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Introdução às Técnicas de Separação

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Academic year: 2022

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(1)

QFL1201

Química Analítica Instrumental –Diurno 1º Semestre 2019

24 de maio

Luís Moreira Gonçalves

BSc, MD, PhD

Introdução às

Técnicas de Separação

(2)
(3)

0.5 1.0 1.5

Espectros de absorção de diferentes substâncias

460 nm

(4)
(5)

Detetor Coluna

Sinal

tempo

(6)
(7)
(8)

Михаил Семенович Цвет

Mikhail Semenovich Tswett

LS Ettre, M.S. Tswett and the Invention of Chromatography, LC-GC Eur Set (2003) 1-7

Asti, 1872

Geneve/Lausanne, 1872-1896

São Petersburgo/Kazan/Varsóvia/Tartu/Voronezh, 1896-1917

Tswett - significa cor

58 artigos, sem co-autores

MS Tswett, Trudy Varshavskogo Obshchestva Estestvoispytatelei Otdelenie Biologii, 14 (1905) 20–39

kroma [cor]

+

graphein [escrever]

1903

(9)

http://www.cromatografialiquida.com.br/claetswett.htm

(10)
(11)
(12)

Termos usados em cromatografia

Fase estacionária –

imobilizada em coluna ou superfície plana

Fase móvel –

movimenta-se através da fase estacionária levando os analitos (gás, líquido ou fluído supercrítico)

Eluição–

processo no qual os solutos são transportados através da fase estacionária pela fase móvel

Eluato –

o que sai da coluna

Eluente–

é o solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através da fase estacionária

Cromatograma–

é o registro gráfico da função da

concentração (sinal) pelo tempo ou volume de eluição

https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/chemical-processes/separations-purifications/a/principles-of-chromatography

(13)
(14)

Mecanismos de Separação

(15)

fase fase móvel (líq./gas.) estacionária

Adsorção

Mecanismos de separação

(físicos)

Cromatografia de adsorção

(sólida) FE

Analito

(soluto)

(16)

fase fase móvel estacionária

Partição

(absorção)

Cromatografia de partição

Coluna capilar

Soluto na fase líquida

ligada

Mecanismos de separação

(físicos)

(17)

Absorção vs. Adsorção

(18)

+

+

fase fase móvel estacionária

Troca iônica

+ +

-SO

3-

-N(CH

3

)

3+

Cromatografia de troca iônica -COO

-

-NH

3+

Mecanismos de separação

(químicos)

(19)

fase fase móvel estacionária

Bioafinidade

Cromatografia de afinidade

Mecanismos de separação

(químicos)

(20)

fase fase móvel estacionária

Exclusão

Cromatografia de exclusão

Mecanismos de separação

(mecânicos)

(21)

‘Ler’ um Cromatograma

(22)

Quais informações podemos tirar do cromatograma?

(tR)B

tempo

(tR)A

Sin al

A B C

injeção

(tR’)A

tM= tempo morto ou tempo de retenção da fase móvel tR= tempo de retenção

tR’= tempo de retenção do analito na fase estacionária

(23)

t

R

t

M

Tempo/Volume

Sin al

Tempo ou volume de retenção

V R ’ = V R - V M V R =  x t R t R ’ = t R - t M

t

R

VM= volume morto

VR= volume de retenção

 = vazão da fase móvel (ml/min)

VR’= volume de retenção do analito na fase estacionária

(24)

t

R

t

M

Tempo

Sin al

Fator de capacidade ( k )

(Fator de Retenção)

k ' = = t

R

t -t

M

M

t

R

’ t

M

 Usado para comparar as velocidades de migração dos solutos na coluna

 k ideais de ~1 a 5 ( k > 20 tempo de eluição é considerado longo)

(25)

(tR)B

tempo

(tR)A

Sin al

A B C

injeção

(t

R

’)

B

(t

R

’)

A

=

Fator de separação (  )

(Fator de seletividade ou Retenção relativa)

 Quanto maior  maior a separação entre dois componentes.

γ (t

R

)

B

(t

R

)

A

=

(26)

(tR)B

tempo

(tR)A

Sin al

A B C

injeção

K B

K A

k B k A

(t

R

’)

B

(t

R

’)

A

= =

=

 Usado para calcular o poder de resolução de uma coluna (  > 1)

Relação entre (  ) ( k ) (K)

(27)

Rs = 0,50 Rs = 0,75

Rs = 1,00 Rs = 1,50

Resolução (Rs)

(28)

1,26%

1,00%

8,9%

Não é normal!

Normal! > 20% Normal!

< 0,01% Não é normal!

(29)

Resolução (Rs)

w

b1

w

b2

t

R1

t

R2

Rs =  t R W b

W

b1

+ W

b2

= 2

W

b

(30)

Medida da largura da banda

ponto de inflexão

Sin al

Tempo ou volume

injeção t=0

Rs 0,59 t R

W 1/2

Rs t R = W b

=

(31)

Mais teoria...

(32)
(33)
(34)

Teoria dos pratos

prato teórico

“estágio” de equilíbrio

A A

K = [A]

E

/[A]

M

(35)

[A]

E

K =

[A]

M

[A]

E

[A]

M

isoterma de distribuição

cromatografia linear

Coeficiente de partição (K)

(Constante de Distribuição)

A móvel A estacionária

K permanece invariável por um amplo intervalo de concentração, portanto [A]E é proporcional a [A]M

(36)

Número de pratos (teóricos), N

Coluna mais eficiente t

R

w

b

N

H = N L

Maior t

R

implica maior tempo de análise

N= número de pratos teóricos L = comprimento da coluna H = altura de prato

(37)
(38)

Eficiência da Coluna Cromatográfica

σ 2

H = L

Pode ser expresso pela variância (σ2) da largura do sinal de pico (geralmente uma gaussiana) por unidade de comprimento da coluna.

Pode ser expresso pelo tempo de retenção de uma dada substância ao passar pela coluna e a largura da base do pico.

Relação entre H e N

L

N = H LL

= σ 2

L 2

= (W/4) 2

CG  H ~ 0,1-1 mm

HPLC  H ~ 10  m Eletroforese Capilar

EC  H < 1  m

(39)

Ainda mais teoria...

(40)

Alargamento de banda

coluna

Causas do alargamento

problemas na injeção

coluna/fase móvel

detector

Alargamento de banda reflete a perda de eficiência da coluna.

(41)

Variáveis que afetam a eficiência da coluna

 Velocidade linear da fase móvel: u = L(cm)/t

M

(s)

 Coeficiente de difusão do soluto na fase móvel: D

M

(cm

2

/s)

 Coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária: D

E

(cm

2

/s)

 Fator de retenção: k’ = t

R’

/t

M

 Diâmetro das partículas (colunas recheadas): d

p

(cm)

 Espessura da camada de líquido da fase estacionária (coluna capilar): d

f

(cm)

(42)

H = A + B/ u + C u

caminhos

múltiplos difusão

longitudinal tempo de equilíbrio

Teoria do alargamento de banda

Equação de van Deemter

A = 2 l d P

l = constante que depende do tipo de empacotamento dp = diâmetro da partícula

u = velocidade linear

(43)

H = A + B/ u + C u

caminhos

múltiplos difusão longitudinal

tempo de equilíbrio

Equação de van Deemter

B = 2 g D

M

g = constante T viscosidade e  u B/ u

(44)

 B = é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel u = velocidade linear do eluente

 Na difusão as espécies migram de uma região mais concentrada para mais diluída.

 Velocidade de migração é proporcional a diferença de conc.

entre as regiões e ao coeficiente de difusão das espécies.

 Efeito significativo na CG e de menor importância na CL

Equação de van Deemter

B/u = termo de difusão longitudinal

t

o

t

1

Efeito da difusão longitudinal

(45)

H = A + B/u + Cu

caminhos

múltiplos difusão

longitudinal tempo de equilíbrio

Equação de van Deemter

termo de transferência

de massa

fase móvel estacionáriafase

eluição

(46)

H = A + B/u + Cu

caminhos

múltiplos difusão

longitudinal tempo de equilíbrio

Equação de van Deemter

termo de transferência

de massa

Fase estacionária

interface Fase móvel

Perfil de concentração no equilíbrio

Perfil de concentração

real

(47)
(48)

H

u (ml/min)

Equação de van Deemter

H = A + B/u + Cu

A + B/u + Cu

(49)

cromatografia gasosa

cromatografia líquida

Equação de van Deemter

(50)

Bandas assimétricas

sobrecarga

formação

de cauda

(51)
(52)
(53)

Resolução em função das condições

(equação de Purnell)

 N ( α – 1 ) k’

B

Rs =

4 α 1 + k’

B

eficiência separação retenção

(54)

aumenta α

aumenta N

t

0

inicial A B

(55)

Resumo dos parâmetros cromatográficos

Relação entre Resolução, N, k’ e 

(56)

www.iq.usp.br/lmgoncalves

lmgoncalves@iq.usp.br

Referências

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