QFL1201
Química Analítica Instrumental –Diurno 1º Semestre 2019
24 de maio
Luís Moreira Gonçalves
BSc, MD, PhD
Introdução às
Técnicas de Separação
0.5 1.0 1.5
Espectros de absorção de diferentes substâncias
460 nm
Detetor Coluna
Sinal
tempo
Михаил Семенович Цвет
Mikhail Semenovich Tswett
LS Ettre, M.S. Tswett and the Invention of Chromatography, LC-GC Eur Set (2003) 1-7
Asti, 1872
Geneve/Lausanne, 1872-1896
São Petersburgo/Kazan/Varsóvia/Tartu/Voronezh, 1896-1917
Tswett - significa cor
58 artigos, sem co-autores
MS Tswett, Trudy Varshavskogo Obshchestva Estestvoispytatelei Otdelenie Biologii, 14 (1905) 20–39
kroma [cor]
+
graphein [escrever]
1903
http://www.cromatografialiquida.com.br/claetswett.htm
Termos usados em cromatografia
Fase estacionária –
imobilizada em coluna ou superfície plana
Fase móvel –movimenta-se através da fase estacionária levando os analitos (gás, líquido ou fluído supercrítico)
Eluição–processo no qual os solutos são transportados através da fase estacionária pela fase móvel
Eluato –
o que sai da coluna
Eluente–
é o solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através da fase estacionária
Cromatograma–é o registro gráfico da função da
concentração (sinal) pelo tempo ou volume de eluição
https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/chemical-processes/separations-purifications/a/principles-of-chromatography
Mecanismos de Separação
fase fase móvel (líq./gas.) estacionária
Adsorção
Mecanismos de separação
(físicos)
Cromatografia de adsorção
(sólida) FE
Analito
(soluto)
fase fase móvel estacionária
Partição
(absorção)
Cromatografia de partição
Coluna capilar
Soluto na fase líquida
ligada
Mecanismos de separação
(físicos)
Absorção vs. Adsorção
+
+
fase fase móvel estacionária
Troca iônica
+ +
-SO
3--N(CH
3)
3+Cromatografia de troca iônica -COO
--NH
3+Mecanismos de separação
(químicos)
fase fase móvel estacionária
Bioafinidade
Cromatografia de afinidade
Mecanismos de separação
(químicos)
fase fase móvel estacionária
Exclusão
Cromatografia de exclusão
Mecanismos de separação
(mecânicos)
‘Ler’ um Cromatograma
Quais informações podemos tirar do cromatograma?
(tR)B
tempo
(tR)A
Sin al
A B C
injeção
(tR’)A
tM= tempo morto ou tempo de retenção da fase móvel tR= tempo de retenção
tR’= tempo de retenção do analito na fase estacionária
t
Rt
MTempo/Volume
Sin al
Tempo ou volume de retenção
V R ’ = V R - V M V R = x t R t R ’ = t R - t M
t
R’
VM= volume morto
VR= volume de retenção
= vazão da fase móvel (ml/min)
VR’= volume de retenção do analito na fase estacionária
t
Rt
MTempo
Sin al
Fator de capacidade ( k )
(Fator de Retenção)
k ' = = t
Rt -t
MM
t
R’ t
M Usado para comparar as velocidades de migração dos solutos na coluna
k ideais de ~1 a 5 ( k > 20 tempo de eluição é considerado longo)
(tR)B
tempo
(tR)A
Sin al
A B C
injeção
(t
R’)
B(t
R’)
A=
Fator de separação ( )
(Fator de seletividade ou Retenção relativa)
Quanto maior maior a separação entre dois componentes.
γ (t
R)
B(t
R)
A=
(tR)B
tempo
(tR)A
Sin al
A B C
injeção
K B
K A
k B k A
(t
R’)
B(t
R’)
A= =
=
Usado para calcular o poder de resolução de uma coluna ( > 1)
Relação entre ( ) ( k ) (K)
Rs = 0,50 Rs = 0,75
Rs = 1,00 Rs = 1,50
Resolução (Rs)
1,26%
1,00%
8,9%
Não é normal!
Normal! > 20% Normal!
< 0,01% Não é normal!
Resolução (Rs)
w
b1w
b2t
R1t
R2Rs = t R W b
W
b1+ W
b2= 2
W
bMedida da largura da banda
ponto de inflexão
Sin al
Tempo ou volume
injeção t=0
Rs 0,59 t R
W 1/2
Rs t R = W b
=
Mais teoria...
Teoria dos pratos
prato teórico
“estágio” de equilíbrio
A A
K = [A]
E/[A]
M[A]
EK =
[A]
M[A]
E[A]
Misoterma de distribuição
cromatografia linear
Coeficiente de partição (K)
(Constante de Distribuição)
A móvel A estacionária
K permanece invariável por um amplo intervalo de concentração, portanto [A]E é proporcional a [A]M
Número de pratos (teóricos), N
Coluna mais eficiente t
Rw
bN
H = N L
Maior t
Rimplica maior tempo de análise
N= número de pratos teóricos L = comprimento da coluna H = altura de prato
Eficiência da Coluna Cromatográfica
σ 2
H = L
Pode ser expresso pela variância (σ2) da largura do sinal de pico (geralmente uma gaussiana) por unidade de comprimento da coluna.Pode ser expresso pelo tempo de retenção de uma dada substância ao passar pela coluna e a largura da base do pico.
Relação entre H e N
L
N = H LL
= σ 2
L 2
= (W/4) 2
CG H ~ 0,1-1 mm
HPLC H ~ 10 m Eletroforese Capilar
EC H < 1 m
Ainda mais teoria...
Alargamento de banda
coluna
Causas do alargamento
⚫
problemas na injeção
⚫
coluna/fase móvel
⚫
detector
Alargamento de banda reflete a perda de eficiência da coluna.
Variáveis que afetam a eficiência da coluna
Velocidade linear da fase móvel: u = L(cm)/t
M(s)
Coeficiente de difusão do soluto na fase móvel: D
M(cm
2/s)
Coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária: D
E(cm
2/s)
Fator de retenção: k’ = t
R’/t
M Diâmetro das partículas (colunas recheadas): d
p(cm)
Espessura da camada de líquido da fase estacionária (coluna capilar): d
f(cm)
H = A + B/ u + C u
caminhos
múltiplos difusão
longitudinal tempo de equilíbrio
Teoria do alargamento de banda
Equação de van Deemter
A = 2 l d P
l = constante que depende do tipo de empacotamento dp = diâmetro da partículau = velocidade linear
H = A + B/ u + C u
caminhos
múltiplos difusão longitudinal
tempo de equilíbrio
Equação de van Deemter
B = 2 g D
Mg = constante T viscosidade e u B/ u
B = é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel u = velocidade linear do eluente
Na difusão as espécies migram de uma região mais concentrada para mais diluída.
Velocidade de migração é proporcional a diferença de conc.
entre as regiões e ao coeficiente de difusão das espécies.
Efeito significativo na CG e de menor importância na CL
Equação de van Deemter
B/u = termo de difusão longitudinal
t
ot
1Efeito da difusão longitudinal
H = A + B/u + Cu
caminhos
múltiplos difusão
longitudinal tempo de equilíbrio
Equação de van Deemter
termo de transferência
de massa
fase móvel estacionáriafase
eluição
H = A + B/u + Cu
caminhos
múltiplos difusão
longitudinal tempo de equilíbrio
Equação de van Deemter
termo de transferência
de massa
Fase estacionária
interface Fase móvel
Perfil de concentração no equilíbrio
Perfil de concentração
real
H
u (ml/min)
Equação de van Deemter
H = A + B/u + Cu
A + B/u + Cu
cromatografia gasosa
cromatografia líquida
Equação de van Deemter
Bandas assimétricas
sobrecarga
formação
de cauda
Resolução em função das condições
(equação de Purnell)
N ( α – 1 ) k’
BRs =
4 α 1 + k’
Beficiência separação retenção
aumenta α
aumenta N
t
0inicial A B
Resumo dos parâmetros cromatográficos
Relação entre Resolução, N, k’ e