PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO GÊNERO Prunus spp.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO

GÊNERO Prunus spp.

PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA

Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Profa_{. Dr}a_{. Márcia} Wulff Schuch, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração: Fruticultura de Clima Temperado, para obtenção do título de Doutor em Ciências (Dr.).

PELOTAS

RIO GRANDE DO SUL – BRASIL MARÇO DE 2006

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO

GÊNERO Prunus spp.

PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA

Tese apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Profa_{. Dr}a_{. Márcia} Wulff Schuch, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração: Fruticultura de Clima Temperado, para obtenção do título de Doutor em Ciências (Dr.).

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO

GÊNERO Prunus spp.

PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA

TESE

Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Programa de Pós-graduação em Agronomia

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Pelotas – RS, Brasil

Comitê de Orientação:

Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch – Orientadora - FAEM/UFPel Prof. Dr. Valmor João Bianchi – Co-orientador - IB/UFPel Homologada em: ______/______/ 2006

Comissão Julgadora:

Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga – IB/UFPel Prof. Dr. Valmor João Bianchi – IB/UFPel

Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri – FAEM/UFPel Prof. Dr. Leo Rufato – UDESC

Profª. Drª. Andrea De Rossi – FAEM/UFPel (Suplente)

PAULO SÉRGIO GOMES DA ROCHA

PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PORTA-ENXERTOS DO

GÊNERO Prunus spp.

TESE

Submetida como parte dos requisitos para obtenção do grau de

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Programa de Pós-graduação em Agronomia

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Pelotas – RS, Brasil

APROVADA EM: 21 de fevereiro de 2006.

Profª.Dra. Andrea De Rossi Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri Prof. Dr. Leo Rufato

Profª. Drª. Márcia Wulff Schuch (Orientadora)

Prof. Dr. Valmor João Bianchi (Co-orientador)

Dados de catalogação na fonte:

(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)

Biblioteca de Ciências Agrárias

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” R672p Rocha, Paulo Sérgio Gomes da

Propagação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus spp. / Paulo Sérgio Gomes da Rocha ; orientadora Márcia Wulff Schuch. – Pelotas, 2006. –101 f.: il.

Tese (Doutorado). Fruticultura de Clima Temperado. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2006.

1. Pessegueiro 2. Qualidade de luz 3. Cultura de tecido 4. Porta-enxertos I .Schuch, Márcia Wulff (orientadora) II. Título.

O pessimista se queixa do vento, o otimista espera que ele mude e o realista ajusta a vela.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.

À Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, pela oportunidade de realização do Curso.

À Professora Drª. Márcia Wulff Schuch, pela orientação, conhecimentos científicos e subsídios para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao professor Dr. Valmor João Bianchi, pela co-orientação, ensinamentos e estímulo.

À Deus, pela sua presença em todos os momentos.

A minha mãe, por ter me possibilitado uma boa formação acadêmica e pessoal.

A todos os colegas e amigos do curso de Pós-Graduação com que convivi durante este período.

A minha namorada Clarice, pelo companheirismo, compreensão e incentivo. Aos professores da FAEM, pelos conhecimentos científicos durante a realização do curso.

Finalmente, minha gratidão sincera a todas as pessoas que de forma direta ou indireta me ajudaram.

ÍNDICE Página SUMÁRIO... ... xvi SUMMARY... xviii 1- INTRODUÇÃO GERAL... 1 2- CAPÍTULO 1 ... 4

ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ... 4

2.1 INTRODUÇÃO ... 4

2.2 MATERIAL E MÉTODOS... 9

2.2.1 MATERIAL VEGETAL... 9

2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp... 10

2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ... 11

2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5... 12

2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba... 13

2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio... 14

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 15 2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de

2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento

do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5 ... 18 2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do

porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5... 23 2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e

BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de

pessegueiro cv. Tsukuba ... 26 2.3.5 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no

estabelecimento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio ... 29 2.4 CONCLUSÕES ... 31 3- CAPÍTULO 2 ... 33 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE

PORTA-ENXERTO DE Prunus spp. ... 33 3.1 INTRODUÇÃO ... 33 3.2 MATERIAL E MÉTODOS... 38 3.2.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação

in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ... 38

3.2.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro

dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba... 39 3.2.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na

multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5... 40 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42 3.3.1 Diferentes meios e concentrações de BAP na multiplicação

in vitro dos porta-enxertos de Prunus cvs. Sírio e Mr. S. 2/5 ... 42

3.3.2 Efeito das concentrações de BAP na multiplicação in vitro

dos porta-enxertos de Prunus cv. Tsukuba... 46 3.3.3 Influência da qualidade da luz e concentrações de BAP na

multiplicação do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5... 49 3.4 CONCLUSÕES ... 54 4- CAPÍTULO 3 ... 55 ENRAIZAMENTO IN VITRO DO PORTA-ENXERTO DE Prunus spp.

cv. Mr. S. 2/5... 55 4.1 INTRODUÇÃO ... 55 4.2 MATERIAL E MÉTODOS... 59 4.2.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in

vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5... 59

4.2.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no

enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5... 60 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 62

4.3.1 Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento in

vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5... 62

4.3.2 Qualidade da luz e diferentes concentrações de AIB no enraizamento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5... 67

4.4 CONCLUSÕES ... 73

5- CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 74

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 75

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Página TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos de Prunus.

UFPel, Pelotas-RS, 2006... 7 TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, Pelotas-

RS, 2006... 8 TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes

provenientes de duas diferentes porções de ramos de

porta-enxertos de Prunus spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006... 16 TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr.

S. 2/5 ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel,

Pelotas-RS, 2006... 19 TABELA 5- Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5

ao final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS,

2006... 20 TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao

final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ... 21 TABELA 7 - Comprimento médio das brotações (mm) e número médio

de folhas em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir de gema e segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo, em função do agente solidificante. UFPel, Pelotas-RS,

TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento médio das brotações (mm), número de gemas e número de folhas das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5,

aos 35 dias de estabelecimento. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ... 25 TABELA 9- Percentagens de contaminação, estabelecimento e

comprimento médio das brotações observados aos 30 dias de cultivo na fase de estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Tsukuba, em função do meio de cultura.

UFPel, Pelotas-RS, 2006... 26 TABELA 10- Percentagem de estabelecimento dos explantes

provenientes de duas diferentes regiões dos ramos do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio. UFPel, Pelotas-RS,

2006... 29

CAPÍTULO 2

TABELA 1- Percentagem de brotações e número médio de brotações formadas ao final de 30 dias de cultivo in vitro, em função

do meio de cultura . UFPel, Pelotas-RS, 2006 ... 43 TABELA 2- Comprimento médio das brotações dos porta-enxertos cvs.

Mr. S. 2/5 e Sírio formadas ao final de 30 dias de cultivo

em meio MS e QL. UFPel, Pelotas-RS, 2006... 45 TABELA 3- Percentagem de brotação e número médio de brotações

formadas a partir de ápice caulinar e segmento nodal isolado do porta-enxerto Tsukuba, aos final de 28 dias de

cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ... 46

CAPÍTULO 3

TABELA 1- Percentagem de enraizamento e número de raízes formadas pelas brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 em meio MS acrescido de ágar ou vermiculita. UFPel,

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Página FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido

(1), phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal (esquerda) e gema (direita), ao final de 30 dias de cultivo.

UFPel, Pelotas-RS, 2006... 23 FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5,

provenientes do cultivo em meio MS e diferentes filtros de luz: SF (sem filtro); verde (nº 088 Lime green), azul (nº 115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e verde (nº 738

Jas green). Pelotas-RS, 2006... 25 FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv.

Tsukuba estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento nodal da planta matriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel,

Pelotas-RS, 2006... 27 FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv.

Tsukuba, aos 30 dias de cultivo in vitro em diferentes

CAPÍTULO 2

FIGURA 1- Número médio de brotações formadas ao final de 30 dias, pelos porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5 e Sírio, cultivados em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS,

2006... 44 FIGURA 2- Aspectos das brotações do porta-enxerto Tsukuba

proveniente da fase de multiplicação, formadas a partir do segmento nodal (A) e ápice caulinar (B). UFPel,

Pelotas-RS, 2006... 47 FIGURA 3- Comprimento médio das brotações (mm), a partir de ápice

caulinar do porta-enxerto cv. Tsukuba, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP, aos final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS,

2006... 48 FIGURA 4- Número médio das brotações formadas do porta-enxerto

cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes

concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ... 50 FIGURA 5- Brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 proveniente da

fase de multiplicação, em meio de cultura acrescido de

0,5; 1,0; e 2,0 mg L-1 de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006... 50 FIGURA 6- Comprimento médio das brotações formadas pelo

porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS,

2006... 51 FIGURA 7- Número médio de folhas formadas por brotações do

porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, em meio de cultura acrescido por diferentes concentrações de BAP e diferentes qualidades

de luz. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ... 53

CAPÍTULO 3

FIGURA 1- Percentagem de enraizamento do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, com diferentes concentrações

de sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006 ... 64 FIGURA 2- Número médio de raízes formadas das brotações do

porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio MS com diferentes concentrações de sacarose. UFPel,

FIGURA 3- Comprimento médio de raízes formadas pelo porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5 cultivado no meio MS, acrescido de vermiculita ou ágar, em diferentes concentrações de

sacarose. UFPel, Pelotas-RS, 2006. ... 66 FIGURA 4- Brotações de Mr.S. 2/5 provenientes do cultivo em meio de

cultura MS com ágar ou vermiculita (esquerda/direita).

UFPel, Pelotas-RS, 2006... 67 FIGURA 5- Percentagem de enraizamento in vitro das brotações do cv.

Mr. S. 2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes

concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006... 68 FIGURA 6- Número médio de raízes formadas por brotações do cv. Mr.

S. 2/5, em meio MS acrescido de diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob diferentes filtros de luz. UFPel,

Pelotas-RS, 2006... 70 FIGURA 7- Comprimento médio das raízes das brotações do cv. Mr. S.

2/5, cultivadas em meio MS acrescido de diferentes

concentrações de AIB. UFPel, Pelotas-RS, 2006... 71 FIGURA 8- Aspecto das brotações enraizadas do porta-enxerto cv.

Mr.S. 2/5, provenientes do cultivo em meio MS acrescido por diferentes concentrações de AIB e cultivadas sob luz

SUMÁRIO

ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, março de 2006. Propagação in vitro de porta-enxertos do Gênero Prunus spp. Orientadora: Drª. Márcia Wulff Schuch. Co-orientador: Dr. Valmor João Bianchi.

Na cultura do pessegueiro, a implantação de um sistema moderno e tecnificado de produção de mudas é determinante para a obtenção de frutos de qualidade e uma alta produtividade. Desta forma, a qualidade genética e sanitária do material propagativo é imprescindível para alcançar o sucesso no empreendimento agrícola. Com o objetivo de adequar uma metodologia de propagação e de redução dos custos para a produção de mudas, foram desenvolvidos uma série de experimentos com porta-enxertos de Prunus spp. nas fases de estabelecimento, multiplicação e enraizamento in vitro. Os experimentos foram realizados na Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel durante o período de 2003 a 2005. Para a fase de estabelecimento foram utilizados os porta-enxertos cvs. Mr. S. 2/5, Sírio, Tsukuba, Nemaguard, Nemared e Flordaguard. Nesta fase foram testados os tipos de explantes, solidificantes do meio de cultura, qualidade da luz através da utilização de filtros, efeito da localização da gema no ramo, tipos de meio de cultura e diferentes concentrações de BAP. Na segunda fase, a de multiplicação,

luz, diferentes concentrações de BAP, tipos de explantes e meios de cultura. Na terceira, a de enraizamento in vitro, avaliou-se a qualidade da luz, a vermiculita como substituto do ágar no meio de cultura, diferentes concentrações de sacarose e AIB no enraizamento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5. Na fase de estabelecimento observou-se que o melhor tipo de explante é o segmento nodal e o ágar foi o melhor solidificante, pois, o phytagel causou vitrificação. Em relação à qualidade da luz, o filtro verde nº 088 favoreceu a morfogênese das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. A melhor região no ramo para a coleta dos explantes pode variar de acordo com o porta-enxerto. Na fase de multiplicação verificou-se que a qualidade da luz não influenciou a formação das brotações. Não houve formação de brotações adventícias no porta-enxerto cv . Tsukuba cultivado no meio acrescido de até 1,2 mg L-1 de BAP. Dos explantes testados na cv . Tsukuba, aquele contendo o ápice proporcionou o maior crescimento dos explantes. O meio de cultura MS foi o que apresentou os melhores resultados na multiplicação. Para a fase de enraizamento verificou-se que a adição de sacarose no meio de cultura é imprescindível e que a vermiculita pode substituir o ágar no meio. Os filtros utilizados para modificar as condições de luz não contribuíram para aumentar o percentual de enraizamento in vitro das brotações da cv. Mr. S. 2/5.

SUMMARY

ROCHA, PAULO SÉRGIO GOMES DA, Universidade Federal de Pelotas, March 2006. In vitro propagation of Prunus spp. rootstocks. Adviser: Drª. Márcia Wulff Schuch. Co-adviser: Dr. Valmor João Bianchi.

To obtain peach plants that produce fruits of high quality and to obtain high productivity, it is necessary a modern and tecnified nursery plant production. The objective for this study was to establish an appropriated and low cost methodology for production of nursery Prunus plants. The experiments were carried out at the “Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel – Universidade Federal de Pelotas” during the period from 2003 to 2005. For the in vitro establishment phase were used explants of peach rootstocks cvs. Mr. S. 2/5, Sírio, Tsukuba, Nemaguard, Nemared and Flordaguard. The variables evaluated on the establishment phase were: type of explant; culture medium solidifiers; light quality; bud location; type of culture medium; and different BAP concentrations in the media culture. Regarding to the in

vitro multiplication phase, the peach rootstocks cultivars tested were: Mr. S. 2/5;

Sírio; and Tsukuba, which were evaluated about the effects of the following variables: light quality; BAP concentrations; type of explant; and type of culture medium. Regarding to the in vitro rooting phase, the peach rootstock tested was

concentrations in culture medium. In the phase of in vitro establishment it was observed that: in general the best explant was nodal segment; the best culture medium solidifier was agar; the culture medium solidifier phytagel caused explants vitrification; and the nº 088 green filter for light promoted shoot morfogenesis on rootstock cv. Mr. S. 2/5. On the in vitro multiplication phase it was observed that: light quality had no effect on sprouting; addition of BAP 1,2 mg L-1 _{to the culture} media had no effect on adventitious shooting in the Tsukuba rootstocks; the sprouts from shoot tip explants had more growth; and the MS culture medium gave the best results. On the in vitro rooting phase it was observed that: sucrose was essential for in vitro rooting; vermiculite substituted for agar in medium without affecting in vitro rooting; and the different light filters did not increase the percentage of in vitro shoot rooting on the cv. Mr. S. 2/5.

1- INTRODUÇÃO GERAL

O Pessegueiro [Prunus persica (L.) Batsch], cultura originária da China e pertencente à família Rosaceae, é uma das principais frutíferas de clima temperado cultivadas na região Sul do Brasil, perdendo em área plantada apenas para a videira e o citros (IBGE, 2005; Tofanelli et al., 2002).

Segundo dados do IBGE (2005), a área plantada com pessegueiro no Brasil, nos últimos quatro anos, tem expandido em média 4% ao ano. Acredita-se que, em nível comercial, se houvesse disponibilidade de mudas de pessegueiro com qualidade genética, fitossanitária e fitotécnica, possivelmente ocorreria elevação da produtividade.

A forma de propagação do pessegueiro na região Sul do país é, tradicionalmente, realizada através da enxertia de borbulhas sobre os porta-enxertos obtidos a partir de sementes provenientes de fábricas de conservas, as quais não possuem garantia de qualidade genética e sanitária (Tofanelli et al., 2001). Essa prática, possivelmente vem ocorrendo ao longo dos anos porque tem como vantagem a facilidade de se obter caroços nas várias fábricas de conservas de pêssego da região Sul do Estado do RS.

Entretanto, esse método de propagação de porta-enxerto apresenta algumas desvantagens, entre as mais importantes, pode-se destacar a segregação genética, a qual poderá ocasionar perdas de características agronômicas desejáveis, desuniformidade das plantas no pomar e morte precoce das plantas (Fachinello, 2000; Tofanelli et al., 2003).

Sendo assim, a propagação do pessegueiro por meio de estacas, tanto para as cultivares de porta-enxerto quanto para as cultivares copa, é apontada por alguns autores (Dutra et al., 2002; Miranda et al., 2003) como uma prática promissora para a produção de mudas homogêneas, com baixo custo, rapidez no processo de produção de mudas e manutenção das características agronômicas importantes. Entretanto, mesmo sendo a produção de mudas por estaquia um método bastante interessante, apresenta entraves e não tem sido uma alternativa viável para a maioria das cultivares de importância econômica, devido ao baixo percentual de enraizamento (Chalfun & Hoffmann, 1997; Rufato & Kersten, 2000).

Embora sejam utilizadas algumas técnicas, tais como o uso de reguladores de crescimento (ácido indolbutírico - AIB), visando potencializar este método de propagação e maximizar o percentual de estacas enraizadas, os resultados obtidos não têm sido satisfatórios (Tofanelli et al., 2002).

Diante deste contexto, faz-se necessário buscar técnicas mais eficientes para a produção de porta-enxertos. A técnica de cultura de tecidos tem ocupado uma posição de destaque e se mostrado como uma alternativa viável de clonagem de espécies lenhosas, para a formação de pomares clonais ou produção comercial de mudas (Assis & Teixeira, 1998).

A qualidade genética e sanitária da muda são consideradas características de fundamental importância para o sucesso da implantação de um pomar comercial, uma vez que a fruticultura moderna está baseada em pomares produtivos e o sucesso do empreendimento depende também da utilização de mudas de qualidade (Fachinello, 2000).

Todavia, a possível substituição dos métodos tradicionais de produção dos porta-enxertos de Prunus pela micropropagação requer que se tenha um domínio da técnica de cultura de tecidos voltado para as cultivares de importância econômica, para que possibilite a disponibilização do material propagado em grande quantidade, principalmente para aos produtores de pessegueiro da região Sul do Brasil.

A utilização da micropropagação para produção de mudas em escala comercial visando atender as necessidades internas é uma realidade em alguns países (Silva, 2004), principalmente em países da Europa, mais especificamente na Itália onde boa parte da produção dos porta-enxertos é realizada por este método de propagação (Loreti & Massai, 1995).

No Brasil, os trabalhos de micropropagação de cultivares de porta-enxerto do gênero Prunus, especialmente para o pessegueiro, são relativamente escassos. Recentemente, alguns autores demonstraram as dificuldades de estabelecer in vitro os explantes (Rodrigues et al., 1999) e em multiplicar as brotações estabelecidas dos porta-enxertos (Silveira et al., 2001).

O objetivo deste trabalho foi identificar nas fases de estabelecimento, multiplicação e enraizamento o melhor meio de cultura, concentração de BAP, tipo de explante, concentração de AIB e qualidade da luz para a propagação in vitro de diferentes cultivares de porta-enxertos de pessegueiro.

2- CAPÍTULO 1

ESTABELECIMENTO IN VITRO DE DIFERENTES CULTIVARES DE PORTA-ENXERTO DE Prunus spp.

2.1 INTRODUÇÃO

Em linhas gerais, o estabelecimento é uma das fases da micropropagação que tem como objetivo estabelecer in vitro os explantes para os subseqüentes experimentos de multiplicação e enraizamento.

Um dos principais problemas desta fase de cultivo é a contaminação dos explantes por diversos organismos (fungos, bactérias e vírus), principalmente as contaminações causadas por fungos e bactérias endógenas, que sendo de crescimento lento, se difundem sobre os explantes após o material estar estabelecido ou em fase de multiplicação (Couto et al., 2004; Mroginski et al., 2002).

Outro fator que pode dificultar a fase de estabelecimento é a oxidação dos explantes, ou seja, a liberação dos compostos fenólicos no meio de cultura, através das células lesionadas pelo corte (Rodrigues et al., 1999). Em alguns casos, além do escurecimento provocado no meio de cultura, tais compostos

podem causar toxidez, inibir o crescimento e ocasionar a morte do explante (Grattapaglia & Machado, 1998). Algumas técnicas podem ser utilizadas eficientemente no controle da oxidação, entre estas se destaca o uso de substâncias anti-oxidantes como ácido ascórbico, carvão ativado, formulação de meio de cultura mais diluído e o cultivo dos explantes no escuro por um período máximo de uma semana. Entretanto, o uso de carvão ativado no meio de cultura poderá dificultar a identificação de contaminação causada por bactéria (Silva, 2004; Rodrigues et al., 2003).

A contaminação dos explantes pode ser evitada ou minimizada através da manutenção das plantas-matrizes cultivadas em vasos na casa-de-vegetação e a realização do controle fitossanitário periódico com o uso de agroquímicos (Couto et al., 2004).

As fontes de contaminações têm como origem a superfície ou o interior do explante, falhas nos procedimentos de desinfestação e o próprio homem. Deste modo, a correta identificação da fonte de contaminação e do tipo de microorganismo são aspectos importantes para efetuar o controle e ter êxito no estabelecimento; sendo a contaminação causada por fungo mais fácil de ser controlada (Mroginski et al., 2002; Dantas et al., 2002).

Quanto ao meio de cultura para estabelecimento, de acordo com Andreu & Marin (2005) podem ser utilizados diferentes tipos. Embora, o meio MS (Murashige & Skoog, 1962) e suas diluições sejam os mais utilizados na micropropagação, na fase de estabelecimento das espécies lenhosas os melhores resultados foram obtidos com meios de culturas diluídos (Silva, 2004).

Ao meio de cultura podem ser adicionados fitorreguladores, visando suprir as deficiências endógenas dos explantes isolados, estimular a multiplicação ou o alongamento, mas nem sempre o uso destas substâncias na fase inicial de cultivo é necessária (Rocha et al., 2004).

Para o estabelecimento in vitro, teoricamente, pode ser utilizado qualquer tipo de explante da planta, em função da totipotência das células vegetais (Grattapaglia & Machado, 1998). Mas, na maioria dos trabalhos envolvendo a

apicais ou axilares (Erig & Fortes, 2002). De acordo com Silva (2004), o tamanho do explante determina a sua sobrevivência e capacidade de crescimento. Se o objetivo for somente o de propagar, é mais adequado iniciar o estabelecimento com ápices ou segmentos caulinares contendo gemas axilares. No entanto, deve-se considerar que a probabilidade de deve-se isolar propágulos livres de agentes contaminantes está relacionada com o tamanho do explante utilizado, pois, quanto menor o explante maior a chance de obter brotações isentas de contaminantes e, em conseqüência, menor a velocidade no desenvolvimento das mesmas (Torres et al., 1998).

Os procedimentos de desinfestação, comumente utilizados, consistem em uma dupla desinfestação mediante a imersão dos explantes em álcool (70% v/v) durante 10-60 segundos, seguido de hipoclorito de sódio (1,0-2,5%) durante 5-30 minutos, com gotas de tensoativo (Tween-20) para favorecer a quebra da tensão superficial. Em alguns casos, o hipoclorito de sódio é substituído pelo hipoclorito de cálcio (6-12%) (Olmos et al., 2002; Mroginski et al., 2002).

Após a desinfestação, alguns patógenos podem permanecer latentes e se proliferarem quando forem transferidos para um novo meio de cultura. Em geral, estes patógenos podem ser controlados mediante o emprego de antibióticos (ampicilina e rifampicina, entre outros) no meio de cultura, no entanto, devem ser evitados porque alteram a composição do meio (Olmos et al., 2002).

Os explantes devem ser preferencialmente coletados a partir de brotações novas e a época de coleta dos mesmos, em geral, deve ser realizada durante a fase de crescimento ativo da planta, ou seja, após o final do período de dormência, durante os meses mais quentes do ano (Grattapaglia & Machado, 1998). Pois, geralmente os órgãos jovens têm melhor resposta no estabelecimento do que aqueles obtidos de materiais adultos. Entretanto, o melhor estádio de desenvolvimento, ou época de coleta dos explantes, deve ser determinado para cada espécie micropropagada (Willalobos & Torpe, 1991). Na tabela 1, são apresentadas as principais características dos porta-enxertos utilizados neste trabalho.

TABELA 1- Principais características dos porta-enxertos de Prunus. UFPel,

Pelotas-RS, 2006

Porta-enxerto Origem genética Propagação Resistência

Flordaguard Seleção de Nemaguard

USA Sementes

Meloidogyne incognita e M. javanica

Nemaguard Prunus pérsica e P. davidiana - USA

Sementes M. incognita e M. arenaria

Nemared Seleção de Nemaguard

USA Sementes

M. incognita e M. javanica

Mr. S. 2/5 Prunus Cerasifera - Itália Estaquia e cultura

de tecidos Asfixia radicular Sírio P. persica e P.

amygdalus - Itália

Estaquia e cultura

de tecidos -

Tsukuba P. persica - Japão Sementes

M. incognita, M. javanica e M. mali

Fonte: Fachinello & Loreti (1995), Loreti (1994).

Em geral, os explantes na fase de estabelecimento são cultivados na primeira semana em ambiente escuro, com temperatura de 25 + 2ºC, e posteriormente transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de 25 µmol m-2 _s-1 _{(Erig & Fortes, 2002; Rodrigues et al.,} 1999).

Quanto à fonte de luz utilizada nas salas de crescimento dos laboratórios de micropropagação, de acordo com Bula et al. (1991), embora as lâmpadas fluorescentes sejam comumente usadas, este tipo de luz não é mais considerada como ótima, por possuir e emitir diferentes comprimentos de ondas, sendo que, atualmente, a melhor fonte de luz são os LEDs (Diodos Emissores de Luz), por possuírem, dentre outras características, comprimento de onda específico e longo período de vida útil. Entretanto, devido ao elevado custo, seu uso ainda é restrito.

Uma das alternativas utilizadas no estudo da qualidade da luz é a utilização de filtros de luz, os quais são colocados sobre os frascos contendo os explantes, e têm contribuído para a obtenção de bons resultados, como exemplo o alongamento das brotações, número de entrenós e aumento da concentração de clorofila (Piagnani et al., 2002; Muleo et al., 2001, Baraldi et al., 1988).

A função do filtro de luz é selecionar a transmissão ou bloquear a absorção de elementos do espectro, emitido a partir de uma fonte de luz. As principais características dos filtros de luz utilizados neste trabalho são apresentadas na tabela 2.

Objetivou-se, neste trabalho, determinar o tipo de explante, posição do explante no ramo, tipo de meio de cultura, concentração de BAP, solidificante do meio de cultura e o filtro de luz mais adequado para o estabelecimento in vitro de diferentes cultivares de porta-enxerto de Prunus spp.

TABELA 2- Características dos filtros de luz utilizados. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Comprimento de onda e Transmissão Tipo de Filtro 520 nm 670 nm 460 nm Verde Nº 088 69% 35% 2% Azul Nº 115 70% 2% 35% Azul Nº 724 45% 60% 35% Verde Nº 738 18% 1% 0%

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, durante o período de 2003 a 2005.

A fase de estabelecimento in vitro foi subdividida em cinco experimentos independentes e a metodologia aplicada em cada um segue abaixo.

2.2.1 MATERIAL VEGETAL

Para os experimentos de estabelecimento foram utilizados os porta-enxertos de Prunus spp. das cultivares Flordaguard, Nemaguard, Nemared, Mr. S. 2/5, Sírio e Tsukuba.

As plantas-matrizes destes porta-enxertos utilizadas como fonte de explante foram cultivadas em vasos em casa-de-vegetação e, pulverizadas semanalmente com Agrimicina® (2,4 g L-1 de Sulfato de estreptomicina) e Cercobin® (0,6 g L-1 de Tiofanato metil) antes da coleta dos ramos.

2.2.2 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.

Este trabalho foi iniciado na segunda quinzena de dezembro de 2003 e teve por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes, visando obter maior percentagem de estabelecimento.

Coletou-se dos porta-enxertos de Prunus spp., cvs. Flordaguard, Nemaguard, Nemared e Mr. S. 2/5, ramos com 30 cm de comprimento, os quais foram separados em dois grupos. O primeiro grupo foi retirado a partir do ápice do ramo (0-15 cm – porção apical) e o segundo logo abaixo do ponto do corte (15-30 cm – porção basal).

A desinfestação dos ramos, após a desfolha, foi realizada em câmara de fluxo laminar com álcool (70%) durante um minuto e hipoclorito de sódio (1,5%) por 15 minutos, seguido da tríplice lavagem em água destilada autoclavada para retirada dos resíduos de hipoclorito de sódio. Após a desinfestação, os ramos de cada grupo (apical e basal) foram seccionados em segmentos nodais com aproximadamente 10 mm de comprimento, em seguida foram inoculados em tubos de ensaio com 8 mL de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescido de 30 g L-1 _{de sacarose, 100 mg L}-1 _{de mio-inositol, 0,75 mg L}-1 _{de BAP, 0,5 mg L} -1 _{de GA3, 7,0 g L}-1 _{de ágar e pH 5,8. Após a distribuição do meio de cultura nos} tubos de ensaio, estes foram autoclavados à temperatura de 121 ºC durante 15 minutos. Depois de inoculado, o material foi mantido durante sete dias em ambiente escuro com temperatura de 25 + 1 ºC. Após este período, foi transferido para sala de crescimento com mesma temperatura, fotoperíodo de 16 horas e luminosidade de 25 µmol m-2 s-1.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x2 (cultivar x porção do ramo), com quatro repetições por tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por seis tubos de ensaio contendo um explante por tubo. As variáveis analisadas ao final de 30 dias de cultivo foram: percentagem de contaminação bacteriana e fúngica e percentagem de estabelecimento.

2.2.3 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2004, e teve como objetivo avaliar o tipo de explante e solidificante. Os ramos coletados da planta matriz cv. Mr. S. 2/5 foram desinfestados de acordo com a metodologia descrita no item 2.2.2. Após a desinfestação, foram isolados a partir dos ramos dois tipos de explantes: segmentos nodais com aproximadamente 10 mm de comprimento e gemas axilares com tamanho de 5 mm.

Os explantes isolados foram cultivados em tubos de ensaio com 8 mL de meio de cultura MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 0,75 mg L-1 de BAP, 0,5 mg L-1 de GA3, 0,05 mg L-1 de AIB e pH 5,8. Para a solidificação do meio MS utilizou-se 6,5 g L-1 de ágar ou 2,5 g L-1 de phytagel. No meio MS líquido utilizou-se uma ponte de algodão para suporte do explante.

Após a inoculação dos explantes nos meio de cultura estes foram cultivados nas mesmas condições descritas no item 2.2.2.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2x3 (tipo de explante x tipo de solidificante), com quatro repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio contendo um explante cada.

As variáveis analisadas ao final dos 30 dias de cultivo foram: percentagem de contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de estabelecimento, percentagem de oxidação, percentagem de vitrificação, comprimento médio das brotações e número médio de folhas. Considerou-se como estabelecimento os explantes que não apresentaram nenhuma contaminação e formaram brotação.

2.2.4 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de

Prunus cv. Mr. S. 2/5

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de fevereiro de 2005 e teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes tipos de filtros de luz sobre o estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5. Os ramos coletados foram desinfestados conforme a metodologia descrita anteriormente no item 2.2.2, e depois seccionados em segmentos nodais com uma gema, medindo aproximadamente 10 mm.

Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 8 mL de meio de cultura MS reduzido a ¾ da composição normal dos sais, suplementado com 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,2. Em seguida o material foi colocado em ambiente escuro com temperatura de 25 + 1 ºC, por sete dias. Transcorrido esse tempo, os tubos de ensaio com os explantes foram transferidos para sala de crescimento com 16 horas de fotoperíodo, luminosidade de 25 µmol m-2 s-1 e mesma temperatura. Sobre os tubos de ensaio foram colocadas folhas de filtros da marca Lee Filters (Walworth Ind. Estate, Andover, England): o filtro verde (nº 088 Lime green) permite, aproximadamente, a transmissão de 69% da luz verde com comprimento de onda de 520 nm, 35% de transmissão da luz vermelha com comprimento de onda de 670 nm e 2% de transmissão da luz azul com comprimento de onda de 460 nm; o filtro azul (nº 115 Jas Blue) permite 35% de transmissão da luz azul, 70% da luz verde e 2% de luz vermelha; o filtro azul (nº 724 Ocean Blue) permite 35% de transmissão da luz azul, 45% de luz verde e 60% de luz vermelha; e o filtro verde (nº 738 Jas Green) permite 18% de transmissão da luz verde, 1% da luz vermelha e 0% da luz azul. No tratamento controle os tubos de ensaio permaneceram desprovidos da cobertura, ou seja, sob luz fluorescente.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com quatro repetições por tratamento, sendo os tratamentos, os tipos de filtros acima citados, e cada repetição constituída por cinco tubos de ensaio contendo um explante cada.

Após 35 dias de cultivo foram avaliadas as variáveis: percentagem de contaminação bacteriana e fúngica, percentagem de oxidação, percentagem de estabelecimento, comprimento médio das brotações, número médio de folhas e número médio de gemas.

2.2.5 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de março de 2004, com o objetivo de identificar o melhor meio de cultura e concentração de BAP. Segmentos nodais com uma gema e medindo aproximadamente 10 mm, previamente desinfestados de acordo com a metodologia já descrita no item 2.2.2, foram colocados em tubos de ensaio com 8 mL de meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o meio MS com a concentração total dos sais e as reduções em MS ¾ e MS ½. Os meios de cultura foram suplementados por 0,0; 0,4; 0,8 e 1,2 mg L-1 _{de BAP, 30 g L}-1 _{de sacarose, 100 mg L}-1 _{de mio-inositol, 7,0 g L}-1 _de ágar e pH 5,8. Em seguida o material foi colocado em ambiente escuro com temperatura de 25 + 1 ºC, por sete dias. Após esse período, os tubos de ensaio com os explantes foram colocados em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, luminosidade de 25 µmolm-2 s-1 e temperatura de 25 + 1 ºC.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x4 (meio de cultura x concentração de BAP), com quatro repetições por tratamento, sendo a unidade experimental seis tubos de ensaio contendo um explante cada.

Após 30 dias de cultivo, avaliaram-se as percentagens de contaminação (bacteriana e fúngica), percentagem de estabelecimento e comprimento médio das brotações.

2.2.6 Efeito da porção do ramo e meio de cultura no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Sírio

Este trabalho foi iniciado na primeira quinzena de dezembro de 2004, e teve por objetivo identificar a melhor porção do ramo para isolamento dos explantes e o tipo de meio de cultura, visando obter maior percentagem de estabelecimento.

Após a desinfestação já descrita no item 2.2.2, segmentos nodais com uma gema e 10 mm de comprimento foram retirados das porções do ramo de 0-15 e 15-30 cm, a partir do ápice. Os explantes foram inoculados em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), SH (Schenk & Hildebrant, 1972) e WPM (Lloyd & McCown, 1980). Os meios de cultura foram acrescidos por 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol, 7 g L-1 de ágar e pH 5,8.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2x3 (porção do ramo x meio de cultura), com quatro repetições por tratamento, sendo a unidade experimental, em cada repetição, composta por seis tubos de ensaio com um explante em cada tubo.

Após 35 dias de cultivo, avaliou-se à percentagem de estabelecimento, percentagem de contaminação (fúngica e bacteriana) e comprimento médio das brotações. Considerou-se como estabelecimento os explantes que não contaminaram e formaram brotação.

Para análise estatística, os dados obtidos nos experimentos de estabelecimento foram submetidos à análise de variância e alguns à análise de regressão; as médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, através do Programa Estatístico Sanest (Zonta & Machado, 1992). Dados expressos em percentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada de x/100.

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.3.1 Influência da porção do ramo sobre o estabelecimento de quatro porta-enxertos de Prunus spp.

Observou-se que os explantes iniciaram a brotação a partir do décimo dia de cultivo. Esse rápido estabelecimento das brotações provavelmente esteja relacionado à época de coleta, ou seja, verão, período em que a planta-matriz se encontrava em ativo crescimento vegetativo. Este resultado está de acordo com Rodrigues et al. (2003), que compararam o efeito da época de coleta dos explantes no verão e outono e verificaram que os percentuais de estabelecimento dos porta-enxertos Marianna e GF 677 foram maiores no verão.

Verificou-se que os segmentos nodais retirados da porção basal dos ramos do porta-enxerto cv. Nemaguard apresentaram uma percentagem de estabelecimento superior aos segmentos obtidos da porção apical da brotação da planta matriz (Tabela 3). Possivelmente, na época de coleta (período de verão) as gemas da porção apical do ramo não estavam completamente formadas e, desse modo, interferiram negativamente na formação da brotação durante o estabelecimento in vitro dos porta-enxertos.

De acordo com Villalobos & Thorpe (1991), o estado fisiológico da planta influencia a capacidade morfogenética, de modo que o requerimento nutricional e hormonal também é diferente em tecidos provenientes de diferentes idades fisiológicas da planta. Outro fator importante é a posição relativa da gema. Bressan et al. (1982) observaram que as gemas axilares de roseiras, obtidas da parte média do ramo, desenvolveram-se mais rapidamente do que aquelas da porção apical.

TABELA 3- Percentagem de estabelecimento in vitro dos explantes provenientes

de duas diferentes porções de ramos de porta-enxertos de Prunus spp. UFPel, Pelotas-RS, 2006

*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Comparando-se o percentual de estabelecimento entre os porta-enxertos observou-se que a cv. Mr. S. 2/5 apresentou a maior percentagem de brotações estabelecidas, independente da porção do ramo de onde foram retirados os segmentos (Tabela 3). Isto ocorreu provavelmente porque a formação e a maturação das gemas nessa espécie são mais precoces e uniformes, para a mesma época de coleta dos ramos, em relação às demais cultivares avaliadas, contribuindo desta forma na maximização do estabelecimento in vitro das brotações, não havendo interferência da porção do ramo.

Porta-enxerto Porção do ramo

Apical (0-15 cm) Basal (15-30 cm) Mr. S. 2/5 100,00 aA 98,30 aA Nemared 63,11 bA 80,55 aA Flordaguard 19,80 cA 37,29 bA Nemaguard 2,01 cB 80,54 aA

Os resultados obtidos permitiram inferir que a cv. Mr. S. 2/5 apresenta um excelente potencial para micropropagação in vitro. Resultados semelhantes aos obtidos com Mr. S. 2/5 foram observados nas cvs. Nemared e Nemaguard quando utilizados os explantes retirados da porção basal do ramo (Tabela 3).

Os explantes da cv. Nemaguard, retirados da região apical, tiveram um baixo percentual de estabelecimento (2%) quando comparados com os explantes da porção basal (80%).

A menor percentagem de estabelecimento entre as cultivares foi obtida com a cv. Flordaguard, fazendo exceção apenas os explantes da cv. Nemaguard retirado da porção apical (Tabela 3). Nas condições em que se desenvolveu este experimento, verificou-se que os porta-enxertos estudados possuem diferentes potenciais para micropropagação. Além disso, a melhor região de coleta do ramo pode variar para cada porta-enxerto.

A contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento foi baixa, sendo verificado 1% de contaminação causada por bactéria e 2% causada por fungo. Estes resultados são inferiores aos obtidos por Rodrigues et al. (2003), que trabalhando com os porta-enxertos Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, coletados de plantas mantidas no campo, verificaram perdas por contaminação de 76%, 66% e 63%.

O reduzido percentual de contaminação comprova que o método utilizado neste experimento (plantas mantidas em casa de vegetação e realização de controle fitossanitário sistemático) é eficiente para obter baixo percentual de contaminação dos explantes durante a fase de estabelecimento in vitro dos porta-enxertos Flordaguard, Mr. S. 2/5, Nemaguard e Nemared. De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), a planta mantida em casa-de-vegetação e/ou telado permite o maior controle de microorganismos e insetos, além de facilitar a descontaminação dos explantes.

2.3.2 Efeito do tipo de explante e solidificante no estabelecimento do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 2/5

A contaminação bacteriana e fúngica ocorrida durante os 30 dias da fase de estabelecimento in vitro foi inferior a 1% e não houve diferença no percentual de contaminação entre gema e segmento nodal. Os tratamentos fitossanitários das plantas-matrizes mantidas em casa-de-vegetação, antes da coleta dos explantes, associados ao processo de desinfestação mostram mais uma vez serem eficientes no controle da contaminação durante a fase de estabelecimento in vitro de Mr. S. 2/5, evitando perdas de explantes. Silva et al. (2003) trabalhando com os porta-enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, obtiveram 18,8% de contaminação dos ápices caulinares e 29,8% das gemas.

Os segmentos nodais cultivados nos meios solidificados com ágar ou phytagel apresentaram os maiores percentuais de estabelecimento em relação à gema, porém não diferiram entre si (Tabela 4). O maior percentual de estabelecimento observado com o segmento nodal provavelmente está relacionado ao tamanho do explante e, conseqüentemente, a maior reserva existente no material vegetal. Rodrigues et al. (1999), comparando o efeito da gema e meristema no estabelecimento in vitro dos porta-enxertos cvs. Mirabolano e Marianna, obtiveram apenas 2,8% de estabelecimento para gemas enquanto que a partir de meristemas não conseguiram o estabelecimento.

De acordo com Grattapaglia & Machado, (1998), o tamanho do explante utilizado está relacionado com a possibilidade de sobrevivência e capacidade de crescimento. Portanto, verifica-se que apesar de serem maiores as possibilidades de contaminação, os segmentos nodais proporcionaram a maior percentagem de estabelecimento.

Com relação às gemas, as maiores percentagens de estabelecimento ocorreram no meio solidificado com phytagel (50,2%) e no meio líquido (31,1%), e o menor percentual de estabelecimento das gemas foi observado no meio de cultura solidificado com ágar (Tabela 4). Esses resultados ocorreram, principalmente, em função da oxidação das gemas ocorrida nesse último tipo de meio (Tabela 5).

TABELA 4- Percentagem de estabelecimento dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao

final de 30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente solidificante Gema Segmento Ágar 14,9 bB 99,6 aA Phytagel 50,2 aB 98,3 aA Líquido c/ algodão 31,1 aA 50,2 bA

*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Verificou-se que, nas condições que o experimento foi conduzido, a oxidação dos explantes influenciou de forma determinante o percentual de estabelecimento, principalmente aliado ao tipo de explante. Os maiores percentuais de oxidação ocorreram nos explantes de menor tamanho, ou seja, nos explantes tipo gema.

De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), quanto menor o explante maior a possibilidade de ocorrer à oxidação do mesmo. Além disso, a oxidação é um sério problema em explantes isolados de espécies lenhosas, devido à liberação de compostos fenólicos pelas células lesionadas. Assim sendo, quanto mais baixa a relação entre a área do explante e a área da lesão maior vai ser a quantidade de fenóis produzidos e maiores as possibilidades de falência do explante. Segundo Rodrigues (2000), os diferentes fenóis presentes nos tecidos, ao entrarem em contato com o oxigênio, sofrem reações de oxidação, cujos produtos são tóxicos e causam o escurecimento e necrose do tecido vegetal.

Já, o segmento nodal teve percentuais de morte por oxidação iguais ou próximos de zero, quando cultivado no meio acrescido com ágar ou phytagel. Mas, quando cultivado no meio líquido as perdas por oxidação foram de 50,2% (Tabela 5).

TABELA 5- Percentagem de oxidação dos explantes da cv. Mr. S. 2/5 ao final de

30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente solidificante Gema Segmento Ágar 85,4 aA 0,0 bB Phytagel 50,1 bA 0,5 bB Líquido c/ algodão 68,1 aA 50,2 aA

*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

A maior percentagem de vitrificação ocorreu com os segmentos nodais cultivados no meio com phytagel. No meio acrescido de ágar a percentagem de vitrificação foi nula para as gemas e segmentos nodais (Tabela 6). Resultados semelhantes foram observados por Leite et al. (1993), que obtiveram, com a pereira cv. Carrick cultivada em meio MS solidificado com ágar ou gelrite, 0% e 100% de vitrificação, respectivamente.

Possivelmente, essa diferença entre os dois agentes solidificantes, tenha sido causada porque a utilização de 6,5 g L-1 de ágar no meio disponibilize menos água para os explantes cultivados do que 2,5 g L-1 de phytagel. De acordo com Ibrahim (1994) a vitrificação pode ser reduzida a zero com o aumento da concentração do solidificante no meio de cultura.

Com relação às gemas cultivadas no meio líquido e com solidificante observou-se que elas tiveram baixos percentuais de vitrificação ou iguais a zero. De acordo com Zimmerman (1984), a vitrificação ou hiperhidricidade é uma desordem fisiológica, que geralmente afeta a propagação vegetativa in vitro ocasionando deformações nas folhas as quais se tornam translúcidas.

Além disso, as plantas vitrificadas apresentam baixos níveis de lignina e celulose, e baixa resistência da parede celular (Cuzzuol et al. 1995). No entanto, a vitrificação ocorrida nos explantes cultivados em meio semi-sólido pode ser evitada ou minimizada através do aumento da concentração de ágar ou phytagel no meio de cultura (Ibrahim, 1994).

TABELA 6- Percentagem de vitrificação dos explantes de Mr. S. 2/5 ao final de

30 dias de cultivo in vitro. UFPel, Pelotas-RS, 2006

Tipo de explante Agente

solidificante Gema Segmento

Ágar 0,0 aA 0,0 cA

Phytagel 0,0 aB 75,1 aA

Líquido c/algodão 0,5 aB 19,8 bA

* Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Para a variável comprimento médio das brotações formadas, explantes constituidos por segmento nodal atingiram o maior comprimento, com exceção daqueles cultivados no meio líquido com ponte de algodão (Tabela 7 e Figura 1). Provavelmente o maior comprimento das brotações originadas destes explantes esteja relacionada a maior quantidade de reservas nutricionais e hormonais existentes no tecido vegetal. Entretanto, para os explantes originados de segmentos nodais, cultivados no meio líquido, o comprimento médio da brotação não diferiu daqueles originados a partir de gemas. Talvez as reservas de tecidos do segmento nodal associadas a maior disponibilidade de nutrientes e reguladores de crescimento proporcionados pelo meio líquido tenham possibilitado uma maior absorção pelo explante. Possivelmente, esta condição de cultivo ocasionou um

Observou-se que as brotações formadas a partir de segmentos nodais formaram o maior número de folhas, exceto para os segmentos cultivados no meio líquido. Talvez a maior disponibilidade de reguladores de crescimento ocorrida no meio líquido tenha provocado uma inibição no desenvolvimento da brotação e, conseqüentemente, interferido no número de folhas formadas. O menor número médio de folhas formadas ocorreu nas brotações formadas a partir de gemas cultivadas no meio solidificado com ágar.

TABELA 7 - Comprimento médio das brotaç

ões

em brotações da cv. Mr. S. 2/5 formadas a partir de gema e segmento nodal ao final de 30 dias de cultivo, em função do agente solidificante. UFPel, Pelotas-RS, 2006

*Médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Comprimento da brotação (mm) (c Número de folhas Agente solidificante

Gema Segmento Gema S Segmento

Ágar 2,3 aB 14,1 aA 0,6 bB 7,6 aA

Phytagel 3,1 aB 15,9 aA 3,2 aB 8,6 aA

FIGURA 1- Brotações da cv. Mr. S. 2/5 estabelecidas em meio líquido (1),

phytagel (2) e ágar (3) a partir de segmento nodal (esquerda) e gema (direita), ao final de 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

2.3.3 Qualidade da luz no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de

Prunus cv. Mr. S. 2/5

As perdas causadas pela contaminação fúngica (2,0%) e bacteriana (0,0%) foram baixas (dados não apresentados). Estes resultados podem ser considerados satisfatórios se comparados com os resultados obtidos por Rodrigues et al. (2003), que trabalhando com os porta-enxertos de pessegueiro, mantidos no campo, cvs. Mirabolano, Okinawa e Nemaguard, obtiveram perdas por contaminação superiores a 50%.

O percentual de oxidação obtido neste trabalho (5%) pode ser considerado alto quando comparado com 1,7% obtido por Rodrigues et al. (2003), que trabalharam com o porta-enxerto cv. Mirabolano. Os mesmos autores citam que o uso de substâncias antioxidantes, como ácido ascórbico e polivinilpirrolidona (PVP), podem favorecer o controle da oxidação dos explantes. Sendo assim, o percentual de oxidação do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 poderá ser minimizado ou anulado com a utilização de antioxidantes no meio de cultura.

1 2 3

1 ₂ 3

Em relação ao percentual de estabelecimento observado (93%), este é considerado alto. Resultados similares foram obtidos por Chaves et al. (2004) que, trabalhando com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio no estabelecimento in vitro do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5, obtiveram 96% de estabelecimento. Esse percentual de estabelecimento possivelmente deve estar relacionado com a manutenção das plantas-matrizes sob condições controladas (casa-de-vegetação) e às pulverizações regulares com os defensivos (fungicida e bactericida).

Para a variável comprimento médio das brotações, verificou-se que os explantes cultivados sob o filtro verde 088 (nº 088 Lime green) formaram brotações com comprimento superior às brotações dos demais tratamentos e visualmente não apresentaram sinais de amarelecimento e/ou vitrificação (Tabela 8 e Figura 2). Esse filtro também contribuiu para a formação de maior número de gemas e número de folhas. Esses resultados reafirmam as observações feitas por Silva et al. (1997) de que a qualidade da luz afeta o crescimento e a morfogênese das brotações cultivadas in vitro.

Observou-se que a morfogênese das brotações do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 é influenciada pela qualidade da luz, ou seja, pelo comprimento de onda e a percentagem de transmissão da luz ocorrida no tipo de filtro utilizado.

O alongamento das brotações cultivadas sob o filtro verde (nº 088 Lime green) ocorreu devido à reflexão da luz verde transmitida pelo filtro (69%), pois, de acordo com Salisbury & Ross (1994) a luz verde é refletida pelas plantas. Possivelmente, a reflexão da luz verde estimulou o alongamento das brotações, ocasionando efeito semelhante à condição de cultivo no escuro, onde as brotações estiolam em busca de luz. Contudo, notou-se que visualmente as brotações deste tratamento não apresentaram aspecto amarelado ou vitrificado. Esses resultados observados confirmam que o filtro verde (nº 088 Lime green) permite a transmissão de outros comprimentos de ondas além do verde, como o vermelho e o azul (35 % e 2% de transmissão, respectivamente) e, possivelmente, o valor de 35% de luz vermelha transmitida foi suficiente para evitar o amarelecimento das brotações.

TABELA 8- Efeito de diferentes tipos de filtros sobre o comprimento médio das

brotaç

ões

*Médias seguidas pela mesma letra, na linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade.

FIGURA 2- Aspecto das brotações do porta-enxerto cv. Mr.S. 2/5, provenientes do

cultivo em meio MS e diferentes filtros de luz: SF (sem filtro); verde (nº 088 Lime green), azul (nº 115 Jas blue), azul (nº 724 Ocean blue) e verde (nº 738 Jas green). Pelotas-RS, 2006.

Tipo de Filtro Variáveis analisadas Sem

Filtro Verde 088 Azul 115 Azul 724 Verde 738 Comprimento da brotação 5,0 b 15,0 a 5,0 b 6,0 b 7,0 b Número de gemas 2,0 b 4,0 a 2,0 b 2,2 b 2,5 b Número de folhas 6,0 b 9,0 a 4,0 c 5,0 bc 6,0 b 088 S/F 115 738 724

2.3.4 Efeito das concentrações de sais do meio de cultura e BAP no estabelecimento in vitro do porta-enxerto de pessegueiro cv. Tsukuba

Na Tabela 9 pode ser observado que a maior percentagem de contaminação foi causada por fungo. Os percentuais de contaminação obtidos no presente trabalho foram inferiores aqueles obtidos por Silva et al. (2003) que estabeleceram in vitro os porta-enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, e obtiveram de 14,8% a 29,8% de contaminação. De modo geral, os valores da contaminação observados neste trabalho podem ser considerados baixos e a metodologia utilizada eficaz para o estabelecimento do porta-enxerto Tsukuba. Os resultados obtidos no presente estudo de estabelecimento, somados aos obtidos por Silva et al. (2003), reforçam a importância de se manter a planta-matriz em condições controladas (telado ou casa-de-vegetação) e realizar o controle fitossanitário periodicamente.

TABELA 9- Percentagens de contaminação, estabelecimento e comprimento

médio das brotaç

ões

* Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

Tipo de

meio Contaminação fúngica (%) bacteriana (%) Contaminação Estabelecimento (%) Comprimento da brotação (mm)

MS 2,13 a 0,35 a 96,67 a 4,32 a

MS ¾ 0,67 a 0,00 a 99,33 a 4,33 a

Para a variável percentagem de estabelecimento, de acordo com a análise da variância, não existiu diferença entre os tratamentos utilizados (concentrações de BAP e tipo de meio de cultura). Possivelmente, a existência de fontes de reservas no tecido vegetal dos segmentos nodais seja suficiente para a formação da brotação (Figura 3). Este resultado pode ser considerado satisfatório, pois representa uma economia significativa, considerando que o BAP é um dos constituintes mais caros da composição do meio de cultura.

FIGURA 3- Aspecto da brotação do porta-enxerto de Prunus cv. Tsukuba

estabelecida in vitro, ainda ligado ao segmento nodal da planta- matriz, aos 30 dias de cultivo. UFPel, Pelotas-RS, 2006.

As percentagens de estabelecimento obtidas com o porta-enxerto cv. Tsukuba (Tabela 9), podem ser consideradas elevadas (superior a 96%) se comparadas com 62,9% obtido por Silva et al. (2003) e 16,67% obtido por Rodrigues et al. (1999) que trabalharam com os porta-enxertos de Prunus GF 677, Mirabolano e Marianna. O alto percentual de estabelecimento obtido no presente trabalho pode estar associado ao período de coleta dos explantes na planta-matriz, pois, na época em que os explantes foram coletados (verão), as plantas estavam em pleno desenvolvimento.

Com relação ao comprimento médio das brotações, verificou-se diferença significativa para a concentração de BAP utilizada no meio de cultura. Pode-se observar, por meio da figura 4, um comportamento quadrático do comprimento médio das brotações com o aumento da concentração de BAP. Em termos práticos, o BAP não foi significativo para esta variável, já que a diferença entre o comprimento médio das brotações cultivadas no meio sem BAP e o maior comprimento médio das brotações cultivadas no meio com BAP (0, 4 mg L-1) foi de apenas 1,3 mm. Teixeira et al. (2004) que trabalharam com o porta-enxerto cv. Carelli cultivado em meio de cultura QL acrescido de 0,0; 0,5; e 1,0 mg L.-1 de BAP e observaram uma inibição do comprimento da brotação ( 16,2; 11,0 e 10,8 mm) à medida que se elevava a concentração de BAP no meio de cultura. Silva et al. (2003), trabalhando com o porta-enxerto VP 411, obtiveram brotações com comprimento médio de 7,5 mm. Isso leva a confirmar que cada genótipo responde de maneira diferente as condições de cultivo in vitro.

y = -3,478x2 + 4,21x + 3,53 R2 = 0,91 0 1 2 3 4 5 6 7 0.0 0.4 0.8 1.2 Concentração de BAP (mg L-1) C o m p ri m en to m éd io d a b ro ta çã o ( m m )

FIGURA 4- Comprimento médio das brotações do porta-enxerto cv. Tsukuba, aos

30 dias de cultivo in vitro em diferentes concentrações de BAP. UFPel, Pelotas-RS, 2006.