ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE a , a-D-TREALOSE, $-D-GLUCANA E DE UM HETEROPOLISSACARíDEO DO BASIDIO- LÍQUEN CORA PÂVONIA (Sv*) Fr.
Tese apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Fe deral do Paraná para a obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
CURITIBA 1985
Pe dr oj ao meu filho Rafael e aos meus p a i s .
Nada Lhe é oeutto e nada Lhe pas_; sa desapercebido. Ele conhece todos os mistérios da ci ên ci a..
Foi Ele que estabeleceu limites ao mar para que dali não u l t r ap a ss e.
Foi Ele que estabeleceu os tempos as estaçõesj e as constelações nos céus.
Foi Ele que nos deu vida através de Seu Filho.
AcOH - ácido acético, cm - cent í m e t r o .
c.p. - cromatografia em papel.
13 _ _
C-n.m.r. - ressonância nuclear magnética de carbono treze. d.i. - diâmetro interno.
D2O - óxido de deutério.
g - grama (s) .
g.l.c. - cromatografia em fase gasosa.
g.l.c.-m.s. - cromatografia líquida-gasosa e espectrometria de massa, h - hora. Hz - Hertz, km - kilometro. L - l i t r o . mL - mililitro
m/e - massa/carga do elétron*
mA - miliAmpêre. MHz - megaHertz . mg - miligrama (s). M - m o l a r . m - m e t r o . min - minuto . I
4 NaBH P/P p/v p . f . p .p .m r\p7m r g a l e R ] s ■ys £ 5 TFA TMS 6 T v/v o - boroidreto de sódio. - peso/peso. - peso/volume. - ponto de fusão. - partes por milhão. - ro tação por nrinuto.
- mobilidade relativa na cromatografia em papel re ferente aos padrões utilizados de galactose e mio-inositol, respectivamente. - segundo (s ) . - m i c r o s e g u n d o s . - coeficiente de sedimentação. - Svedberg. - ácido t r ifluoracético. - tetrametilsilano. - delta (em p . p . m ) .
- tempo de retenção em gil.c. - volume/ volume.
- grau (s) em rotação óptica e grau(s) Celsius.
Pagina ABSTRACT ... IX RESUMO ... XI INTRODUÇÃO .... 1 MATERIAL E M É T O D O S ... 18 Métodos gerais ... 18
Coleta e preparo do material ... 22 Isolamento e cristalização da a, a - D -trealose ... 22 Isolamento e purificação dos polissa c a r i d e o s o b
tidos por extração aquosa ... * ... 23 Isolamento e purificação dos p o l issacarideos o b
tidos por extração alcalina ... 24 Hidrólise ácida dos polissacarideos ... 25 Redução e acetilação dos produtos de hidrólise
- ácida ... *... 25 Desproteinização do heteropolissacarideo e 0D
-glucana obtidos da extração aquosa ... 26 Cromatografia em coluna de Sepharose 4B-200 do
heteropolissacarideo ... 27
Determinação enzimãtica da ^-fucose no heteropo—
lissacarldeo ... 27
Derivatização e preparação das amostras monossa- carldicas (preparação dos 2-octil-glicosídeos a- cetilados), e exame por g.l.c.-m.s. para a deter minação das formas enantiomêricas ... 28
Metilação do heteropolissacarídeo ... 29
Metilação da glucana ... 30
Metilação da a ,a-D-trealose ... 30
Análise dos produtos de hidrólise ácida das amos tras metiladas ... -... 30
Determinação do consumo de meta-periodato e áci do fõrmico liberado do heteropolissacarídeo .... 31
Degradação de Smith (hidrv suave) dos polissacarídeos. . . 32
Ultracentrifúgação dos polissacarídeos ... 33
- . 1 3 -Ressonância de C-n.m.r. do oligossacarídeo e dos polissacarídeos ... 34
Compohentes amino-acidicos do líquen bruto .... 34
RESULTADOS E DISCUSSÃO . . ... 36
Isolamento, purificação ç composição do oligossa carídeo e dos polissacarídeos ... 36
Extração aquosa dos polissacarídeos ... 39
Extração alcalina dos polissacarídeos ... 43
Ultracentrifúgação dos polissacarídeos ... 44
Eletroforese dos polissacarídeos ... 51 Eluição do heteropolissacarídeo em coluna de
Determinação da configuração absoluta dos compo - nentes monossacarídicos obtidos do
heteropolissa-ca r i d e o ... 55 Análise estrutural do heteropolissacarídeo ... 62
CONCLUSÕES ... 71
AGRADECIMENTOS . . 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77
TABELA- -PÃG-INA-I Composição em aminoãcidos do líquen Cova pavonia
(conteúdo proteico de 3 6 , 0 5 % ) ... 38 II Detecção por g.l.c. dos acetatos de alditõis par
-cialmente O-metilados formados do extrato metanol- aquoso por análise de m e t i l a ç ã o ... 40 III Analise por g.l.c. A) dos produtos de hidrólise
ácida total da fração solúvel em água fria (sobre nadante) resultante do congelamento e degelo do extrato aquoso e B) dos produtos de hidrólise ãci da total do extrato alcalino (precipitado etanôli
co total), na forma de acetatos de a l d i t õ i s ... 45 IV Análise por g.l.c. dos resultados de hidrólise ã-
cida total dos precipitados de Fehling A) extra - ção aquosa e B) extração alcalina, na forma de acc
tatos de alditõis ... 46
V Análise por g.l.c. dos acetatos de alditõis parci^
almente O-metilados obtidòs da 0 -g-glucana... 54
VI Tempos de retenção relativos, forma do anel, e p e r centagem das áreas dos picos por g.l.c. dos glicosl deos (-)-2-octil acetilados obtidos de amostras pa
drões e frações provenientes da coluna de celulose... 57
do polissacarideo insolúvel em etanol (extração
aquosa) na forma de acetatos de a l d i t õ i s ... 64 VIII Análise por g.l.c. dos acetatos de alditõis p a r
cialmente O-metilados obtidos do polissacarldeo metilado rico em manose, derivado da degradação
_de Smith da_ heteropo.lls.sacarídeo^-~-. . . , .. . 6 5 -IX Análise por g.l.c. dos acetatos de alditõis p a r
cialmente O-metilados obtidos do heteropolissaca
r l d e o ... 67
F-IGU-RA- -PÃGINA—
13 -r
1 Espectro de C-n.m.r. do oligossacarídeo
ct,tí-g-t r e a l o s e ... 41
13 ~
2 Espectro de C-n.ra.r. da 8-g-glucana (extraçao
a q u o s a ) ... 47 13
3 Espectro de C-n.m.r. do heteropolissacarídeo
(A- extração aquosa e B- extração a l c a l i n a ) 48 4 Análise por ultracentrifúgação dos componentes
A) 8-g-glucana e B) heteropolissacarídeo... 50 5 Cromatografia do heteropolissacarídeo em coluna de
Sepharose 4 B - 2 0 0 ... ... 5 2
6 Perfil obtido por g.l.c.-m.s. dos derivados ace-tilados (-)-2-octil glicosídeos formados por deri vatização das frações provenientes da coluna de celu
lose, contendo ramnose e fucose (A) e fucose e xi_
lose (B)... . 58 7 Espectros de massa por impacto eletrônico dos d e
rivados acetilados (-)-2-octil glicosídeos de fu- copiranose (A) , fucofuranose (B) , xilopiranose (C), xilofuranose (D), manopiranose (E), e
manofurano-se (F)... 59
8 Curva de oxidação com meta-periodato do
heteropo-polissacarídeo (extração a q u o s a ) ... 68
- Cover -p-av orcira— ts— air—unusual lichen “braving a basïdïomy- cetous mycosymbiont. It is very rich in protein (36%), of Which 10% is tyrosine, a/a-g-Trehalose is present as 4,3% of the total lichen.
The lichen contains polysaccharides typical of basidi^ omycetes and different from those of ascomycetes and ascomyce tous l i c h e n s . Hot aqueous extraction followed by treatment of the ethanol-insoluble extract with Fehling solution provided, via its insoluble copper complex, a heteropolysaccharide (5.1% protein) which was homogeneous on ultracentrifugation (2,6S) , electrophoresis, and gel filtration. From the mother liquor was isolated a glucan wich was homogeneous on ultracentrifuga
tion (1,4S) and electrophoresis.
The heteropolysaccharide contained 6 monosaccharides, whose enantiomeric configurations were det e r m i n e d . Hydrolysis of the polysaccharide followed by a partial fractionation of the hydrolyzate by cellulose column chromatography, deri v a t i2ation of each fraction to form acetates of (-)-2-octyl glycosides , and examination of the products by g.l.c.-m.s., gave peaks whose retention times and mass' spectra indicated the p r e s e n
ce of g-rhamnose, g-fucose, g-xylose, g-mannose, g-glucose , and g-galactose. The use of m.s. in enantiomeric determinations
tions of peaks of acetates of octyl glycosides with those of standards. This was previously carried out on less compli cated monosaccharide mixtures, but in the present study imuri_ ties were detected in each fraction obtained by cellulose co lumn chromatography and m.s. was needed as a further parameter in—peak— identif ication.
Analysis of the heteropolysaccharide showed that it contained principally xylose and mannose with a m a n n o s e - containing nucleus. The main chain consisted mainly (60%) of
(1 -*■ 3)-linked a-g-mannopyranosyl units which were unsubstitu ted (1 0%), or 4-0- (1 0%) and 2,4-di-0-substituted (1 0%) with units of 6-Q-xylopyranose. In the methylation analysis of the heteropolysaccharide, a capillary column of DB-210 proved to be particularly useful for more efficient g.l.c. resolution of partially O-methylated alditol acetates.
The glucan had the $-Q-configuration and was highly branched with 21% of nonreducing end-units with 3-0-(30%), 6 0- (30%), and 3 ,6-di-0-substituted Residues (19%), and had a main chain consisting of interspersed (1 3) and (1 6)
-link a g e s .
Cora jpavarríra~ e.- um~-âos~ po u c o s '"liquens c u jo micossimbl onte ê um basidiomiceto e não um ascomiceto. Ê muito rico em proteína (36%) , dos quais 10% é tirosina. A a, arr g-trealose foi isolada do líquen com um rendimento de 4,3 %.
O líquen contém polissacarideos típicos de basidiomi cetos e diferentes daqueles de ascomicetos e liquens ascomice tos. Extração aquosa quente seguida por tratamento do extrato insolúvel em etanol com solução de Fehling forneceu, via seu complexo cúprico insolúvel, um heteropolissacarldeo (contendo
5,1% de pr o t e í n a ) , que foi homogêneo por ultracentrifugação (2,6S), e l e t r oforese, e filtração em gel. Do sobrenadante de Fehling foi isolada a glucana, que foi homogênea por ultracen trifugação (1,4S) e eletroforese.
O heteropolissacarídeo continha seis monossacarídeos cujas configurações enantiomiricas foram determinadas. Hidró lise do polissacarídeo seguida por um fracionamento parcial do hidrolisado por cromatografia em coluna de celulose, derivati^ zação de cada fração para formar acetatos de (— ) — 2 — octil gli_ cosídeos, e exame por g.l.c.-m.s., forneceu picos cujos tempos de retenção e espectrometria de massa indicaram a presença de g-ramnose, g-fucose, g-xilose, g-manose, g-glucose, e g-galac tose. O uso de m.s. em determinações enatioméricas representou
dos acetatos de actil glicosldeos com aqueles de padrões. E s tas técnicas foram previamente conduzidas em misturas monossa caridicas menos complicados, mas no presente estudo foram d e tectadas impurezas em cada fração obtida por cromatografia em coluna de celulose, e m.s. foi necessária como um parâmetro ex tr-a- -na- ide-nti f ica-çãe doe- p i c o s .
Análises do heteropolissacarldeo mostraram que ele continha principalmente xilose e manose com um núcleo conten do manose. A cadeia principal consistia principalmente (60 %) de unidades a-g-manopiranosil em ligações (1 -*■ 3), que eram não substituídas (1 0%) ou 4-0-(1 0%) e 2,4-di-0-substituídas
(10%) por unidades de 3-g-xilopiranose. Nas análises de meti- lação do heteropolissacarldeo, uma coluna capilar de DB - 210 mostrou ser particularmente útil para resolução mais eficien te por g.l.c. dos acetatos de alditõis parcialmente O-metila dos ,
A glucana tinha uma configuração 3-g sendo alta - mente ramificada com 2 1% de unidades terminais não redutoras, com resíduos 3-0- (30%), 6-0- (30%) e 3,6-di-0-substituídos
(19%) , e tinha uma cadeia principal consistindo de ligações intercaladas (1 ■+ 3) e (1 -*■ 6) .
Gãlactomananas de tLíquens
Em 1729 Micheli (20) em p r e g o u p e l a primeira vez o ter mo "líquen", planta rasteira ou lambe-chão. A verdadeira n a tureza dos liquens, p o rém só foi reconhecida em 1868, q u ando o biõlogo suiço Schwendener (20) demonstrou tratar-se n ã o de uma entidade vegetal, mas de uma simbiose complexa de alga e fungo.
N a maior parte dos estudos a atenção é voltada para dois grupos de substâncias: (i) os chamados ãcidos liquênicos e (ii) os constituintes carboidratados solúveis na água, que formam a maior parte dos constituintes sólidos no líquen (20).
0 exame cientifico pioneiro do material foi registrado por Berzelius em 1915 (12) que isolou um poliss a c a r í d e o do líquen Cetraria islanãica (musgo da Islândia) através de p r e c i p i t a ção por resfriamento de um extrato aquoso quente. Liquenana, assim isolada, foi mais tarde purificada via complexo c ú p r i co insolúvel formado com s o l u ç ã o de Fehling (16). Sua estrutu ra é de um polímero linear de 8-g-glucose contendo ligações
(1 3) e (1 4) na proporção de 3:7 (16,52) .
A mistura polissacarídica obtida do sobrenadante por resfriamento do extrato aquoso quente, acima citado, foi
originalmente chamada isoliquenana por Meyer & Gurtler (53). Mais tarde, p o r i m Chanda et al. (16) aplicaram este nome ao componente a-p-glucopiranana que foi p u r i f i c a d o via p r e c i p i tação fracional do complexo cúprico solúvel em água usando acetona. Neste estudo foi demonstrado que a isoliq u e n a n a é composta, de fato, somente de resíduos de g - g l u c o s e em l i g a ções a-gli cosi dicas (1 3) e (1 4) numa relação m o lar de £0-:-4fl-,— embora— Peet-et- -al. -(-6-0-)- mais- tarde s-ugeri-r-am nma- r e l a ção de 55:45. O processo de fracionamento e m p r e g a d o por Chan da et a l . (16) presumivelmente separou liquenana de u m c o m p o nente contendo manose e galactose que já havia sido d e t e c t a do por Ulander & Tollens em 1906 (73) . Em adição â manose e galactose, Buston & Chambers (15) sugeriram a p r e s e n ç a de uma hemicelulose e m virtude da presença de ácido g a l a c t u r ô n i c o , contudo, a p r esença de ácido urônico na c a r a t e rização e s t r u tural da mo l é c u l a não foi ainda confirmada.
Pela remoção da liquenana (B-glucana) através de pre cipitação em água fria e tratamento subsequente do sobrena - dante com solução de Fehling, Karrer e Joos (43) o b s e r v a r a m a formação de um complexo cúprico insolúvel c o n t e n d o mannose, galactose e glucose numa relação molar de 21:35:44. Tal obser vação sugere uma co-precipitação, como complexo cúprico, de uma galactomanana com liquenana remanescente. C o n t u d o , um componente heter o p o r i m ê r i c b de C. islanãica n ã o foi i s o l a d o num estado puro. O ú nico -achado sobre os componentes de sua possível estr u t u r a molecular foi sugerido por G r a n i c h s t á d t e n e Percival (32) que, por tratamento de um extr a t o a l c a l i n o com solução de Fehling, obtiveram um p r e c ipitado c o n s i s t i n d o principalmente de glucana. Este estava presente p o r q u e o
ex-trato alcalino acima não foi submetido ao m é t o d o usual ' de dissolução pelo calor seguido por p r e c i p i t a ç ã o a frio.. Mesmo assim uma pequena proporção de heter o p o l i s s a c a r í d e o estava presente sendo constitüido por unidades terminais n ã o reduto ras de galactopiranose.
Mais tarde Gorin e Iacomini (27) m o s t r a r a m ser o h e teropolissacarídeo de C. islandica u m a galactomanana, cuja -e-s-tr-ut-ur-a— foi— compa-ra-da— com— aquelra tio l íquen-RamaTina usnea
(coletado de ramos de pereira., p e r t o de Q u a t r o - B a r r a s , Pana- ná) . A a-glucana de R. usnea foi também investigada. Tanto C. -Lstandioa como R. usnea são liquens com uma forma de cres cimento fruticoso e micossimbionte ascomiceto, contendo ga - lactomananas com estruturas diferentes daquelas previamente reconhecidas. Os heteropolissacarídeos são relacionados àque les das mananas e polissacarídeos contendo manose, encontra dos na parede celular da maioria dos fungos ascomicetos, des^ de que eles contêm unidades a-Q-manopiranosil em ligações
(1 -*■ 6) nas cadeias principais (23) . Por outro lado heteropo lissacarídeos de fungos basidiomicetos contêm resíduos a-D- manopiranosil em ligações (1 3) nas cadeias principais (23).
O heteropolissacarídeo de C. islanã-ica3 previamente tratado com uma celulase obtida de Aspergillus n-igev, apre - sentou após hidrólise ácida total jnanose, galactose e g l u c o se (esta última em proporção b a s t a n t e diminuída) nu m a rela - ção molar de 49:45:6. Após hidrólise ácida parcial do referi^ do heteropolissacarídeo, foi obtido um p o límero contendo ma— nose, galactose e glucose numa relação m olar de 74:21:5. Seu
13
)-substituída a-manopiranana desde que tinha sinais p r i n c i p a i s em 6 101,0; 72,5 (2 si n a i s ) ; 71,6; 68,5 e 67,5 (25) . Tendo en tão em v ista que o polissacarídeo ãcido degr a d a d o contem prin cipalmente ligações na configuração a, de acôrdo com o
espec-13 ~ ,
tro de C-n.m.r. e uma rotaçao específica p o s itiva r e l a t i v a mente alta de +51°, próximo ao valor de +8 8° r e latado pa r a a a-g-manopiranana da levedura de pan i f i c a ç ã o (37), os resíduos m anasil— devem ter—a conf iguração-g^— As— un-i-dades galactos-il-tam- bém têm esta confuguração desde que elas foram oxidadas pela galactose oxidase (3) .
C o n v ê m a;qui citar para termos de comparação a rotação específica de -78° para a 3-g-manopiranana isolada dé Rhodoto_ rula gZutinis (26).
Pelos dados anteriormente citados e pelos obtidos em análises de metilação, se pode sugerir que a g a l a c t omanana de C. -islandica contem vima alta proporção de unidades a-g-manopi^ ranosil e m ligações (1 -*• 6) na cadeia principal. Estas unjL
d a d e s s ã o e m p a r t e 2,4-di-O-substituidas por u n i d a des g - g a l a c t o p i r a n o s i l . De acordo com o e s pectro de ^C-n.m.r. que contem vim sinal de C-l em campo b a ixo em 6 104/5; as u n i dades g-galactopiranosil, ligadas (1 4) aos resíduos a-g-ma nopiranosil devem ter a configuração 8 (35). Também consisten
te com isto i a presença de um sinal t í p i c o de Ç-5 em 6 77,0 (29). Um outro sinãl de C-l em 6 102,7 sugeriu unidades a-g- galactopiranosil substituindo as posições 2_ de uma cadeia prin cipal com ligações (1 6)-a-g-manopiranosil (Estrutura 1) co mo na galactomanana de Saccharomyces octosporus (29) . Em c o n cordância com estes dados, acetõlise parcial, que ataca p r e ferencialmente as ligações de cadeia prin c i p a l (1 6) —
a-g-manopiranosil e resíduos 3-D-galactopiranosil, forneceu 2-0- a-D-galactopiranosil-Ç-manose, que foi isolado.
a-g-Galp 1 + 2 -a-D-Manp- (1 6)- a - Q - M a n p - (1 •+ 6 )-4. + 1 3-g-Galp 1
Um polissacarldeo de R. uanea (27) d a n d o um complexo cúprico insolúvel com solução de Fehling, continha galactose, manose e glucose numa relação m olar de 43:53:3 e uma rotação
especifica de +63°. As unidades manosil e galactosil existem comO g - e n a n t i ô m e r o s . Análises de m e t i l a ç ã o m o s t r a r a m a presen ça de unidades terminais não redutoras de g a l actopiranose (40%), manopiranose (2%), galactofuranose (3%) e unidades 6-0- (19%) e 4 , 6-di-0-substituldas (37%) de manopiranose. Hidrólise á c i da parcial do polissacarldeo de R. usnea forneceu um núcleo
_ , o •
resistente, tendo uma rotaçao especifica de +61 , com 17% de galactose e -33% de manose. Esse núcleo, em dados obtidos em análises de metilação consistia p r i n c ipalmente de unidades ma nopiranosil em ligações (1 6) (6 6%), com u n i dades terminais não redutoras de manopiranose (11%), galactopiranose (14%) e unidades de manopiranose 4,6- (7%) e 2,6- (2%)-di-O-substitui^ das.
O e s p e c t r o de C-n.m.r. desta galactomanana indicou a pre sença de unidades galactopiranosil na configuração 3 (C - 1, 6 104,3). De aco r d o com os dados acima, estes e s t ã o ligados
(1 -*■ 4) â cadeia principal e, dessa forma, uma alta proporção de uma estrutura como a 2 está presente, com s ubstituintes em aproximadamente duas de cada três unidades e m liga ç ã o (1 **■ 6 ) de cadeia principal á - D - m a n o p i r a n o s i l . Assim, as g a l a ctomana - na-s -de C. -irs-Va-n-âdr&u— e.- -R— -u-snenjambas— c om— formas— frutfco-sas -de—
13 3-D-Galp 3-fí-Galp 1 1 + + 4 4 - a - D - M a n p - (1 6) -a-D-Manp- (1 6) - a - D - M a n p - (1 -+■ 6)
-2
crescimento, apresentam estruturas diferentes mas quimicamente relacionadas em termos das cadeias principais e das estruturas das cadeias lateraiá. Se a maioria dos liquens que têm micossim bionte ascomiceto contem tais galactomananag ê de significância. Também as fontes destes e outros polissacarldeos são de interes se, se eles se originam do simbionte fungo ou alga de cada líquen. Heteropolissacarldeos de outros liquens como Clado_ nia alpestris (musgo das renas) e Evemia prunastrn. já foram isola dos. Aspinall et a l . em 1955 (5) obtiveram do m usgo das renas , via precipitação com solução de Fehling, produtos contendo ga -
la*'-tose, manose e glucose. Embora os dados de metilação a p aren temente diferiram daqueles obtidos de preparações de C. islan_
-dem semelhanças na estrutura química, considerando que estas técnicas n a o eram sensíveis o sufici e n t e para permitir uma de terminação detalhada da estrutura química.
Outro heteropolissacarídeo obtido de E. p r u n a s t r i (54) contem galactose, manose e ácido glucurônico. As únicas possí^ veis semelhanças â estrutura 1 altamente ramificada ê a pre - sença de altàs proporções de terminais n ã o redutores de galac topiranose (36%) _, manopiranose. (1 1%) t* rpRi^nnc; t r i - O - s u b s t i - tuídos de manopiranosil, cujas posições de substituição nã o foram confirmadas. Em vista destes result a d o s incertos, hete- ropolissacarídeos de outros líquens, t endo um ascomiceto como micossimbionte, foram investigados.
Uma comparação foi conduzida sobre as estruturas q u í micas de componentes polissacarídicos de três espécies de lí quens do gênero Ctadoni.a (4 2) 1 Duas espécies que têm formas de crescimento quase indistinguíveis, C.álpestris (Saskatchewan Central-Canadá) e C. confusa (Sul do Brasil) aprese n t a r a m tra ços de nigerana, um polissacarídeo insolúvel na água fria, iso lado por precipitação após extração aq u o s a quente. A e s t r u t u ra da nigerana consiste p r e d o m inantemente de unidades r e peti das a-g-glucopiranosil em ligações alternadas 3- e 4- (6, 7) . Os líquens residuais foram extraídos com hidr ó x i d o de potássio aquoso a quente e os extratos tratados com solução de Fehling formaram complexos cúpricos insolúveis. A p ó s remoção do cobre, galactomananas quase puras foram obtidas, que não e r a m idênti^ cas mas estruturalmente relacionadas.
Análises baseadas na compos i ç ã o monossacarídica, hi - drõlise parcial, rotação específica, d a d o s de m e t i l a ç ã o e ace tólise parcial mostraram que cada g a l a c t o m a n a n a co n t i n h a uma
— v ?eia principal composta de unidades a-g-manopiranosil em li ga<r.ões (1 6). Algumas destas eram 2-0-substituIdas por resl duos a-g-manopiranosil (Estrutura 3) ou 4-0-substituIdas por resíduos f?-g-galactopiranosil e em alguns casos 2,4-di-0-sub£ tituldas (Estrutura 4). a-g-Manp 1 + 2 -a-D-Manp- (1 6 )-a-D-Manp 1 + 2 -a-g-Manp- (1 6) 4 + 1 B-D-Galp
Embora algumas diferenças estruturais foram encontra das, elas se tornaram mais aparentes na compar a ç ã o das regiões
13
de C-l dos espectros de C-n.m.r. Estes d i f e r i r a m daqueles das galactomananas de C. islanã-Lca e R. usnea previamente in vestigadas (27). N o caso do h e t e r o p o l i s a a c a r L d e o de C. alpes-tris (Fração-A), uma estrutura complexa foi refletida no seu
13
-espectro de C-n.m.r. que continha 8 sinais na região de C-l, cada um deles representando ao-menos u m a estrutura diferente.
13
O espectro de C-n.m.r. do heterop o l i s s s a c a r l d e o de C. confu_ sa (Fração-C), mostrou que este era e s t r u t u r a l m e n t e diferente da Fração-A, o componente correspondente de C. a l p e s t v i s . E m bora o espectro contivesse sinais comuns em 6 104,9; 103,7 e 100,0; suas respectivas proporções e r a m diferentes. Hidrólise parcial da Fração-C forneceu um p o l i s s a c a r l d e o cujo espectro
de C-n.m.r. era semelhante ao m a t erial correspondente o b t i do da Fração-A de C. alpestr-Ls. C. amaurocraea continha dois p o lissacarldeos, extraídos com h i d r ó x i d o de potássio aquoso a quente, e dando complexos cúpricos insoliiveis com solução de Fehling. Tratamento dos complexos cúpricos com resina originou o polissacarldeo insolúvel na água, pustulana, uma 3-D-glucopi_ ranana linear em ligações (1 ■+ 6) p r e v iamente encontrada como um componente de outros liquens (4_9,_ 57) e uma g a 1 actnmanana solúvel na água e contaminada com pustulana. A galactomanana embora tendo uma estrutura geral já descrita anteriormente pa ra os dois outros liquens do gênero Cladonia3 tinha u m
espec-13
-tro de C-n.m.r. cuja região de C-l diferiu de todos aqueles previamente determinados com a possível excessão daquele da galactomanana de R. usnea (27).
Componentes polissacarldicos estruturalmente d i f e r e n tes de C. alpe stris e C. confusa foram isolados em rendimento baixo dos sobrenadantes correspondentes aos já citados p r e c i pitados obtidos com solução de Fehling. Aquele de C. alp&stris
continha galactose, manose e alguma glucose e uma alta propor ção de unidades a -g-manopiranosil em ligações (1 ■+ 2), aparen temente na forma de uma cadeia substituída nas posições -6 por unidades 3~D-galactofuranosil (Estrutura 5) . Seu e s pectro de
3-D-Galf 1 + 6 -a-Ç-Manp- (1 2 )-5 13
-C-n.m.r. tinha uma região de C-l complexa. V i r tualmente ne-13
nhum polissacarideo estava presente n o s o brenadante do passo de Fehling para o liquen C. a m a u r o c r a e a .
Glucanas de liquens
Os liquens geralmente poss u e m u m c o m p o n e n t e galactoma nana e uma ou duas glucanas.
Desde os estudos iniciais de B e r z e l i u s em 1815 (12) o curso de análises dos componentes p o l i s s a c a r i d i c o s de diver - sos liquens vêm experimentando novos processos de fracionamen to para a obtenção de polissacarideos puros. Estes métodos in cluem, por exemplo, precipitação por com p l e x a ç ã o cúprica inso lúvel em água usando solução de F e h l i n g (31) e p r e c i pitação com hidróxido de cetiltrimetilamonio (6 6).
3-D-Glucanas de liquens
Entre as B_glucanas comuns em liquens temos a já ante riormente citada liquenana, uma p-g-glucana linear com liga - ções (1 3) e (1 4) na proporção de 3:7 (16, 52) como na estrutura preponderante 6^ . L iquenana constitui aproxi m a d a
-- B--S--Glcp--(1 ■+ 4) --B--D--Glcp--(1 4) 0DGlcp (1 + 3)
-6
mente 10% do liquen C. •islanã-ioa (musgo da Islândia) (23) e está presente também em outras espécies liquênicas, incluindo Usnea rubeseens (56), Alector-ia sulcata (Lev.) N y l . e Alecto- ria sarmentosa (Ach.) Ach (71) e foi ob t i d a des t a s três e s p é cies por precip i t a ç ã o a frio após e x t r a ç ã o aquosa quente.
O e s p ectro de C-n.m.r. da liquenana, ob t i d o em c am po mag 'tico alto (9), correspondia a u m a s equência repetiti va (1 -*■ 4) , (1 -*■ 4) , (1 3) , dando quinze sinais em vez dos dezoito esperados, por causa da superp o s i ç ã o de sinais. A pre sença de duas ligações consecutivas (1 3) não é provável , pois não h á nenhuma separação de sinais asso c i a d o com ligações
(1 3) em contraste com aquèles associados com ligações (l-*4). E. prunastr-i possui uma 3-g-glucana e s t r u t u r a l m e n t e diferente, com ligações (1 ■+ 3) e (1 4) n u m a relação de 3:1, precipitada por hidróxido de c e t i l t r i m e t i l a m o n i o da fra ção solúvel em água fria (71) .
U m a 3 -2-glucopiranana com ligações (1 -*■ 6) parcialmente acetilada, foi extraída com água quente do líquen Gyrophora e scuZenta Miyoshi e purificada pelo m é t o d o de congelamento e degelo. O grau e posição (s) de substituição n ã o tem sido ain da d e t e rminado (6 8). Uma glucana semelhante também foi e n c o n trada e m LasaZZia pensyZvanica (56) e L a sa ZZ ia papuZosa (Ach.) Llano (68) . A glucana desacetilada forneceu u m espectro de
13
-C-ri.m.r. (63) sfemelhante aquele da pust u l a n a (11), uma 8 -glucana linear com ligações (1 -*■ 6) ob t i d a dos liquens UmbiZi_ caria pustuZat a (L) Hoffm. (49) e U mbiZicaria hirsuta (sw. ex. Wester) Ach. (57), por precipitação a frio após extração aquo
sa quente. Glucanas tipo pustulana O - a c e t i l a d a s foram obtidas de outras espécies do gênero UmbiZicaria como V. anguZata, U. caroZiniana e U. poZyphyZZa (57), também por p r e c i p i t a ç ã o a frio após e x tração aquosa quente.
Cab e aqui citar a correlação t a x a n o m i c a m e n t e Intima dos gêneros G yr ophor as LasaZZia e U mb i Z i c a r i a > todos perten - centes à família Gyrophoraceae e com a o c o r r ê n c i a comum e
característica da pustulana (57). Assim, os polissacarídeos de liquens p odem ser usados em alguma e x tensão como compostos de referência para a classificação quimotaxonomica dos liquens
(70) .
g-Glucanas de liquens
Entre as a-glucanas comuns em liquens temos a jã cita da isoliquenana-, uma a-Q-glucana contendo ligações (1 — - 3) e
(1 4) numa relação de 1 1 r9 (60) . Tal componente estã presen te em C . islandica (16), Aleatória sulcata (Lev.)Nyl., e A l e a tória sarmentosa (Ach.) Ach (71).
Parmelia caperata (L.) Ach. forneceu uma a-D-glucopi- ranana insolúvel em ãgua fria tendo resíduos em ligações (1 3) e (1 -»■ 4) em proporções e q u i m o l e c u l a r e s . Como não havia liga ções sucessivas (1 3) e (1 -*■ 4) , a glucana é e s t r u t u r a l m e n te semelhante à nigerana (6, 7), (unidade re p e t i t i v a 7^). G l u
agGlcp (1 + 3) a Q G l c p (1 + 4)
-7
canas tipo nigerana também estão pres e n t e s e m pequena quanti dade em quatro liquens do gênero Claãonia, C . c r i s p a t a 3 C. mi_ tis3 C. rangiferina subsp. gris ea3 e C. squamosa (56).
A partir de análises químicas (76), a glucana de Stereocaulon japonicum aparentemente tinha ligações a-(l->- 3) e a-(l 4) numa relação de 3:1, mas d e m o n s t r o u - s e ser esta
- 13
-relaçao de 2:1 por um estudo de C-n.m.r. (77). Esta técnica foi útil por mostrar que as aQglucanas obti d a s de Sphaero -phorus globosus e Acroscyphus sphaerophoroiães tinham ligações
(1 3) e (1 4) numa relação de 2:3, com menos de 6% de l i gações (1 -*• 6) , não ficando claro este últ i m o valor somente por análises de metilação (71) .
Uma a-Q-glucana de E. p r u n a s t r i , que perman e c e u no li quido sobrenadante, apõs precipitação com hidr ó x i d o de cetil- trimetilamonio continha ligações (1 3) e (1 + 4) numa rela ção de 'v 3:2, relembrando isoliquenana (71) .
Uma glucana, precipitada pelo frio apõs uma extração aquosa quente, foi isolado do líquen E. usnea (27) . As análises de metilação most r a r a m que a glucana de R. usnea contem ligações
(1 + 3) e (1 + 4) numa relação de 62:38. Seu espectro de 13
C-n.m.r. mostrou principalmente sinais de C-l em 6 102,8 e 101,9 típicos do componente principal a - g - g l ucopiranana que aparece., no sobrenadante (35). Um sinal m e n o r de C-l em <5 104,8 corresponde a um sinal de um componente g alactomanana ao in -vis da liquenana que daria também outros sinais em 6 105,1 e 106,0. O prod u t o insolúvel estava presente n u m a proporção mui
13 ~
to pequena,' pois seu espectro de C-n.m.r. n a o continha um sinal típico de C-l em 6 101,3. Ò sobrenadante dessa p r e c i p i tação a frio, acima descrita, continha uma a-g-glucana e uma galactomanana que foram fracionadas us a n d o solução de Fehling. A a-g-glucana solúvel foi isolada do sobrenadante do passo de Fehling e tinha uma rotação especifica de +243°. Seu espectro de ^ C - n . m . r . mostrou semelhanças aquele da isoliquenana* e m bora um sinal maior em 6 1 0 1 , 0 e outro m e n o r e m 6 7 9,3..indi -.
_ __ _ 0 e s p e c t r o de C - n . m . r . da i s o l i q u e n a n a e de i n t e r e s s e d e £ de que a r e l a ç ã o de s i n a i s de ^ - s u b s t i t u í d o s C - 3 e C- 4 em 6 62,1; 8 1 , 9 e 7 9 , 3 r e s p e c t i v a m e n t e é 6 6 : 3 4 , i n d i c a n d o uma p r o p o r ç ã o m a i o r de r e s í d u o s 3 - j D - s u b s t i t u í d o s do q u e os valjo res de 60% (16) e 55% (60) que f o r a m p r e v i a m e n t e c i t a d o s .
cassem algumas diferenças estruturais (as proporções das l i gações (1 4) são menores). Análises de m e t i l a ç ã o indicaram que as ligações (1 3) e (1 ■+ 4) esta v a m presentes, respecti vãmente, nas proporções de 69% e 2 2%, com estr u t u r a r e p e t i t i va preponderante como em 8^, com três ligações c o n s e c u t i v a s
(1 -*■ 3) interceptadas com ligações isoladas (1 4) . Uma peque
- a - g - G l c p - d -*■ 3)-a-Ç-Glcp-(1 -*■ 3)-a-Q-Glcp-(1 3)-a-D-Glçp-(l -+
4)-8
na proporção de ramificações estava pr e s e n t e , com unidades terminais não redutoras (4%); 3,4- (3%) e 2,3 - di-O-substituidas (2%) . As ligações (1 3) e (1 4) da glu-cana estão distribuídas regularmente ao longo da cadeia l i near, tendo em vista os dados da degrad a ç ã o de Smith f o r n e c i dos a seguir. O poliol resultante foi submetido a uma hidrólise ácida branda e o produto obtido forneceu dois pontos p r i n c i pais por c.p. A mistura foi fracionada por c r o m a t o g r a f i a em coluna de celulose, dando, na ordem de emergência, três produ tos numa relação de 17:30:4. O componente p r incipal tinha uma rotação especifica de +177°, e por hidr ó l i s e deu glucose e eritri-tol*. Analises de metilação m o s t r a r a m que as unidades glucopiranosil estavam presentes como terminais não redutores e unidades 3-0-substituídas numa r e l ação de 1:2. Estes dados são consistentes com uma estrutura O-a-D-glucopirancsil (l->- 3)- O - a - g - g l u c o p i r a n o s i l - (1 3)- O - a - D - g l u c o p i r a n o s i l - (1 2) Q -eritritol (Estrutura 9J . Correspondente com esta estrutura,
a -g-Glcp- (1 3)-a-g-Glcp- (1 3)- a - Q - G l c p - (1 2) -Ç-eritritol
que tem três unidades de glucopiranosil , o espectro de
13 ~
C-n.m.r. contem três sinais de C-l em 6 100,9; 100,8 e 99,5; além de três sinais corrrespondentes a carbonos 0-sub£ tituidos em 6 82,2; 82,0 e 80,3 e cinco sinais corresponden tes a grupos hidròxílicos primários não substituídos em 6 64,3; 62,4; 62,1 (2 sinais) e 61,5. O o utro produto da degradação de Smith pareceu ser um derivado O-hidroxietilideno de 9 e dessa forma., a glucana originai., .teria u m a .estrutura--principal repetida <8, lembrando a estrutura p o stulada para a glucana já isolada do líquen Stereocaulon japonicum (76) .
Uma glucana precipitada após congelamento e degelo de uma extração aquosa quente de Cladonia alpestris <42), con t i nha glucose (91%), manose (5%) e galactose (3%) e foi h o m o g ê nea por ultracentrifugação, tendo um c o e f iciente de sedimenta ção de 2.1 S. A glucana tinha a configuração a desde que seu
13
espectro C-n.m.r. continha dois sinais de C-l em campo alto em ô 100,8 e 101,8 (35). Após metilação os produtos foram convertidos a acetatos de O-metilglucitol e analisados por g.l.c.-m.s., usando u m a coluna capilar revestida com O V - 2 2 5 — OV-17 (3:1) onde derivados 2,3,6- e 2,4,6- foram detectados . Suãs proporções relativas indicaram que as unidades glucopira nosil ligadas (1 3) e (1 4) esta v a m presentes numa rela -ção de 1:1. Estas estavam distribuídas regularmente ao longo de uma cadeia linear desde que umã degrad a ç ã o de Smith, ipcor porando condições hidrolíticas suaves, deu por c.p. um único ponto correspondente ao 2- O-a-g-glucopiranosil-g- eritritol , como na glucana de Aspergillus niger (nigerana) (6, 7), Estru tura 1_. Como n o líquen C. a lpestris3 uma ct-g-glucana insolú - vel na água foi obt i d a por congelamento de u m extr a t o aquoso
quente do líquen Claãonia confusa (42). A glucana resultante tinha uma rotação específica de +189°, e deu um espectro de
13
-C-n.m.r. semelhante aquele da a-glucana de C.alpestris. R e síduos 3-0- e 4-0-substituídos também e s t avam presentes em uma relação de 53:47 (análises de metilação) e e s t a v a m di s t r i b u í dos regularmente ao longo de uma cadeia linear como evidencia do pela formação de 2-0- a - y - g l u c o p i ranosil-g-er itritol através de vima degradação de Smith.. -JL g l u c a n a tinha- uma estrutura s e melhante àquela da nigerana (6,7), E strutura 1_.
É de interesse citar que vá r i a s glucanas isoladas de liquens têm se mo s t r a d o ativas contra sarcomas sólidos 180 im plantados subcutâneamente em ratos.
0 principio ativo isolado em um estado p u r o do líquen Gyrophora esculenta Miyoshi (6 8), vima g l u c a n a tipo pustulana contendo ligações a-g-(l ->-6), mas d i f e r i n d o desta por conter 4-10% de grupos acetil situados em 0-3 (74), m o s t r o u efeito antitumorlgeno ativo. O grau de inibição foi de 99,1% e uma regressão c o mpleta do tumor ocorreu e m oito dos dez ratos tes_ tados (21). Desacetilação abaixou a atividade, e troca de g r u pos 0-acetil por grupos 0-metil da glucana, forneceu produtos inativos (74).
De modo semelhante, glucanas p a r c i a l m e n t e acetiladas têm sido isoladas dos liquens Lassal ia pa pu lo sa ( A c h . ) L. (68,74) e Vmbilicaria sp (57), com grau de inibição de 98,4% (6 8) e 97% (57) e u m a regressão completa do tumor em nove (63) e seis (57) dos dez ratos testados, respectivamente. Liquena- na e isoliquenana isolados do l í q u e n C. -islandica (L.) Ach. var. orientalis Asahina m o s t r a r a m graus de inibição de 100% e 99,6%, r e s p e c t i v a m e n t e (21).
Embora poucos trabalhos têm sido feitos sobre a dis - tribuição de polissacarídeos liquênicos, aqueles do tipo li - quenana ocorrem em muitos líquens, com ou sem polissacarídeos tipo isoliquenina (2 1).
O mecanismo de ação antineoplãsica destes polissacarí deos i considerada como sendo dependente da reação do hospe - deiro, isto ê, apresentarem seus efeitos mediados pelo h o s p e deiro,. pois a inibição do tumor. .s_5_._sue toxna-pexcepiív-el - no grupo tratado depois da segunda semana. E nenhuma das amos - tras ativas se mostrou diretamente citotõxica (21,74).
Convém também citar o efeito a n t i n eoplãsico sobre sar coma-180 implantado em ratos obtido de extratos de alguns fun gos basidiomicetos (2 1).
Como se pode observar, os líquens são sugeridos como uma fonte promissora de polissacarídeos com este tipo de efei to antineoplãsico (2 1) e fica portanto justificado seu estudo mais detalhado em termos de isolamento, purificação e análise química estrutural para futuros testes.
MATERIAIS E MÉTODOS
Métodos g e r a i s : as rotações ópticas foram obtidas com polarímetro automático P e r k i n - E l m e r , mo d e l o 141 a 25°. Para estas determinações os polissacarídeos e o oligossacarídeo fo ram solubilizados em água.
As evaporações foram realiz a d a s em evaporador r o t a t ó rio, modelo Buchi, à v á cuo e em banho de água na temperatura média de 50°, com excessão dos produtos de formõlise de a m o s tras metiladas, onde a temperatura d o banho de água foi de 30°.
As medidas de pH foram usualm e n t e tomadas à temperatu ra ambiente em aparelho Clamann - Gralmert M V 85 (Dresden).
As determinações e s p e c t r o f o t o m é t r icas foram efetuadas em aparelho Coleman Junior, modelo 6A, para a região do espec tro visível.
0 componente heteropolis s a c a r l d i c o foi submetido a eletroforese em fitas de acetato de celulose (Cellogel), u t i lizando tampão barbital 0,04 M; pH 8,6 e tampão borato d e - s ó dio 0,05 M; pH 8,6. A corrida foi de 80 minutos, com 200 V e 1,5 m A por fita, em equipamento Fanem Ltda., com câmara d e l m e r são da Chametron. 0 componente 8 -g-glucana também foi e x a m i nado por eletroforese utilizando tampão borato de sódio 0,05 M; pH 8,6; nas mesmas condições já citadas. P a r a visualizar.proteína
utilizou-se o sistema com Coomassie b r i l l i a n t blue R250 (69) e para visualizar glicoprotelna empregou-se o r e a tivo de Schiff (62).
A cromatografia liquida-gasosa (g.l.c.) foi realizada em cromatõgrafo Varian, modelo 2440, com d e tector de ionização de chama, usando-se nitrogênio como gás de arraste n u m fluxo de 37,5 mL/min. A temperatura da câmara de injeção foi de 200° e do detector 250°. A seguinte cõluna foi empregada: a) c o l u na de aço inoxidável (200 x 0,15 cm d.i.) e m p a c o t a d a com ECNSS-M a 3% (p/p) sobre "Gas Chrom* Q" de 100-120 mesh. Esta coluna foi utilizada para a determinação q u a n t i t a t i v a dos ace tatos de alditõis (â temperatura de 180° ou com p r o g r a m a ç ã o de temperatura de 130 a 180°, com variação de 4o por minuto) e dos acetatos de alditõis parcialmente metilados (â t e m p e r a t u ra de 160°), sendo seus tempos de retenção (T) r elativos ao do xilitol penta-O-acetato e do 1,5 - d i - 0 - a c e t i l - 2 , 3 , 4 ,6-tetra - O-metil-g-glucitol, respectivamente.
As determinações quantitativas dos m a t e r i a i s a n a l i s a dos por g.l.c. foram obtidas de acordo com o m é t o d o da t r i a n gulação, segundo Sawardeker et a l . (65).
A cromatografia llquida-gasosa a c oplada a e s p e c t r o m e - tria de m assa (g. 1. c.-m. s .) foi realizada com os d e r i v a d o s ace tatos de alditõis parcialmente metilados em e s p e c t r ô m e t r o mar ca Finnigan, modelo 4000, dotado de um sistema de dados Inco 2300 e equipado com colunas capilares (0,25 m m d . i . , x 30 m) , revestidas com; b) OV-17; c) DB-210; d) OV-225 — OV-17 ( 3 : 1 , p/p e 1:3, p/p). Os espectros foram obtidos por i m p a c t o de elétrons, repetitivamente a cada dois segundos, desde m a s s a 40 até massa420. As injeções foram feitas dire t a m e n t e na c o l u n a a 50°, e então, o aparelho foi rapidamente p r o g r a m a d o (40°/min)
a 2 2 0° (então m a n t i d o ) . O gás de arraste foi o h é l i o com uma velocidade linear de 22 cm/s. Identificação final dos produ - tos foi realizada por co-injeção com padrões e as áreas dos picos foram obtidas por integração automática.
Sobre m etilação do heteropolissacarídeo, acetato de
2,3-di-O-metil-xilitol foi identificado como u m produto u s a n do a coluna de OV-225 — OV-17 3:1, p/p (coluna d) conduzido a uma ambiguidade desde que o produto acima é idêntico ao isõme ro 3 , 4-di-O-metil. Para distinguir entre os dois tipos de substituição, a mistura de a l d o s e s - O -metiladas foi tratada com ácido clorídrico 3% em metanol, a refluxo, por três horas e o produto resultante foi examinado por g.l.c. u s a n d o a coluna de DB-210 (coluna c ) , 50°, rapidamente progra m a d a a 200° (então mantido) .
Para a análise dos glicosldeos octil - a c e t i l a d o s utili zou-se a seguinte coluna; e) coluna capilar de q u a r t z o (0,32 mm d.i. x 60 m) quimicamente ligada com Durowax-4 (J & W.Scientific). As injeções foram feitas diretamente na coluna a 50° e então rapidamente programada (40°/min) até 230° (então m a n t i d o ) . 0 gás de arraste foi o hidrogênio, com veloci d a d e linear de 80 cm/s. G.l.c.-m.s. foi realizada em e s p e c t r ô m e t r o Finnigan, mo delo 4000 nas mesmas condições já descritas..
As cromatografias em papel (c.p.) foram efet u a d a s p e los métodos ascendente e descendente, u t i l i z a n d o - s e como su - porte papel W h a tman n9l, com os seguintes sistemas de s o l v e n te; f) método ascendente* u t i l i z a n d o benzeno-n-butanol-piridi^ na-água (1:5:3:3, v/v, fase s u p e r i o r ) . Com o v i s u a l i z a d o r dos açúcares obtidos por hidrólise ácida total (TFA 2 M, 100°, 15 h (2) ou H2S0 4 0,5 M,- 1 0 0°, 18 h, n e u t r a l i z a ç ã o BaCC>3) ' ^ ^ 7)
utilizou-se nitrato de prata alcalino (72) ou cloridrato de para-anisidina (40) e suas respectivas migrações foram c o m p a radas aos padrões utilizados de glucose, galactose, ma n o s e e xilose. A migração do oligossacarideo da extração metanòl-ãgua 4:1 foi relacionada â da g-galactose (R(;A L ) ; g) m é t o d o descen dente, utilizando n-butanol-etanol-ãgua (2:1:1, v / v ) . Como vi_ sualizador dos oligossacarideos obtidos pela d e g r a d a ç ã o de Smith controlada do h e teropolissacarldeo e da 0-D-glucana uti lizou-se nitrato de prata aquoso 1 0% e h i d r ó x i d o de amónia concentrado (1:1, v/v), (59). A revelação foi feita em estufa a 1 2 0° e as respectivas migrações foram compar a d a s ao padrão utilizado de l-O-0-D-glucopiranosil-D -glicerol (R„~); h) m i- todo descendente, utilizado n-butan o l - e t a n o l - ã g u a (40:11:19 , v/v), com o mesmo procedimento de v i s u a l i z a ç ã o (59) e r e v e l a ção do sistema g.
A cromatografia em camada delgada (t.l.c.) foi efetua da em placas de sílica gel Merck (20 x 20 cm com 0,25 m m de espessura) com o seguinte sistema de solvente; i) b e n z e n o - etanol-ãgua-ãcido acético (200:47:15:1, v/v) e a v i s u a l i z a ç ã o foi feita por nebulização da placa com solução de metanol-ãc:L do sulfúrico (9:1, v/v), seguindo-se de a q u e cimento a 100° du rante 15 minutos. As migrações dos m o n o s s a c a r í d e o s obtidos por hidrólise ãcida total (TFA 2 M, 100°, 15 h) foram c o m p a r a d a s 'aos mesmos padrões utilizados no sistema f.
-. A determinação de açúcar total foi feita pelo m é t o d o do fenol-ácido sulfúrico descrito por Dubois e c o l a b o r a d o r e s
(18); proteínas totais, pelo m é t o d o do Lowry e c o l a b o r a d o r e s (51); conteúdo de pentoses do h e t e r o p o l i s s a c a r l d e o por uma can binação dos métodos de A l b a u m e Umbreit (1) e Dische (17) e
nitrogênio tòtal, pelo método de micro-Kjeldahl.. (58) .
0ponto de fusão da a >a-Q-trealose foi obtido em .apa relho HMK 69 - 268-L, usando-se termômetros de Anschúzt. Os va lores de peso seco dos polissacarídeos foram obtidos com amos tras em estufa a 1 0 0° até peso constante.
Coleta e preparo do m a t e r i a l : o líquen Cora pavonia foi cole tado na Serra do Mar-Paranã-Estrada da Graciosa, a aproximada mente 1,0 Km do posto de Policia Florestal e m direção a Morre tes a uma altitude de 900 metros e situado na e n c o s t a do m o r ro, em locais Íngremes, onde é difícil o d e s e n v o l v i m e n t o de plantas superiores. Como seu crescimento é em barr a n c o s e co- letâneamente com outras espécies vegetais, como musgos e di - versas plantas rasteiras, foi necessário c u idadosa limpeza da superfície liquênica com posterior expo s i ç ã o ao ar e sol, ou e m estufa, com ventilação, â temperatura de 60°, para secagem.
Apôs completamente secos (150 g) f oram fragmentados e extraídos a refluxo por duas vezes c o n s e c u t i v a s com b e n z e n o - etanol (9:1, v/v; 1,5 L) na temperatura de 70° por três horas. A seguir o material foi filtrado ainda quente.
Isolamento e cristalização da g , g - D - t r e a l o s e : o resí d u o liquê nico seco (135,18 g) proveniente da e x t ração b e n z ê n i c a foi a seguir tratado a refluxo com metanol-^água (4:1, v/v,' 1L) 'por um período de 3 horas, filtrado a quente, e o filtrado, evapo rado a vácuo ati secura, foi tratado em solução a q u o s a com re sinas Dowex 5 0W x 8 (forma H+ ) e Dowex 2 x 8 (forma H C O3). Fil^ tração seguida por evaporação a vácuo pro v e ú u m resíduo de 6,7 g, que correspondeu a 4,4 g% do peso do líquen original.
Foram analisados por c.p. (sistema f) o resíduo s o l ú b i l i z a d o em água e os seus respectivos produtos apôs hidrólise ácida to tal (TFA 2 M, 100°, 15 h ) .
Do resíduo anterior (3,0 g) foram submetidas ao pro - cesso de cristalização em meio e t a n ô l i c o (19) e m a n t i d o em "freezer" por vários dias.
Isolamento e purificação dos polissacarldeos a . Extração aquosa
O líquen (125,16 g) que tinha sido previamente extraí_ do com benzeno-etanol e metanol aquoso foi tratado com água
(2 L) , pH 7,0 a 100° por oito horas. O res*Iduoi foi filtrado en quanto quente e o processo de extração r e petido cinco vezes nas mesmas condições. Os filtrados combin a d o s foram congelados, com posterior degelo à temperatura ambiente, e o m a t erial i n solúvel não carboidratado que se formou foi centrifugado e se parado. O sobrenadante (1 L) obtido foi c o n c e n t r a d o a vácuo ati 200 mL e continha 5,5 g de p o l i s s a c a r l d e o extraído que foi precipitado por adição de excesso de etanol. 0 produto polis- sacarldico foi dissolvido em água (200 mL) e adicionado de so lução de Fehling (200 mL) com posterior repouso em r e f r i g e r a dor por 24 horas. O precipitado que se formou foi filtrado e lavado sucessivamente com hidróxido de p o tássio aquoso 2% a frio e metanol. O complexo cúprico foi decomp o s t o por agita - ção em uma suspensão aquosa de resina Dowex 50W x 8 (formaH+) que foi filtrada e o filtrado c o n c e n t r a d o para um pequeno v o lume (10 m L ) . Adição de excesso de etanol precipitou o h e tero polissacarldeo que foi isolado. Este foi rediss o l v i d o em água,
reprecipitado com solução de Fehling e dessa forma efetuado seu isolamento. 0 processo foi repetido por mai s três vezes, até que a composição dos açúcares fosse constante.
O sobrenadante da primeira preci p i t a ç ã o com solução de Fehling foi neutralizado com ácido acético 2 M,- dializado contra ãgua corrente por três dias e e n t ã o dèsionizado com re sinas Dowex 50W x 8 (forma H+ ) e Dowex 2 x 8 (forma H C O ^ ) . A solução foi concentrada para um pequeno volume (10 mL) , a di cionado de excesso de etanol e o p o l i s s a c a r í d e o p r e c i p i t a d o foi isolado após centrifugação. A p r e p aração demostrou estar impura desde que quando tratada por solução de Fehling forne ceu um novo precipitado. Este foi removido, a glucana i s o l a da, e o processo repetido por mais três vezes para remoção completa de impureza.
b . Extração alcalina
Com finalidade de se obter os componentes polissaca rldicos em maior rendimento, o liquen (100 g) foi ex t r a í d o su cessivamente com benzeno-etanol e metanol aquoso em condições já descritas, e então tratado com hidr ó x i d o de potássio aquo so 2% (1 L) a 100° por duas horas. A m i s t u r a foi n e u t r a l i z a da com ácido acético 2 M,- filtrada a quente, e o filtrado oon çentrado para um pequeno'volume (50 mL) foi adicio n a d o de ex cesso de etanol. O polissacarídeo p r e c i p i t a d o foi isolado por centrifugação e o sobrenadante etanõlico (900 mL) foi concen trado (20 mL) . O conteúdo do sobrenadante foi e ntão tratado com excesso de etanol e centrifugado. O p r e c i p i t a d o a p r e s e n tou rendimento de 11% do peso do líquen original. Uma alíquo ta (0,5 g) foi então dèsionizada com r e s i n a s Dowex 50W x 8
(forma H+ ) e Dowex 2 x 8 (forma HCO^) e analizada por c.p. (sistema f ) . O polissacarldeo isolado, como d e s c r i t o anterior mente, por conter inositol liberado no t r a t a m e n t o com álcali, foi então r e d i s solvido em água para pur i f i c a ç ã o e o processo de precipitação etanõlica repetido. O p o l i s s a c a r l d e o isolado estava livre de inositol e foi submetido ao pr o c e s s o com solu ção de Fehling, como jã descrito, p r o v e n d o he t e r o p o l i s s a c a r l - deo e 8-g-glucana.
Hidrólise ácida total dos polissacarldeos obtidos das ex t r a ções aquosa e alcalina e da g ,g-D - t r e a l o s e : amostras dos pol:L meros e da g^-g^-g-trealose (cerca de 3 mg) foram tratadas com os seguintes ácidos, tempos e concentrações: a) T F A 2 M (2mL) e aquecidas a 100° em m é d i a durante 15 horas. Apó s hidrólise, o excesso de solvente foi removido por evaporação, até secura. Os resíduos foram então dissolvidos em água; b) H2S O4 0,5 M (1 mL) durante 18 horas a 100°. Apó s hidrólise, a solução foi neutralizada com carbonato de bário, filtrada por papel e o filtrado evap o r a d o até pequeno volume.
As soluções contendo as amostras h i d r o l i s a d a s foram cromatografadas em papel (sistema f ) .
Redução e acetilação dos produtos de h idrólise ácida t o t a l ; os monossacarldeos obtidos da a>g-ç-trealose e dos polissaca- rídeos hidrolisados foram reduzidos c o m b o r o i d r e t o de sódio (67) na temperatura ambiente por 16 horas. Após esse período, com a finalidade de e l iminar os cationtes sódio, as soluções reduzidas foram tratadas com resina Dowex 50W x 8 (forma H+ ) , que converteu o sal b o r a t o sódio em á c i d o livre.
As soluções foram, a seguir, filtradas por papel e os f i l t r a dos resultantes foram evaporados à secura. O ácido bórico r e sultante deste tratamento foi e vaporado a v á c u o como éster vo lãtil borato de metila, por sucessivas evaporações com me t a - nol. Os alditõis foram acetilados, u s ando-se piridina-anidri- do acético (1:1, v/v,* 2 mL) , (67,75), na temperatura ambiente por 12 horas, quando o processo de acetilação foi inte r r o m p i do pela adição de gelo picado. A m i s t u r a de reação foi trasfe rida para um funil de separação e os açúcares acetilados fo - ram extraídos com clorofórmio. A piridina residual foi e l i m i nada da preparação por tratamentos com ácido s u lfúrico 0,5 M e em seguida a solução clorofòrmica foi lavada diversas vezes com água destilada, desidratada c o m sulfato de sódio anidro , filtrada por papel, e o solvente evaporado â vácuo. A análise por g.l.c. de cada amostra, na forma de acetatos de alditõis, foi conduzida na coluna a.
Desproteinização do heteropol i s s a c a r í d e o e 8-Q -glucana obti - das da extração a q u o s a : a despíroteinização de cada fração foi feita utilizando-se enzimas proteolíticas (subtilisina . tipo VII) deixando a m i s tura em "shaker" por 18 horas a 37°. R e p e tiu-se essa técnica por mais três vezes. A seguir utilizou-se hidróxido de sódio aquoso 40% n u m m e smo volume líquido que continha a amostra para se obter concentração final da soda na mistura de 20%, e esta foi deixada por 30 minu t o s em banho de água fervente. Após o que foi dosado proteína total pelo méto do de L o wry (51) e não se o b servou mais sua presença dentro dos limetes de sensibilidade do r e f e r i d o método. Após a des -proteinização das frações obtidas da extração aquosa foram efetuadas todas as análises a seguir.
