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Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica

http://farmacia.ufrj.br/mauricio/

CQPB FFM-001

Polipeptídeos

Luís Maurício T. R. Lima

2

Caracterização de Proteínas

Objetivo:

Fundamentos quimicos e métodos fisico-químicos,

estruturais e funcionais de caracterização de proteínas e

peptídeos que permitam a inserção no estado da arte e o

estudo posterior de casos particulares da prática

Polipeptídeos - Substâncias

Substâncias

•

Substância – entidade molecular única ou mistura de

entidades moleculares individuais que são isoladas juntas ou

o resultado do mesmo processo sintético ou extrativo.

•

Qualquer matéria (possui massa e ocupa espaço) que

possui existência discreta (visão Aristotélica)

– Entidade química bem-definida

– Misturas (isoladas juntas) de naturência natural ou sintética

– Material bruto natural homogêneo estruturalmente diverso.

•

Cinco grupos de elementos empregados para descrever

substâncias únicas.

– Monodisperso

• Químico

• Proteinas

• Ácidos nucleicos

– Polidisperso

• Polímeros (polisacarídeos e polímeros sintéticos)

• Substâncias diversas estruturalmente

Polipeptídeos - Substâncias

5

6

Polipeptídeos - Substâncias

Reflexão:

- Cloreto de zinco

- Ácido clorídico

- Gene de insulina humana

- Insulina humana

- Monômero

- Dímero

- Hexâmero

- Agregado

- Insulina humana – zinco

- EPO

Enovelamento de Proteínas

O Paradoxo de Levinthal

Quantos graus de liberdade há numa cadeia polipeptídica

contendo 150 amino ácidos?

2000 átomos X 3[x, y, z] = 6000 graus de liberdades ?

150 X 2[f,y] + 150X[cadeias laterais] = 450 ?

Quantas conformações do esqueleto peptídico são possíveis ?

[+/- 36

o

_{de acurácia]  10}

300

Enovelamento de Proteínas

O Experimento de Anfinsen com RNase

“...toda a informação necessária para

especificar a estrutura completa de uma

proteína reside em sua seqüência

primária.”

Anfinsen, C.B. (1973) Science,

181:223

12

Interações que estabilizam a estrutura protéica

•

Ligação de hidrogênio;

•

Interações salinas;

•

Interações dipolo-dipolo;

•

Interações de van der Waals;

•

Interações hidrofóbicas;

•

Ligações disulfeto;

Interações fracas

4 – 30 KJ/mol

Ligação covalente

200 – 460 KJ/mol

Ligação de

hidrogênio

•

átomos doadores

e receptores de

elétrons;

Em pH 7.0

Interações salinas

•

Grupos carregados com cargas opostas formam

pares iônicos;

Arg

Asp

2,89

Interações dipolo-dipolo



– hélices possuem um

grande momento

dipolo-dipolo;

Direção do dipolo:

Interações de van der Waals

•

Resíduos aromáticos interagem

entre si com grande interação de

van der Waals;

Interações hidrofóbicas

•

Resíduos hidrofóbicos

tendem a ocupar o interior

da proteína para evitar

cisteína

cistina

Ligações disulfeto

•

Ligações disulfeto estabilizam covalentemente a estrutura

da proteína

Ângulos internos

f

e

y

•

A conformação da

cadeia principal de cada

resíduo é determinada

pelos ângulos

f

e

y

;

•

Algumas combinações

de

f

e

y

levam a

conformações não

permitidas (impedimento

estérico);

Diagrama de Ramachandran

•

As duas grandes regiões

correspondem a



-hélice e

folha-

b

48

Esquerda - serina-protease subtilisina, determinada à resolução de 0.78Å (código no PDB: 1GCI). A presença de um resíduo em regiões não-permitidas (em branco) pode indicar, por exemplo, uma distorção causada por uma interação forte.

Já quando há um grande número de resíduos em tais regiões, é mais provável que o modelo tenha sido construído de forma errônea, ou, no caso de uma estrutura experimental, que o mapa de densidade eletrônica tenha sido mal interpretado.

Folhas-

b

f

= -139

Y

= 135

•

Fitas paralelas e

antiparalelas

f

= -119

Y

= 113

Estruturas Supersecundárias

•

Interações entre



-hélices e folhas-

b

próximas em

seqüência;

1958 e 1960  Primeiras estruturas de proteínas resolvidas

Princípios gerais importantes:

•Interior hidrofóbico

•Superfície hidrofílica

Formação de estruturas secundárias regulares

no interior da proteína com formação de

Estrutura terciária de proteínas

Mioglobina

Mioglobina

Triosefosfa

_to

Isomerase

Estrutura terciária de proteínas

Estruturas com domínios

b

Aspartato

transcabomila

se

Flavodoxina

Plastocianina

Estrutura terciária de proteínas

Domínios protéicos

Triosephosphate isomerase

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase de

59

60

DOI 10.1016/S0969-2126(03)00149-7

62

64

Inhibition of insulin amyloid formation by small stress molecules

65

Fibra Amilóide de Amilina

R.P.R. Nanga, et al., Structure and membrane orientation of IAPP in its natively amidated form at physiological pH in a membrane environment , Biochim. Biophys. Acta (2011),

66

Fibra Amilóide de Amilina

69

Casting Metal Nanowires Within Discrete Self-Assembled Peptide Nanotubes Science 300, 625 (2003);

DOI: 10.1126/science.1082387

70

Casting Metal Nanowires Within Discrete Self-Assembled Peptide Nanotubes Science 300, 625 (2003);

DOI: 10.1126/science.1082387

L. Smeller, BBActa, 1595, 1-2 , p 11-29, 2002.

Protein folding ... and misfolding.

José Nelson Onuchic, Nicholas D Socci, Zaida Luthey-Schulten, Peter G Wolynes

Folding & Design 13 Nov 1996, 1:441-450.

Doença Prevalência nos EUA em

2000

Proteína

envolvida Deposição protéica Doença de prion <1: 100.000 PrPSc _{Placas amilóides da proteína}

do prion

Doença de

Alzheimer 1450: 100.000 Ab Placas amilóides do peptídio Ab Tau Filamentos helicoidais

pareados em entrelaçados neurofibrilares

Doença de

Parkinson 360: 100.000 -sinucleína Corpos de Lewy Demência

frontotemporal 14: 100.000 Tau Filamentos finos e filamentos pareados em hélice

Doença de Pick 2: 100.000 Tau Corpos de Pick

Paralisia progressiva supranuclear

5: 100.000 Tau Filamentos finos em

entrelaçados neurofibrilares

Esclerose lateral

amiotrófica 7: 100.000 Neurofilamento Agregados neuronais Doença de

Huntington 11: 100.000 Huntingtina Inclusões nucleares Ataxias

espinocerebelares 4: 100.000 Ataxina 1 _{Ataxina 2}

Ataxina 3

Inclusões nucleares e citoplasmáticas

Tabela adaptada de Prusiner, 2001

Marcadores de agregados amilóides

- Inibição de agregação proteica

- Citotoxicidade

- Neurotoxicidade

- Resitência a digestão proteolítica

- Microscopia eletrônica

- Propriedades tintoriais

(ligação de tioflavina T e vermelho do congo)

- Difração de raios X por fibrilas

- Espectrometria de absorvância no infravermelho (FTIR)

Histopatologia da vCJD (x 460)

‘Many, perhaps most, proteins, are

capable of forming

self-propagating,

β-sheet (amyloid) aggregates.’

Toyama and Weissman, Annu. Rev. Biochem.

2011. 80:557–85

•considerando a ocorrência da epizootia de encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em

países europeus;

•considerando a ocorrência de casos da variante da Doença de Creutzfeldt-Jakob - vDCJ

em humanos, constatada em países europeus, e a forte suspeita de sua relação com a

encefalopatia espongiforme bovina;

•considerando os países de risco definidos pelo Escritório Internacional de Epizootias

-OIE;

•considerando os critérios definidos pelo Código Zoosanitário Internacional para

determinação do enquadramento de um país ou zona a respeito de encefalopatia

espongiforme bovina;

•considerando que diversos países adotam legislações restritivas acerca das

encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs);

•considerando a necessidade de adotar medidas para prevenir a população brasileira

contra as encefalopatias espongiformes transmissíveis;

•considerando a existência de evidências epidemiológicas que demonstram a relação

dessas enfermidades em seres humanos com o consumo de produtos cárneos e derivados,

elaborados de ruminantes infectados;

•considerando a possibilidade de transmissão de substâncias patogênicas a humanos por

produtos de origem animal utilizados em procedimentos de diagnóstico e tratamento;

•considerando o risco potencial de transmissão da doença pela utilização de tecidos e

órgãos humanos de pessoas de países onde a vDCJ vem se manifestando; ...

Art.1º

Ficam proibidos

, em todo o território nacional, enquanto

persistirem as condições que configurem risco à saúde, o

ingresso e a comercialização de matéria-prima e produtos

acabados, semi-elaborados ou a granel para uso em seres

humanos, cujo

material de partida

seja

obtido a partir de

tecidos/fluidos de

animais ruminantes

, relacionados às classes

de medicamentos, cosméticos e produtos para a saúde,

conforme discriminado (...)

PrP

C

_PrP

Sc

Conversão estrutural PrP

C

_

_PrP

Sc

J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 23, 19687-19690, June 8, 2001

Folding of Prion Protein to Its Native -Helical Conformation Is under Kinetic Control

Ilia V. Baskakov

, Giuseppe Legname

, Stanley B. Prusiner

, and Fred E. Cohen

c, normalized transition of

the isoform (filled circles)

and the isoform (open

circles) as determined by

SEC (solid line) and by CD

(dashed line) against

varying concentrations of

urea.

d, free energy diagram for

the



and the

b

-isoform of

MoPrP determined at pH

3.6. U represents the

unfolded state.

An End to the Prion Debate? Don't Count on It

Science, Vol 305, Issue 5684, 589 , 30 July 2004

Synthetic Mammalian Prions

Science, Vol 305, Issue 5684, 673-676 , 2004

Tg9949 mice inoculated with

() RML prions,

seeded-amyloid

(▲) recMoPrP(89–230),

(▲) unseeded-amyloid

recMoPrP(89–230).

Amyloid fibrils were formed

upon incubation of

recMoPrP(89–230) (0.6

mg/ml) at 37°C in 3 M urea,

0.2 M NaCl, 50 mM sodium

acetate buffer, pH 5.0, as

described (11).

Science, Vol 305, Issue 5684, 673-676 , 2004

Synthetic Mammalian Prions

“Our finding that amyloid fibrils harbor detectable levels of

prion infectivity allows us to draw some conclusions about

mammalian

prions.

First, PrP is both

necessary and sufficient

for infectivity.

Second,

neither the Asn-linked oligosaccharides nor the

glycosylphosphatidylinositol

anchor are required for prion

infectivity

, because recMoPrP(89–230)

contains neither of