssea (MO) revelou hipercelularidade, com presença de megacariócitos volumosos e agrupados e presença de fibrose; o hemograma evidenciou leucocitose, neutrofilia e trombocitopenia (Tabela 1). Foi verificada ausência da mutação V617F no gene JAK2 e do gene de fusão BCR-ABL1 no DNA de sangue periférico das pacientes (resultados provenientes dos prontuários clínicos das pacientes, de exames realizados, respectivamente, no Laboratório de Análise Molecular de Polimorfismo e no Laboratório de Diagnóstico de Doenças Oncohematológicas – Hemocentro da Unicamp). A história familiar das pacientes indica que a avó materna faleceu de neoplasia uterina (I-2), por

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volta dos 40 anos, e uma das irmãs faleceu de eclampsia (III-1). O pai faleceu de infarto agudo do miocárdio aos 44 anos (II-1). A mãe (II-2) e o irmão mais jovem (III-4) estão saudáveis. O irmão III-4 não possui HLA (HLA: sistema antígeno leucocitário humano) compatível com o HLA das pacientes, o que as torna inelegíveis ao transplante aparentado de medula óssea.

Figura 3. Heredograma dos membros da família do caso 1. Os círculos pretos representam as irmãs sintomáticas com mielofibrose primária. Os quadrados e os círculos brancos representam, respectivamente, os homens e mulheres sem NMP da família em estudo. O círculo hachurado representa a familiar que faleceu de neoplasia uterina. As setas vermelhas indicam os indivíduos que foram selecionados para o sequenciamento do exoma.

A irmã mais jovem (III-3, Figura 3), sem diagnóstico prévio de doença hematológica, aos 34 anos de idade iniciou quadro de dores ósseas, astenia, sonolência excessiva e febre esporádica. O hemograma coletado para investigação na cidade de origem revelou anemia (concentração de hemoglobina de 10,5 g/dL) e trombocitopenia (contagem de plaquetas de 60 x 103/µL) (dados provenientes do prontuário clínico da paciente). O

mielograma revelou medula óssea hipercelular, normomaturativa, com atipias de megacariócitos e quantidade normal de blastos. Embora não apresentasse deficiência de ferro, a paciente iniciou terapia com hidróxido férrico na cidade de origem, sem melhora do quadro

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clínico e laboratorial. Dois anos depois, em exame de triagem no ambulatório de hematologia do Hemocentro da Unicamp, um novo hemograma evidenciou leucocitose com neutrofilia, anemia e trombocitopenia (Tabela 1). A análise citogenética das células nucleadas da MO revelou cariótipo normal (46,XX[20]). A cada dois meses apresenta febre sem sintomas infecciosos, sem necessidade de antibioticoterapia para melhora do quadro. O último filho, nascido há 8 anos, faleceu aos 3 meses de vida devido a um tumor intracraniano (IV-5 do heredograma).

Aos 36 anos, a paciente III-2 (Figura 3), sem diagnóstico prévio de doença hematológica, realizou exames de triagem para doação de MO para a irmã e, nessa ocasião, foram verificadas anemia (concentração de hemoglobina igual a 11,8 g/dL) e trombocitopenia (contagem de plaquetas de 48 x 103/µL) (resultados provenientes do prontuário clínico, de hemograma realizado no estado de origem da paciente). Antes dos exames, a paciente já sentia dores crônicas em membros inferiores, sonolência excessiva e astenia, sem investigação prévia. A análise citogenética da MO revelou monossomia do cromossomo 7 em 35% das metáfases (45,XX,-7[20]). Há cerca de três anos faz tratamento com ácido fólico via oral diariamente. No momento, aguarda transplante de MO. Os dados do hemograma quando da apresentação ao

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Tabela 1. Dados hematológicos das pacientes com mielofibrose primária do caso 1 em sua primeira consulta no Hemocentro da Unicamp. Paciente WBC (x103/μL) Hgb (g/dL) Hct (%) MCV (fL) MCH (pg) Plt (x103/μL) Neut (x103/μL) Eos (x103/μL) Ret (x109/L) Valores normais 3,70-11,1 11,8-16,7 36,0-50,0 82,0-98,0 27,3-32,6 130-400 1,50-7,50 0,020-0,670 22-139 III-2 10,4 10,2 30,8 91,8 30,5 39,3 7,90 0,042 86,2 III-3 13,46 11,4 35,4 90,5 29,2 64 8,82 0,06 87,9

WBC, leucócitos; Hgb, concentração de hemoglobina; Hct, hematócrito; MCV, volume corpuscular médio; MCH, média corpuscular da hemoglobina; Plt, plaquetas; Neut, neutrófilos; Eos, eosinófilos; Ret, reticulócitos.

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 CASO 2

Paciente do sexo feminino, 31 anos de idade (paciente II-1, Figura 4), com diagnóstico de síndrome mielodisplásica do subtipo citopenia refratária com displasia multilinear (CRDM), segundo a classificação da OMS [11]. Há cerca de 10 anos apresentou-se ao Hemocentro da Unicamp com quadro de anemia sintomática refratária ao tratamento com ferro, vitamina B12 e ácido fólico. O histórico clínico da paciente acusa anemia desde a infância e o histórico familiar mostra que um primo possui doença de Fabry e uma prima possui fibrose cística. O cariótipo de medula óssea é normal. O hemograma evidencia leucopenia com neutropenia, além de anemia; por esse motivo, a paciente encontra-se em programa de transfusão regular e faz terapia quelante de ferro com deferasirox. A biópsia de MO revelou medula intensamente hipercelular, normomaturativa e com relação granulocítica/eritrocítica aumentada.

Este caso foi selecionado para o estudo porque se trata de paciente jovem, diagnosticada aos 21 anos de idade, acometida por neoplasia (SMD – CRDM) cuja idade média de apresentação é de 70 anos de idade, com ligeiro predomínio do sexo masculino, segundo a OMS [11]. Os dados do hemograma quando da apresentação ao Hemocentro da Unicamp constam na Tabela 2.

Figura 4. Heredograma dos membros da família do caso 2. O círculo preto representa a paciente com síndrome mielodisplásica. Os quadrados e o círculo vazios representam, respectivamente, homens e mulher sem SMD. A seta vermelha indica a paciente selecionada para o sequenciamento do exoma.

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Tabela 2. Dados hematológicos da paciente II-1 do caso 2 em sua primeira consulta no Hemocentro da Unicamp. Paciente WBC (x103/μL) RBC (x106/μL) Hgb (g/dL) Hct (%) MCV (fL) MCH (pg) RDW (%) Plt (x103/μL) Neut (x103/μL) Eos (x103/μL) Ret (x109/L) Valores normais 3,70-11,1 3,90-6,00 11,8-16,7 36,0-50,0 82,0-98,0 27,3-32,6 11,6-13,9 130-400 1,50-7,50 0,020-0,670 22-139 II-1 2,5 1,60 5,10 15,6 97,20 31,90 16,70 314 0,625 0 32,7

WBC, leucócitos; RBC, contagem de células vermelhas; Hgb, hemoglobina; Hct, hematócrito; MCV, volume corpuscular médio; MCH, média corpuscular da hemoglobina; RDW, largura da distribuição das células vermelhas; Plt, plaquetas; Neut, neutrófilos; Eos, eosinófilos; Ret, reticulócitos.

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 CASO 3

Paciente do sexo masculino (I-2, Figura 5), com diagnóstico de síndrome mielodisplásica [11], do tipo anemia refratária com excesso de blastos-1 (AREB-1) e escore prognóstico internacional revisado (R-IPSS) de alto risco (7,5 pontos) [19]. O histórico familiar do paciente indica que os avós são primos em primeiro grau e que a tia materna do paciente faleceu aos 62 anos devido a leucemia. Aos 47 anos de idade, o paciente apresentou trombocitopenia isolada (81.000/mm3) em exame de rotina. Cerca de dois anos depois, começou a apresentar fraqueza, cansaço, hemorragia gengival e hematomas com traumas leves. Quando o paciente se apresentou ao nosso serviço, o hemograma acusava pancitopenia (Tabela 3). A citogenética de medula óssea revelou cariótipo complexo: 46,XY,-5,t(5;22)(q11;p11),+mar[20]. O FISH (hibridização fluorescente in situ) de medula óssea acusou 15% de deleção 5q (braço longo do cromossomo 5) (cut-off = 4,43%). Passou a realizar múltiplas transfusões de concentrados de hemácias e desenvolveu hemocromatose secundária (ferritina = 1942ng/mL). Em seus antecedentes pessoais, o paciente possuía implante de marcapasso definitivo devido a BAVT (bloqueio atrioventricular) há 20 anos e antecedente de cirurgia cardíaca há 10 anos para correção de valvopatia congênita (homoenxerto de válvula aórtica e mitral). Fazia uso de carvedilol e espironolactona. O paciente foi submetido a transplante de medula óssea (TMO) aparentado (doador I-8, Figura 5), mas foi a óbito aos 51 anos devido a sepse pós-TMO.

Após o diagnóstico do pai, o filho mais velho (II-1), 29 anos, foi avaliado em nosso serviço por quadro de trombocitopenia (≤120 mil plaquetas/mm3) desde a infância. Para melhor avaliação, foi submetido a exames de medula óssea: o cariótipo foi normal (46,XY[20]) e a biópsia de MO evidenciou leve hipocelularidade global e atipias muito discretas de megacariócitos. Mantém seguimento em nosso serviço, com índices hematimétricos estáveis e mantendo trombocitopenia discreta (Tabela 3).

A segunda filha (II-2), 28 anos, também foi avaliada em nosso serviço com histórico de anemia, neutropenia e trombocitopenia (Tabela 3). Para avaliação do quadro, a paciente foi submetida a exames de medula óssea que evidenciaram cariótipo normal (46,XX[20]). A biópsia de MO e o mielograma indicaram displasia trilinear.

O terceiro filho (II-3), 21 anos, também apresenta trombocitopenia desde a infância e já fez uso de prednisona sem melhora do quadro (Tabela 3). Em nosso serviço, os exames de medula óssea revelaram cariótipo normal (46,XY[20]), moderada hipocelularidade global, atipias de megacariócitos e hemossiderose leve (evidenciadas por biópsia de MO).

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Figura 5. Heredograma dos membros da família do caso 3. Os símbolos pretos representam os indivíduos com trombocitopenia. Os quadrados e os círculos vazios representam, respectivamente, os homens e mulheres que não possuem alteração hematológica. O círculo azul (I-8) representa a doadora de medula óssea do paciente I-2. As setas vermelhas indicam os indivíduos que foram selecionados para o sequenciamento do exoma.

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Tabela 3. Dados hematológicos dos pacientes com trombocitopenia da família 3 em sua primeira consulta no Hemocentro da Unicamp. Paciente (Sexo) WBC (x103/μL) RBC (x106/μL) Hgb (g/dL) Hct (%) MCV (fL) MCH (pg) RDW (%) Plt (x103/μL) Neut (x103/μL) Eos (x103/μL) Ret (x109/L) Valores normais H: 3,7-9,5 M: 3,9-11,1 H: 4,4-6,0 M: 3,9-5,0 H: 13,3-16,7 M: 11,8-14,8 H: 39,0-50,0 M: 36,0-44,0 82,0-98,0 27,3-32,6 11,6-13,9 130-400 H: 1,5-6,5 M: 1,7-7,4 0,02-0,67 22-139 I-2 (H) 2,61 3,61 10,7 33,5 92,7 29,7 18,4 60,3 0,93 0,07 26,4 II-1 (H) 5,46 4,56 12,6 39,3 86,3 27,6 13,0 114 2,36 0,17 58,3 II-2 (M) 4,09 4,30 11,6 37,8 87,9 26,9 12,8 141 1,22 0,04 55,2 II-3 (H) 6,22 5,23 14,1 46,1 88,1 27,0 13,8 94 3,57 0,65 63

WBC, contagem de leucócitos; RBC, contagem de células vermelhas; Hgb, concentração de hemoglobina; Hct, hematócrito; MCV, volume corpuscular médio; MCH, média corpuscular da hemoglobina; RDW, largura da distribuição das células vermelhas; Plt, plaquetas; Neut, neutrófilos; Eos, eosinófilos; Ret, reticulócitos; H, homem; M, mulher.

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Coleta das Amostras e Separação de Células

Foram coletados cerca de 12mL do sangue periférico (SP) em tubos contendo EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) e 8mL de aspirado de medula óssea (MO) em tubos heparinizados de cada paciente. Em seguida, as células mononucleares de MO ou de SP foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade com auxílio de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suécia), de acordo com as instruções do fabricante.

Para os controles de linhagem germinativa dos pacientes, as células mononucleares de sangue periférico foram marcadas com anticorpo CD3-APC e as células (linfócitos T) CD3+ isoladas através de separação de células ativada por fluorescência – FACS (fluorescence-activated cell sorting). A pureza de células CD3+ foi averiguada por citometria de fluxo e revelou valor superior a 85%. Por sua vez, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ da medula óssea foram isoladas das demais células mononucleares por separação celular imunomagnética por meio do MiniMACS Starting Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha) (Figura 6). Ao final destes procedimentos, as células foram contadas em câmara de Neubauer.

Em apenas um dos casos, o pellet (agregado) de células nucleadas totais da medula óssea foi utilizado como material de partida para a extração do DNA genômico (paciente II-1, caso 2).

Figura 6. Esquema simplificado de coleta e separação de células do sangue periférico ou medula óssea dos pacientes com neoplasia mieloide estudados.

SP ou MO +Ficoll Centrifugação Mononucleares Plasma Ficoll Eritrócitos Mononucleares CD34+ de MO CD3+ de SP Separação celular Granulócitos

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Extração e Controle de Qualidade do DNA de Partida

Os DNAs genômicos foram extraídos a partir de: (A) agregados de células nucleadas totais de aspirado de MO (apenas no caso 2, paciente II-1), (B) células (linfócitos T) CD3+ separadas por FACS a partir de sangue periférico e (C) agregados de células-tronco hematopoiéticas CD34+ após separação imunomagnética a partir de aspirado de MO.

A extração dos DNAs foi realizada com auxílio do DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Venlo, Países Baixos) e a sua quantificação feita por fluorimetria no Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen - Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA).

Os perfis de integridade dos DNAs de partida extraídos foram verificados através de separação eletroforética utilizando o equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) e os kits Agilent DNA 12000 e Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA). Os perfis de integridade encontrados para as amostras estão representados nas Figuras 7 e 8.

Apesar de todas as amostras demonstrarem bom perfil qualitativo em Bioanalyzer, as amostras de CD3+ da paciente II-1 do caso 2 (C2.II-1, CD3), CD34+ do paciente II-1 do caso 3 (C3.II-1, CD34) e CD34+ do paciente II-3 do caso 3 (C3.II-3, CD34) não atingiram a massa de DNA de partida (50 ng) recomendada pelo kit de captura de exoma utilizado (Tabela 4), devido à escassez de material biológico disponível do paciente. Mesmo assim, decidiu-se proceder com o preparo da biblioteca de exoma dessas amostras.

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Tabela 4. Massa de DNA de partida utilizada no preparo de bibliotecas de DNA para o sequenciamento do exoma nas amostras dos casos estudados. As amostras estão identificadas pelo número do caso (C1, C2 ou C3), número do paciente em cada caso (III-2, III-3, II-1, I-2 ou II-3) e população celular de origem do DNA sequenciado (MO, células nucleadas totais de medula óssea; CD3+, linfócito T CD3+ de sangue periférico; e CD34+, célula-tronco hematopoiética CD34+ de medula óssea).

Amostra Origem Massa de DNA

(nanogramas) C1.III-2 CD34+ 52,6 C1.III-2 CD3+ 50,0 C1.III-3 CD34+ 58,0 C1.III-3 CD3+ 50,0 C2.II-1 MO 50,0 C2.II-1 CD3+ 46,0 C3.I-2 CD34+ 50,0 C3.I-2 CD3+ 50,0 C3.II-1 CD34+ 19,1 C3.II-1 CD3+ 50,0 C3.II-3 CD34+ 46,2 C3.II-3 CD3+ 50,0

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Caso 1, III-2, CD34+ de MO Caso 3, I-2, CD34+ de MO

Caso 1, III-3, CD34+ de MO Caso 3, II-1, CD34+ de MO

Caso 2, II-2, MO total Caso 3, II-3, CD34+ de MO

Figura 7. Perfil qualitativo de corrida eletroforética no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) das amostras de DNA genômico extraídas de células-tronco hematopoiéticas CD34+ de medula óssea (CD34+ de MO) ou de células nucleadas totais de medula óssea (MO total) dos pacientes estudados. FU, unidades de fluorescência; bp, tamanho em pares de base; number of peaks found, número de picos encontrados.

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Caso 1, III-2 Caso 3, I-2

Caso 1, III-3 Caso 3, II-1

Caso 2, II-2 Caso 3, II-3

Figura 8. Perfil qualitativo de corrida eletroforética no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) das amostras de DNA genômico extraídas de linfócitos T CD3+ de sangue periférico dos pacientes estudados. FU, unidades de fluorescência; bp, tamanho em pares de base; number of peaks found, número de picos encontrados.

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Preparo de Bibliotecas de DNA para Sequenciamento do Exoma

As bibliotecas de DNA para sequenciamento completo do exoma foram preparadas utilizando o Nextera Rapid Capture Exome Kit (Illumina, Inc., San Diego, EUA) [83], cujo protocolo simplificado está representado na Figura 9. Para as amostras desse trabalho, foi escolhida a modalidade “exoma estrito” do protocolo (37Mb, somente éxons, sem regiões regulatórias). O preparo das bibliotecas foi realizado na forma de serviço terceirizado pelo Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida – LaCTAD, Unicamp.

Inicialmente, os DNAs genômicos foram individualmente tagmentados (do inglês, tagged and fragmented) pela ação de transposomas específicas, isto é, foram simultaneamente marcados com sequências de reconhecimento nas suas terminações (tagged) e fragmentados (fragmented) em porções de ~150pb a ~1,0kb. Esse processo é fundamental para a amplificação dos fragmentos por PCR (reação em cadeia da polimerase) nas etapas subsequentes. Os DNAs tagmentados foram purificados para remoção das enzimas de tagmentação (transposomas) e, em seguida, procedeu-se à reação de PCR.

O DNA tagmentado purificado de cada amostra foi individualmente amplificado e às suas terminações foram adicionadas sequências de identificação – índice 1 e índice 2 –, que permitem o reconhecimento das bibliotecas durante o processo de alinhamento das leitura (reads). Os fragmentos amplificados de menor tamanho (~150pb a ~1,0kb) foram capturados e separados dos demais, seguido de lavagem dos fragmentos de maior (>1,0kb) e menor (<150pb) tamanhos (Figura 9 A).

Em seguida, uma nova corrida foi feita no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (kit Agilent High Sensitivity DNA), desta vez com todas as bibliotecas combinadas (pool de bibliotecas), para verificar a distribuição de tamanho dos fragmentos gerados após a tagmentação. Os fragmentos ficaram majoritariamente entre 200 e 350pb (Figura 10).

Após a corrida em Bioanalyzer, as bibliotecas combinadas e marcadas com sequências de reconhecimento foram desnaturadas (isto é, os DNAs dupla-fita foram desnaturados em fita simples) e submetidas à hibridização com sondas de biotina, que se ligam a regiões específicas do DNA para captura do exoma (Figura 9 B e C).

Na etapa seguinte, esferas magnéticas de estreptavidina foram utilizadas para capturar as sondas hibridizadas às regiões de interesse, etapa esta designada “enriquecimento”

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(Figura 9 D). Por fim, o pool de bibliotecas foi eluído das esferas magnéticas (Figura 9 E) e preparado para o sequenciamento.

O preparo do pool de bibliotecas para o sequenciamento consistiu na sua quantificação por fluorimetria no Qubit 2.0 Fluorometer, aplicação do pool na flow cell (placa de sequenciamento) e amplificação “em ponte” da biblioteca quantificada, que consiste na formação de clusters (agrupamentos monoclonais dos fragmentos).

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A - Tagmentação C - Hibridização

D - Enriquecimento

E -Eluição

B - Desnaturação

Figura 9. Esquema de captura do exoma completo conforme protocolo Nextera Rapid Capture Exome (Illumina, Inc.) [83]. O preparo das bibliotecas compreende 5 etapas principais: (A) tagmentação e inserção de índices e adaptadores, (B) desnaturação da dupla-fita de DNA, (C) hibridização dos adaptadores biotinilados, (D) enriquecimento e (E) eluição das esferas magnéticas.

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Figura 10. Perfil qualitativo de corrida eletroforética no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) do pool de bibliotecas de amostras dos pacientes com neoplasia mieloide estudados. FU, unidades de fluorescência; bp, tamanho em pares de base.

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Sequenciamento

O sequenciamento do exoma foi realizado em equipamento Illumina® HiSeq 2500 (Illumina, Inc.), numa estratégia denominada sequenciamento cíclico reversível por síntese. Nessa estratégia, há repetição de três etapas cíclicas:

o Ligação competitiva dos nucleotídeos a uma fita nascente de DNA;

o Captura da imagem da fluorescência emitida por um fluoróforo ligado a cada um dos nucleotídeos incorporados;

o Clivagem do grupamento inibitório da base nitrogenada ligada.

O pool de bibliotecas foi sequenciado no modo high output, paired end 100 pb, dual index, com multiplexação total em duas lanes, isto é, 12 amostras por lane distribuídas em duas lanes (duplicata). A cobertura média contratada para esse sequenciamento foi de 135X.

Análises em Bioinformática

As análises em bioinformática, com exceção da filtragem de variantes e das predições do impacto da variante na estrutura proteica, foram realizadas como serviço terceirizado pelo Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida – LaCTAD, Unicamp.

1. Filtragem das leituras (reads) por qualidade

As leituras de cada amostra foram filtradas usando o programa NGSQCToolkit versão 2.3.3 [84], que remove adaptadores e sequências de baixa qualidade. Foram descartadas as sequências que possuíam mais de 70% das bases com escore Phred ≤ 20. Nesta etapa, em média 10% das leituras foram removidas.

2. Alinhamento das leituras

As leituras filtradas de cada exoma foram alinhadas com o genoma humano (montagem hg19, GRCh37, Fev. 2009) utilizando o programa BWA (Burrows-Wheeler Aligner), algoritmo BWA-backtrack, versão 0.7.1 [85], sem alteração nos parâmetros. Os arquivos de saída foram gravados em formato BAM, uma versão binária comprimida de um

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arquivo SAM usada para representar as sequências alinhadas (Site: <http://www.samtools.sourceforge.net>). Após o alinhamento, o programa SAMtools versão 0.1.19 [86] foi utilizado para remover duplicatas de PCR dos resultados de alinhamento.

3. Identificação de variantes

A identificação de variantes foi realizada usando o programa GATK (Genome Analysis ToolKit), versão 3.0 [87, 88]. O algoritmo de chamada de variantes utilizado foi o HaplotypeCaller. O GATK executa 4 etapas: I) realinhamento local, II) recalibragem do score de qualidade das bases, III) chamada de variantes e IV) recalibragem dos SNPs identificados visando separar SNPs verdadeiros de artefatos. Foram filtrados os SNPs com GQ (genotype quality) < 20 e ao mesmo tempo DP (depth ou profundidade de cobertura) < 20 em todas as amostras. Os arquivos de saída foram gravados em um único arquivo VCF (Variant Call Format), contendo os resultados das 12 amostras (Site: <https://www.broadinstitute.org/gatk/>). Mais informações sobre o formato VCF, podem ser obtidas em: <https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/tagged?tag=annotation>.

4. Anotação das variantes

As variantes identificadas pelo GATK foram anotadas utilizando o programa ANNOVAR (versão de agosto de 2013) [89]. O programa gerou dois arquivos de saída, sendo um de log e outro que contém a anotação das variantes, este último do tipo VCF. Um arquivo do tipo VCF é um formato de arquivo de texto padronizado para representar SNPs, indel (inseções e deleções) e variantes estruturais maiores.

5. Filtragem das variantes

As variantes anotadas foram filtradas com auxílio do software R, versão 3.2.1 (The R Foundation for Statistical Computing, 2015) e complementadas pelo programa Microsoft Excel 2010. Do total de variantes anotadas, foram utilizados os seguintes filtros, representados simplificadamente na Figura 11, na ordem em que foram aplicados:

 Filtro A (exclusão): em cada amostra foram eliminadas todas as ocorrências aqui denominadas “ocorrências de genótipo consenso ou indeterminado”, isto é,

Referências

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