UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
LAURA SAMPAIO SALOMÃO
AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA APÓS
ISQUEMIA/REPERFUSÃO HEPÁTICA E HEPATECTOMIA SOB
INFLUÊNCIA DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO.
NITERÓI – RJ
2011
LAURA SAMPAIO SALOMÃO
AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA APÓS
ISQUEMIA/REPERFUSÃO HEPÁTICA E HEPATECTOMIA SOB
INFLUÊNCIA DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO.
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Ciências Médicas.
Orientador: Prof. Dr. JOSÉ MANOEL DA SILVA GOMES MARTINHO
Co-orientadora: Prof
a. Dr
a. MARIA APARECIDA GALHARDO
NITERÓI - RJ
2011
LAURA SAMPAIO SALOMÃO
AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA APÓS
ISQUEMIA/REPERFUSÃO HEPÁTICA E HEPATECTOMIA SOB
INFLUÊNCIA DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO.
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Ciências Médicas.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.Gilson Teles Boaventura
Prof. Dr.Lúcio Filgueiras Pacheco Moreira
Prof. Dr.Anielo Palombo
NITERÓI - RJ
2011
Aos meus pais, pelo estímulo, carinho e dedicação.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal Fluminense e ao Curso de Pós Graduação em Ciências Médicas pela oportunidade de realizar este curso.
À FAPERJ pelo apoio financeiro, possibilitando a execução do trabalho.
Ao Prof. Dr. José Manoel da Silva Gomes Martinho e Dra. Maria Aparecida Gallhardo pela orientação, estímulo e cooperação.
À Profa. Dra Andréa Rodrigues Cordovil Pires e a Mestranda Silvia Barbosa
Young pela dedicação e compreensão.
Ao Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura e toda a equipe do laboratório de nutrição experimental pela gentileza e carinho.
Às Profas. Dras. Eliene Carvalho Fonseca, Ana Maria Reis Ferreira, Juliana da
Silva Leite e Marcela Freire Vallin de Mello pela atenção e dedicação.
Ao Prof. Ms. Leandro Alves Pereira e a Prof. Dr. Ana Beatriz Fonseca pelos conhecimentos em estatística e grande ajuda.
RESUMO
Salomão LS. ...[dissertação]. Niterói: Pós graduação em Ciências Médicas, UFF, 2011.
Palavra-chave: regeneração, fígado, precondicionamento isquêmico
Este estudo teve como objetivo avaliar a regeneração hepática com modulação pelo precondicionamento isquêmico após isquemia e reperfusão e hepatectomia parcial. Foram usadas 24 ratas Wistar, de 12 semanas de idade, distribuídas randomicamente em quatro grupos: (SHAM) laparotomia, simulação cirúrgica e observação sob anestesia durante 60 minutos; (HEP) hepatectomia parcial após 55 minutos da abertura da cavidade; (GIR) Isquemia hepática por 30 minutos e posterior hepatectomia parcial; (PRE) precondicionamento isquêmico 10/10 minutos (isquemia/reperfusão) seguido de 30 minutos de isquemia e posterior hepatectomia parcial. Em todos os animais foi realizada laparotomia mediana, secção dos ligamentos falciformes e coronário esquerdo e a identificação e isolamento do pedículo hepático. Após 48 horas, os animais foram relaparotomizados, feito coleta de sangue para dosagem de aspartato aminotransferase (AST) e alanino aminotransferase (ALT) e remoção dos lobos remanescentes do fígado, avaliando assim, a regeneração através dos pesos inicial e final do fígado e para estudo da proliferação dos hepatócitos por método imunohistoquímico (PCNA). Para a análise dos resultados e comparação entre os grupos, foi aplicado o Teste de Mann-Whitney. Adotou-se o nível de significância de 0,05 ou 5% (P < 0,05). Em todos os grupos houve um alto índice de regeneração, sendo que o grupo PRE apresentou o maior índice. Houve diferenças significativas em relação à ALT e AST entre os grupos HEP-SHAM, GIR-PRE, GIR-SHAM E PRE-SHAM (P< 0,05). Com relação às enzimas ALT e AST, comparando com o grupo controle, ocorreu um aumento, o que caracteriza dano hepático devido ao procedimento cirúrgico. Também houve diferença significativa em relação à marcação de PCNA do grupo SHAM quando comparado aos demais grupos.
ABSTRACT
Salomão LS. ... [dissertation]. Niterói: MSc in Medical Sciences, UFF, 2011.
Keyword: regeneration, liver, ischemic preconditioning
This study aimed to evaluate liver regeneration modulation by ischemic preconditioning after ischemia and reperfusion and partial hepatectomy. 24 female Wistar rats of 12 weeks of age were assigned randomly into four groups: (SHAM) laparotomy, surgical simulation and observation under anesthesia for 60 minutes (HEP) partial hepatectomy after 55 minutes of the opening of the cavity, (GIR) Ischemia liver for 30 minutes and after partial hepatectomy, (PRE) 10/10 minute ischemic preconditioning (ischemia / reperfusion) followed by 30 minutes of ischemia and subsequent partial hepatectomy . In all animals, laparotomy was performed and section of the falciform and left coronary ligaments and the identification and isolation of the hepatic pedicle. After 48 hours, the animals were relaparotomized to collect blood for determination of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and removal of the remaining lobes of the liver for evaluation of regeneration through the initial and final weight of the liver and to study the proliferation of hepatocytes by immunohistochemistry (PCNA). For the analysis of results and comparison between groups, was applied the Mann-Whitney test. It was adopted significance level of 0.05 or 5% (P <0.05). In all groups there were high rates of regeneration, and the PRE group had the highest rate. There were significant differences for ALT and AST between the groups HEP-SHAM, GIR-PRE, GIR-SHAM E PRE-SHAM (P <0.05). With respect to the enzyme ALT and AST compared with the control group, there was an increase, which characterizes liver damage due to surgery. There were also significant differences in the PCNA labeling of the SHAM group when compared to other groups
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Procedimento anestésico: injeção intramuscular da associação de Cetamina
e Xilasina na face lateral da pata direita traseira. ... 23
Figura 2- Tricotomia abdominal na linha mediana de 8 X 5cm. ... 23
Figura 3- Rata anestesiada, instrumental micro cirúrgico e microscópio utilizado. 23 Figura 4- Abertura da cavidade abdominal. Incisão na Linha Mediana ... 23
Figura 5- Afastamento de musculatura abdominal e identificação dos órgãos... 24
Figura 6- Abordagem do pedículo hepático. ... 24
Figura 7- Sutura de musculatura da parede abdominal ... 24
Figura 8- Prevenção de hipotermia. Adaptação de luva cirúrgica, com líquido aquecido, em contato com o rato anestesiado. ... 24
Figura 9- Fotomicrografia mostrando fígado de rato pertencente ao padrão de positividade para PCNA. ... 34
Figura 10 - Fotomicrografia mostrando fígado de rato pertencente ao padrão de negatividade para PCNA. ... 34
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- MÉDIAS, EM GRAMAS, DOS VALORES DO PESO TOTAL HEPÁTICO, PESO INICIAL, PESO FINAL E PESO DO LOBO REMANESCENTE DOS GRUPOS SHAM, HEP, GIR E PRE... 29 Tabela 2- MÉDIA E DESVIO PADRÃO DE ALT, AST E PERCENTUAL DE
POSITIVIDADE DO PCNA DOS GRUPOS SHAM, HEP, GIR E PRE. ... 31 Tabela 3- TESTE MANN-WHITNEY PARA COMPARAÇÃO DE ALT, AST ,
PERCENTUAL DE POSITIVIDADE DO PCNA E REGENERAÇÃO DOS
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- MÉDIA DOS PESOS TOTAL, INICIAL E FINAL DO FÍGADO DAS RATAS DOS GRUPOS HEP, GIR E PRE. ... 30 Gráfico 2 - PESO TOTAL E PESO DA PARTE REGENERADA, EM GRAMAS, DO FÍGADO DAS RATAS DOS GRUPOS HEP, GIR E PRE. ... 31 Gráfico 3 - VALORES MÉDIOS DE AST E ALT. ... 32 Gráfico 4 - VALORES MÉDIOS DO PERCENTUAL DE POSITIVIDADE DO PCNA.33
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADN - ácido desoxirribonucleico ALT - alanina aminotransferase AST- aspartato aminotransferase C – Celsius
DP - desvio padrão g - gramas
GIR - grupo isquemia e reperfusão HEP - grupo hepatectomia
IL-6 - interleucina 6 IPC - precondicionamento IR - isquemia e reperfusão Kg - quilograma L - litro mg - miligrama mL - mililitro Mm - milímetro
NaCl cloreto de sódio
NF − fator nuclear kappa beta
PCNA - antígeno nuclear de células proliferativas PRE.- grupo precondicionamento isquêmico SHAM - grupo controle
SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO ... 13 2 – OBJETIVOS ... 17 2.1- OBJETIVO GERAL ... 17 2.2 -OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 3 – MATERIAL E MÉTODOS ... 19 4- RESULTADOS ... 28 5- DISCUSSÃO ... 35 6- CONCLUSÕES ... 42 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 43
1 INTRODUÇÃO
As novas técnicas de diagnóstico por imagem, associadas ao conhecimento da anatomia funcional e da fisiologia da regeneração, possibilitam o diagnóstico precoce
da doença hepática e favorecem o sucesso da cirurgia de ressecção do fígado.1 A
segurança na realização da ressecção do fígado também é potencializada pelo
conhecimento da fisiologia,2 das novas técnicas operatórias e das novas tecnologias
utilizadas no transplante hepático.1
A pesquisa a respeito da regeneração hepática tem crescido nos últimos 15 anos, devido ao surgimento dos transplantes inter vivos. Nestes, com receptores adultos, retira-se o lobo direito do fígado do doador, sendo que em alguns meses, o
INTRODUÇÃO 14
Agressões causadas ao fígado por ressecções cirúrgicas, traumas, infecções ou
intoxicações medicamentosas, tem como consequência perdas de parênquima.Como
resposta a essas agressões, ocorre o processo de regeneração.7 Pesquisas recentes
sobre a capacidade regenerativa hepática tem mostrado que a mesma é quase
ilimitada.7 Durante o processo de regeneração há uma proliferação de todas as células
do fígado, contudo, a maior parte dos trabalhos faz referência aos hepatócitos, já que
estes constituem cerca de 90% da massa hepática e 60% do número total de células.8
No tratamento dos tumores hepáticos, a ressecção de segmentos ou lobos é, algumas vezes, o procedimento utilizado. Durante o procedimento cirúrgico é de
extrema importância o controle do sangramento.9 Considerando-se que a isquemia
hepática é mais tolerada e traz menos consequências aos pacientes do que grandes hemorragias que venham a demandar transfusões de sangue e derivados, pode-se controlar o sangramento durante a dissecção do parênquima, procedendo-se à
exclusão total ou parcial do fluxo sanguíneo para o fígado, durante a ressecção.7, 9, 10
Este procedimento leva a uma privação do aporte de oxigênio ao tecido remanescente, o que pode acarretar em graus variáveis de lesão celular, resultando em hipóxia celular, metabolismo anaeróbio e formação de substâncias potencialmente lesivas como as
espécies reativas de oxigênio 11,12. A essa injuria tecidual dá-se o nome de lesão de
isquemia e reperfusão (IR). hepática 6 Tanto os sangramentos excessivos, quanto a
isquemia celular interferem diretamente na morbidade e mortalidade operatórias. Diversas substâncias liberadas durante o processo de IR têm sido identificadas e seu
papel no dano celular, estudados. 7, 13
Em 1908, com o objetivo de coibir sangramentos hepáticos, CANALENSE apud
PRINGLE5 criou uma técnica de pinçamento da tríade portal para indução de isquemia
hepática.14 Esta técnica tem sido um dos procedimentos utilizados nas cirurgias por
trauma hepático e nas ressecções hepáticas segmentares ou amplas, visando diminuir
as perdas sangüíneas.15 No entanto, a manobra de Pringle induz lesão isquêmica no
fígado remanescente, associada com o aumento de
INTRODUÇÃO 15
por alterações próprias desta síndrome, com liberação de enzimas hepatocelulares,
redução do fluxo biliar e disfunções metabólicas. 14
Outro procedimento que minimiza ou evita sangramentos é o clampeamento total do fígado com pinçamento da tríade portal concomitante a veia cava supra e infra
hepática, que no entanto leva a isquemia e induz sofrimento IR hepatocelular.16
A reperfusão hepática apresenta duas conseqüências benéficas que são a
restauração da oferta de energia e a remoção dos metabólitos tóxicos.17 No entanto, a
reperfusão causa graves consequências metabólicas em razão do retorno de sangue com pH ácido e rico em potássio para a circulação sistêmica. A restauração do fluxo sanguíneo é fundamental na prevenção de danos celulares a um órgão isquêmico, mas
a reperfusão per se pode agravar o dano celular isquêmico.7 No período de reperfusão,
ocorrem alterações tais como distúrbios da microcirculação hepática, hipotensão arterial, elevação da concentração sérica de aminotransferases e de desidrogenase láctica, disfunção mitocondrial e lipoperoxidação, relacionadas, na sua maioria, à
duração da isquemia.2 A reperfusão pode também agravar a lesão tecidual causada
pela isquemia. Essa conseqüência da reperfusão ainda não é totalmente entendida sendo, portanto, um campo de pesquisa, considerando-se a grande variedade de
fenômenos envolvidos na lesão.18
São utilizados vários tipos de procedimentos para proteger o fígado das lesões
de IR, tais como uso de drogas 3, 2, hipotermia9, precondicionamento isquêmico (IPC)9,
19, 20
e indução de IR sucessivas por clampeamentos intermitentes do pedículo hepático
por tempos diferentes. 7, 9
O IPC, seja farmacológico ou isquêmico, atua no período antecedente à isquemia, que se constitui numa fase de ativação de inúmeras alterações moleculares
INTRODUÇÃO 16
responsáveis pelas lesões de IR.2 Este termo, precondicionamemto isquêmico (IPC), foi
introduzido na literatura por SANTOS apud MURRY et al., 201017 e significa indução de
um pequeno período de isquemia seguido por pequeno período de reperfusão antes de
um período mais longo de isquemia7, 9, 16, sendo uma intervenção utilizada para
melhorar a tolerância à lesão de IR do fígado.2, 7, 9, 21 A relação do IPC com o
crescimento da tolerância à isquemia tem sido observado em vários órgãos além do fígado como coração, cérebro, medula espinhal, músculo esquelético, retina, rins,
intestino.9 Entretanto, apesar de estudos sobre o efeito protetor do IPC, o seu real
fundamento não está ainda claramente estabelecido. 7, 9
A partir dos trabalhos já realizados propomos um estudo sobre a influência do IPC na regeneração hepática após IR e hepatectomia parcial.
2 OBJETIVOS
2.1- OBJETIVO GERAL
Avaliar a regeneração hepática com modulação pelo precondicionamento isquêmico após isquemia/reperfusão e hepatectomia parcial
2.2 -OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o índice de regeneração hepática nos vários grupos.
Avaliar o grau de lesão hepática pelas concentrações de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT).
OBJETIVOS 18
Avaliar o fígado remanescente quanto à proliferação dos hepatócitos por método imunohistoquímico (PCNA).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Para esta pesquisa foram utilizados animais fornecidos pelo NAL – Núcleo de
Criação de Animais de Laboratório (UFF). Trabalhou-se com ratas da espécie Rattus norvegicus, da linhagem Wistar com 12 semanas de idade e peso médio de 300g. O Projeto foi submetido às regras do comitê de ética da UFF e aprovado sob o número 049/08.
Os animais foram mantidos no Biotério do Laboratório de Nutrição Experimental da UFF, até que completassem idade ideal para procedimento cirúrgico. Estes foram alimentados com ração comercial NUVILAB® para ratos e tiveram oferta livre de água potável. As ratas foram alojadas em gaiolas de poliuretano com grade de aço inox, com tamanho de 41 x 34 x 17 cm, ficando um animal em cada gaiola. Houve restrição alimentar seis horas antes do procedimento operatório.
Material e Métodos 20
Delineamento Experimental
Os animais, num total de 24 ratas, foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos cirúrgicos, descritos abaixo:
Grupo Controle - SHAM (n= 6) – animais submetidos a laparotomia, simulação cirúrgica e observação sob anestesia durante 60 minutos, período correspondente aos dos demais grupos;
Grupo Hepatectomia – HEP (n= 6) – animais submetidos à hepatectomia parcial após 55 minutos da abertura da cavidade.
Grupo Isquemia e Reperfusão - GIR (n= 6) – animais submetidos à isquemia de 30 minutos e posterior hepatectomia parcial.
Grupo Precondicionamento - PRE (n= 6) – animais submetidos ao IPC de 10/10 minutos IR seguido de 30 minutos de isquemia e posterior hepatectomia parcial.
Procedimentos Pré-operatórios
Todos os animais foram pesados e distribuídos aleatoriamente nos grupos. A anestesia dos animais foi feita com a associação de xilazina (10mg/Kg) e cetamina (60mg/Kg), por via intramuscular na face lateral da pata traseira direita (Fig. 1). Foi considerado anestesiado o animal, quando ocorreu a perda do reflexo córneo-palpebral e ausência do reflexo de retirada, ao estímulo doloroso por preensão da pata traseira esquerda.
A tricotomia da região abdominal, na linha mediana, de 8 X 5 cm, foi realizada por tricótomo (Fig. 2 e 3). Foi feita anti-sepsia com solução de álcool iodado a 2%, sendo usado um campo cirúrgico fenestrado na delimitação da área operatória.
Material e Métodos 21
Foi feita hidratação subcutânea com solução de NaCl 0,9% aquecida a 30°C. O
cálculo da hidratação foi feito baseado no peso do animal, utilizando-se 8% do peso corporal.
Procedimento Cirúrgico
As cirurgias foram feitas, aleatoriamente, intercalando os grupos cirúrgicos. Os animais foram postos sob colchão térmico a 37°C. Foi utilizado durante todo o procedimento operatório, microscópio cirúrgico nos aumentos de 6 a 16 e instrumental micro cirúrgico.
Após assepsia e anti-sepsia foi realizada laparotomia mediana, supra-umbilical, iniciando no apêndice xifóide, com 5 cm de extensão (Fig. 4). Realizada a secção dos ligamentos falciforme e coronário esquerdo e a identificação e isolamento do pedículo hepático, englobando o ducto biliar, artéria hepática e veia porta (Figura 5 e 6). Também em todos os animais, após revisão da hemostasia, o fechamento da parede da cavidade abdominal consistiu de um plano músculo aponeurotico com sutura continua com fio náilon 4-0 (Figura 7) e sutura separada de pele com náilon 5-0.
Procedimento pós-operatório
Após o procedimento cirúrgico, as ratas foram alojados individualmente nas gaiolas, aquecidas com bolsa térmica e cama própria para ratos, conhecida como maravalha (Figura 8) para evitar hipotermia, recebendo alimentação e água à vontade.
Os animais permaneceram 48 horas em observação, sendo então novamente anestesiados, conforme o protocolo descrito anteriormente e relaparotomizados para realização de coleta de sangue através de punção da veia cava infra hepática e remoção dos lobos remanescentes.
Material e Métodos 22
Após esses procedimentos foi realizada a eutanásia através de overdose de anestésico (Xilazina e Cetamina). Todos os animais foram sacrificados após 48 horas.
Os animais do grupo controle (SHAM) foram mantidos anestesiados pelo período de 60 minutos, sendo o mesmo tempo de procedimento dos demais grupos.
Nas cirurgias referentes ao grupo HEP, após os procedimentos comuns a todos os grupos, foi feita observação durante 50 minutos após abertura da cavidade, e hepatectomia dos lobos mediano e esquerdo.
Os animais do grupo GIR, foram observados durante 20 minutos, e em sequência, o pedículo ocluído através de clampe vascular microcirúrgico, promovendo assim, isquemia durante 30 minutos. Ao final da isquemia, foi realizado hepatectomia dos lobos mediano e esquerdo e liberação do clampe, para posterior reperfusão por 48 horas.
Para os animais submetidos ao PRE, foi feito oclusão por 10 minutos do pedículo hepático através de clampe vascular microcirúrgico, sendo este liberado por mais 10 minutos e novamente posicionado de forma a causar isquemia por 30 minutos. Ao final da isquemia, foi feita hepatectomia dos lobos mediano e esquerdo e liberação do clampe, para posterior reperfusão por 48 horas.
Material e Métodos 23
Figura 1- Procedimento anestésico: injeção intramuscular da associação de Cetamina e Xilasina na face lateral da pata direita traseira.
Figura 2- Tricotomia abdominal na linha mediana de 8 X 5cm.
Figura 3- Rata anestesiada, instrumental micro cirúrgico e microscópio utilizado.
Figura 4- Abertura da cavidade abdominal. Incisão na Linha Mediana 1
3
Material e Métodos 24
Figura 5- Afastamento de musculatura abdominal e identificação dos órgãos.
Figura 6- Abordagem do pedículo hepático.
Figura 7- Sutura de musculatura da parede abdominal
Figura 8- Prevenção de hipotermia. Adaptação de luva cirúrgica, com líquido aquecido, em contato com o rato anestesiado.
.
5
6 8
Material e Métodos 25
Determinações Bioquímicas, Imunohistoquímicas e Histológicas
O sangue coletado da veia cava inferior foi processado no Laboratório de Patologia Clínica do HUAP - UFF. Para avaliar a lesão hepática foram feitas as análises bioquímicas de ALT e AST.
Após a hepatectomia parcial de 70% (peso inicial), foi estimado o peso total do fígado. Após 48 horas, o fígado remanescente foi retirado e pesado. O percentual da massa hepática regenerada foi calculado, conforme a fórmula abaixo :
%= [C − (A − B)]/A × 100%, onde A = peso total estimado no momento da hepatectomia parcial; B = peso do fígado ressecado (aproximadamente 70% do peso total do fígado) e C = peso do fígado regenerado no momento do sacrifício.
As amostras teciduais do fígado foram identificadas e fixadas em formol tamponado a 10%. Foram, então, incluídas em parafina e enviadas para processamento histológico e imunohistoquímico.
Foram realizados cortes dos blocos e colocados em lâminas para análise. O preparo das lâminas foi realizado no Laboratório Fonte e a leitura destas feitas pelo Departamento de Patologia Veterinária da UFF.
Para a análise imunohistoquímica foram obtidos cortes, de 3 µm de espessura, aderidos em lâminas silanizadas, processados conforme a determinação do PCNA. As imagens foram captadas e analisadas por patologista em procedimento cego com o auxilio do microscópio de luz, sendo feito contagem de 1000 células, evidenciando os núcleos marcados, corados e negativos.
A análise da imunohistoquímica obedeceu o seguinte protocolo:
1. Desparafinização: colocar as lâminas silanizadas com os cortes na estufa a 60ºC ±5°C por, no mínimo, 40 minutos
Material e Métodos 26
a. 4 banhos de ECO-K / EasyClean Solvente ecológico, durante 5 minutos
b. 2 banhos de álcool absoluto, durante 5 minutos
c. 2 banhos de álcool 95%, durante 5 minutos
d. passar na água destilada
3. Bloqueio da peroxidase endógena: passar as lâminas no suporte por banho de 3.2 mL de peróxido de hidrogênio (30 Volumes) diluído em 250mL de metanol a 30% por 15 minutos, lavar em água destilada
4. Recuperação antigênica: colocar o suporte com as lâminas em cuba preenchida por tampão de recuperação antigênica (tampão citrato pH6 para o anticorpo anti caspase-3 e tampão Cell Marque Trilogy®1:400 [código 92OP-07]em água destilada para o anticorpo anti PCNA), em câmara de pressão elétrica para imuno-histoquímica por 5 minutos a 125ºC, em alta pressão; ao final, retirar e deixar resfriar por 20 minutos em água corrente e lavar com tampão PBS.
5. Diluição dos anticorpos que serão utilizados, com solução diluidora comercial Biocare Da Vinci Green (código PD900M) enquanto as lâminas estão na fase de recuperação antigênica; caspase 3= 1:50 e PCNA= 1:400.
6. Bloqueio de ligações inespecíficas: presente na solução diluidora de anticorpos.
7. Incubação com o anticorpo primário (por duas horas)
8. Lavagem com tampão PBS
9. Incubação com o polímero - anticorpo secundário e reagente de ligação –
Polímero Mach4 para tecido de rato e anticorpo policlonal e Polímero Mach4 para tecido de rato e anticorpo monoclonal (Biocare, códigos RMR622H e MRT511H, respectivamente)por 30 minutos de acordo com o protocolo que acompanha o kit, podendo este ser alterado após testes internos de validação.
Material e Métodos 27
11. Revelação com DAB (5-diaminobenzidina, Biocare, código DS900L) por 5 minutos.
12. Lavagem com água destilada
13. Contra-coloração com hematoxilina de Harris por 30 segundos(Easy Path código EP101071)
14. Lavagem com água amoniacal (10 gotas de amônia para cada 250 ml de água destilada)
15. Desidratação dos cortes em
a. 2 banhos de álcool 95%, 2 minutos
b. 2 banhos de álcool absoluto, 2 minutos
c. 4 banhos de ECO-K / EasyClean Solvente ecológico, 2 minutos
16. Montagem das lâminas
Análise Estatística
Todos os dados foram expressos sob forma de tabelas e gráficos com os valores de médias± DP (desvio padrão). Para a análise dos resultados foram aplicados os testes segundo a natureza das variáveis. Para a análise dos resultados e comparação entre os grupos, foi aplicado o Teste de Mann-Whitney. Adotou-se o nível de significância de 0,05 ou 5% (P < 0,05).
4 RESULTADOS
O estudo estatístico é apresentado a partir de dados obtidos nas análises das amostras coletadas em cada grupo.
Para avaliar o crescimento do parênquima hepático remanescente, foram
calculadas as relações entre os pesos inicial, final e total do fígado, assim como o peso da parte regenerada.
A partir da hepatectomia parcial de 70% (peso inicial), o peso total foi estimado. Após a regeneração, calculou-se a porcentagem dos pesos finais e dos pesos das partes regeneradas, relativas ao peso total. Para o cálculo do peso da parte regenerada, usou-se a fórmula:
%= [C − (A − B)]/A × 100% , onde:
A = peso total estimado no momento da hepatectomia; B = peso do fígado ressecado e C = peso do fígado regenerado no momento do sacrifício.
RESULTADOS 29
Essas relações são mostradas na Tabela 1 e ilustradas nos Gráficos 1 e 2.
Tabela 1- MÉDIAS DOS VALORES DO PESO TOTAL HEPÁTICO, PESO INICIAL, PESO FINAL E PESO DO LOBO REMANESCENTE DOS GRUPOS SHAM, HEP, GIR E PRE. GRUPOS PESO TOTAL (A) PESO INICIAL (B)
PESO FINAL (C) PESO DA PARTE
REGENERADA
(C- (A-B)) Gramas Gramas Gramas Porcentagem Gramas Porcentagem
SHAM 6,84 6,84
HEP 6,59 4,62 5,95 90,01% 3,97 60,03%
GIR 6,5 4,55 5,85 89,93% 3,9 60,00%
PRE 6,6 4,62 6,14 93,18% 4,16 63,16%
Pode-se observar na Tabela 1 que o grupo PRE teve, percentualmente, maior regeneração.
No Gráfico 1, a seguir, pode-se comparar as médias dos pesos hepáticos total,
RESULTADOS 30
Gráfico 1- MÉDIA, EM GRAMAS, DOS PESOS TOTAL, INICIAL E FINAL DO FÍGADO DAS RATAS DOS GRUPOS HEP, GIR E PRE.
Para avaliar o crescimento do parênquima hepático remanescente, foram
comparados o pesos total e o peso da parte regenerada, como mostrado no Gráfico 2, a seguir.
RESULTADOS 31
Gráfico 2 - PESO TOTAL E PESO DA PARTE REGENERADA, EM GRAMAS, DO FÍGADO DAS RATAS DOS GRUPOS HEP, GIR E PRE.
Foram calculadas a média e o desvio padrão de ALT, AST e do percentual de positividade do PCNA, dados constantes da Tabela 2, abaixo. O GIR obteve maior valor de ALT e AST (324 e 1442, respectivamente). Observamos que o grupo PRE teve valores de ALT, AST (187,5 e 988, respectivamente) menores que GIR e HEP. O grupo PRE teve o maior percentual de positividade do PCNA (52,25).
Tabela 2- MÉDIA E DESVIO PADRÃO DE ALT, AST E PERCENTUAL DE POSITIVIDADE DO PCNA DOS GRUPOS SHAM, HEP, GIR E PRE.
Média (± Desvio Padrão)
Grupo ALT AST PCNA
SHAM 41,333±2,42 216,5±22,01 5,67±5,48
HEP 292,5±133,01 1089±395,98 43,84±27,42
PRE 187,5±35,76 988±291,5 52,25±22,18
RESULTADOS 32
Os valores médios de AST e ALT podem ser comparados através do Gráfico 3.
Gráfico 3 - VALORES MÉDIOS DE AST E ALT.
Os valores médios do percentual de positividade do PCNA dos grupos estão representados no Gráfico 4. Pode-se observar que o grupo PRE apresentou os valores máximos, enquanto que o grupo SHAM apresentou os valores mínimos de PCNA.
RESULTADOS 33
Gráfico 4 - VALORES MÉDIOS DO PERCENTUAL DE POSITIVIDADE DO PCNA.
Foi utilizado o Teste de Mann-Whitney para as enzimas hepáticas ALT, AST, o percentual de positividade do PCNA e regeneração dos hepatócitos entre os grupos SHAM, HEP, GIR e PRE. Para o percentual de positividade para o PCNA, quando comparados HEP-SHAM, GIR-SHAM e PRE-SHAM houve diferença significativa. Os valores de significância (valor-p) do teste Mann-Whitney para comparação de grupos são mostrados na Tabela 3, a seguir.
Tabela 3-TESTE MANN-WHITNEY PARA COMPARAÇÃO DE ALT, AST , PERCENTUAL DE POSITIVIDADE DO PCNA E REGENERAÇÃO DOS HEPATÓCITOS DOS GRUPOS SHAM, HEP, GIR E PRE.
Teste de
Mann-Whitney ALT AST PCNA Regeneração
HEP-GIR 0,69 0,07 0,22 0,81 HEP-PRE 0,14 0,81 0,93 0,47 HEP-SHAM 0,005* 0,005* 0,005* - GIR-PRE 0,02* 0,02* 0,93 0,23 GIR-SHAM 0,005* 0,005* 0,01* - PRE-SHAM 0,005* 0,005* 0,005* -
valores com * indicam diferenças significativas (P<0,05)
RESULTADOS 34
HEP-PRE não tiveram diferença significativa. Sobre o percentual de positividade do PCNA, apenas o grupo SHAM, quando comparado com os demais grupos, obteve diferença significativa. Para regeneração de hepatócitos, não houve diferença significativa entre os grupos.
A seguir, exemplificamos lâminas para a imunohistoquímica PCNA
Figura 9- Fotomicrografia mostrando fígado de rato pertencente ao padrão de positividade para PCNA.
Figura 10 - Fotomicrografia mostrando fígado de rato pertencente ao padrão de negatividade para PCNA.
5 DISCUSSÃO
O animal escolhido para este estudo experimental foi a fêmea de rato, pela facilidade em sua contensão e em adquirir homogenia nos grupos, além de suas
características biológicas e pelo seu baixo custo.3 O rato possui metabolismo
aumentado em relação ao homem, admitindo análise tardia em relação ao processo
de cicatrização, podendo ser observado em tempo menor.14, 3 Em nosso grupo o
tempo de observação foi de 48 horas.
Existem grandes semelhanças entre o fígado do rato e o fígado do homem, como por exemplo, a textura e as características de manipulação do parênquima
DISCUSSÃO 36
Situações patológicas como hepatite viral, reações hepatotóxicas e cirrose levam à proliferação de hepatócitos. Esta pode ocorrer através de hepatectomia parcial ou ser induzida experimentalmente em animais através de agentes químicos
ou virais que causam a morte celular. 10
Um modelo experimental de regeneração hepática em ratos Wistar foi criado por Higgins e Anderson (1931), que através da ressecção parcial do fígado obtiveram uma resposta positiva para a proliferação de hepatócitos. A hepatectomia parcial descrita por esses pesquisadores é considerada um dos melhores modelos para o estudo de regeneração hepática e é um dos procedimentos mais utilizados, pois permite a definição precisa do início do estímulo regenerativo. O procedimento de Higgins e Anderson consiste na ressecção dos lobos lateral esquerdo e mediano
(lobos anteriores), que correspondem a aproximadamente 70% da massa hepática
total. Os lobos lateral direito e caudado (lobos posteriores), que correspondem
respectivamente a 24 e 6% da massa hepática total, são mantidos intactos.19
Em nosso trabalho, as cirurgias foram feitas conforme o modelo experimental descrito por Higgins e Anderson.
A regeneração hepática caracteriza-se por alterações de citocinas que deflagram a proliferação celular, seguida pelo aparecimento dos fatores de
crescimento envolvidos na continuidade do processo de proliferação celular.3 Todas
as células hepáticas (hepatócitos, células endoteliais, de Kupffer e ductais) proliferam para substituir a perda do tecido hepático. Os hepatócitos são os primeiros a se proliferarem, constituindo cerca de 90% da massa hepática e 60% do
número total de células.2, 22 Inicia-se, então, a fase de ciclo celular, na qual ocorre
ativação de genes que levam os hepatócitos da fase G0 para a fase G1 (de crescimento). Nesta, as células tornam-se responsivas aos fatores de crescimento e progridem pelo ciclo celular, passando para a fase S, havendo síntese do ADN. Segue-se para a fase G2 (de replicação), em que são sintetizadas as proteínas necessárias para a divisão celular, e por fim a fase da mitose (M) propriamente dita.
DISCUSSÃO 37
Após uma fase de intenso crescimento e reestruturação do parênquima hepático, o
processo regenerativo cessa. 3, 23
Em experimentos com camundongos, observou-se que um único hepatócito sofreu 69 divisões celulares sucessivas, originando 5,9 x 10²° células, possuindo
potencial clonogênico para produzir 7 x 10¹² fígados.24, 27 Através dessas pesquisas
pode-se concluir que o fígado tem uma grande capacidade regenerativa.
Convém observar, que o termo "regeneração", amplamente utilizado, é biologicamente incorreto, pois os lobos ressecados não são recuperados. Ocorre que a resposta induzida pelo dano tecidual hepático promove hiperplasia e hipertrofia compensatória do tecido remanescente, até o restabelecimento da massa
hepática primitiva. 8, 23
Neste experimento, os animais submetidos à hepatectomia tiveram um alto índice de regeneração hepática. No entanto, nenhum grupo obteve peso final igual
ao inicial, sendo que o grupo PRE apresentou o maior índice regenerativo, tendo o
peso final igual a 93,18% do peso total, conforme pode-se observar na Tabela 1. De acordo com o teste de Mann Whitney, os grupos não apresentaram diferença significativa quanto à regeneração.
Segundo Lima2, nos organismos submetidos à isquemia hepática, seguida de
reperfusão, ocorre interação complexa entre alterações microvasculares, liberação de mediadores inflamatórios, radicais livres de oxigênio, ativação de neutrófilos, plaquetas, células de Kupffer e células endoteliais sinusoidais. A ativação destas células pode levar à liberação de fator de necrose tumoral (TNF-α), leucotrienos, tromboxanos, prostaglandinas, endotelinas, fator de ativação plaquetária, causando danos à membrana celular, membrana mitocondrial interna e endotélio, levando a
DISCUSSÃO 38
pela reperfusão do fígado submetido à oclusão temporária de fluxo sanguíneo se denomina lesão de IR hepática. Esta lesão se constitui numa resposta celular,
bioquímica e imunológica do organismo frente a essas alterações.2
Pesquisadores têm relatado que após IR, em modelos experimentais, ocorre uma indução da proliferação celular como parte do processo de reparo que se segue à IR. Algumas citocinas, como TNF-α e IL-6, que participam como parte da resposta inflamatória geral, provocada pela IR hepática, assim como, pela hepatectomia
parcial, estão associadas à fase de iniciação da regeneração hepática 25-27 pela
ativação precoce de fatores de transcrição responsivos a TNF-α e IL-6. 28, 29
Um dos procedimentos utilizados para proteger o fígado da IR é o IPC que baseia-se no fato de que os tecidos adquirem resistência aos efeitos da IR através
da exposição prévia a breves períodos de oclusão vascular.18, 2 Esse efeito pode ser
resultado, em parte, da liberação de adenosina pelo tecido isquêmico. Os efeitos
benéficos da adenosina devem ser mediados por óxido nítrico30, já que podem ser
abolidos por inibidores da síntese de óxido nítrico, além da detecção da expressão
da forma induzível da óxido nítrico sintase pela manobra de Pringle. 18
O IPC protege as células endoteliais dos sinusóides contra a morte, e suprime
a ativação das células de Kupffer após conservação a frio e reperfusão do fígado. As células de Kupffer tem um papel central na lesão de IR do fígado, pois podem gerar
vários mediadores inflamatórios, incluindo radicais livres e citocinas.18
Aparentemente o metabolismo de células de Kupffer e a síntese de prostaglandinas não são mediadores do IPC das células endoteliais. O IPC protege o tecido à
distância do órgão reperfundido. Essa
proteção ocorre principalmente através da liberação de óxido nítrico, que impede a
falência da perfusão sinusoidal e aderência dos leucócitos31. Embora o IPC não
modifique a infiltração de leucócitos no fígado durante a reperfusão, em órgãos remotos ele previne a infiltração de leucócitos, e os distúrbios da microcirculação em
DISCUSSÃO 39
situações de lesão de IRhepática.18 O curto intervalo de tempo de isquemia durante
o IPC gera estresse oxidativo leve, que induz mecanismos de defesa natural .31
Alguns pesquisadores, estimulados por experimentos animais, iniciaram a aplicação do IPC em estudos clínicos, observando uma redução da ocorrência de apoptose da célula sinusoidal, antes da reperfusão, e dos níveis séricos de
aminotransferases, no período tardio. Em um estudo prospectivo, Clavien et al. 32, 33,
mostraram a eficiência do IPC, no primeiro estudo clínico envolvendo o IPC do fígado em pacientes submetidos a hepatectomia. Os autores com 100 pacientes onde o IPC foi efetivo em reduzir as lesões de IR evidenciou algumas situações onde o IPC foi ineficaz, como em ressecçoes maiores que 50%. Mais recentemente,
Azoulay et al 34 relataram pela primeira vez o uso do IPC no transplante clínico
demonstrando uma maior tolerância à lesão de IR, mas identificaram uma piora da
função hepática inicial. No inicio de 2008 uma revisão sistemática 35, do grupo de
cirurgia hepatobiliar da Fundação Cochrane, em ensaios clínicos, não conseguiu evidências que suportem ou refutem o uso do IPC na cirurgia de doadores vivos. Estudos adicionais foram recomendados para avaliar o papel do IPC em doadores vivos envolvendo o período de isquemia normotérmica.
A função hepática é avaliada a partir do nível das enzimas hepáticas chamadas de transaminases, responsáveis pelo processamento dos aminoácidos do fígado. Níveis das transaminases ALT e AST acima dos normais indicam algum dano hepático. A ALT é uma enzima transaminase, geralmente associada ao fígado, mas também encontrada no plasma e em vários tecidos corpóreos. Em caso de danos na membrana do hepatócito a ALT é liberada no sangue em grandes
quantidades. 36
Em lesões com destruição celular verifica-se um aumento significativo da enzima AST no sangue, por ela existir em grande quantidade no miocárdio, fígado,
DISCUSSÃO 40
Uma das diferenças entre as enzimas hepáticas é o sítio de localização destas. Enquanto que a enzima ALT é encontrada basicamente no citoplasma do hepatócito, a AST está presente com cerca de 80% na mitocôndria. Este fato é
importante no diagnóstico e prognóstico de doenças hepáticas. 37
Em dano hepatocelular leve, a forma predominante no soro é a citoplasmática, enquanto que em lesões graves, há liberação de enzima mitocondrial elevando a relação AST/ALT. Neste caso, os valores de ALT podem ter uma diminuição mais rápida por terem sido primeiramente lançados na corrente circulatória permanecendo, portanto os valores de AST elevados por mais tempo,
ocasionando a elevação da relação AST/ALT.38
Em nosso trabalho, os grupos HEP, GIR e PRE apresentaram valores de ALT acima do normal (considerando os valores de 26 a 78 UI/l como fisiológicos para a
espécie)35, enquanto que o grupo SHAM apresentou valores de ALT dentro do limite.
Considerando os valores de 157 UI/l a 246 UI/l como fisiológicos para a enzima
hepática AST para a espécie estudada,35 apenas o grupo SHAM apresentou valores
dentro dos limites normais, sendo que os grupos HEP, GIR e PRE apresentaram valores acima desta taxa. Estes resultados das enzimas hepáticas evidenciaram que a técnica cirúrgica acarretou dano hepático aos indivíduos dos grupos HEP, GIR e PRE.
Em nosso estudo, com relação à AST e ALT, o grupo controle alcançou os menores valores para todas as medidas descritivas e apresenta forte homogeneidade. Comparando os demais grupos com o grupo controle, pode-se dizer que ocorreu um aumento de AST e ALT, o que caracteriza dano hepático
devido ao procedimento cirúrgico. O teste de Mann-Whitney mostrou que os grupos
HEP-SHAM, GIR-PRE, GIR-SHAM E PRE-SHAM se diferem significativamente (P<0,05).
DISCUSSÃO 41
Para a detecção da proliferação celular em vários tecidos tem-se usado diferentes métodos que fornecem informações a respeito do crescimento e reparação teciduais. Um recurso utilizado por vários autores para a visualização da proliferação celular é o método imunohistoquímico pelo uso de anticorpos monoclonais específicos, chamado de antígeno nuclear de proliferação celular
(PCNA).39
Nesta pesquisa, com relação ao percentual de positividade do PCNA , o grupo PRE teve o maior índice, seguido dos grupos HEP, GIR, e SHAM, respectivamente. O teste de Mann-Whitney mostrou que o grupo SHAM se difere significativamente dos demais grupos (P<0,05). Sendo que esses, não apresentaram diferença significativa quando comparados entre eles.
6 CONCLUSÕES
Nesta pesquisa, pode-se concluir que:
1- Os animais submetidos ao precondicionamento isquêmico tiveram menos dano hepatocelular que os animais submetidos apenas à isquemia e reperfusão hepática, segundo a avaliação das transaminases.
2- A lesão de isquemia e reperfusao e o precondicionamento isquêmico não alteraram significativamente o peso final do fígado remanescente quando comparados ao estimulo da hepatectomia.
3- A proliferação celular não apresenta melhora significativa com o precondicinamento isquêmico em relação aos animais que são submetidos somente a lesão de isquemia e reperfusao
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