UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
Efeito da biotransformação enzimática de diferentes resíduos de citros no crescimento e adesão de bactérias do intestino
Effect of enzymatic biotransformation of different citrus by-products on bacterial growth and intestinal adhesion
CAMPINAS 2019
PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
Efeito da biotransformação enzimática de diferentes resíduos de citros no crescimento e adesão de bactérias do intestino
Effect of enzymatic biotransformation of different citrus by-products on bacterial growth and intestinal adhesion
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.
Thesis presented to the Faculty of Food Engineering of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Food Science.
Orientadora: Dra. Gabriela Alves Macedo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. GABRIELA ALVES MACEDO
CAMPINAS 2019
Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Barbosa, Paula de Paula Menezes,
B234e BarEfeito da biotransformação enzimática de diferentes resíduos de citros no crescimento e adesão de bactérias do intestino / Paula de Paula Menezes Barbosa. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
BarOrientador: Gabriela Alves Macedo.
BarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Bar1. Flavanonas. 2. Beta-glicosidase. 3. Tanase. 4. Bactérias patogênicas. 5. Probióticos. 6. Celulas Caco-2. I. Macedo, Gabriela Alves, 1971-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Effect of enzymatic biotransformation of different citrus by-products on bacterial growth and intestinal adhesion
Palavras-chave em inglês: Flavanones Beta-glucosidase Tannase Pathogenic bacteria Probiotics Caco-2 cells
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Gabriela Alves Macedo [Orientador] Ruann Janser Soares de Castro Adriane Elisabete Antunes de Moraes Joelise de Alencar Figueira Angelotti Eliana Setsuko Kamimura
Data de defesa: 27-05-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-8455-6991 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/2514996973347100
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo Presidente
FEA - UNICAMP
Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro Membro Titular
FEA - UNICAMP
Profa. Dra. Adriane Elisabete Antunes de Moraes Membro Titular
FCA - UNICAMP
Profa. Dra. Joelise de Alencar Figueira Angelotti Membro Titular
IQ - UNIFAL
Profa. Dra. Eliana Setsuko Kamimura Membro Titular
FZEA - USP
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Dedicatória
Aos meus amados pais, Itamar e Regina, à minha irmã Laís e ao meu amor, Leonardo, pelo constante incentivo no desenvolvimento deste trabalho.
Agradecimentos
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e ao Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela oportunidade de desenvolvimento profissional e pessoal.
À Professora Gabriela pela orientação, confiança, amizade, ensinamentos e motivação durante a realização deste trabalho.
À Professora Juliana Macedo pelos ensinamentos, auxílio e disponibilidade na realização dos experimentos com células.
À Professora Gisèle LaPointe por me receber no Canadian Research Institute for Food Safety (CRIFS) e por todo conhecimento transmitido em nossas reuniões e desafios lançados que me instigaram a ir além.
Aos meus pais Itamar e Regina pelo amor, orações, ensinamentos, apoio, valores transmitidos e conselhos que promovem meu crescimento pessoal.
À minha irmã Laís, pela amizade, companheirismo e motivação durante o período de intercâmbio e redação deste trabalho.
Ao meu namorado, Léo, por ser minha fonte de inspiração e o meu maior incentivador. Obrigada por ouvir minhas aflições e dificuldades do doutorado. Os seus conselhos e otimismo foram essenciais neste momento.
Aos meus colegas do Laboratório de Bioprocessos: Ádina, Aline, Amanda Ávila, Amanda Ruviaro, Annayara, Andressa, Bruninha, Camila, Débs, Érica, Isa, John, Júlia, Karina, Lívia Dias, Lívia Reis, Mônica, Naice, Paula Speranza, Renata, Vânia e Vanize. Obrigada pela troca de conhecimento, auxílio na realização dos experimentos, amizade e cafezinhos. Meu agradecimento especial à Amanda Ruviaro, Bruninha, Débs, Isa, John, e Lívia Dias pela amizade verdadeira, companheirismo, auxílio nos experimentos e momentos especiais que tivemos juntos.
Ao Laboratório de Bioquímica de Alimentos, em especial Bia, Fernanda, Jessika, Jô, Marília, Profa. Hélia e Ruann, pela amizade e pelos cafezinhos neste ambiente único e acolhedor. Meu agradecimento especial à Jô, Marília e ao Ruann pela amizade verdadeira, disponibilidade, ensinamentos e prontidão em ajudar.
Aos amigos que fiz no CRIFS e na University of Guelph: Amy, Atinuke, Ayano, Bayla, Fatima, Ives, James, Jessie, Justina, Kalyani, Kavita, Karen, Krishna,
Myra, Nafiseh, Prof. Jeff Farber, Ryan, Samuel, Tim, Vanessa, Valéria, Vivian, Yan e Zoha. Agradeço pela amizade, acolhimento e os divertidos momentos de “lunch” e na copa do mundo. Meu agradecimento especial à Ayano, Nafiseh, Karen e Valéria pela amizade e auxílio no desenvolvimento da pesquisa, e à Amy e ao “team kiyomi” pelos “boardgames”, pelas experiências culinárias e por tornarem a minha experiência no Canadá inesquecível.
Aos meus queridos amigos de Lavras: Doug, Manu, Mayara e Lud. Obrigada pela amizade que se faz presente, mesmo a quilômetros de distância.
Às amigas que fiz no Apto 22C, Laís, Jess, Mari, Marluce, Monyca e Paola pela convivência, amizade, companheirismo, gordices na cozinha e aprendizado.
Aos membros da família, em especial, Dona Graça, Fernando (in memoriam), Madi, Madrinha, Vó Maricota e Vó Aparecida pelas orações e por estarem sempre me auxiliando de alguma forma.
A todos os funcionários da FEA pela amizade e auxílios prestados durante o doutorado, em especial ao Chico, meu companheiro de HPLC, Cidinha, Beth, Vivi e Geraldo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de doutorado concedida (número do processo: 141108/2015-0).
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pelo apoio financeiro através do projeto de auxílio à pesquisa (2015/04555-2).
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À Deus, pelo dom da vida, pelas graças recebidas e por ser fonte de esperança diante das dificuldades.
RESUMO
Quantidades significativas de subproduto são geradas na indústria de citros, o qual é rico em compostos fenólicos que podem ser explorados aumentando o valor agregado deste material. Em geral, estes compostos encontram-se em vacúolos ou complexados às paredes celulares dos vegetais, sendo os tratamentos enzimáticos capazes de maximizar a recuperação de fenólicos e simultaneamente biotransformá-los em moléculas mais simples, como as agliconas. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da biotransformação enzimática de subprodutos de citros na recuperação de fenólicos e avaliar o efeito destes extratos no crescimento e adesão intestinal de bactérias patogênicas e probióticas. Dois subprodutos da indústria cítrica foram estudados, um obtido no processamento de suco e o outro proveniente da extração da pectina. As análises de HPLC-DAD demonstraram que as flavanonas glicosiladas eram os compostos majoritários nos dois subprodutos, sendo que o da indústria de pectina possuía o maior conteúdo de flavanonas que o da indústria de suco. A biotransformação enzimática foi aplicada aos subprodutos e o efeito de diferentes parâmetros foram avaliados na capacidade antioxidante e no conteúdo fenólico dos subprodutos, como: tipo de enzima (tanase de Paeilomyces variotii, e as enzimas comercias β-glicosidase e celulase), suas concentrações (5, 10 e 20 U/g de subproduto) e tempo de reação (6, 12 e 24 h). Todos os tratamentos aumentaram a capacidade antioxidante e o teor de fenólicos totais dos extratos. A combinação tanase e β-glicosidase (10 U/g de subproduto de cada enzima) por 24 h foi escolhida dentre os melhores tratamentos, por oferecer elevada concentração das agliconas hesperetina (642,65 mg/100 g de subproduto) e naringenina (68,24 mg/100 g de subproduto). Os extratos biotransformados apresentaram atividade antibacteriana contra todas as cepas patogênicas estudadas (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium e S. Enteritidis),
enquanto que os extratos in natura inibiram apenas as cepas Gram-positivas. Além disso, a biotransformação dos extratos aumentou significativamente o crescimento da cepa probiótica Lactobacillus acidophillus quando comparado ao extrato in natura. Nos ensaios de adesão em células Caco-2, o extrato in natura estimulou a adesão de
Bifidobacterium lactis (~80%) e inibiu a adesão e invasão de S. Typhimurium (75 e 50%,
respectivamente). Já o extrato biotransformado aumentou a adesão de L. casei (50%) e reduziu a adesão e invasão de L. monocytogenes (40 e 75%). Além disso, os dois extratos diminuíram (~20%) a secreção da citocina inflamatória IL-8 pelas células Caco-2,
causada pela adesão de S. Typhimurium. Diferentes mecanismos demonstraram estar envolvidos na inibição da adesão de S. Typhimurium pelos extratos. Dentre eles, a capacidade em se ligarem a estruturas proteicas de adesão da S. Typhimurium, como fímbria e flagelo. Outro mecanismo foi a diminuição da expressão de fímbria e genes de virulência. O extrato biotransformado ainda demonstrou inibição da motilidade desta bactéria, reduzindo sua capacidade de atingir sítios de adesão no epitélio. A biotransformação enzimática se mostrou vantajosa na obtenção de flavanonas agliconas e aumentou o potencial prebiótico e antibacteriano destes subprodutos. Assim, este estudo contribui para o desenvolvimento de um processo para o reaproveitamento de subprodutos de citros como ingredientes de alimentos funcionais com potencial preventivo de infecções intestinais, valorizando este abundante material.
Palavras-chave: Flavanonas; beta-glicosidase; tanase; celulas Caco-2; bactérias
ABSTRACT
Significant amounts of by-products are produced by citrus juice industry, which is source of phenolic compounds that can be extracted in order to add-value to this material. These compounds are usually captured inside vacuoles of plant cells or complexed to cell wall structures, thus enzyme-assisted extraction can be applied to maximize phenolic compounds recovery and biotransform them into smaller molecules, such as aglycones. This study aimed to investigate the effect of enzymatic biotransformation of citrus by-products on polyphenolic profile and evaluate the effect of these extracts on the growth and adhesion of pathogenic and probiotic bacteria. Two by-products from citrus industry were applied, obtained from juice process and pectin extraction. HPLC-DAD analyzes showed that glycosylated flavanones were the major compounds found in the products. The one from pectin industry presented higher flavanone content than the by-product from juice industry. Enzymatic biotransformation was applied to the by-by-products and the effect of different parameters were evaluated on their antioxidant capacity and phenolic content, such as: type of enzyme (tannase from Paeilomyces variotii, and the commercial enzymes β-glucosidase and cellulase), their concentrations (5, 10 and 20 U/g by-product) and reaction time (6, 12 and 24 h). All treatments increased the antioxidant capacity and the total phenolic content of the extracts. The combination of tannase and β-glucosidase (10 U/g by-product of each enzyme) for 24 h was chosen among the best treatments, as it offered high amounts of the aglycones hesperetin (642.65 mg/100 g by-product) and naringenin (68.24 mg /100 g by-by-product). Biotransformed extracts showed antibacterial activity against all studied pathogenic strains (Bacillus cereus, Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium and S. Enteritidis), while the in natura extracts inhibited only Gram-positive bacteria. The
biotransformed extracts significantly increased the growth of the probiotic Lactobacillus
acidophillus when compared to the in natura extracts. In the adhesion assays in Caco-2
cells, the in natura extract stimulated the adhesion of Bifidobacterium lactis (~ 80%) and inhibited adhesion and invasion of S. typhimurium (75 and 50%, respectively). The biotransformed extract increased the adhesion of L. casei (50%) and reduced the adhesion and invasion of L. monocytogenes (40 and 75%). In addition, both extracts decreased (~20%) the secretion of inflammatory cytokine IL-8 by Caco-2 cells, caused by the adhesion of S. Typhimurium. Different mechanisms were shown to be involved in the extracts inhibition of S. Typhimurium adhesion. Among them, their ability to bind to
Salmonella adhesin structures, such as fimbriae and flagella. Another mechanism was the
decrease in fimbria and virulence genes expression. The biotransformed extract also inhibited Salmonella motility, which can challenge this bacteria ability to reach adhesion sites in the epithelium. Enzymatic biotransformation proved to be advantageous in the obtainment of flavanones and increased the prebiotic and antibacterial potential of these by-products. Thus, this study contributes to development of a process to the reuse of citrus by-products as food functional ingredients, with the potential to prevent intestinal infections, and add-value to this abundant material.
Keywords: Flavanones; beta-glucosidase; tannase; caco-2 cells; pathogenic bacteria;
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAPH 2,2’-azobis(2-methylpropionamidine ANOVA Analysis of variance
ATCC American type culture collection
C Cellulase
cDNA Complementary DNA
CJB Citrus juice by-product
CJB-E Citrus juice by-product enzymatic extract CJB-nE Citrus juice by-product non-enzymatic extract
CP Citrus pomace
CP-E Citrus pomace enzymatic extract CP-H Citrus pomace hydroalcoholic extract CPB Citrus pectin by-product
CPB-E Citrus pectin by-product enzymatic extract CPB-nE Citrus pectin by-product non-enzymatic extract DAD Diode array detection
DM Dry matter
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DTA Doenças transmitidas por alimentos EDTA ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme linked imune sorbent assay FBS Fetal bovine serum
HPLC High performance liquid chromatography IL-1b interleukin-1b
IL-8 Interleucina 8
LB Luria-Bertani broth
LPS Lipopolysaccharides
MBC Minimal bactericidal concentration
MH Mueller Hinton broth
MIC Minimal inhibitory concentration MRS De Man-Rogosa-Sharpe broth
MRS* De Man-Rogosa-Sharpe broth without glucose
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NB Nutrient broth
NF-κB Fator nuclear kappa B
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity RNA Ribonucleic acid
RT-qPCR Real time quantitative polymerase chain reaction
SD Standard deviation
SPI-1 Salmonella pathogenicity island 1
T Tannase
T3SS Type III secretion system
TC Tannase combined with cellulase TLR Tool like receptor
TPC Total phenolic content TSB Trypticase soy broth
TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride UV-VIS Ultraviolet-visible
β β-glucosidase
βC β-glucosidase combined with cellulase βT β-glucosidase combined with tannase
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 17
CAPÍTULO I. REVISÃO DE LITERATURA ... 20
1. SUBPRODUTOS DA INDÚSTRIA DE CITROS ... 20
2. COMPOSTOS FENÓLICOS EM FRUTAS CÍTRICAS ... 21
3. EXTRAÇÃO ENZIMÁTICA DE COMPOSTOS FENÓLICOS ... 24
4. APLICAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS EM ALIMENTOS ... 27
4.1EFEITO ANTIMICROBIANO DE POLIFENÓIS ... 28
4.2EFEITO PREBIÓTICO DE POLIFENÓIS ... 30
4.3EFEITO ANTIOXIDANTE DE POLIFENÓIS ... 31
5. BIODISPONIBILIDADE DE POLIFENÓIS E EFEITO NA ADESÃO DE BACTÉRIAS NO INTESTINO ... 32
5.1EFEITO DE COMPOSTOS FENÓLICOS NA ADESÃO DE BACTÉRIAS NO EPITÉLIO INTESTINAL... 35
6. CONCLUSÃO... 39
7. REFERÊNCIAS... 39
CAPÍTULO II. COMPARISON OF DIFFERENT BRAZILIAN CITRUS BY-PRODUCTS AS SOURCE OF NATURAL ANTIOXIDANTS ... 54
ABSTRACT ... 54
1. INTRODUCTION ... 54
1. MATERIAL AND METHODS ... 56
2.1MATERIALS ... 56
2.2CITRUS BY-PRODUCTS ... 56
2.3CHEMICAL COMPOSITION OF RESIDUES ... 56
2.4POLYPHENOLS EXTRACTION ... 57
2.5TOTAL POLYPHENOLS CONTENT... 57
2.6ANTIOXIDANT CAPACITY ... 57
2.7IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION OF MAIN CITRUS POLYPHENOLS BY HPLC-DAD ... 58
2.8STATISTICAL ANALYSIS ... 58
2. RESULTS AND DISCUSSION ... 59
3.1CHEMICAL COMPOSITION ... 59
3.2TOTAL POLYPHENOLS CONTENT AND ANTIOXIDANT CAPACITY ... 61
3.3POLYPHENOLIC PROFILE ... 62
3. ACKNOWLEDGMENTS ... 66
4. REFERENCES ... 66
CAPÍTULO III. CONDITION OF ENZYME-ASSISTED EXTRACTION TO INCREASE THE RECOVERY OF FLAVANONE AGLYCONES FROM PECTIN WASTE ... 70
ABSTRACT ... 70
1. INTRODUCTION ... 71
2. MATERIAL AND METHODS ... 72
2.1.CHEMICALS ... 72
2.2.CPB ... 73
2.3.ENZYMES ... 73
2.4.ENZYMATIC TREATMENTS AND POLYPHENOL EXTRACTION ... 74
2.5.ANALYSES OF POLYPHENOLS ... 74
2.6.ANTIOXIDANT ASSAYS ... 75
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 76
3.1.POLYPHENOLS ANALYSES ... 76
3.2ANTIOXIDANT CAPACITY ... 80
3.3. CORRELATION AND MULTIVARIATE ANALYSES... 81
4. CONCLUSION ... 88
ACKNOWLEDGMENTS ... 88
REFERENCES ... 88
CAPÍTULO IV. EFFECT OF ENZYMATIC TREATMENT OF CITRUS BY-PRODUCTS ON BACTERIAL GROWTH, ADHESION AND CYTOKINE PRODUCTION BY CACO-2 CELLS 94 ABSTRACT ... 94
1. INTRODUCTION ... 95
2. MATERIAL AND METHODS ... 96
2.1MATERIALS ... 96
2.2CITRUS ENZYMATIC EXTRACTS ... 97
2.3QUANTIFICATION OF POLYPHENOLS ... 98
2.4EFFECT OF POLYPHENOLS ON BACTERIAL GROWTH ... 98
2.4.1BACTERIA STRAINS AND GROWTH CONDITIONS... 98
2.4.2ANTIBACTERIAL ASSAY ... 98
2.4.3 ASSAY FOR PREBIOTIC EFFECT ... 99
2.4.4GROWTH CURVE OF PROBIOTIC STRAINS ... 99
2.5EFFECT OF POLYPHENOLS ON BACTERIAL ADHESION TO CACO-2 CELLS ... 100
2.5.1CELL CULTURE ... 100
2.5.2CELL VIABILITY ASSAY ... 100
2.5.3BACTERIAL ADHESION ASSAY ... 100
2.5.4INVASION ASSAY ... 101
2.5.5IL-8 PRODUCTION ... 101
2.6STATISTICAL ANALYSES ... 101
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 102
3.1POLYPHENOLIC CONTENT OF CITRUS EXTRACTS ... 102
3.2INHIBITION OF FOODBORNE PATHOGENS BY CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES... 103
3.3PREBIOTIC EFFECT OF CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES ... 107
3.4EFFECT OF CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES ON CACO-2 VIABILITY AND BACTERIA ADHESION ... 109
3.5EFFECT OF CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES ON INFLAMMATORY RESPONSE OF CACO-2 CELLS INDUCED BY PATHOGENS ... 114 4. CONCLUSION ... 117 DECLARATIONS OF INTEREST ... 117 ACKNOWLEDGMENTS ... 117 REFERENCES ... 117 SUPPLEMENTARY MATERIAL ... 125
CAPÍTULO V. IMPACT OF ENZYME-ASSISTED AND HYDROALCOHOLIC EXTRACTION OF FLAVANONES FROM CITRUS POMACE ON SALMONELLA TYPHIMURIUM ADHESION AND VIRULENCE FACTORS ... 128
ABSTRACT ... 128
1. INTRODUCTION ... 129
2. MATERIAL AND METHODS ... 131
2.1MATERIALS ... 131
2.2CITRUS EXTRACTS ... 131
2.3QUANTIFICATION OF POLYPHENOLIC COMPOUNDS ... 132
2.5EFFECT OF CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES ON BACTERIAL GROWTH ... 133
2.6BACTERIAL ADHESION IN CACO-2 CELLS ... 133
2.6.1CELL CULTURE ... 133
2.6.2BACTERIA ADHESION ASSAY ... 133
2.7FIMBRIAE AND FLAGELLA AGGLUTINATION ASSAY ... 134
2.8BIOFILM FORMATION ... 134
2.9MOTILITY ASSAY... 135
2.10VIRULENCE GENES EXPRESSION USING HILA∷LUX AND SSRB∷LUX REPORTER STRAINS ... 135
2.11GENE EXPRESSION ANALYSIS USING RT-QPCR ... 135
2.12STATISTICAL ANALYSIS ... 137
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 137
3.1POLYPHENOLIC PROFILE OF CITRUS EXTRACTS ... 137
3.2EFFECT OF CP EXTRACTS AND FLAVANONES ON S.TYPHIMURIUM GROWTH ... 138
3.3EFFECT OF CP EXTRACTS AND FLAVANONES ON S.TYPHIMURIUM ADHESION TO CACO-2 CELLS... 139
3.4EFFECT OF CP EXTRACTS AND FLAVANONES ON S.TYPHIMURIUM AGGLUTINATION ... 141
3.6FIMBRIAE, FLAGELLA AND VIRULENCE GENES EXPRESSION OF S.TYPHIMURIUM IN PRESENCE OF CITRUS EXTRACTS AND FLAVANONES ... 145
4. CONCLUSION ... 148 ACKNOWLEDGMENTS ... 149 CONFLICT OF INTEREST... 149 REFERENCES ... 149 DISCUSSÃO GERAL ... 157 CONCLUSÃO GERAL ... 161 REFERÊNCIAS ... 162 APÊNDICES ... 166 ANEXOS ... 173
Introdução geral
A indústria processadora de frutas gera quantidades expressivas de subprodutos durante a fabricação de suco, vinho e óleo. Estes subprodutos são principalmente destinados à alimentação animal, compostagem agrícola e geração de energia. No entanto, são encontrados nestes materiais compostos de alto valor agregado, como pigmentos, ácidos orgânicos, enzimas e compostos bioativos (DELGADO; FLEURI, 2016). Esta composição possibilita que estes subprodutos sejam valorizados e tenham aplicação mais nobre na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos (CHAMORRO et al., 2012).
A laranja é a fruta mais cultivada no país e no mundo, com produção estimada de 17 e 73 milhões de toneladas em 2017, respectivamente (FAO, 2018). O principal destino desta produção é o processamento de suco, cujo rendimento é metade do peso do fruto e a outra metade corresponde ao material sólido, designado subproduto (NAKAJIMA et al., 2016). Atualmente, este material já é empregado na extração de produtos com maior valor agregado, como óleo essencial (D-limoneno) e pectina. Porém, outras aplicações poderiam ser exploradas, como a obtenção de antioxidantes naturais, pigmentos, conservantes de alimentos e ingredientes funcionais (DELGADO; FLEURI, 2016). Estas aplicações são atribuídas aos constituintes bioativos dos subprodutos de laranja, como os polifenóis, sendo a maioria pertencente à classe das flavanonas (TOMÁS-BARBERÁN; CLIFFORD, 2000; TRIPOLI et al., 2007).
Em frutas cítricas, as flavanonas são predominantemente encontradas glicosiladas à neohesperidoses e rutinoses, como a naringina e a hesperidina, respectivamente (KHAN; ZILL-E-HUMA; DANGLES, 2014). Os interesses nestes compostos são suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antibacterianas e cardiovasculares (BARRECA et al., 2017). Assim, diferentes métodos têm sido considerados com o intuito de maximizar a obtenção de flavanonas. Dentre eles, técnicas sustentáveis são exploradas visando substituir o uso de solventes orgânicos nocivos ao ambiente, como: extração por micro-ondas, fluidos supercríticos, ultrassom ou tratamentos enzimáticos (MADEIRA; TEIXEIRA; MACEDO, 2013; M’HIRI et al., 2014). A extração enzimática depende das propriedades do biocatalisador, sendo estes capazes de atuar na lise da parede celular vegetal, tornando o material intracelular mais acessível para extração (M’HIRI et al., 2014). Além disso, algumas enzimas podem atuar na biotransformação de fenólicos, removendo grupamentos glicosídicos e liberando as
respectivas agliconas, raramente encontradas na natureza (MADEIRA; MACEDO, 2015). A ausência dos glicosídeos nas moléculas das flavanonas intervém na atividade biológica destes compostos, aumentando a sua biodisponibilidade e efeitos antioxidante, anti-inflamatório e antibacteriano (MANACH et al., 2004; MANDALARI et al., 2007; BARRECA et al., 2017; NAKAJIMA et al., 2017).
A adição de compostos fenólicos em alimentos, além de agregar funcionalidade, pode beneficiar a vida de prateleira destes produtos. O efeito antioxidante dos fenólicos permite que eles sejam utilizados no controle da oxidação de alimentos com alto teor lipídico (CORY et al., 2018). Estes compostos também podem ser aplicados como compostos prebióticos por diminuírem o potencial redox de alimentos, aumentando a viabilidade e crescimento de bactérias probióticas, ou por servirem de substrato à estas bactérias (GYAWALI; IBRAHIM, 2012). Outra aplicação se refere ao efeito antimicrobiano destes compostos, os quais podem controlar o desenvolvimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes no alimento (CHIBANE et al., 2019).
Uma vez ingeridos, os fenólicos devem ser primeiramente metabolizados pela microbiota intestinal, para a posterior absorção. Além do auxílio na absorção, os fenólicos fornecidos às bactérias do intestino podem regular o metabolismo e causar variações na população microbiana devido aos seus efeitos antimicrobianos, prebióticos e na adesão e invasão de bactérias no epitélio (SELMA; ESPÍN; TOMÁS-BARBERÁN, 2009; RASTMANESH, 2011; BUSTOS et al., 2012; CARDONA et al., 2013). A adesão de bactérias neste tecido é um fator importante para a colonização do intestino, sendo coordenado por múltiplos fatores e sítios de adesão na superfície da bactéria e do epitélio intestinal. Os compostos fenólicos demonstram estimular a adesão de bactérias probióticas, bem como inibir a adesão de bactérias patogênicas e o desenvolvimento de infecções intestinais (SELMA et al., 2012; VOLSTATOVA et al., 2017).
Desta forma, os principais objetivos deste estudo foram: (i) caracterizar subprodutos da indústria de suco de laranja e processadora de pectina quanto ao conteúdo fenólico e antioxidante; (ii) aplicar tratamentos enzimáticos (tanase de Paeilomyces
variotii e as enzimas comerciais β-glicosidase e celulase) em subprodutos de pectina e
avaliar o efeito destes tratamentos na capacidade antioxidante e no conteúdo fenólico dos extratos biotransformados; (iii) avaliar o efeito de extratos biotransformados quanto à sua influência no crescimento e adesão de bactérias patogênicas e probióticas em células de adenocarcinoma humano (Caco-2); (iv) investigar o efeito e os mecanismos de inibição
dos extratos biotransformados na adesão e de patogenicidade da Salmonella Typhimurium.
A extração e biotransformação enzimática de compostos fenólicos de subprodutos de citros é fundamentada na experiência prévia do nosso grupo de pesquisa, o qual já demonstrou que este processo aumenta o efeito antioxidante, anti-inflamatório, anti-obesogênico e a proteção vascular destes compostos (MADEIRA; MACEDO, 2015; NAKAJIMA et al, 2015; NAKAJIMA et al, 2017; RUVIARO, 2018). Neste estudo, o efeito da biotransformação enzimática de subprodutos de citros foi avaliado na atividade antimicrobiana e prebiótica dos extratos. As flavanonas, como maiores constituintes destes extratos, foram pouco exploradas nesta atividade e na adesão de bactérias no epitélio intestinal. Sendo a Salmonella spp. a principal causa de doenças transmitidas por alimentos no Brasil, maior atenção foi direcionada à esta bactéria. Assim, este estudo amplia a bioatividade das flavanonas, visando diversificar a aplicação dos subprodutos da citricultura na área de alimentos. A obtenção de um novo extrato bioativo irá contribuir no desenvolvimento de um novo ingrediente ou aditivo de alimentos a partir de subprodutos da citricultura, o que irá agregar valor a estes materiais e contribuir às tendências de mercado, que buscam por produtos naturais, saudáveis e com apelo sustentável (ITAL; FIESP, 2010).
Capítulo I. Revisão de literatura
1. Subprodutos da indústria de citros
O desenvolvimento de alimentos funcionais é uma área crescente no mercado de alimentos, visando atender as expectativas atuais do consumidor que se preocupa com nutrição e saúde (FAUSTINO et al., 2019). O projeto “Brasil Food Trends” confirma que entre as tendências para o ano de 2020 estão alimentos que tragam “saudabilidade e bem-estar” e “sustentabilidade e ética” (ITAL; FIESP, 2010). Neste contexto, a inovação e a busca por ingredientes funcionais obtidos de forma sustentável beneficiará o sistema de alimentos.
No processamento de frutas, aproximadamente 70% da matéria prima utilizada se torna subproduto (MORALES et al., 2014). A principal aplicação destes materiais é na alimentação animal e compostagem agrícola visando minimizar problemas ambientais, como a produção de metano e contaminação de rios e lençóis freáticos (MAMMA; CHRISTAKOPOULOS, 2014). No entanto, os rsubprodutos agroindustriais são fontes de fibras, proteínas, fruto-oligossacarídeos, compostos fenólicos, vitaminas e minerais (DIAZ-VELA et al., 2013). O efeito nutracêutico e funcional destes componentes possibilita que os subprodutos desta indústria sejam reaproveitados de forma mais nobre, como no desenvolvimento de alimentos (DELGADO; FLEURI, 2016).
Os citros são os frutos mais cultivados no mundo (86 milhões de toneladas),
sendo a laranja (Citrus sinensis) o maior representante deste grupo (73 milhões de toneladas) (FAO, 2018). O Brasil é responsável por aproximadamente um quarto desta produção (17 milhões de toneladas), cujo destino principal é a indústria de suco (~70%) (FAO, 2018; SATARI; KARIMI, 2018; ZEMA et al., 2018). No processo de extração do suco de laranja, metade da fruta (em massa) é descartada, gerando aproximadamente 6 milhões de toneladas de subproduto no país. Em sua constituição estão as cascas (40-55%), bagaço (30-35%) e sementes (menos de 10%), cuja composição química varia de acordo com o cultivo e cultivares dos frutos, tempo de colheita e técnica de extração do suco (ZEMA et al., 2018). Atualmente, este subproduto é fornecido como matéria-prima para extração de pectina, óleo essencial, utilizado na alimentação animal, fertilização agrícola ou produção de energia (Figura 1). No entanto, outros compostos de interesse na indústria de alimentos, farmacêutica e química podem ser obtidos a partir deste subproduto abundante e de baixo custo (Tabela 1) (SATARI; KARIMI, 2018). A extração
de compostos bioativos com aplicação nutracêutica e/ou terapêutica, pode aumentar o valor agregado dos subprodutos da indústria cítrica, beneficiando este importante setor industrial brasileiro.
Figura 1. Esquema de reaproveitamento do subproduto da indústria processadora de frutas cítricas (Adaptado de Zema et al., 2018).
2. Compostos fenólicos em frutas cítricas
Os compostos fenólicos são agentes redutores que possuem um ou mais anéis aromáticos em sua estrutura química, considerados os antioxidantes naturais mais comuns da alimentação. Estes compostos são derivados do metabolismo secundário de plantas, desempenhando papéis fundamentais no crescimento e desenvolvimento dos vegetais (SHAHIDI; NACZK, 2004). Os compostos fenólicos constituem uma ampla classe de moléculas, agrupadas em ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, cumarinas, taninos, e ligninas (SHAHIDI; YEO, 2016). Os flavonoides, por sua vez, compreendem o maior número de compostos cuja estrutura básica tem o formato C6 – C3 – C6 (dois anéis
aromáticos conectados por três carbonos), sendo ainda classificados em: flavonas, flavanonas, flavonóis, flavanolóis, isoflavonas, flavanóis e antocianinas (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
Nos vegetais, os compostos fenólicos são encontrados na sua forma solúvel e insolúvel. A fração insolúvel está ligada de forma covalente à substâncias da parede celular, como pectina, celulose e proteínas estruturais, compondo até 60% dos fenólicos
Frutas cítricas Processamento
da fruta Subproduto Suco Uso direto • Alimentação animal • Compostagem/fertilização orgânica Produção de energia • Combustão direta
• Fermentação e produção de bioetanol
• Digestão anaeróbia e produção de biogás
Biorrefinaria
• Óleo essencial (D-limoneno)
• Pectina cítrica
• Ácidos orgânicos
dos vegetais. Já a porção solúvel é encontrada dentro dos vacúolos das células, presentes na forma livre ou conjugada à moléculas de açúcar (SHAHIDI; YEO, 2016). As principais funções desempenhadas pelos fenólicos nos tecidos vegetais são proteção UV, redução de estresse oxidativo, efeito tóxico à predadores e atrativo à polinizadores (NACZK; SHAHIDI, 2004). Nos alimentos, estas moléculas contribuem às características sensoriais (sabor, cor e odor) e à estabilidade oxidativa dos produtos (SHAHIDI; NACZK, 2004). Porém, o maior interesse nestes compostos é devido às suas propriedades biológicas, como proteção cardiovascular, efeito antioxidante, anti-inflamatório e prevenção de cânceres (JIANG; DUSTING, 2003; JAFARI; SAEIDNIA; ABDOLLAHI, 2014; LUTZ et al., 2019). Neste contexto, diversas fontes vegetais têm sido investigadas na obtenção destas moléculas. Dentre elas, os subprodutos agroindustriais se mostram promissores devido ao baixo custo destes materiais e ao seu rico conteúdo de compostos fenólicos (DI DONATO et al., 2017).
Tabela 1. Compostos de interesse industrial presentes em subprodutos de citros.
Composto Concentração Aplicações na indústria Referência
Pectina 180 - 230 g/ kg da casca1 de citros
• Aplicação em alimentos: geleias, iogurtes, sucos de frutas • Produção de oligossacarídeos (MAMMA; CHRISTAKOPOULOS, 2014; BARBOSA; RUVIARO; MACEDO, 2018) Açúcares totais 250 g/ kg de subproduto2 de citros (sacarose, glicose e frutose) • Produção de etanol • Produção de ácidos orgânicos (O’SHEA et al., 2015) Hemicelulose,
celulose e lignina 550 g/ kg da casca
1 de citros (respectivamente) • Produção de etanol • Produção de fibras dietéticas (MAMMA; CHRISTAKOPOULOS, 2014) Carotenóides 0,5 g/ kg da casca1 de citros (β-caroteno, α-caroteno, luteína, zeaxantina, entre outros) • Pigmentos naturais (margarinas) (WANG; CHUANG; HSU, 2008) Óleo essencial 5,44 g/100 kg de fruto (90% da composição é D-Limoneno) • Cosméticos • Pesticidas • Produtos de limpeza doméstica • Antimicrobianos naturais (MAMMA; CHRISTAKOPOULOS, 2014) Flavonóides 13,5 g/ kg da casca 1 de
citros • Antioxidantes naturais
• Antimicrobianos naturais (BOCCO et al., 1998) Enzimas Lipase: 65,1 U/ g de casca1 de citros • Aplicação na indústria de alimentos (OKINO-DELGADO; FLEURI, 2014) 1Matéria seca; 2matéria fresca
Os flavonóides são os principais compostos fenólicos encontrados em frutas cítricas (TRIPOLI et al., 2007). Estima-se que a casca destes frutos possua aproximadamente 13,5 g de flavonóides por Kg de matéria seca, cuja quantidade é muito superior àquela encontrada no suco, o produto primário da indústria de laranja (BOCCO et al., 1998; ESCOBEDO-AVELLANEDA et al., 2014). A maior parte destes compostos pertence à classe das flavanonas, encontradas principalmente na forma glicosilada de rutinose ou neohesperidose (Figura 2) (TRIPOLI et al., 2007). As rutinoses, sobretudo a hesperidina, são as principais flavanonas encontradas em laranja (C. sinensis), tangerina (C. reticulada) e limão (C. limon). Enquanto que as neohesperidoses, como a naringina, são comumente encontradas em “Grapefruit” (C. paradisi) e laranja azeda (C. aurantium) (TOMÁS-BARBERÁN; CLIFFORD, 2000). Dentre as agliconas, naringenina e hesperetina são as mais importantes, porém encontradas em menor proporção na natureza (GATTUSO et al., 2007; KHAN; ZILL-E-HUMA; DANGLES, 2014). As flavanonas já foram relacionadas a diferentes efeitos benéficos à saúde, como antioxidante, anti-inflamatório, anticancerígeno, antimicrobiano e proteção cardiovascular (MANTHEY; GUTHRIE, 2002; ORALLO et al., 2004; MANDALARI et al., 2007; NAKAJIMA et al., 2017). Assim, há um interesse crescente na obtenção destes compostos e diferentes métodos de extração podem ser empregados na recuperação destas moléculas.
Tradicionalmente, a extração de compostos fenólicos de plantas e matrizes vegetais é realizada empregando solventes orgânicos e sistemas de calor (MADEIRA; TEIXEIRA; MACEDO, 2013). Porém, outros métodos de extração vêm sendo estudados visando aumentar a recuperação destes compostos. Dentre eles, processos físico-químicos, como fluidos supercríticos, alta pressão, extração por micro-ondas e ultrassom; e processos biológicos, como fermentação por micro-organismo e tratamentos enzimáticos (enzimas exógenas) (KHAN et al., 2010; MADEIRA; MACEDO, 2015; NAKAJIMA et al., 2016; BARRALES et al., 2018). Estes processos demonstram aumentar o rendimento de extração de fenólicos e são considerados tecnologias limpas por consumirem pouca energia, requerendo menor quantidade ou nenhum solvente orgânico (MADEIRA; TEIXEIRA; MACEDO, 2013; M’HIRI et al., 2014).
Figura 2. Flavanonas agliconas e glicosiladas comumente encontradas em frutas cítricas (Fonte: KHAN; ZILL-E-HUMA; DANGLES, 2014).
3. Extração enzimática de compostos fenólicos
As enzimas, devido às suas efetivas propriedades catalíticas, já são aplicadas em diferentes setores industriais, como na fabricação de detergente, alimentos, óleos, bebidas, combustível, papel e celulose (KIRK; BORCHERT; FUGLSANG, 2002; LI et al., 2012). Na extração de compostos fenólicos, a aplicação de enzimas baseia-se na capacidade destes biocatalisadores promoverem a lise da parede celular vegetal, tornando o material intracelular mais acessível para extração (M’HIRI et al., 2014). Além disso, algumas enzimas podem atuar na biotransformação de fenólicos, removendo grupamentos metil ou glicosídicos, liberando as respectivas agliconas, raramente encontradas na natureza (MADEIRA; TEIXEIRA; MACEDO, 2013).
Os principais fatores que interferem no processo de extração enzimática são os tipos de enzima, suas concentrações, pH, temperatura, tempo de reação e tamanho de partícula do substrato (NADAR; RAO; RATHOD, 2018). Diferentes enzimas são utilizadas na extração de fenólicos. As carboidrases celulases (EC 3.2.1.4) e pectinases (EC 4.2.2.2) por exemplo, demonstraram efeito positivo na recuperação destes compostos, devido à capacidade destas enzimas em hidrolisar os polissacarídeos constituintes da parede celular vegetal (celulose e pectina) (CHAMORRO et al., 2012; MADEIRA; MACEDO, 2015; MARTINS et al., 2016). As β-glicosidases (EC 3.2.1.21)
Agliconas Açúcares Glicosiladas Rutinose (6-O-α-L-rhamnosyl-D-glucose) Neohesperidose (2-O-α-L-rhamnosyl-D-glucose) Naringenina (R1 = OH) Hesperetina (R1 = OH) Narirutina (R1 = Rutinose) Naringina (R1 = Neohesperidose) Hesperidina (R1 = Rutinose) Neohesperidina (R1 = Neohesperidose)
atuam na deglicosilação de fenólicos e produção de agliconas (SHIN; NAM; OH, 2013). As tanino acil hidrolases (tanases) (EC 3.1.1.20) apresentam atividade similar às β-glicosidases, atuando ainda em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis (MACEDO et al., 2011; FERREIRA et al., 2013). Dentre os outros fatores que influenciam a reação enzimática, o pH, a temperatura, a concentração de enzima e o tempo de reação estão relacionados às características bioquímicas das enzimas e do substrato utilizado. No entanto, temperaturas baixas (25 – 60 °C) são comumente empregadas visando diminuir a degradação dos compostos fenólicos que são termossensíveis (NADAR; RAO; RATHOD, 2018). Quanto ao tamanho de partícula do substrato, a diminuição deste parâmetro aumenta a recuperação de fenólicos por aumentar a superfície de contato entre o sólido e a substância extratora (enzima), além de facilitar a transferência de massa de fenólicos. Porém, a redução excessiva das partículas pode promover o fenômeno de empacotamento do substrato, reduzindo a eficiência de extração (LANDBO; MEYER, 2001; PINELO et al., 2005). Assim, estudos de otimização são realizados para avaliar as diferentes condições destes parâmetros, buscando aumentar o rendimento de extração e reduzir o custo do processo (como a redução de tempo e concentração de enzima).
A extração enzimática de compostos fenólicos em substratos de citros já é descrita na literatura (Tabela 2). Dentre os benefícios observados, os principais são: aumento do rendimento e do conteúdo de fenólicos totais. Porém, alguns trabalhos também relataram que aliado à extração, o tratamento enzimático promove um aumento na atividade biológica dos extratos/compostos obtidos. Estes resultados podem ser explicados devido ao maior conteúdo de fenólicos nos extratos ou pela biotransformação das flavanonas glicosiladas em agliconas (naringenina e hesperetina), raramente encontradas na natureza (FERREIRA et al., 2013; MADEIRA; MACEDO, 2015). A vantagem das formas agliconas é que na ausência dos glicosídeos, as flavanonas tem maior número de grupos hidroxilas disponível na estrutura da molécula, aumentando assim o seu potencial antioxidante e absorção no intestino (KOBAYASHI et al., 2008; DE QUEIRÓS; MACEDO; MACEDO, 2016; MARTINS et al., 2016; ROBERTO et al., 2016; XIAO, 2017). Desta forma, é de grande interesse métodos de obtenção destas moléculas e a investigação dos seus efeitos biológicos.
Tabela 2. Extração e biotransformação enzimática de compostos fenólicos em substratos cítricos.
Substrato Tratamentos enzimáticos Resultados Referência
Suco
Laranja (C. sinensis)
• Tanase (Paecilomyces variotii): pH 7,4; 5 U/mL de suco; 40 °C; 60 min
• Naringinase: pH 4,0; 0,85 U/mL; 40 °C; 60 min
• Biotransformação das flavanonas glicosiladas em agliconas
• ↑ Atividade antioxidante do suco • ↑ Efeito antiproliferativo do suco
(FERREIRA et al., 2013)
Laranja (C. sinensis)
• α-L-ramnosidase (Aspergillus sojae)
• Condições: pH 6,0; 10% DMSO; 10% etanol; enzima 2 mg/mL de reação; 37 °C; 24 h
• Biotransformação de hesperidina em hesperetin-7-O-glucoside (remoção da rutinose)
• ↑ Inibição de Helicobacter pylori
(LEE et al., 2012)
Casca de frutas cítricas
“Grapefruit” (Citrus paradisi)
• Pectinex Ultra SPL + Viscozyme L
• Condições: pH 4,8; 50 °C; 1,5% de enzimas (ratio
5:2, Pectinex:Viscozyme); 50 min • ↑ Fenólicos totais (~74%)
(KHUE; PHUC; MAI, 2015) Casca e polpa de
“Grapefruit” (C. paradisi)
• β-glicosidase (Pyrococcus furiosus)-recombinante • Condições: pH 5,5; 95 °C; 0,85 U/mL de reação;
10% DMSO; 0,1% Tween 40; 12 h
• Biotransformação das flavanonas glicosiladas em agliconas
• Produtividade das agliconas: 0,9-1,9 g.L-1h-1
(SHIN; NAM; OH, 2013) Laranja (C. sinensis) • Viscozyme L • Condições: pH 4,5; 50 °C; 12 U/ g de casca; 160 rpm; 180 min
• ↑ Rendimento de extração de polifenóis
(10-60%) (EL KANTAR et al., 2018)
Laranja
(C. sinensis cv. Marss)
• Pectinase
• Condições: pH 4,0; 25 °C; 0,5% de enzimas; 120 min com uma sonda ultrassônica (20 kHz)
• ↑ Rendimento de extração (~100%) • ↑ Fenólicos totais (~30%)
• ↑ Efeito antimicrobiano contra os patógenos
Staphylococcus aureus e Escherichia coli
(SHAHRAM; DINANI; AMOUHEYDARI, 2019) Laranja lima (C. limetta cv. Risso)
• Pectinex Ultra SPL + Celluclast 1.5L + Alcalase • Condições: pH 6,5; 45 °C; 3,3% de enzimas (ratio
1:2:1, pectinase:celulase:alcalase); 120 rpm; 75 min
• ↑ Rendimento de extração
• ↑ Fenólicos totais e atividade antioxidante dos extratos
(MUSHTAQ et al., 2014)
Limão (C. limon Meyer) • Celluzyme MX • Condições: 50 °C; 1,5% de enzima; 3 h • ↑ Fenólicos totais (~40%) (LI; SMITH; HOSSAIN, 2006) Subproduto
da indústria de suco
Citrus sinensis e C. latifolia
• Tanase (P. variotii) + Celluclast 1.5L
• Condições: 40 °C; celulase 5 U/ mL de reação; tanase 7 U/ mL; 200 rpm; 24 h
• Biotransformação das flavanonas glicosiladas em agliconas: hesperetina (↑95,9%) e naringenina (↑63,9%)
• ↑ Produção de acido elágico (↑64%) • ↑ Atividade antioxidante dos extratos
(MADEIRA; MACEDO, 2015) Abreviações: Naringinase (Penicillium decumbens, Sigma-Aldrich); Pectinex Ultra SPL (pectinase de A. aculeatus, Novozymes A/S); Viscosyme L (complexo multi-enzimático de arabanase, celulase, β-glucanase, hemicelulase e xilanase, Novozymes A/S); Celluclast 1.5L (celulase de Trichoderma reesei, Novozymes A/S); Alcalase (protease de Bacillus licheniformis, Novozymes S/A); ↑ (aumento); ↓ (redução).
4. Aplicação dos compostos fenólicos em alimentos
O maior interesse na obtenção de compostos fenólicos é a aplicação destas moléculas na saúde, cujos principais benefícios são os efeitos antioxidante, anti-inflamatório, antimicrobiano e proteção cardiovascular (JIANG; DUSTING, 2003; JAFARI; SAEIDNIA; ABDOLLAHI, 2014; LUTZ et al., 2019). Alguns destes efeitos permitem também que os fenólicos sejam aplicados em alimentos e tragam benefícios à estes produtos. Dentre eles, o efeito antioxidante dos fenólicos permite que eles sejam empregados em alimentos com intuito de evitar a oxidação de compostos, como os lipídios, aumentando a estabilidade dos produtos (CORY et al., 2018). Outra aplicação se refere ao efeito antimicrobiano destes compostos, os quais podem controlar o desenvolvimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes no alimento, aumentando a segurança e a vida de prateleira do produto (CHIBANE et al., 2019). Contrariamente, os fenólicos podem também aumentar a viabilidade e o crescimento de micro-organismos em alimentos, como as bactérias probióticas. Ainda pouco explorado, este efeito é principalmente atribuído à capacidade antioxidante dos fenólicos, a qual reduz os níveis de oxigênio no alimento e aumenta a viabilidade das bactérias (GYAWALI; IBRAHIM, 2012). Outra aplicação é o uso de compostos fenólicos como pigmentos naturais, cuja propriedade é popularmente conhecida nas antocianinas (KOSSEVA, 2009).
Em geral, os efeitos apresentados permitem a aplicação dos compostos fenólicos em alimentos como uma alternativa natural de substituição dos aditivos sintéticos. O uso de aditivos sintéticos vai contra às atuais tendências de mercado de alimentos saudáveis e funcionais. Além disso, estes aditivos demonstraram alguns problemas como a redução do valor nutricional dos alimentos e podem causar prejuízos à saúde do consumidor (GUTIÉRREZ-DEL-RÍO; FERNÁNDEZ; LOMBÓ, 2018). Os sulfitos, por exemplo, são comumente utilizados como conservantes e causam a degradação da vitamina B1 nos alimentos (GARCIA-FUENTES et al., 2015). O nitrato pode ser convertido em ácido nitroso, o qual está relacionado ao desenvolvimento de câncer no estômago (SHARMA, 2015). O antioxidante BHT, frequentemente utilizado na prevenção da oxidação de lipídios, pode apresentar efeito tóxico ao fígado (SHAHIDI; AMBIGAIPALAN, 2015). Neste contexto, os próximos itens exploram a aplicação dos compostos fenólicos na estabilidade de alimentos.
4.1 Efeito antimicrobiano de polifenóis
Apesar do desenvolvimento das tecnologias de processo de alimentos, a contaminação de alimentos ainda é um desafio na redução dos desperdícios desta indústria e na segurança do consumo de alimentos (LYU; LEE; CHEN, 2019). Estima-se que aproximadamente 600 milhões de pessoas tenham sido acometidas por doenças transmitidas por alimentos (DTA) no ano de 2010, ocasionando 230 mil mortes (WHO, 2015). No Brasil, os principais agentes causadores de DTA são: Salmonella ssp.,
Escherichia coli, Sthaphylococcus aureus, Bacillus cereus, Rotavírus e Norovírus
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016). Dentre os métodos utilizados no controle da contaminação de alimentos, os antimicrobianos naturais têm sido investigados no intuito de assegurar o consumo e substituir aditivos sintéticos (DAGLIA, 2012).
Os antimicrobianos naturais englobam diferentes classes de moléculas, dentre elas a de compostos fenólicos. As propriedades antimicrobianas de fenólicos variam quanto à estrutura da molécula, sua dosagem e o tipo de micro-organismo (CARDONA et al., 2013). O efeito antimicrobiano destes compostos está relacionado a múltiplos mecanismos de ação (Figura 3), o que pode inibir a seleção de micro-organismos resistentes (UPADHYAYA et al., 2014). Dentre os mecanismos envolvidos, os compostos fenólicos são capazes de interagir com as membranas bacterianas, modificando a sua função e permeabilidade, ou promover a sua ruptura. Outro mecanismo está associado à inibição de enzimas e funções intracelulares dos micro-organismos (CHIBANE et al., 2019). Além disso, a afinidade fenólica por metais e proteínas pode diminuir a disponibilidade de nutrientes e afetar populações bacterianas mais sensíveis, como as aeróbias que requerem ferro em seu metabolismo (JANECKI; KOLODZIEJ, 2010; KEMPERMAN et al., 2010). Ainda assim, os compostos fenólicos estão relacionados a inibição de outros fatores da patogenicidade de micro-organismos, como a comunicação bacteriana (quorum sensing inhibitiors), a adesão em células epiteliais do intestino e fatores de virulência (essenciais durante o processo de invasão celular) (BUSTOS et al., 2012; LI et al., 2014; BARBIERI et al., 2017).
Em geral, as bactérias Gram-negativas são mais resistentes aos fenólicos do que as Gram-positivas, cuja explicação pode ser a membrana lipopolissacarídica externa das negativas que prejudica a passagem destes compostos. Nas bactérias Gram-positivas, os fenólicos modificam o pH intracelular por afetarem o transporte de H+ e K+
No entanto, verifica-se que a estrutura química e os diferentes substituintes da molécula do composto fenólico possuem grande influência na afinidade destas moléculas com sítios de ligação nas bactérias. Como exemplo, os taninos parecem atuar nas membranas bacterianas e inativar enzimas do metabolismo celular (CHUNG; LU; CHOU, 1998). Os ácidos fenólicos demonstram comprometer a integridade das membranas (BORGES et al., 2013). Os flavonóides podem interagir com proteínas da membrana celular, inibir enzimas do metabolismo das bactérias e a síntese de DNA e RNA (CUSHNIE; LAMB, 2005; CHIBANE et al., 2019). As agliconas, em particular, demonstram maior efeito antimicrobiano por estas serem facilmente transportadas através da membrana celular (MANDALARI et al., 2007).
Figura 3. Diferentes mecanismos de ação da atividade antibacteriana dos polifenóis (Adaptado de CHIBANE et al., 2019).
A atividade antimicrobiana das flavanonas foi menos explorada, quando comparada à outras classes de flavonóides, como as antocianinas, flavonas e catequinas (DAGLIA, 2012). É relatado na literatura que o efeito antimicrobiano das flavanonas é principalmente observado nas agliconas naringenina e hesperetina (MANDALARI et al., 2007; PARKAR; STEVENSON; SKINNER, 2008). O grupo 4-carbonila do anel C3 das
flavanonas parece ser crucial na atividade inibitória destas moléculas (DUDA-CHODAK, 2012). A naringenina apresenta efeito antimicrobiano contra as bactérias Listeria
monocytogenes, S. aureus, E. coli O157:H7, S. enterica, Vibrio cholera e Pseudomonas
1.Membranas bacterianas: Modificam sua função, permeabilidade ou promovem sua ruptura
2. Inibição de enzimas intracelulares: Alterações no metabolismo e inibição da síntese de DNA/RNA E S X E P X 3. Diminui a disponibilidade de nutrientes:
Interação com metais e proteínas
4. Afeta o pH intracelular: São transportadores de cátions
monovalentes (aumentam H+
intracelular e transportam K+
para o meio extracelular)
K+
H+
H+
aeruginosa (UPADHYAYA et al., 2014). Estes compostos demonstraram diferentes
mecanismos de ação no desenvolvimento de bactérias, sendo antagonista na formação de biofilme, no quorum sensing e na expressão de fatores de virulência e motilidade (VIKRAM et al., 2010, 2011). A hesperitina por sua vez, é ativa contra as bactérias S.
aureus e Aeromonas hydrophylia, porém mais estudos necessitam ser realizados no
entendimento do mecanismo de ação deste composto (UPADHYAYA et al., 2014). Em geral, as flavanonas agliconas são encontradas em baixas concentrações em frutas cítricas. A síntese química e a hidrólise ácida são métodos que inviabilizam a obtenção destes compostos por serem onerosos e muito agressivos às matrizes de alimentos, respectivamente (TIMELL, 1964; MADEIRA; TEIXEIRA; MACEDO, 2013). Como alternativa, a biotransformação enzimática de substratos cítricos pode ser utilizada na deglicosilação das flavanonas, permitindo a obtenção de extratos com maior atividade antimicrobiana e uma aplicação mais efetiva em alimentos.
4.2 Efeito prebiótico de polifenóis
Em definição, os prebiótico são “substratos que são utilizados seletivamente por micro-organismos hospedeiros, conferindo um benefício à saúde” (GIBSON et al., 2017). Anteriormente, este conceito era limitado aos carboidratos não digeríveis, como a inulina, os fruto-oligossacarídeos (FOS) e galacto-oligossacarídeos (GOS). Novos candidatos à classe de prebióticos incluem o amido resistente, os grãos integrais, a pectina e outras fibras dietéticas (BINDELS et al., 2015). Porém, evidências demonstraram que outras classes de nutrientes podem apresentar efeito prebiótico. Dentre eles, os compostos fenólicos, os quais são resistentes ao processo de digestão e atuam na proliferação de bactérias benéficas do intestino (CARDONA et al., 2013; ANHÊ et al., 2015).
O efeito prebiótico de compostos fenólicos glicosilados está relacionado a capacidade de algumas bactérias em metabolizar estes compostos por meio da hidrólise da porção glicosídica, a qual é utilizada como substrato para obtenção de energia (HERVERT-HERNÁNDEZ et al., 2009; BRAUNE; BLAUT, 2016). Na microbiota intestinal, certas bactérias dos gêneros Blautia, Bifidobacterium e Lactobacillus promovem a deglicosilação das flavanonas (KIM; KIM; HAN, 2014; AMARETTI et al., 2015; THEILMANN et al., 2017). A degradação completa das flavanonas é raramente observada, sendo relatada pelas bactérias Eubacterium ramulus e Flavonifractor plautii, capazes de hidrolisar o anel C3 das flavanonas agliconas (SCHNEIDER; BLAUT, 2000;
SCHOEFER et al., 2003). Além de serem utilizadas como fonte de carbono, o efeito prebiótico das flavanonas também é devido ao efeito antioxidante destas moléculas que aumenta a viabilidade das bactérias (GYAWALI; IBRAHIM, 2012).
As principais bactérias benéficas do intestino pertencem aos gêneros
Bifidobacterium e Lactobacillus, sendo estes também os principais probióticos existentes
no mercado (BINDELS et al., 2015; BRAUNE; BLAUT, 2016). Em definição, os probióticos são “micro-organismos que quando administrados em doses adequadas oferecem benefícios à saúde do hospedeiro” (FAO; WHO, 2002). Dentre estes benefícios incluem equilíbrio da microbiota intestinal, inibição do desenvolvimento de patógenos, estímulo do sistema imunológico, aumento da biodisponilidade de nutrientes, e prevenção de câncer e inflamação intestinal (NAGPAL et al., 2012; CHEN et al., 2015; LENOIR et al., 2016; BAGAROLLI et al., 2017; JACOUTON et al., 2017). Em alimentos, os probióticos são comumente combinados a prebióticos visando aumentar a viabilidade das bactérias no produto (NAGPAL et al., 2012). Com este objetivo, extratos fenólicos podem ser adicionados em alimentos agregando ainda aspectos sensoriais e apelo funcional aos produtos. Os lácteos probióticos são os principais produtos em que se avaliou o efeito prebiótico dos compostos fenólicos. Em iogurte probiótico, a adição de extratos fenólicos de uva aumentou a viabilidade de L. acidophillus LA-5 durante a estocagem do produto (DOS SANTOS et al., 2017). Em leite fermentado, o extrato de uva favoreceu a etapa de acidificação do leite, diminuindo o processo de fermentação, e aumentou também a viabilidade do probiótico L. acidophillus ao longo da estocagem (DE AZEVEDO et al., 2018). Além do efeito prebiótico, a adição de extratos fenólicos de maçã em iogurte melhorou aspectos reológicos e sensoriais deste alimento (SUN-WATERHOUSE; ZHOU; WADHWA, 2012). Neste contexto, os extratos fenólicos de frutas, como de frutas cítricas, podem ser aplicados no desenvolvimento de outros produtos probióticos além do mercado de lácteos, agregando funcionalidade a estes produtos e inovação na área de alimentos.
4.3 Efeito antioxidante de polifenóis
Os óleos, gorduras e alimentos que possuem lipídios em sua composição tendem a sofrer reações de oxidação durante a produção e estocagem. A oxidação lipídica reduz a qualidade sensorial (cor, textura e off-flavours) e nutricional do alimento, podendo ser catalisada na presença de oxigênio, umidade, metais, luz e temperatura (GRAMZA;
KORCZAK, 2005). As estratégias utilizadas para retardar ou inibir as reações de oxidação no alimento incluem a aplicação de tecnologias de embalagem ou a adição de compostos antioxidantes. As tendências atuais de alimentos valorizam o emprego de antioxidantes naturais, como exemplo, os tocoferóis, óleos essenciais, e extratos ricos em polifenóis (SANTOS-SANCHEZ et al., 2017).
Os polifenóis atuam como doadores de hidrogênio aos radicais livres, estabilizando estas moléculas e interrompendo as reações em cadeia da oxidação lipídica. Em alimentos, extratos ricos em polifenóis demonstraram controlar a oxidação de carnes e derivados ao longo da estocagem destes produtos (JIANG; XIONG, 2016). Isto foi observado para extratos de chá verde, os quais controlaram a oxidação da carne quando adicionados na alimentação animal ou na própria carne (JO et al. 2003; TANG et al., 2002). Do mesmo modo, a adição de extratos de alecrim e rosa-mosqueta controlaram a oxidação de hambúrguer e salsicha, respectivamente (GANHÃO; MORCUENDE; ESTÉVEZ, 2010; JIANG et al., 2013). Além disso, os polifenóis podem atuar como antioxidantes em alimentos sendo adicionados em embalagens ativas ou filmes comestíveis (GANIARI; CHOULITOUDI; OREOPOULOU, 2017).
Comparados aos antioxidantes sintéticos, um dos desafios da aplicação dos polifenóis em alimentos é alto custo destes compostos (GRAMZA; KORCZAK, 2005). Neste sentido, os resíduos agroindustriais podem ser utilizados como matéria prima na obtenção destes agentes antioxidantes, reduzindo o custo de obtenção destes compostos naturais.
5. Biodisponibilidade de polifenóis e efeito na adesão de bactérias no intestino
Estima-se que na dieta da população ocidental seja ingerido em média 1 g de polifenóis por dia, por meio do consumo de frutas, legumes, cereais, chás, café e vinho (SELMA; ESPÍN; TOMÁS-BARBERÁN, 2009). Uma vez ingeridos, os fenólicos são pouco biodisponíveis por serem principalmente encontrados na sua forma conjugada (glicosilados, polimerizados ou ligados a grupamentos metil). Desta forma, aproximadamente 90-95% dos polifenóis ingeridos não são absorvidos, permanecendo no intestino grosso e interagindo com a microbiota residente. Esta, por sua vez, possui grande importância na absorção dos polifenóis, sendo responsável pela biotransformação destes compostos, tornando-os biodisponíveis (PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002; AURA, 2008; SÁNCHEZ-PATÁN et al., 2012; FIRRMAN et al., 2016).
A absorção das flavanonas glicosiladas no intestino depende do tipo de açúcar conjugado a estas moléculas. Os monoglicosídicos (ligadas a glicose, por exemplo) podem ser diretamente absorvidas por meio de transportadores de glicose, enquanto que os diglicosídicos (rutinoses e neohesperidoses) devem ser previamente hidrolisadas em agliconas pela microbiota intestinal e depois absorvidas por transporte passivo ou difusão facilitada (KHAN; ZILL-E-HUMA; DANGLES, 2014). No entanto, evidências demonstraram que a interação entre fenólicos e a microbiota intestinal vai além do auxílio na absorção destas moléculas. Os polifenóis podem, por sua vez, modular a composição de micro-organismos do intestino (SELMA; ESPÍN; TOMÁS-BARBERÁN, 2009; RASTMANESH, 2011; CARDONA et al., 2013). A Tabela 3 expõe alguns trabalhos recentes que sugerem os polifenóis e os seus metabólitos como contribuintes para a manutenção da saúde intestinal. A literatura indica que os substratos fenólicos fornecidos às bactérias do intestino podem causar variações na composição destas populações microbianas devido aos efeitos prebióticos e à atividade antimicrobiana destes compostos (CARDONA et al., 2013). Porém, outros mecanismos podem estar envolvidos na interação entre fenólicos e bactérias no intestino. Dentre eles, o efeito de compostos fenólicos na adesão e invasão de bactérias em células epiteliais, colonizando o intestino (SELMA; ESPÍN; TOMÁS-BARBERÁN, 2009; BUSTOS et al., 2012; SELMA et al., 2012; VOLSTATOVA et al., 2017).
Tabela 3. Efeito de compostos e extratos fenólicos em micro-organismos do intestino. Composto/extrato
fenólico Ensaio Efeito nos micro-organismos da microbiota intestinal Outros efeitos Referência
Ácido cafeico e
clorogênico, quercitina e rutina
Modelo de fermentação in
vitro • ↑ Bifidobacterium spp. • ↓ Firmicutes:Bacteroidetes • ↑ AGCC (PARKAR; TROWER; STEVENSON, 2013)
Ácido cafeico Estudo in vivo (colite) • ↑ Akkermansia spp. • ↓Firmicutes:Bacteroidetes • ↓ Inflamação intestinal (ZHANG et al., 2016)
Hesperitina Estudo in vivo • ↓ Clostridium spp. •↓α-amilase pancreática •↑ AGCC (UNNO; HISADA; TAKAHASHI, 2015)
Quercetina e
trans-resveratrol Estudo in vivo (obesidade e diabetes) • ↓ Firmicutes:Bacteroidetes •↓ Ganho de peso •↑ Sensibilidade à insulina (ETXEBERRIA et al., 2015) Extrato fenólico de semente de uva Modelo de fermentação in vitro • ↑ Bifidobacterium spp. • ↑Lactobacillus– Enterococcus • ↑ Bacteroides-Prevotella spp. • ↑ Clostridium-histolyticum
•↑ AGCC (ZHOU et al., 2016)
Polifenóis de vinho tinto Estudo in vivo com humanos • ↑ Bifidobactérias • ↓ Bactérias não-benéficas • ↓ PA, CT, e proteína C-reativa (QUEIPO-ORTUÑO et al., 2012) Extrato de “cranberry” Estudo in vivo (obesidade e diabetes) • ↑ Akkermansia spp. •↓ Ganho de peso e GV •↑ Sensibilidade à insulina
•↓ Inflamação intestinal
(ANHÊ et al., 2015)
Extrato de “blueberry” Modelo de fermentação in vitro e estudo in vivo • ↑ Bifidobacterium spp. • ↑ Lactobacillus spp. - (MOLAN et al., 2009)
Extrato de chá verde Estudo in vivo (obesidade com MIH) • ↓ Firmicutes:Bacteroidetes • Regulação da disbiose •↓ Riscos da obesidade (GUO et al., 2017) Extrato de cacau Estudo in vivo com humanos • ↑ Bifidobacterium spp. • ↑ Lactobacillus spp.
• ↓ Clostridium histolyticum
•↓ Triglicerídeos
•↓ Proteína C-reativa (TZOUNIS et al., 2010)
Extrato de Romã Modelo de fermentação in vitro • ↑ Bifidobacterium spp. • ↑ Lactobacillus spp. •↑ AGCC (BIALONSKA et al., 2010)
Extrato de açaí Modelo de fermentação in vitro • ↑ Bifidobacterium spp. • ↓ Bacteroides-Prevotella spp.
• ↓ Clostridium-histolyticum •↑ AGCC
(ALQURASHI et al., 2017)
5.1 Efeito de compostos fenólicos na adesão de bactérias no epitélio intestinal
O epitélio intestinal consiste em uma monocamada de células que atuam, simultaneamente, na absorção de nutrientes e na barreira contra patógenos e toxinas. A adesão de bactérias neste tecido é um fator importante para a colonização do intestino. O mecanismo do processo de adesão é complexo e coordenado por múltiplos fatores e sítios de adesão na superfície da bactéria e do epitélio intestinal. A dieta e os polifenóis da alimentação são fatores que afetam a adesão e, consequentemente, a colonização bacteriana no epitélio intestinal (PARKAR; STEVENSON; SKINNER, 2008; BUSTOS et al., 2012; SUN; WU, 2017).
No ambiente fisiológico, as bactérias, o epitélio e a camada de muco estão carregados negativamente. O processo de adesão ocorre por interações que superam a repulsão das cargas negativas. Primeiramente, a adesão ocorre por ligações não específicas e reversíveis, como as interações hidrofóbicas. Em seguida, são formadas ligações específicas e de maior afinidade, envolvendo proteínas e polissacarídeos (SIGNORETTO et al., 2012; KRACHLER; ORTH, 2013; SUN; WU, 2017; ASADI et al., 2019). Em particular, a adesão de bactérias patogênicas é comumente mediada por adesinas proteicas que se ligam à receptores específicos na célula hospedeira. Estas estruturas são classificadas em adesinas fimbriais e não-fimbriais, as quais normalmente reconhecem receptores de carboidrato e proteína, respectivamente (BOUGUÉNEC, 2005). As adesinas não-fimbriais incluem estruturas como flagelos e lipopolissacarídeos, os últimos responsáveis por ligações não específicas devido ao caráter anfipático destas moléculas (WAGNER; HENSEL, 2011).
Ao resistirem ao processo de digestão e atingirem o intestino, as bactérias patogênicas se aderem ao epitélio intestinal, ação que corresponde à primeira fase da infecção. A adesão do patógeno permite que proteínas efetoras sejam injetadas nas células, as quais provocam rearranjos no citoesqueleto celular e facilitam a invasão e modulação das funções biológicas das células (HARMIDY; TUFENKJI; GRUENHEID, 2011; KRACHLER; ORTH, 2013; BONDUE et al., 2016). Em resposta à adesão e invasão de patógenos, as células epiteliais iniciam um processo inflamatório no intestino com a liberação de citocinas, como a interleucina-8 (IL-8), essencial para o recrutamento de neutrófilos e macrófagos (SELMA et al., 2012). A detecção de patógenos pelas células epiteliais é mediada por receptores do tipo “toll-like receptors” (TLR) que detectam
