PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Luis Ernesto Campos Torres
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN-VITRO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) SOBRE A MICROBIOTA OCULAR DE EQUINOS HÍGIDOS
DE MINAS GERAIS.
Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG
2022
Luis Ernesto Campos Torres
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN-VITRO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) SOBRE A MICROBIOTA OCULAR DE EQUINOS HÍGIDOS
DE MINAS GERAIS.
Belo Horizonte 2022
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Área de Concentração: Medicina e Cirurgia Veterinárias Orientadora: Profa. Dra. Renata de Pino Albuquerque Maranhão
Bibliotecária responsável Cristiane Patrícia Gomes – CRB2569
Biblioteca da Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais equinos hígidos em Minas Gerais / Luis Ernesto Campos Torres . -2022.
63.:il.
Orientadora: Renata de Pino Albuquerque Maranhão.
Dissertação (Mestrado) apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais para obtenção do título de Mestre em Ciência animal
Área de concentração: Medicina e Cirurgia Veterinária.
Bibliografia: f. 49 a 60.
1. Equino - Teses - 2. Antimicrobianos - Teses - 3. Veterinária - Teses - I. Maranhão, Renata de Pino Albuquerque - II. Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária – III.
Título.
CDD – 636.089
ATA DE DEFESA DE DISSERTAÇÃO - LUIS ERNESTO CAMPOS TORRES
Às 14:00 horas do dia 30 de maio de 2022, reuniu-se, na Escola de Veterinária da UFMG a Comissão Examinadora de Dissertação, para julgar, em exame final, a defesa da dissertação in tulada:
"ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN-VITRO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) SOBRE A MICROBIOTA OCULAR DE EQUINOS HÍGIDOS DE MINAS GERAIS”
Como requisito final para a obtenção do Grau de Mestre em Ciência Animal, área de concentração em Medicina e Cirurgia Veterinária.
Abrindo a sessão, o(a) Presidente da Comissão, Renata de Pino Albuquerque Maranhão, após informar o aos presentes o teor das Normas Regulamentares da Defesa de Dissertação, passou a palavra ao candidato (a), para apresentação de seu trabalho. Seguiu-se a arguição pelos examinadores, com a respec va defesa do(a) candidato(a). Logo após, a Comissão se reuniu, sem a presença do(a) candidato(a) e do público, para julgamento da dissertação, tendo sido atribuídas as seguintes indicações:
Examinador / Prof. (a) / Dr. (a) Aprovado(a) Reprovado(a) Renata de Pino Albuquerque Maranhão x
Jorge Uriel Carmona Ramírez x
Priscila Fan ni x
Face os resultados, o (a) aluno (a) foi considerado(a):
Aprovado(a) x Reprovado(a)
Para concluir o Mestrado, o(a) candidato(a) deverá entregar 01 volume encadernado da versão final da dissertação, acatando, se houver, as modificações sugeridas pela banca, e a comprovação de submissão de pelo menos um ar go cien fico em periódico recomendado pelo Colegiado dos Cursos. Para tanto, terá o prazo máximo de 60 dias a contar da data da defesa.
O resultado final, foi comunicado publicamente ao(a) candidato(a) pelo(a) Presidente da Comissão. Nada mais havendo a tratar, o(a) Presidente encerrou a reunião e lavrou a presente ata, que será assinada por todos os membros par cipantes da Comissão Examinadora.
Belo Horizonte, 30 de maio de 2022.
Assinatura dos membros da banca:
Documento assinado eletronicamente por Renata de Pino Albuquerque Maranhao, Professora do Magistério Superior, em 09/06/2022, às 14:17, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Priscila Fan ni, Cidadão, em 09/06/2022, às 19:49, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Jorge Uriel Carmona Ramírez, Usuário Externo, em 09/06/2022, às 20:38, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
A auten cidade deste documento pode ser conferida no site h ps://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?
acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 1474106 e o código CRC E2B9B1DD.
Referência: Processo nº 23072.229720/2022-21 SEI nº 1474106
FOLHA DE APROVAÇÃO LUIS ERNESTO CAMPOS TORRES
Dissertação subme da à banca examinadora designada pelo Colegiado do Programa de Pós-Graduação em CIÊNCIA ANIMAL, como requisito para obtenção do grau de MESTRE em CIÊNCIA ANIMAL, área de concentração Medicina e Cirurgia Veterinária.
Aprovado(a) em 30 de maio de 2022, pela banca cons tuída pelos membros:
Dr.(a). Renata de Pino Albuquerque Maranhão - Presidente - Orientador(a) Dr.(a). Jorge Uriel Carmona Ramírez
Dr.(a). Priscila Fan ni
Documento assinado eletronicamente por Renata de Pino Albuquerque Maranhao, Professora do Magistério Superior, em 07/06/2022, às 10:11, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Priscila Fan ni, Cidadão, em 09/06/2022, às 19:49, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Jorge Uriel Carmona Ramírez, Usuário Externo, em 09/06/2022, às 20:37, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
A auten cidade deste documento pode ser conferida no site h ps://sei.ufmg.br/sei/controlador_externo.php?
acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 1474173 e o código CRC B8497CD8.
Referência: Processo nº 23072.229720/2022-21 SEI nº 1474173
Dedico A toda minha família, que sem o apoio deles, nada disso teria acontecido. Também para aquelas pessoas que vi por última vez na Colômbia e agora que voltar não vou ver mais.
AGRADECIMENTOS
Quiero dar las gracias primeramente a toda mi familia, que me dieron las alas para volar hasta donde estoy ahora. En especial a mi madre Elizabeth Torres, mi hermana Katherine Campos, mi hermano Jhon Campos, mi papá Luis Campos, mi padrino Fabian Barrios y sus hijos, mi tía Olga Torres y todos los demás familiares y amigos que siempre desde la lejanía me brindaron su apoyo incondicional y desearon lo mejor para mí. Agradezco también a mis casi hermanos y roomies que me regalo esta experiencia en Brasil, Jennifer Castro y Camilo Osorio, que fueron piezas claves e incondicionales en estos años.
Quero dar um agradecimento especial para minha orientadora, Profa. Renata de Pino Albuquerque Maranhão, por ter me acolhido como seu orientado, pela oportunidade, pela paciência, pelo apoio, pelos conhecimentos transmitidos, por ser a luz nesses momentos de escuridão durante essa caminhada. Também quero dar um agradecimento a minha colega Jéssica Guerra pela ajuda e o apoio incondicional que me brindo neste processo, para que tudo fora possível. A minha outra mão esquerda e colega da pós-graduação Camilo Osorio, pela ajuda, acompanhamento e amizade real neste processo. À Profa. Priscila Fantini por sua amizade, seu apoio, seu conhecimento em todos os momentos do mestrado. À Profa. Fabíola Paes Leme por ter me aberto um espaço no laboratório da unidade multidisciplinar de pesquisa animal (MULTILAB), pela ajuda e ensinamentos. A Profa.
Kelly Moura Keller pela ajuda no esclarecimento de dúvidas, pelo apoio e pelo acesso ao laboratório de micologia e toxinas (LAMICO). A Prof. Carmona, que além de ser um pesquisador exemplar, desde a Colômbia me brindo assessoria incondicional. A Profa. Ilza Santos, que sempre desde a distância sua ajuda, apoio e gentileza foi presente. A Profa. Rafaella Teixeira por todos os conhecimentos transmitidos e por ser esse docente inspirador. A Prof. Jorge Tibúrcio pela amizade, pelo apoio e pelos ensinamentos no transcurso de seu projeto de Doutorado. Aos jovens cientistas Henrique Lobato e Giovanna Debeche que me acompanharam durante todo o experimento. A todo o pessoal do grupo de estudos EMIE e o pessoal do galpão de equinos.
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo auxílio com a bolsa de estudos durante o período do mestrado.
Só tenho palavras de gratidão para as pessoas que fizeram parte deste processo, e desejo o melhor para todos.
A nossa recompensa está no esforço, não no resultado.
Um esforço total é uma vitória completa.
Mahatma Gandhi
RESUMO
Na oftalmologia equina, as ceratites ulcerativas estão entre as afecções mais comuns e, em geral, surgem como consequência a algum trauma sofrido. Apesar do trauma ser a causa primária, a contaminação subsequente por bactérias patogênicas ou residentes da microbiota ocular do cavalo pode ter consequências não desejáveis. Em condições fisiológicas, a microbiota normal coexiste com o estado imunológico do hospedeiro. Serve como barreira, garantindo a saúde da superfície ocular e inibindo a proliferação de agentes patógenos. No entanto, no desequilibro das barreiras imunes, a microbiota normal pode se tornar patogênica e levar a infecção, agindo como um agente oportunista. O objetivo do presente estudo é demonstrar o efeito antimicrobiano do Plasma rico em plaquetas (PRP), seu tempo de ação e sua correlação com a concentração dos seus mesmos componentes in-vitro sobre Staphylococcus sciuri, bactéria com alta prevalência na microbiota ocular normal de cavalos hígidos do município de Minas Gerais, avaliando diversos testes antimicrobianos na busca de métodos mais rápidos, mais sensíveis e com dados com maior estabilidade. Para a confecção do PRP, foram utilizados oito equinos adultos da raça Quarto de Milha (QM) que forneceram apenas o sangue para processamento. Após a coleta de sangue, foi realizado hemograma, obtendo: contagem plaquetária, contagem de hemácias e leucócitos em hemocitômetro de impedância. O PRP individual foi elaborado pelo protocolo de dupla centrifugação e em seguida, os PRPs foram somados em um pool, seguindo a ser testado sua interação em cultivo com caldo Brain heart infusion (BHI) em diferentes diluições frente a seis cepas coletadas de diferentes animais. Após 3, 6, 12 e 18 horas, foi avaliada a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em placa de ágar sangue de equino 5%, e a leitura da densidade óptica pelo método de espectrofotometria de massa, para cada tempo. Nosso estudo demostrou que o Staphylococcus sciuri, é mais susceptível que a cepa padrão “American Type Culture Collection”
(ATCC) Staphylococcus aureus, micro-organismo patógeno, utilizado para a validação de nosso estudo.
O efeito antibacteriano apresentado neste estudo foi bacteriostático por até 6 horas. Onde nossas diluições mais concentradas de PRP 1:1 (5) e 1:2 (6) foram as mais efetivas, garantindo que esse efeito antibacteriano é dependente do volume.
Palavras chaves: PRP, equino, Staphylococcus sciuri, atividade antimicrobiana, UFC, bacteriostático, Staphylococcus aureus.
ABSTRACT
In equine ophthalmology, ulcerative keratitis is among the most common affections and, in general, arises as a consequence of some trauma suffered. Although trauma is the primary cause, subsequent contamination by pathogenic or resident bacteria of the horse's ocular microbiota can have undesired consequences. Under physiological conditions, the normal microbiota coexists with the host's immune status. It serves as a barrier, ensuring the health of the ocular surface and inhibiting the proliferation of pathogens. However, in the imbalance of immune barriers, the normal microbiota can become pathogenic and lead to infection, acting as an opportunistic agent. The aim of the present study is to demonstrate the antimicrobial effect of platelet-rich plasma (PRP), its time of action and its correlation with the concentration of its same components in-vitro on Staphylococcus sciuri, a bacterium with high prevalence in the normal ocular microbiota of horses. in the municipality of Minas Gerais, evaluating several antimicrobial tests in the search for faster, more sensitive methods with more stable data. For the preparation of the PRP, eight adult Quarter Horse (QM) horses were used, which only supplied the blood for processing. After blood collection, a complete blood count was performed, obtaining platelet count, erythrocyte and leukocyte count in an impedance hemocytometer. The individual PRP was prepared by the double centrifugation protocol and then the PRPs were added into a pool, followed by testing their interaction in culture with Brain heart infusion (BHI) broth at different dilutions against six strains collected from different animals. After 3, 6, 12 and 18 hours, was evaluated the colony forming units (UFC) count on a 5% horse blood agar plate, and the optical density reading by spectrophotometry, were evaluated for each time. Our study demonstrates that Staphylococcus sciuri, commensal microorganism of the ocular microbiota of healthy horses in the municipality of Minas Gerais, is more susceptible than the standard
“American Type Culture Collection” (ATCC) strain Staphylococcus aureus, a pathogenic microorganism, used for the validation of our study. The antibacterial effect presented in this study was bacteriostatic for up to 6 hours. Where our most concentrated dilutions of PRP 1:1 (5) and 1:2 (6) were the most effective, ensuring that this antibacterial effect is volume dependent.
Keywords: PRP, horse, Staphylococcus sciuri, antimicrobial activity, CFU, bacteriostatic, Staphylococcus aureus.
ISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Medianas de UFC/ml das cepas em cada tempo, considerando-se todas as
medianas das diluições. ... 40 Tabela 2 - Medianas das UFC/ml das diluições de acordo à tempo considerando-se todas as cepas. ... 41 Tabela 3 - Medianas da Absorbância (A ₆₂₀) das cepas ao longo do tempo considerando-se todas as medias das diluições ... 42 Tabela 4 - Medianas da absorbância (A ₆₂₀) das diluições ao longo do tempo considerando-se todas as cepas. ... 43
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desenho dos subgrupos de cada tratamento ... 37 Figura 2 -Médias de UFCs/ml das cepas ao longo do tempo considerando-se todas as medias das diluições. Fonte: pessoal. *C1-6 Staphylococcus sciuri, CP Staphylococcus aureus. Letras maiúsculas especificam diferenças entre cepas para um mesmo tempo e minúsculas
especificam as diferenças entre tempos para uma mesma cepa, com nível de significância de 5%. ... 40 Figura 3 – Medias de UFC/ml das diluições ao longo do tempo considerando-se as medias das cepas. Letras maiúsculas especificam diferenças entre diluições para um mesmo tempo.
Letras minúsculas especificam as diferenças entre tempos para uma mesma diluição, com nível de significância de 5%. Fonte: pessoal. *(3) controle, (5) 1:1, (6) 1:2, (7) 1:4, (8) 1:8, (9) 1:16. ... 41 Figura 4 – Medias de UFC/ml das diluições consideranso-se todas as medias das cepas e tempos agrupadas. Fonte: pessoal. *(3) controle, (5) 1:1, (6) 1:2, (7) 1:4, (8) 1:8, (9) 1:16. ... 42 Figura 5 – Médias da Absorbância (A ₆₂₀) das cepas ao longo do tempo considerando-se todas as medias das diluições. Letras maiúsculas especificam diferenças entre cepas para um mesmo tempo. Letras minúsculas especificam as diferenças entre tempos para uma mesma cepa, com nível de significância de 5%. Fonte: pessoal. *C1-6 Staphylococcus sciuri, CP
Staphylococcus aureus. ... 43 Figura 6 – Médias da Absorbância (A ₆₂₀) das diluições ao longo do tempo considerando-se as medias das cepas. Letras maiúsculas especificam diferenças entre diluições para um mesmo tempo. Letras minúsculas especificam as diferenças entre tempos para uma mesma diluição, com nível de significância de 5%. Fonte: pessoal. *(5) 1:1, (6) 1:2, (7) 1:4, (8) 1:8, (9) 1:16.44 Figura 7 – Médias da Absorbância das diluições considerando-se todas as medias das cepas e tempos agrupados. Fonte: pessoal. *(5) 1:1, (6) 1:2, (7) 1:4, (8) 1:8, (9) 1:16. ... 45
LISTA DE ABREVIATURAS
%T: Porcentagem de transmissão ADP: Adenosina difosfato
ATCC: American Type Culture Collection ATP: Adenosina trifosfato
BHI: Brain heart infusion CaCl₂: Cloruro de cálcio CP: Concentrado plaquetário
CTAP3: Peptídeo ativador do tecido conjuntivo DO: Densidade óptica
EGF: Fator de crescimento epidermal ERO: Espécies reativas de oxigeno FC: Fatores de crescimento
FcγRII: Receptor de baixa afinidade para fragmentos de imunoglobulina G FGF: Fator de crescimento fibroblástico
IGF: Fator de crescimento derivado de insulina IL-1β: Interleucina 1 beta
L-PRP: Plasma rico em plaquetas e leucócitos MIC: Concentração mínima inibitória
MK: Megacariócitos MMP: Metaloproteinase MPO: Mieloperoxidase
MRSA: Staphylococcus aureus resistente à meticilina MRSE: Staphylococcus epidermis resistente à meticilina MSSA: Staphylococcus aureus sensível à meticilina MSSE: Staphylococcus epidermis sensível à meticilina NAP2: Peptídeo ativador de neutrófilos
PBS: Solução buffer fosfato salina PBP: Proteína básica plaquetária
PDGF: Fator de crescimento derivado das plaquetas
PF-4: Fator plaquetário 4 pH: Potencial hidrogeniônico
PMP: Proteínas antimicrobianas plaquetárias PPP: Plasmas pobre em plaquetas
PPR: Peste des petites ruminants
PRGF: Plasma rico em fatores de crescimento PRP: Plasma rico em plaquetas
QM: Quarto de milha
TGF-β: Fator de crescimento beta transformante TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
UFC: Unidades formadoras de colônias
VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular
SUMARIO
RESUMO ... 8
ISTA DE TABELAS ... 10
LISTA DE FIGURAS ... 11
LISTA DE ABREVIATURAS ... 12
1. INTRODUÇÃO ... 15
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 16
2.1 Plasma rico em plaquetas ... 16
2.2 Plaquetas ... 18
2.3 Atividade antimicrobiana do PRP ... 20
2.4 Microbiologia do crescimento bacteriano ... 25
2.4.1 Condições físicas e químicas ... 25
2.4.2 Meios de cultura e método de contagem em placa ... 26
2.4.3 Espectrofotometria... 28
2.5 Conjuntiva ocular e sua microbiota ... 29
2.5.1 Staphylococcus sciuri ... 30
2.5.2 Staphylococcus aureus ... 32
3. MATERIAIS E METODOS ... 33
3.1 Animais ... 33
3.2 Coleta e processamento do PRP ... 34
3.3 Preparação das Bactérias e inóculo ... 35
3.4 Desenho do estudo e ensaio antibacteriano in-vitro ... 36
4. RESULTADOS ... 38
4.1 Animais e avaliação do sangue total comparado com o PRP ... 39
4.2 Comportamento das cepas e as diluições ao longo do tempo relacionadas com a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) ... 39
4.3 Comportamento das cepas e as diluições ao longo do tempo relacionadas com a densidade óptica medida por absorbância. ... 42
5. DISCUSSÃO ... 45
6. CONCLUSÕES ... 50
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 50
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 51
9. ANEXOS ... 63
1. INTRODUÇÃO
As ceratites ulcerativas estão entre as afecções mais comuns na oftalmologia equina, em geral, surgem como consequência a algum trauma sofrido (CÁRDENAS e CACERES, 2017).
Embora o trauma seja a causa inicial, a contaminação secundária por bactérias patógenas ou residentes da microbiota ocular do equino pode resultar em sequelas graves. Em situações fisiológicas, a microbiota normal vive em equilíbrio com a condição imune do hospedeiro. Ela cumpre uma função de barreira, mantendo a saúde da superfície ocular e evitando crescimento excessivo de agentes patogênicos. Porém, diante da redução das barreiras imunes, a microbiota normal pode tornar-se patogênica e levar a infecção, cursando como um agente oportunista (JOHNS et al., 2011; KHOSRAVI et al., 2014). Os isolados bacterianos e fúngicos da conjuntiva normal podem variar conforme a localização geográfica, clima, idade, sexo e habitação dos animais. Mais comumente predominam as bactérias Gram-positivas aeróbias (ANDREW et al., 2003;
KHOSRAVI et al., 2014): Staphylococcus spp., Bacillus spp. e Corynebacterium spp. (BARAN et al., 2015; FERREIRA et al., 2017; HAMPSON et al., 2018). Concordando com esses estudos, Oliveira (2019) isolou micro-organismos de cavalos hígidos em dois municípios de Minas Gerais onde um dos agentes com mais prevalência foi o Staphylococcus sciuri sendo compatível também com outros estudos na espécie (ANDREW et al., 2003; JOHNS et al., 2011; FERREIRA et al., 2015; HAMPSON et al., 2018).Os Staphylococcus são um dos principais gêneros envolvidos nas alterações oculares de equinos (WADA et al., 2010; KELLER e HENDRIX, 2005).
Os tratamentos para ceratite ulcerativa, muitas vezes, apresentam resultados limitados. Por isso, surge a necessidade de encontrar novas estratégias terapêuticas que sejam de ação múltipla, menos artificiais e sem potenciais alérgenos, como conservantes ou outros produtos que, em curto ou longo prazo, possam induzir toxicidade na superfície ocular, que é muito vulnerável (RIBEIRO et al., 2017). Nesse contexto o plasma rico em plaquetas (PRP) que é um produto biológico derivado do sangue, utilizado para a promoção de melhor reparo tecidual, por meio de seus fatores de crescimento (FC) contidos na sua composição, cumpre com a maioria dos objetivos terapêuticos para este tipo de patologias oculares. Bezerra et al., (2020) demostrou a efetividade do PRP frente à ceratite ulcerativa em um equino, em que houve redução do tempo de consolidação e maior qualidade da cicatrização. Além das vantagens terapêuticas já citadas, seu potencial antimicrobiano vem recebendo atenção. Bielecki et al., (2007) e Moojen et al., (2008) reportaram que o concentrado de plaquetas humanas tem atividade antimicrobiana contra bactérias como Staphylococcus aureus (Resistente e sensível à meticilina), Escherichia coli e outros. Álvarez et al., (2011) e López et al.,
(2014) comprovaram também este efeito dos derivados das plaquetas do equino em um modelo in- vitro frente a Staphylococcus aureus resistente e sensível à meticilina. Esses estudos chegaram à conclusão de que a combinação dos componentes do PRP como as plaquetas e seus grânulos alfa que liberam algumas proteínas microbicidas e fatores de crescimento, como os leucócitos e o plasma que contêm complemento e proteínas de ligação ao complemento, produz uma substância com efeitos antimicrobianos (BLAIR e FLAUMENHAFT, 2009; ALVARES et al., 2011; LÓPEZ et al., 2014).
Esse estudo tem como objetivo, demonstrar o efeito antimicrobiano do Plasma rico em plaquetas (PRP), seu tempo de ação e sua correlação com a concentração dos seus mesmos componentes in-vitro sobre Staphylococcus sciuri, bactéria com alta prevalência na microbiota ocular normal de cavalos hígidos do município de Minas Gerais. Até o presente momento, não foram encontrados estudos que tenham relatado a ação antimicrobiana do PRP em bactérias isoladas da microbiota ocular normal do equino, nem in-vitro nem in vivo. Para esse estudo aplicaram-se diversos testes antimicrobianos, onde um dos objetivos deste fato foi a busca de técnicas que pudesse reduzir a instabilidade da variável UFC, teste padrão ouro para avaliar crescimento bacteriano (TORTORA et al., 2017), para aquilo optou-se por utilizar também a espectrofotometria para avaliar o padrão de crescimento bacteriano das diferentes diluições testadas.
Caso o efeito antimicrobiano nessa situação se confirme, poderá reduzir-se o uso de antimicrobianos para tratamentos oculares em equinos, utilizando-se uma terapia biológica de fácil obtenção, sem efeitos colaterais relatados. Além disso, essa terapia, provavelmente, também apresentará vantagens na modulação da inflamação e reparo tecidual, assim como tem sido observado para outros tecidos e doenças.
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Plasma rico em plaquetas
O plasma rico em plaquetas (PRP) ou também chamado concentrado de plaquetas, é um produto biológico derivado do sangue, de forma autógena, atóxica que apresenta em sua composição, plaquetas, fatores de crescimento, proteínas plasmáticas, células mesenquimais circulantes, proteínas séricas e algumas hemácias e leucócitos (ÁLVAREZ et al., 2011; FANTINI, 2014; MARQUES, 2014; SEIDEL, 2017).
O PRP para receber essa denominação, deve possuir uma concentração de plaquetas significativamente maior quando comparado com as basais do sangue total (TEXTOR, 2011).
Anitua et al. (2004) e Yamada et al. (2012) pontuam que uma concentração mínima de 300.000 plaquetas/μL deve ser encontrada para receber essa denominação. No entanto, Baksh et al. (2013), observou que a concentração plaquetária descrita na literatura para o uso do PRP em tendões variou de 1,5 a 10 vezes no PRP em relação à concentração original do sangue total. Fontenot et al. (2012) ressaltam que a contagem plaquetária no sangue total de equinos está entre uma das mais baixas dentre os mamíferos e que, valores extrapolados da literatura de seres humanos, sugeridos como concentrações ideais no PRP, podem não se adequar à espécie equina. Esses autores ainda frisam que essa extrapolação da literatura humana também não leva em consideração a distinta fisiologia dos mecanismos de degranulação e do conteúdo de fatores de crescimento por plaqueta da espécie equina (MIRANDA, 2016).
Na medicina veterinária, o uso do PRP iniciou-se no campo da medicina esportiva (CAMARGO et al., 2021) sendo utilizado como tratamento para doenças musculoesqueléticas crônicas, como a osteoartrite (CARMONA et al., 2009a), tendinite (CARMONA et al., 2009b), desmite do ligamento suspensório e supraespinhoso (WASELAU et al., 2008; FANTINI, 2014) e feridas cutâneas (MONTEIRO et al., 2009). A racionalidade atrás do uso do PRP, reside no fato que as plaquetas possuem no seu citoplasma grânulos alfa (α), densos e lissosomais, organelas contendo moléculas bioativas que provêm as propriedades cicatrizantes plaquetária. Os grânulos-α contém diversos fatores de crescimento (FC) que são liberados após a ativação plaquetária. O efeito combinado desses fatores cria um elaborado processo autócrino e parácrino que posteriormente resulta em resposta tissular regenerativa (WROBLEWSKI et al., 2010). Dentre os principais FC, estão: fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento beta transformante (TGF-β), fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e fator de crescimento derivado de insulina I (IGF-I). Dentre eles, os dois primeiros são os mais reconhecidos e estudados (TEXTOR, 2011).
Os FC que foram descobertos na década dos 80 por Kaplan et al., (1979) têm propriedades que incluem modulação da inflamação, analgesia, aumento da capacidade regenerativa dos tecidos, indução de quimiotaxia, neovascularização, deposição de matriz célular, proliferação, diferenciação celular e antimicrobiano (CARMONA et al., 2009b, TEXTOR, 2011; FANTINI, 2014; ANITUA et al., 2015; RUSHTON et al., 2017; SEGABINAZZI et al., 2021).
Devido aos efeitos clínicos positivos deste tratamento no sistema musculoesquelético, e seus diversos potenciais efeitos terapêuticos, o PRP também tem sido estudado como alternativa terapêutica nas enfermidades dos demais sistemas (TEIXEIRA, 2014; ANITUA et al., 2015;
RUSHTON et al., 2017; CARDENAS, 2017; SEGABINAZZI et al., 2021).
Nos últimos anos os concentrados plaquetários (CP) incluindo entre eles o PRP, têm sido estudados com resultados clínicos positivos em tratamento de úlceras de córnea que não cicatrizam e que são resistentes à terapia medicamentosa, e seu uso em ceratites ulcerativas, obtendo redução do tempo de consolidação e maior qualidade da cicatrização (BEZERRA et al., 2010; ALIO et al., 2012, ANITUA et al., 2015; CARDENAS, 2017; RUSHTON et al., 2017).
Anitua et al., (2015) verificou que o Plasma rico em fatores de crescimento (PRGF) um derivado do PRP, estimula a regeneração em cicatrizes da superfície ocular in-vitro. Os efeitos benéficos do PRGF e do PRP na cicatrização de feridas na córnea têm sido atribuídos à alta quantidade de fatores de crescimento (RUSHTON et al., 2017). Uma das características mais interessantes desta terapia na oftalmologia é a habilidade angiogênica. Diversos fatores pró- angiogênicos como o fator de crescimento epitelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento beta transformante (TGF-β), fator de crescimento epidermal (EGF) e angiopoietinas, sinalizam e mediam a atividade pró-angiogênese do PRP, o que abre uma nova janela de aplicações terapêuticas desse rico material biológico (MAMMOTO et al., 2013; TEIXEIRA, 2014).
2.2 Plaquetas
As plaquetas ainda que careçam de núcleo, são fragmentos derivados do citoplasma dos megacariócitos (MKs), que possuem componentes estruturais, metabólicos e de sinalização, próprios de células nucleadas (FANTINI, 2014; TEIXERIA, 2014). Meyers et al. (1982) propuseram o conceito das plaquetas serem consideradas como células secretoras, com armazenamento de diversas substâncias em seus grânulos alfa. Esse conceito está sendo retomado na literatura mais atual, posto que as plaquetas se demostram cada vez mais presente na fisiopatologia de algumas doenças na medicina equina, nos casos de endotoxemia, laminite e afecções do trato gastrointestinal (PAES LEME et al., 2006; SEGURA et al., 2006; PICCIONE et al., 2010). Assim, a composição molecular das plaquetas e sua multiplicidade de funções atribuídas recentemente, apoiam a decisão de ser consideradas células complexas, multifuncionais e com capacidade imunomoduladora (MCFARLAND et al., 2005; HAMZEH-COGNASSE et al., 2015).
As plaquetas surgem da fragmentação do citoplasma dos MKs que se desenvolvem a partir de células mieloides progenitoras pluripotenciais CD 34+ que residem no tecido hematopoiético e na corrente sanguínea (MARQUES, 2014). O processo de trombopoese é estimulado e regulado por citocinas, principalmente as interleucinas 1, 3, 6 e 11, e pelo hormônio trombopoietina que regula o desenvolvimento dos MKs e a liberação das plaquetas (REBAR et al., 2003).
A vida útil das plaquetas está entre uma faixa de 5 a 9 dias na circulação sanguínea, sendo eliminadas por apoptose após alterações em sua estrutura de superfície, que ocorre predominantemente por meio das células de Kuppfer e hepatócitos (SEIDEL, 2014). Segundo Zago et al. (2001) 80% das plaquetas se encontram na circulação e o restante fica armazenado no baço, com movimentação livre entre estes dois compartimentos. Na circulação as plaquetas são suscetíveis a sofrerem alterações físicas, bioquímicas e funcionais, o que colabora para sua heterogeneidade. A resposta funcional é variável e relacionada ao tamanho e idade, sendo atribuída às maiores e mais jovens, a maior capacidade hemostática (KARPATKIN, 1978; HARTLEY, 2007; PEREIRA 2008).
Morfologicamente, as plaquetas dos equinos apresentam forma discoide, medindo aproximadamente 5 a 7µm de comprimento, largura inferior a 3µm, apresentam formato lentiforme e podem alcançar até 20µm de diâmetro (PEREIRA, 1993; FELDMAN et al., 2000; ARGÜELLES et al., 2006).São compostas por três camadas: glicocalix que é a mais externa e contém receptores glicoproteicos que atuam no processo de ativação e adesão plaquetária. Nesta camada também estão os antígenos de membrana das plaquetas, divididos em três famílias, sendo eles as integrinas, proteínas ricas em leucina e as selectinas. A segunda camada é a bicamada fosfolipídica que contém glicoproteínas atuantes na interação entre células e fosfolipídios necessários para a coagulação. A terceira camada é a submembranosa que está formada por microtúbulos de actina, atuando como um citoesqueleto que mantém a forma discoide da plaqueta em repouso e permite a alteração de forma pós ativação (HALE et al., 1996; TABLIN, 2000). As plaquetas de mamíferos possuem em seu citoplasma três tipos de grânulos: alfa, lisossomais e densos. Os grânulos alfa (α) são organelas secretoras de proteínas reguladoras de processos biológicos, incluindo, adesão e agregação plaquetária, coagulação, quimiotaxia, proliferação e inflamação (LALKO et al., 2003). Entre estas proteínas se encontram citocinas, quimiocinas, FC, fator plaquetario-4, tromboglobulina, albumina, condroitina, fibrinogênio, fibronectina, trompospondina, fator V, fator Va e fator Von Willebrand (ANITUA et al., 2004). Os grânulos densos armazenam componentes de baixo peso molecular serotonina, catecolamina, cálcio, fosforo, adenosina difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP). O ADP induz a migração plaquetária e em combinação com a serotonina produz contração das artérias lesionadas, e o ATP antagoniza a ação do ADP (MARQUES, 2014; PELAGALLI et al., 2003). Os grânulos lisossomais contém hidrolases ácidas, guanina, fosfolipases, e quinases, que atuam como enzimas proteolíticas e hidrolíticas (MARQUES, 2014; LALKO et al., 2003).
Segundo GACHET (2005) as plaquetas em condições fisiológicas encontram-se num estado quiescente, protegidas de ativação prematura. Disfunções no endotélio e alterações na liberação de fatores antiplaquetários podem levar ao aumento da ativação das plaquetas. Carmona et al. (2007)
afirmam que as plaquetas podem ser ativadas por agentes fisiológicos (serotonina, epinefrina, trombina, ADP, tromboxano, colágeno) ou farmacológicos (cloreto de cálcio, ionoforo de cálcio).
Após ativação, as plaquetas mudam sua forma e apresentam projeções membranosas chamadas de pseudópodes (HOFFBRAND et al., 2004; FANTINI, 2014), responsáveis pela agregação plaquetária liberando todas as suas organelas e componentes para o tecido, entre eles os FC. Além de atuar no processo de hemostasia, cicatrização de feridas e reepitelização, as plaquetas por meio do potencial terapêutico dos FC promovem potencialização da quimiotaxia, proliferação, diferenciação e secreção célular (FOSTER et al., 2009), além de estimular a angiogênese e a proliferação de fibroblastos, que por sua vez proporcionam um aumento na síntese de colágeno (MARX, 2004).
2.3 Atividade antimicrobiana do PRP
As propriedades antimicrobianas de diversos concentrados plaquetários tem sido demostrada em humanos contra Staphylococcus aureus (BIELECKI et al., 2007; MOOJEN et al., 2008;
MARIANI et al., 2014; INTRAVIA et al., 2014, DRAGO et al., 2014) e Escherichia coli (BIELECKI et al., 2007) em ensaios clínicos (YUAN et al., 2008) e in-vitro (BIELECKI et al., 2007; MOOJEN et al., 2008). Também foi evidenciada a inibição do crescimento in-vitro com o uso do PRP contra Enterococcus faecalis, Candida albicans, Streptococcus agalactiae e Streptococcus oralis (DRAGO et al., 2013, 2014), S. epidermidis e Propionibacterium acnes (INTRAVIA et al., 2014). Na medicina veterinária equina poucos estudos avaliaram o efeito antimicrobiano dos hemocomponentes. O efeito antimicrobiano foi comprovado frente ao Staphylococcus aureus sensível à Meticilina e Staphylococcus aureus resistente à Meticilina (ÁLVAREZ et al., 2011; LÓPEZ et al., 2014) e Escherichia coli (AKTAN et al., 2013).
Até o momento, os componentes responsáveis pela atividade antimicrobiana dos concentrados de plaquetas permanecem pouco compreendidos. Vários fatores antimicrobianos têm sido propostos, no caso das plaquetas, tem atribuído seu efeito antimicrobiano a proteínas antimicrobianas plaquetárias (PMP), componentes de grânulos-α plaquetários, espécies reativas de oxigênios (EROs) liberadas pelas mesmas e precursores que participam da ativação da via do complemento (BLAIR e FLAUMENHAFT, 2009; AKTAN et al., 2013; DRAGO et al., 2014). Uma hipótese sugerida é que as plaquetas são capazes de se ligar, agregar e internalizar microrganismos, além de apresentarem funções citotóxicas, liberando uma variedade de peptídeos com efeito antimicrobiano direto (TANG et al., 2002; TRIER et al., 2008).
As plaquetas são consideradas sentinelas do sistema vascular devido ao seu elevado número
na circulação e à gama de imunorreceptores funcionais que expressam. As plaquetas expressam uma ampla gama de potenciais receptores bacterianos, incluindo receptores de complemento, receptor de baixa afinidade para fragmentos constantes de imunoglobulina G (FcγRII), receptores Toll-like, mas também integrinas convencionalmente descritas na resposta hemostática, como GPIIb-IIIa ou GPIb (HAMZEH-COGNASSE et al., 2015).
Existem três mecanismos de interação entre bactérias e plaquetas que foram descritos: (1) A ligação indireta de bactérias a uma proteína plasmática (fibrinogênio), que por sua vez é um ligante de um receptor plaquetário (GPIIb-IIIa) (OHSHIMA et al., 1991; PETERSEN et al., 2010; COX et al., 2011); (2) a ligação direta de bactérias a receptores de plaquetas (GPIIb-IIIa ou GPIb) (PLUMMER et al., 2005; BRENNAN et al., 2009; MIAJLOVIC et al., 2010) e (3) a ligação de produtos bacterianos secretados, particularmente toxinas, às plaquetas (ARVAND et al., 1990;
BRYANT et al., 2005; FITZPATRICK et al., 2009).
As bactérias se ligam a esses receptores direta ou indiretamente via fibrinogênio, fibronectina, ou receptores de plaquetas. O destino dessas bactérias ligadas às plaquetas é questionado (HAMZEH-COGNASSE et al., 2015). Clawson et al. (1975) estudaram a interação entre plaquetas e bactérias, onde ocasionalmente observaram a internalização de Staphylococcus aureus em algumas plaquetas. Esses fragmentos derivados do citoplasma dos megacariócitos tem maior capacidade de internalização quando ativadas por um agonista convencional (ADP ou trombina) o que ressalta um mecanismo comum entre ativação plaquetária e internalização (HAMZEH-COGNASSE et al., 2015).
Li et al. (2008) confirmaram a internalização de S. aureus em plaquetas, mas somente após a ativação desta pelo ADP. O mesmo estudo mostra que Porphyromonas gingivalis também pode ser internalizado nas plaquetas. Parece, no entanto, haver um mecanismo diferente de internalização em ação em ambas as bactérias. De fato, o P. gingivalis é capaz de induzi-lo sozinho, sem a adição de outro agonista plaquetário, pois os agregados plaquetários são adequados para a internalização da bactéria. Embora o resultado seja o mesmo, é possível que bactérias Gram-positivas e Gram- negativas possam ter mecanismos de internalização diferentes, sugerindo que uma delas tenha uma molécula adicional promovendo sua internalização.
O destino das bactérias internalizadas nas plaquetas permanece em discussão, sendo um meio de defesa do hospedeiro ou um mecanismo de fuga para as bactérias. No entanto, sem progredir para a internalização, a adesão das bactérias ou produtos bacterianos na superfície das plaquetas é suficiente para induzir uma resposta de defesa das plaquetas (HAMZEH-COGNASSE
et al., 2015). A mesma ativação plaquetária ou sua interação com a bactéria faz que as plaquetas tenham a capacidade de interagir com o sistema de complemento. Essa interação pode ser bivalente.
Por um lado, as plaquetas podem auxiliar na destruição de bactérias aumentando a atividade do complemento, mas como se ligam às proteínas do complemento, elas próprias podem se tornar alvo da atividade lítica do complemento. Isto é notavelmente o que ocorre no caso de púrpura trombocitopênica (PEERSCHKE e GHEBREHIWET 2010). As plaquetas, no entanto, possuem um inibidor de C1 em seu grânulo α, que, durante a estimulação plaquetária, permitiria a modulação da ativação do complemento (SCHMAIER et al., 1985).
De fato, embora a presença de fagolisossomas não tenha sido demonstrada em plaquetas, eles contêm PMP que se mostraram eficientes em S. aureus (YEAMAN 2010). As PMP são liberadas sob a indução de trombina ou pelas mesmas bactérias. Essa família de proteínas foi ampliada através da integração das quinocidinas, que inclui as citocinas plaquetárias que têm efeito bactericida direto. Elas são divididas em dois grupos, α-quinocidinas, que incluem as CXC-citocinas [fator plaquetário 4 (PF-4), proteína básica plaquetária (PBP), peptídeo ativador do tecido conjuntivo (CTAP3) e peptídeo ativador de neutrófilos (NAP2)], enquanto as β-quinocidinas são do tipo CC (RANTES) (YANG et al., 2003).
As quinocidinas estão integradas nos mecanismos da imunidade inata, na medida em que conservam seu papel primário, que é a quimioatração de leucócitos, possibilitando a cooperação entre fatores plaquetários e leucocitários na depuração bacteriana (AGERBERTH et al., 2006;
GUANI-GUERRA et al., 2010).
Além de todos esses mecanismos antibacterianos plaquetários estudados, os leucócitos também foram estudados como fator envolvido no efeito antimicrobiano dos concentrados plaquetários. Segundo Cieślik-Bielecka et al. (2018) o efeito antibacteriano em um plasma rico em plaquetas e leucócitos (L-PRP) é causado por leucócitos, pois encontraram uma relação entre o aumento dos subtipos de leucócitos (Linfócitos T reguladores CD25, linfócitos T citotóxicos e Células Natural Killer) e o diâmetro da zona de inibição pelo método de difusão em disco de Kirby- Bauer. Os mesmos autores encontraram ainda uma associação negativa entre contagens aumentadas de monócitos e a atividade antimicrobiana.
D´asta et al. (2017) em uma revisão sistemática referente à contribuição dos leucócitos no efeito antimicrobiano nos concentrados plaquetários, não encontram evidência suficiente para atribuir esse efeito à presença de leucócitos nos hemocomponentes. Um dos fatores para afirmar isso foi que em estudos comparativos entre PRP e L-PRP in-vitro (LÓPEZ et al., 2014; MARIANI
et al., 2014) ambos foram efetivos, mas não apresentaram diferença significativa em seu efeito antimicrobiano. No entanto, buscando resultados em cepas bacterianas específicas, Anitua et al.
(2012b) mostraram que seu hemoderivado com concentração mais alta de leucócitos (quase quatro vezes a linha de base) foi a única preparação capaz de reduzir efetivamente o Staphylococcus aureus sensível à meticilina (MSSA). Além disso, Intravia et al. (2014) relataram que as preparações de L- PRP (com alta concentração de leucócitos) foram superiores ao PRP (sem leucócitos) contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Staphylococcus epidermis sensível à meticilina (MSSE) e Propionibacterium acnes. Também em comparação com o sangue total, ambas as preparações limitaram o crescimento bacteriano, mas para MSSA o L-PRP mostrou uma inibição mais longa (24 horas de duração). Além disso, López et al. (2014) mostraram que a preparação não ativada enriquecida com leucócitos apresentou melhor efeito bacteriostático contra MSSA (em 6 e 24 horas) em comparação com preparações pobres em leucócitos. Em contraste, a forma ativada da preparação com leucócitos parecia ter um desempenho melhor do que as outras preparações testadas em 24 horas contra MRSA.
Embora haja controvérsia nesses estudos in-vitro sobre o papel que tem os leucócitos na atividade antimicrobiana dos CPs, se sabe que in vivo, os leucócitos em especial os neutrófilos e macrófagos são responsáveis pela fagocitose de patógenos estranhos. Esse sistema parece representar uma das defesas mais importantes do hospedeiro contra infecção (MOOJEN et al., 2007). Os neutrófilos secretam peptídeos antimicrobianos: lactoferrina, defensinas, proteína bactericida que aumenta a permeabilidade, azurocidina/proteína de ligação à heparina, catelicidinas, fosfolipases A2 e calprotectina (CIESLIK-BIELECKA et al., 2008), que desempenham os papéis mais importantes na defesa imune. Essas moléculas desempenham papéis biológicos que não são apenas antibacterianos, mas também antivirais, antiparasitários e antifúngicos. Essas proteínas antimicrobianas destroem os micróbios usando cargas positivas, o que permite que se liguem à superfície carregada negativamente da célula alvo (UVELL e ENGSTRÖM 2007). Ao interagir com o corpo celular de bactérias gram-negativas, as proteínas antibacterianas reagem com lipopolissacarídeos, mas para bactérias gram-positivas, as proteínas reagem com ácido teicóico e peptidoglicano, suportando íons bivalentes (LOHNER, 2017; MISTOU et al., 2016; MALANOVIC e LOHNER 2016)
Os neutrófilos também são ricos em grânulos contendo mieloperoxidase (MPO), que é liberado nos tecidos após ativação e degranulação. A MPO catalisa a oxidação do cloreto para gerar ácido hipocloroso e outros derivados reativos de oxigênio. Essas substâncias atuam como potentes oxidantes bactericidas e são tóxicas para micro-organismos e fungos (ARTANI, 2018).
Outro fator antimicrobiano do PRP estudado é o plasma e seus componentes como o complemento que é conhecido por desempenhar um papel importante na imunidade inata (DAHA, 2010). Drago et al. (2014) testaram diversos produtos como PRP concentrado em 2 e 4 vezes (PRP x2, PRP x4), plaquetas suspensas em tampão fosfato salino (PBS) e plasma pobre em plaquetas (PPP) frente a Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus oralis e Staphylococcus aureus, onde o grupo de concentrado de plaquetas suspenso em PBS não mostrou nenhuma atividade antibacteriana, e os outros grupos, PRP x2, PRP x4 e PPP inibiram o crescimento de todas as cepas testadas. Com esses resultados foi observado ainda que a atividade antimicrobiana do PRP não está associada só à concentração de plaquetas, uma vez que compararam duas concentrações diferentes e não houve diferença entre elas. Além disso esses resultados sugerem que a atividade antimicrobiana dos concentrados plaquetários é sustentada por uma cooperação de fatores derivados das plaquetas e os componentes do plasma, como o sistema de complemento que é um elemento do sistema imunológico essencial para os mecanismos de defesa humoral contra agentes infecciosos. A ativação da cascata do complemento determina a lise celular bacteriana e o recrutamento de leucócitos (VARSHNEY, 2019).
Burnouf et al. (2013) tentaram entender melhor quais componentes dos concentrados de plaquetas podem apresentar atividade antimicrobiana, testando amostras antes e após a inativação térmica do complemento plasmático a 56º C por 30 minutos. A ausência de qualquer inibição bacteriana por qualquer um dos componentes do plasma e das plaquetas, tratados termicamente, apoiou a hipótese de que o complemento plasmático (e/ou outros compostos sensíveis ao calor) desempenhava o papel principal nas propriedades bacteriostáticas dos concentrados de plaquetas.
A atividade antimicrobiana dos concentrados plaquetários está influenciada também pelo método de ativação deles. Ainda sejam controversos os resultados das possíveis relações entre esse efeito e a ativação das preparações, Drago et al. (2014) observaram que seus concentrados plaquetários sem ativação, não inibiram o crescimento das bactérias testadas in-vitro, sugerindo que a ativação da coagulação é uma etapa fundamental deste processo biológico. Burnouf et al. (2013) sugeriram que a ativação de plaquetas pelo cloreto de cálcio diminuiu as propriedades antimicrobianas contra cepas bacterianas selecionadas. Da mesma forma, Wu et al. (2013) mostraram que as preparações de PRP ativado por trombina têm menor atividade antimicrobiana contra E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae em comparação com as preparações inativadas.
Acredita-se que esses achados sejam devidos ao consumo de complemento durante a ativação da coagulação (BURNOUF et al., 2013). Também López et al. (2014) indicaram que após 24 horas de incubação, as preparações de PRP ativado por gluconato de cálcio exibiram menos atividade
antimicrobiana contra MSSA em comparação com as preparações inativadas. Quando as preparações foram testadas contra MRSA em 6 horas, o efeito antimicrobiano mais forte contra MRSA foi exercido pela forma não ativada da preparação enriquecida com leucócitos.
Controversamente outros estudos indicam que o PRP ativado com trombina leva à um aumento significativo da atividade inibitória sobre as bactérias (AKTAN et al., 2013; CHENG et al., 2013).
2.4 Microbiologia do crescimento bacteriano
Uma população microbiana em crescimento ativo, em meio nutritivo, constitui uma cultura (LARPENT e GOURGAUD, 1975). Após crescimento os micro-organismos agrupa-se em colônias (grupo de células que podem ser visualizadas sem a utilização de um microscópio). Essas colônias são formadas por uma célula viável, que é definida como aquela capaz de dividir-se, originando células filhas, e, na maioria das situações de contagens de células, são as células de maior interesse (MADIGAN et al., 2016). Para o crescimento microbiano são necessárias uma combinação de nutrientes e certas condições que podem ser divididas em físicas e químicas (ALVES, 2006;
PELCZAR et al., 1997).
2.4.1 Condições físicas e químicas
Dentro das condições físicas necessárias para um cultivo bem-sucedido, encontra-se: a temperatura, o potencial hidrogeniônico (pH) e a pressão osmótica. A taxa de crescimento, que se traduz no número de divisões celulares por um devido tempo, está associada a temperaturas favoráveis. Os micro-organismos são classificados em três grupos primários de acordo com as variações de temperatura de crescimento (TORTORA et al., 2017):
- Psicrófilos: Crescem a baixas temperaturas (Micro-organismos que podem crescer entre 0ºC a 25ºC).
- Mesofilos: Crescem a temperaturas moderadas (Micro-organismos que podem crescer entre 25ºC a 40ºC).
- Termofilos: Crescem em altas temperaturas (Micro-organismos que podem crescer entre 50ºC a 60ºC).
O pH influencia o meio físico de um micro-organismo pois, a maioria deles cresce bem em meios com uma faixa de pH entre 6,5 a 7,5, ainda que muitas espécies tolerem variações entre 4 a 9 (ALVES, 2006).
A pressão osmótica também exerce um papel importante no crescimento microbiano
influenciando o meio físico de um micro-organismo. A pressão osmótica é a força com a qual a água se move através da membrana citoplasmática de uma solução contendo uma baixa concentração de sustâncias dissolvidas (solutos) para outra contendo uma alta concentração de solutos. Os meios de cultura com pressões osmóticas inferiores às do interior da bactéria, geralmente não afetam sua viabilidade, uma vez a rigidez da parede celular impede a entrada excessiva de água (TRABULSI e ALTHERTUM, 2015).
O conhecimento das necessidades nutricionais dos micro-organismos é importante para seu cultivo. As bactérias necessitam de uma variedade de elementos químicos como nutrientes. Esses elementos são necessários tanto para a síntese como para funções normais dos componentes celulares. Os principais elementos químicos para o crescimento das células incluem carbono, nitrogênio, hidrogeno, oxigeno, enxofre e fosforo (TORTORA et al., 2017).
2.4.2 Meios de cultura e método de contagem em placa
A supervivência dos micro-organismos depende do fornecimento adequado de nutrientes e condições favoráveis para seu crescimento. Os meios de cultura definem-se como uma solução nutriente utilizada para promover o crescimento de micro-organismos (MADIGAN et al., 2016).
Os meios de cultura podem ser líquidos, semissólidos ou sólidos. Um meio líquido sem agente solidificante é chamado de caldo nutritivo. O caldo nutritivo combinado com o agente solidificante, geralmente ágar, cria um meio semissólido ou sólido. O ágar é um extrato de algas marinhas, ele contém um carbo-hidrato complexo, na sua maioria, galactose e possui muito valor nutritivo. Ele é um excelente agente solidificante porque se liquefaz a 100ºC e solidifica a 40ºC.
Devido a estas propriedades os micro-organismos podem ser cultivados a temperaturas de 37ºC (ALVES, 2006).
Para o crescimento de micro-organismos em laboratórios há uma variedade de meios de cultura. Os mais utilizados na microbiologia são os meios definidos e meios complexos. Os meios definidos são preparados pela adição precisa de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos, tendo uma composição exata e conhecida. Quando a composição do meio não é bem definida e se empregam componentes como produtos microbianos, animais e vegetais, ou várias substâncias nutritivas, esses meios são chamados de complexos (MADIGAN et al., 2016; TORTORA et al., 2017).
Em situações particulares, especialmente na microbiologia diagnostica, frequentemente os meios de cultura são produzidos de modo a tornar-se seletivos ou diferenciais (ou ambos). Sua
elaboração surge pela necessidade de determinar a presença de micro-organismos específicos associados a doenças ou com condições de pouca sanidade (TRABULSI e ALTHERTUM, 2015).
Os meios seletivos são elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas e favorecer o crescimento dos micro-organismos de interesse; por exemplo o ágar Sabouraud dextrose, com pH de 5,6, é utilizado para isolar os fungos que superam a maioria das bactérias neste pH (PELCZAR et al., 1997). Os meios diferenciais facilitam a diferenciação das colônias de organismos desejados em relação a outras colônias crescendo na mesma placa; o ágar-sangue (que contêm hemácias) é um meio utilizado com frequência pelos microbiologistas para identificar espécies bacterianas que destroem hemácias (SOUZA, 2008).
O método mais frequentemente utilizado para a mensuração de populações bacterianas é a contagem em placas ou também chamado contagem de células viáveis. O procedimento de contagem de células viáveis infere que cada célula viável é capaz de crescer e dividir-se, originando uma colônia. Assim, o número de colônias e o número de células são proporcionais. Uma desvantagem desse método é que são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas (MADIGAN et al., 2016; TRABULSI e ALTHERTUM, 2015).
Tortora et al., (2017) afirmam que não sempre essas células viáveis, originam por se só uma colônia, pois as bactérias frequentemente crescem unidas em agregados ou cadeias. Para refletir essa realidade, as contagens em placas são frequentemente reportadas como unidades formadoras de colônias (UFC).
Quando é efetuada uma contagem de colônias em placa, é importante que somente um número limitado de colônias se desenvolva na placa. Tendo excesso de colônias, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver, essas condições causam imprecisão na contagem. Uma recomendação pelos microbiologistas é a contagem de placas com somente 25 a 300 UFC. Para garantir que as contagens de colônias estejam nessa faixa, o inóculo inicial é diluído várias vezes, em um processo chamado de diluição seriada (ALVES, 2006).
Existem dois métodos de preparação das placas para contagem, método de incorporação em placa ou também chamado (Pour plate) e método de espalhamento em placa (PELCZAR et al., 1997).
O método de incorporação em placa é feito com 1 ml a 0,1 ml das diluições da suspensão bacteriana, onde é introduzido na placa de Petri. O meio ágar é mantido em fase líquido a 50ºC, e vertido sobre a amostra, que é então misturada com o meio por agitação lenta da placa. Quando o
ágar solidifica, a placa é incubada. Essa técnica tem algumas desvantagens, pois os micro- organismos sensíveis a temperaturas altas podem ser danificados pelo ágar fundido, sendo incapazes de formar colônias. Além disso, o observar a aparência diferenciada da colônia na superfície é essencial para fins diagnósticos. As colônias que se formam abaixo da superfície da placa por incorporação não são adequadas para este teste (TRABULSI e ALTHERTUM, 2015).
O método de espalhamento em placa é muito mais efetivo e, porém, aplicado com mais frequência. Para esse método é colocado um inoculo de 0,1 ml das diluições da suspensão bacteriana, adicionando na superfície de um meio ágar previamente solidificado. O inoculo é espalhado de modo uniforme na superfície do médio com uma alça driglasky ou bastão de vidro, esterilizados (TORTORA et al., 2017).
2.4.3 Espectrofotometria
Durante o crescimento bacteriano exponencial, todos os componentes celulares aumentam proporcionalmente. Um desses componentes é a massa celular. As células dispersam luz, e um método rápido e bastante útil para estimar a massa celular é a turbidez (MADIGAN et al., 2016). A turbidez é a habilidade das partículas em suspensão para desviar radiação eletromagnética (BARON et al., 1994).
O aparelho utilizado para mesurar a turbidez é o espectrofotômetro. No espectrofotômetro, um feixe de luz é transmitido através de uma suspensão bacteriana até um detector fotossensível. É uma das técnicas mais simples e frequentemente empregadas para culturas líquidas (KULSTAD et al., 2004). Essa luz transmitida pelo prisma ou grade de difração deve ter um comprimento de onda específico. Os componentes de onda normalmente utilizados para medir turbidez bacteriana incluem 480 nm (azul), 540 nm (verde), 600 nm (cor de laranja) e 660 nm (vermelho). A sensibilidade é maior nos comprimentos de onda mais curtos, porém as medidas de suspensões celulares densas são mais precisas com o uso de comprimentos de onda mais longos. A unidade de medida da turbidez corresponde à densidade óptica (DO) no comprimento de onda especificado, como por exemplo, DO 540 para medidas de densidade óptica a 540 nm (TORTORA et al., 2017).
A técnica utiliza a propriedade das soluções de absorver ou transmitir a luz para quantificar reações. Na prática, a quantidade de luz absorvida ou transmitida é proporcional à concentração da substância em solução (DIAZ et al., 2016). A transmitância exprime a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma determinada espessura de um material, sem ser absorvida. Ou seja, a capacidade de transmitir a luz. Por outro lado, a absorbância exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma determinada espessura de um material. Ou seja, a capacidade de absorver
a luz. A absorbância de uma solução está relacionada com a transmitância. Quando a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância diminui (XAVIER et al., 2016).
2.5 Conjuntiva ocular e sua microbiota
A superfície ocular é formada pela conjuntiva bulbar, superfície das pálpebras inferior, superior e terceira pálpebra, com suas respectivas conjuntivas, limbo, epitélio da córnea e filme lacrimal (SILVA, 2014; OLIVEIRA, 2019).
A conjuntiva é uma delgada membrana mucosa, móvel, semitransparente, úmida, brilhante e ricamente vascularizada que recobre toda a superfície interna palpebral (conjuntiva palpebral), a esclera (conjuntiva bulbar) e toda a terceira pálpebra. O espaço formado entre a conjuntiva palpebral e bulbar é chamada de saco conjuntival (BROOKS, 2005; LEITES et al., 2013; NETO, 2016).
Histologicamente a conjuntiva palpebral é revestida por um epitélio colunar pseudoestratificado superficial, células caliciformes, cápsula de tenon e um epitélio escamoso estratificado não queratinizado que reveste a conjuntiva bulbar. (CARASTRO, 2004; GILGER, 2005).
A conjuntiva é uma estrutura resistente e altamente regenerativa que desempenha um papel na dinâmica lacrimal, na proteção imunológica do olho, nos movimentos oculares e na cicatrização da córnea, onde é usada com frequência para tratar lesões ulcerativas. (CARASTRO, 2004; NETO, 2016).
Entre os mecanismos de proteção da superfície ocular encontram-se as pálpebras que através do reflexo de piscar, realizam a proteção mecânica contra corpos estranhos e a remoção regular de partículas estranhas, restos celulares e bactérias. O filme lacrimal tem em sua composição macrófagos e substâncias bactericidas (lisozima, lactoferrina, fosfolipases e imunoglobulinas A), e efetua a remoção de debris e células esfoliativas através da drenagem (OLIVEIRA, 2019).
A conjuntiva está continuamente exposta a bactérias, fungos e vírus presentes no ambiente (SANTOS, 2011), mas nem todos os microrganismos adaptam-se ao colonizar um hospedeiro.
Alguns falham em estabelecer uma interação e outros podem colonizar por períodos variáveis. Por isso, essa microbiota pode ser classificada em: microrganismos residentes, transitórios e patogênicos (HERITAGE et al., 2003). A microbiota residente consiste em microrganismos não invasivos que conseguem se estabelecer por um período longo e indefinido, habitando a conjuntiva e a córnea. A formação desta microbiota residente se inicia no momento do parto, a partir de então será composta principalmente por microrganismos da pele e trato respiratório superior (OLIVEIRA, 2019). A microbiota transitória, são aqueles agentes que são adquiridos do meio ambiente que cerca o hospedeiro, em geral esses microrganismos não conseguem estabelecer uma colonização efetiva,
seja por competição com outros organismos ou por não conseguir superar o sistema de defesa do hospedeiro (HERITAGE et al., 2003). Para conseguir classificar os micro-organismos em residentes ou transitórias, devesse realizar várias culturas, em diferentes períodos (SANTOS, 2011).
A maioria dos organismos da microbiota conjuntival não é considerada patogênica desde que haja a integridade da conjuntiva e do epitélio da córnea. Se ocorrer a quebra da barreira de proteção da superfície ocular, como uma abrasão da córnea, microrganismos residentes e transitórios podem infiltrar no estroma córneano e resultar em uma úlcera de córnea ou ainda, em casos de lesão da conjuntiva, causar uma conjuntivite bacteriana (ANDREW et al., 2003).
A microbiota bacteriana ocular do equino tem predominância de microrganismos não patogênicos, principalmente as Gram-positivas aeróbicas (KHOSRAVI et al., 2014; OLIVEIRA, 2019) Staphylococcus spp., Bacillus spp. e Corynebacterium spp. (ANDREW et al., 2003; JOHNS et al, 2011; BARAN et al., 2015; FERREIRA et al., 2015; HAMPSON et al., 2018; OLIVEIRA, 2019). Espécies de bactérias Gram-negativas e fungos também são considerados normais, porém são tidos como microrganismos transitórios (ANDREW et al., 2003). Pode-se ainda encontrar Gram-negativas potencialmente patogênicas, como Pseudomonas spp. (JOHNS et al., 2011). Entre os fungos, os mais frequentes são Aspergillus spp., Cladosporium spp. e Penicillium spp.
(ANDREW et al., 2003; ROSA et al., 2003; SOUSA et al., 2011; BARAN et al., 2015; HAMPSON et al., 2018). Leveduras também podem ser encontradas em algumas regiões (KHOSRAVI et al., 2014).
2.5.1 Staphylococcus sciuri
Staphylococcus sciuri é uma das espécies bacterianas mais primitivas do gênero Staphylococcus, que atualmente compreende mais de 50 espécies e subespécies (NEMEGHAIRE et al., 2014a). S. sciuri foi descrito pela primeira vez por (KLOOS et al., 1980) quando cepas foram isoladas da pele de animais e humanos. Esse micro-organismo é coagulase-negativa, oxidase- positiva, resistente a novobiocina e oxacilina (meticilina) (BEIMS et al., 2016); principalmente associada a animais, comumente presente na pele e superfícies mucosas. Além de encontra-se em uma ampla variedade de animais de estimação e animais de fazenda e selvagens (STEPANOVIC et al., 2001; HAUSCHILD et al., 2003), também é isolada em alimentos de origem animal (GARCIA et al., 2002; PAPAMANOLI et al., 2002) e no ambiente, como solo, areia, água e grama do pântano (KLOOS, 1980).
Embora Staphylococcus sciuri tenham se mostrado patógenos facultativos, esse micro- organismo possui alguns fatores de virulência que tem atividade (lipofílica, proteolítica ou
hemolítica) semelhantes às de outros estafilococos envolvidos em processos patogênicos como o S.
aureus (STEPANOVIC et al., 2001). Outros fatores de virulência estão tipicamente relacionados a outros estafilococos como enterotoxinas (de S. aureus) ou a toxina esfoliativa C (de S. hyicus).
Nemeghaire et al., (2014a) demostrou em uma revisão profunda sobre S. sciuri a capacidade desses micro-organismos carregar uma grande variedade de genes antimicrobianos e de virulência, indicando que essa espécie bacteriana contém um grande reservatório de genes trocáveis por transferência horizontal com outros estafilococos e outros gêneros bacterianos, o que pode fortalecer ainda mais o potencial patogênico dessas bactérias.
Porém seja uma bactéria com baixas taxas de isolamento nasofaringe, pele e trato urogenital na espécie humana, sua relevância clínica está aumentando, já que foi isolada em infecções, como endocardite (HEDIN e WIDERSTROM, 1998), peritonite (WALLET et al., 2000), choque séptico (HORII et al., 2001), infecção do trato urinário (STEPANOVIC et al., 2003), doença inflamatória pélvica (STEPANOVIC et al., 2005) e mais frequentemente em infeções de feridas (KOLAWOLE et al., 1997; SHITTU et al., 2004; STEPANOVIC et al., 2002).
Na medicina veterinária o S. sciuri tem sido associada a vários casos de mastite bovina (LÜTHJE e SCHWARZ, 2006; NAM et al., 2010; FREY et al., 2013), bem como em caprinos que sofrem o vírus da peste de pequenos ruminantes ou também chamada “peste des petites ruminants”
(PPR) (UGOCHUKWU e AGWU, 1991), em dermatite canina (HAUSCHILD e WÓJCIK, 2007;
HAUSCHILD et al., 2010), em surtos de epidermite exsudativa fatal em leitões (CHEN et al., 2007;
NEMEGHAIRE et al., 2014b) e em ferida de pele de equino (BEIMS et al., 2016).
Curiosamente Moodley e Guardabassi (2009) e Aslantas et al., (2012) relataram uma transmissão entre animais domésticos saudáveis colonizados com S. sciuri foi observada repetidamente, o que respalda a hipótese de que pelo fato de ser uma bactéria que de vida livre a colonização desta bactéria na pele ou mucosas dos animais, pode ser promovida por insetos servindo como vetores de transmissão. Ao respeito, um relatório também sugeriu que a possível fonte de colonização de S. sciuri em feridas cirúrgicas pode ser moscas pousando em feridas abertas (KOLAWOLE e SHITTU, 1997). Assim, assume-se que o contato frequente com animais domésticos e de fazenda saudáveis pode também contribuem para uma colonização pelo menos temporária da pele e, posteriormente, das feridas, por S. sciuri (KLOOS, 1980; NEMEGHAIRE et al., 2014b).
