UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
GILENO VIEIRA LACERDA JÚNIOR
CARACTERIZAÇÃO DO MICROBIOMA DE SOLOS
SEMIÁRIDOS DA CAATINGA E SEU POTENCIAL PARA A
DEGRADAÇÃO DE LIGNOCELULOSE
CHARACTERIZATION OF THE MICROBIOME OF CAATINGA
SEMIARID SOILS AND ITS POTENTIAL FOR
LIGNOCELLULOSE DEGRADATION
CAMPINAS
2017
CARACTERIZAÇÃO DO MICROBIOMA DE SOLOS SEMIÁRIDOS DA
CAATINGA E SEU POTENCIAL PARA A DEGRADAÇÃO DE
LIGNOCELULOSE
CHARACTERIZATION OF THE MICROBIOME OF CAATINGA
SEMIARID SOILS AND ITS POTENTIAL FOR LIGNOCELLULOSE
DEGRADATION
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutor em Genética e Biologia Molecular na Área de Genética de Microorganismos.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology in the area of Genetics of Microorganims.
Orientador: Dra. VALÉRIA MAIA MERZEL
CAMPINAS
2017
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO GILENO VIEIRA LACERDA JÚNIOR E ORIENTADA PELA VALÉRIA MAIA MERZEL.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Valéria Maia Merzel (orientadora)
Profa. Dra. Anete Pereira de Souza
Prof. Dr. Renato Vicentini dos Santos
Prof. Dr. Fernando Dini Andreote
Prof. Dr. Rodrigo Mendes
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus queridos pais Gileno e Sueli, que sempre estiveram do meu lado apoiando nos
momentos difíceis e sendo exemplos de força e superação.
A minha irmã Vivian, pelo carinho e amor que transborda no seu sorriso e apoio incondicional
em todos os momentos.
.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em especial ao CPQBA, pela
oportunidade e infraestrutura disponibilizada para execução deste trabalho;
À minha orientadora, Profa Dra Valéria Maia Merzel, pelo apoio, dedicação, amizade
e confiança no transcorrer do doutorado, contribuindo para meu crescimento pessoal
e científico;
Aos membros da Banca Profa Dra Anete Pereira, Prof Dr Renato Vicentini,
Prof. Dr. Fernando Andreote e Prof. Dr. Rodrigo Mendes, pela disponibilidade e
valiosas correções e sugestões realizadas nesta Tese;
À querida Melline Fontes Noronha, pela grande parceria e colaboração fundamental
nas análises de bioinformártica, bem como pela amizade e companheirismo ao longo
desses anos.
Aos atuais técnicos: Viviane, Túlio, Milena; e aos que já se foram: Mariana, Ayume,
Éricka, Jaqueline e Rafael, que, com muita dedicação, gerenciam as atividades nos
laboratótios, mantendo um ótimo ambiente de trabalho, agradeço pelos
ensinamentos e amizade.
A todos os amigos da Divisão de Recursos Microbianos e do CBMEG/UNICAMP
pela parceria, companheirismo e agradáveis momentos de convivência e incentivo;
Enfim, muito obrigado a todos que colaboraram direta ou indiretamente
para execução deste trabalho.
que abriga uma exuberante e exclusiva diversidade biológica. Este ecossistema
consiste em uma floresta tropical seca adaptada a condições climáticas severas,
como elevadas temperaturas, alta acidez e irradiação solar, e déficit hídrico causado
pelo regime sazonal de chuvas. Portanto, é esperado abrigar uma microbiota
carreando arsenais enzimáticos únicos e versáteis com potencial aplicação
industrial. Micro-organismos residentes do solo são capazes de decompor a lignina
(segundo biopolímero mais abundante da biosfera) utilizando um conjunto de
enzimas ligninolíticas as quais também podem ser aplicadas na desintoxicação de
efluentes, na indústria de papel e de biocombustíveis, dentre outros processos. Visto
que aproximadamente 99% dos micro-organismos do solo ainda não podem ser
isolados por métodos de cultivo, tecnologias moleculares baseadas na análise do
material genético, como a "metagenômica", podem fornecer informações mais
precisas sobre a diversidade microbiana ainda não cultivada e o seu potencial
biotecnológico. Assim, este estudo propõe o uso de uma abordagem integrada de
metagenômica funcional (baseada na atividade biológica e similaridade de
sequências) e descritiva, com o objetivo de identificar novas enzimas
lignocelulolíticas, além de analisar o impacto da sazonalidade e práticas agrícolas
(irrigação/fertilização) na estrutura da comunidade e nas respostas funcionais da
microbiota de solos da Caatinga. A triagem funcional baseada na expressão
fenotípica de 40.000 clones metagenômicos não permitiu detectar atividade
ligninolítica. Entretanto, o rastreamento molecular via PCR possibilitou a
identificação de uma
“Multicopper oxidase" do tipo lacase, afiliada ao gênero
Mesorhizobium. Análises in silico a partir do sequenciamento em larga escala da
biblioteca metagenômica revelaram um vasto repertório enzimático relacionado à
degradação da biomassa lignocelulósica carreado por diferentes grupos bacterianos,
com potencial aplicação na produção de biocombustíveis a partir de fontes
renováveis, bem como em outros processos ambientais. Numa abordagem ecológica
foi verificado o enriquecimento dos filos Actinobacteria e Proteobacteria nos períodos
sazonais de seca e chuva, respectivamente. Os dados sugerem que
micro-organismos presentes em solos nativos do período seco são especializados na
utilização de monossacarídeos e dissacarídeos, bem como carboidratos com
funções osmoprotetoras, como a trealose. Por outro lado, o microbioma de solos
afetados pela agricultura foi influenciado, principalmente, por fatores químicos,
apresentando enriquecimento do filo Acidobacteria e de genes relacionados a
processos como nitrificação e desnitrificação, e ao estresse oxidativo. Estes
resultados sugerem que o input de nutrientes e a quebra dos ciclos naturais do
regime de água podem impactar os ciclos biogeoquímicos, afetando a
funcionalidade natural dos solos semiáridos da Caatinga.
Palavras-chave: Caatinga; Comunidade microbiana do solo; Metagenômica;
exuberant and exclusive biological diversity. This ecosystem consists of a dry tropical
forest adapted to severe climatic conditions, including high temperatures and solar
irradiation, soil acidity, and water deficit caused by the seasonal rainfall regime.
Therefore, it is expected to harbor a soil microbiota carrying unique and versatile
enzymatic arsenals with a potential biotechnological application. Resident soil
microorganisms are capable of decomposing lignin (second most abundant
biopolymer of the biosphere) using a set of ligninolytic enzymes which can also be
applied in the treatment of effluents, pulp and paper industry, biofuels productions,
among other industrial processes. Considering that about 99% of soil
microorganisms cannot be isolated by conventional culture methods, molecular
approaches based on the direct extraction of environmental genetic material, such as
"metagenomics", are needed to provide more precise information about the diversity
and biotechnological potential of the native microbial community. Thus, this study
uses an integrated approach of functional (based on biological activity and sequence
similarity) and descriptive metagenomics, with the aim of identifying new
lignocellulolytic enzymes, in addition to analyzing the impact of seasonality and
agricultural practices (irrigation/fertilization) in the community structure and functional
responses of the Caatinga soil microbiome. The functional screening based on the
phenotypic expression of 40,000 metagenomic clones did not show any ligninolytic
activity. However, the molecular screening by PCR allowed the identification of a
bacterial Laccase-like Multicopper oxidase, affiliated with the genus Mesorhizobium.
The large-scale sequencing of a soil metagenomic library and subsequent in silico
analysis revealed a large enzymatic repertoire related to the lignocellulosic
degradation carried by different bacterial groups with potential application in the
biofuels production as well as other environmental processes. In an ecological
approach, it was observed the enrichment of the phyla Actinobacteria and
Proteobacteria in the drought and rainy seasonal period, respectively. The data
suggest that microorganisms thriving on native soils of the dry period are specialized
in monosaccharides and disaccharides utilization, as well as osmoprotective sugars
such as trehalose. In contrast, the soil microbiome affected by land use was mainly
driven by chemical factors, with the enrichment of the Acidobacteria phylum and
genes related to nitrification and denitrification processes, and to oxidative stress.
These results suggest that the nutrients input and the breakdown of the natural
cycles of the water regime may impact the biogeochemical cycles, affecting the
natural functionality of the Caatinga semiarid soils.
Keywords: Caatinga; Soil microbial communities; Metagenomic; Bioprospection;
1. REVISÃO DA LITERATURA ...11
O bioma Caatinga ...11
1.1. O solo como fonte inestimável da diversidade microbiana ...11
1.2. A microbiota do solo da Caatinga ...13
1.3. Metagenômica e metatranscriptômica: acessando a biodiversidade microbiana 1.4. não cultivável ...15
Enzimas envolvidas na degradação da lignina e suas potenciais aplicações ...19
1.5. 2. APRESENTAÇÃO DA TESE ...23
CAPÍTULO 1 - Triagem de enzimas ligninolíticas a partir de uma biblioteca metagenômica do solo da Caatinga ...24
1. INTRODUÇÃO ...25
2. MATERIAL E MÉTODOS ...26
Réplica da biblioteca metagenômica...26
2.1. Extração do DNA fosmidial ...27
2.2. Screening de enzimas envolvidas na degradação de lignina ...27
2.3. Clonagem e expressão heteróloga do gene de interesse ...29
2.4. 2.4.1. Anotação, predição de ORF e desenho de primers específicos: ...29
2.4.2. Amplificação do gene alvo a partir do DNA fosmidial: ...30
2.4.3. Reação de ligação: ...31
2.4.4. Procedimento de Eletroporação: ...31
2.4.5. Procedimento de PCR de colônia para confirmar a clonagem: ...31
2.4.6. Testes de expressão em E. coli para indução da proteína recombinante: ...31
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...32
3.1. Ensaio funcional para prospecção de enzimas ligninolíticas ...32
3.2. Clones com fenótipos diferenciados ...33
3.3. Extração do pigmento e análise de espectrometria de massa (MALDI-TOF)...34
3.4. Extração de DNA fosmidial dos clones da biblioteca metagenômica...36
3.5. Triagem de genes via PCR e sequenciamento das bandas ...36
3.6. Sequenciamento do clone metagenômico, predição de ORFs e anotação ...40
3.7. Alinhamento da sequência de aminoácidos para predição da estrutura tridimensional e filogenia...41
3.8. Clonagem da ORF de interesse ...44
CAPÍTULO 3 - Potential of semiarid soil from caatinga biome as a novel source for mining lignocellulose-degrading enzymes ...70 3. DISCUSSÃO GERAL ...108 4. CONCLUSÃO GERAL ...112 5. PERSPECTIVAS FUTURAS ...113 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...114 7. ANEXOS ...121
1. REVISÃO DA LITERATURA
O bioma Caatinga
1.1.
O bioma da Caatinga está situado na região semiárida dos estados do
Nordeste do Brasil, estendendo-se até o Norte e Nordeste do estado de Minas
Gerais. Ocupa uma área de aproximadamente 850.000 km
2, cerca de 10% do
território nacional (MMA, 2010). Trata-se de um bioma exclusivamente brasileiro, o
que significa que grande parte do seu patrimônio biológico não pode ser encontrado
em outro lugar do planeta. A Caatinga é composta por uma floresta tropical sazonal
seca com vegetação arbustiva adaptada ao déficit hídrico, ocorrendo em áreas
altamente sazonais com baixos níveis de precipitação (500-750 mm por ano), que
são distribuídos irregularmente através do ano (3-5 meses), com temperaturas
anuais médias de 23-27 ºC. A irregularidade das chuvas, juntamente com as altas
temperaturas e radiação solar, provoca déficit hídrico durante uma grande parte do
ano, resultando em dois períodos bem definidos: o período chuvoso e o período de
seca severa (Moura e Ramos, 2004; Salgado et al., 2015). A seca torna a vida difícil
para os habitantes humanos e proporciona desafios adaptativos para a biota da
região. Apesar de sua grande extensão e características peculiares, poucos estudos
biológicos estão disponíveis, tornando a Caatinga o bioma brasileiro menos
conhecido cientificamente (Leal et al., 2005; Santos et al., 2011) e um dos mais
ameaçados pela ação antrópica, com apenas uma pequena parcela dos
remanescentes (<1%) protegidos por unidades de conservação (Leal et al., 2005;
Redo et al., 2012; Beuchle et al 2015). Estima-se que aproximadamente 45% da sua
vegetação original tenham sido desmatados até o ano de 2008 (MMA, 2010). Apesar
disso, o bioma apresenta valores de biodiversidade mais altos do que os registrados
para outras florestas secas do mundo (Rodal e Melo, 1999; Leal et al., 2005), sendo
que o número real de espécies está subestimado, uma vez que 41% da região
nunca foram investigados (Silva et al., 2004).
O solo como fonte inestimável da diversidade microbiana
1.2.
O solo é um ambiente desafiador do ponto de vista microbiológico, visto que é
considerado o maior reservatório natural da diversidade genética microbiana,
podendo armazenar bilhões de céluas microbianas englobando milhares de
espécies individuais (Fierer e Jackson, 2006). A complexidade da comunidade
microbiana do solo e sua funcionalidade é regulada pela interação de múltiplos
fatores bióticos e abióticos, como pH, teor de água, estrutura da matriz, variação
climática e atividade biótica (Singh et al., 2009). Neste ambiente, os
micro-organismos distribuem-se de forma heterogênea, ligando-se fortemente com as
partículas do solo e possuem papel fundamental na ciclagem de nutrientes (Kirk et
al., 2004; Rousk e Bengtson, 2014). Portanto, é de extrema importância investigar as
comunidades microbianas do solo para prever as futuras consequências das
mudanças globais e seus efeitos nos ciclos biogeoquímicos do planeta.
Historicamente, produtos de interesse biotecnológico têm sido descobertos a
partir da diversidade microbiana do solo com base em metodologias tradicionais de
isolamento e cultivo de espécies individuais (Davis et al., 2005; Vartoukian et al.,
2010). Produtos naturais derivados de metabólitos secundários de microrganismos
que habitam o solo têm sido usados nas áreas médica, industrial e agrícola, como os
antibióticos, drogas anticarcinogênicas, antifúngicas, agentes imunossupressores,
probióticos, enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas,
herbicidas, inseticidas, promotores de crescimento, dentre outros (Traxler e Kolter,
2015). Entretanto, estimativas indicam que aproximadamente 99% dos
micro-organismos presentes em ambientes ambientais não podem ser recuperados por
métodos convencionais de cultivo sendo, portanto, inacessíveis para prospecção
biotecnológica e/ou pesquisa básica (Amann et al., 1995; Schloss e Handelsman,
2003). Por esta razão, o acesso da diversidade
‘oculta’ dos micro-organismos no
solo é crucial, pois representa uma grande fonte de genes desconhecidos que
codificam novas enzimas e produtos naturais (Daniel, 2004; Daniel, 2005).
Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas (extração de ácidos
nucléicos, amplificação por PCR, clonagem e sequenciamento em larga escala de
DNA) têm sido amplamente utilizadas para superar as limitações impostas pelo
isolamento e cultivo microbiano, apesar da grande dificuldade ainda encontrada no
estudo das comunidades em seus nichos nativos, em parte por sua grande
diversidade, interações complexas, intercâmbio genético e falta de ferramentas de
análise apropriadas (Singh, 2010). A utilização destes métodos para avaliar
microbiomas de diferentes solos tem revelado um inestimável reservatório de
micro-organismos não cultivados e de vias biossintéticas desconhecidas e ainda não
exploradas, além de um profundo entendimento de como fatores bióticos e abióticos
moldam a composição da comunidade microbiana e sua funcionalidade no ambiente
(Singh et al., 2009; Reddy et al., 2012; Traxler e Kolter, 2015). Recentemente, essas
ferramentas foram utilizadas com sucesso na descoberta de novos biocatalisadores
enzimáticos e produtos naturais com diversas aplicações biotecnológicas, como na
área de biocombustíveis (Xing et al., 2012; Ausec, et al., 2017) e médica (Borsetto et
al., 2016; Katz et al., 2016), revelando o inexplorado potencial desses complexos
ecossistemas microbianos.
A microbiota do solo da Caatinga
1.3.
O conhecimento sobre certos tipos de habitats, como a Caatinga, é quase
nulo, ficando limitado ao estudo da fauna e flora. A diversidade microbiana nativa do
solo da Caatinga e o seu potencial biotecnológico ainda são pouco explorados. Essa
região representa um grande potencial para prospecção biotecnológica, pois a
microbiota adaptada a esse ambiente significativamente heterogêneo e exposto a
condições extremas, incluindo acidez, altas temperaturas, radiação solar, acidez e
baixa disponibilidade de água, foi selecionada ao longo da evolução para lidar com
os estresses ambientais e, portanto, pode apresentar uma maquinaria enzimática
com grande aplicação industrial (Antranikian et al., 2005). Estas enzimas são
produzidas por micro-organismos que podem viver e se reproduzir em ambientes
com condições severas, isolados de outros habitats em nosso planeta por milhares
de anos devido à sua natureza peculiar (Tehei e Zaccai, 2005). Isto resulta na
seleção de organismos incomuns, e provavelmente, também impede a sua
dispersão. Portanto, espera-se nesses ambientes uma comunidade microbiana
desconhecida com potencial genético para descoberta de novos processos
biocatalíticos (Antranikian et al., 2005; Ferrer et al., 2007; Sulzbacher et al., 2012).
Devido às características biológicas e morfoclimáticas únicas, a microbiota
residente do solo semiárido do bioma da Caatinga tem sido mais intensamente
investigada na última década. Gorlach-lira e Coutinho (2007) avaliaram a produção
de enzimas extracelulares por micro-organismos termofílicos e mesofílicos isolados
desta região. A maioria dos isolados mesofílicos produziu amilases e proteases, e
38% dos isolados produziram todas as enzimas extracelulares estudadas: amilases,
celulases, proteases e quitinases. Em contrapartida, todos os isolados termofílicos
apresentaram atividade proteolítica e 77% produziram amilases, mas nenhum
representante produziu quitinases ou celulases. Mais recentemente, Soares e
colaboradores (2012) isolaram bactérias celulolíticas de dois ambientes com
condições climáticas severas (Antártica e semiárido da Caatinga), concluindo que
ambientes que apresentam maior variação de temperatura, como a Caatinga,
possuem uma comunidade microbiana com maior plasticidade no arsenal de
endoglucanases (ativas a 4°C e 60°C) do que solos de ambientes com temperaturas
constantes, como da Antártica. Apesar de inovadores, estes estudos ficaram
limitados apenas ao potencial da parcela cultivada da microbiota. O uso de
metodologias moleculares independentes de cultivo pode fornecer informações mais
detalhadas e precisas sobre a diversidade e potencial biotecnológico de bactérias
que vivem no solo da Caatinga no Nordeste brasileiro.
Por meio da técnica de T-RFLP e sequenciamento do gene RNAr 16S,
Kavamura (2012) demonstrou que a estrutura de comunidades bacterianas do solo
da Caatinga apresentou uma variação sazonal (período chuvoso e de seca),
levantando a hipótese de que a disponibilidade de água nesse ambiente delineia os
padrões de diversidade da comunidade. No entanto, apesar de caracterizar a
diversidade microbiana, estas abordagens não permitem ter acesso ao potencial
metabólico que possibilita aos micro-organismos se adaptarem as essas alterações
ambientais, bem como os efeitos nos ciclos biogeoquímicos neste ecossistema.
Recentemente, análises metagenômicas revelaram características funcionais chaves
da comunidade microbioma de um solo da Caatinga que permitem sobreviver em
condições estressantes, com enriquecimento de genes relacionados à resistência ao
estresse e reparo de DNA quando comprado com a microbiota de solos da Floresta
Atlântica (Pacchioni et al., 2014). Também foi demonstrado, pela primeira vez, um
grande potencial genético de uma biblioteca metagenômica do solo da Caatinga
para produzir o arsenal de enzimas relacionadas com a degradação da biomassa
vegetal, com perspectivas de aplicação na indústria de biocombustíveis (Lacerda
Junior et al., 2017).
Metagenômica e metatranscriptômica: acessando a biodiversidade
1.4.
microbiana não cultivável
Embora as técnicas de isolamento e cultivo de micro-organismos tenham sido
aprimoradas nos últimos anos, o entendimento sobre a ecologia microbiana ainda é
insuficiente para recuperar e cultivar a maioria deles (Amann et al., 1995; Schloss e
Handelsman, 2003), principalmente aqueles que sobrevivem em condições
ambientais extremas (LEWIN et al., 2013). Por microscopia de fluorescência
utilizando o
DAPI (4’,6-diamino-2-fenilindol), um marcador fluorescente que se liga
ao DNA, a contagem direta de micro-organismos em uma amostra de solo foi
estimada em aproximadamente 10
10por grama de solo. Entretanto, após o emprego
de técnicas de enriquecimento e cultivo deste solo foram recuperadas apenas 10
6UFC (Unidades Formadoras de Colônias) de bacérias, ou seja, apenas 0,01% dos
representantes da diversidade bacteriana deste solo (Torsvik et al., 2002). Tal
dificuldade consiste em reproduzir fielmente as condições ambientais às quais os
micro-organismos estão adaptados, dificuldade que é acentuada com amostras de
ambientes com características peculiares, como a Caatinga brasileira (Lewin et al
2013; Tanner et al., 2017).
Handelsman e colaboradores (1998) definiram pela primeira vez o termo
“metagenômica” para descrever a aplicação de técnicas genômicas modernas para o
estudo de comunidades microbianas diretamente do ambiente natural, sem a
necessidade de isolamento e cultivo de espécies individuais. O termo é derivado do
conceito estatístico de meta-análise (processo de combinar estatisticamente análises
separadas) e genômica (análise ampla do material genético total de um organismo)
(Schloss e Handelsman, 2003). Esta abordagem envolve a extração do material
genético de todos os organismos presentes numa amostra ambiental, com
subsequente sequenciamento em larga escala (Whole Metagenome Sequencing,
Tringe e Rubin, 2005) com a finalidade de entendimento da estrutura, composição e
funções microbianas, ou seja, um enfoque ecológico; ou a laboriosa clonagem de
grandes fragmentos de DNA (40 a 100 kb) em vetores do tipo BAC (Bacterial
Artificial Chromosome), fosmídeos ou cosmídeos e rastreamento das bibliotecas de
clones em busca de uma nova expressão fenotípica numa linhagem hospedeira
(Figura 1) (Handelsman et al., 1998; Lewin et al., 2013).
Figura 1 | Esquema da metodologia geral de estudo metagenômico, ilustrando as diferentes
abordagens possiveis. Fonte: Lewin et al. (2013).
Uma vez que o DNA ambiental está imobilizado nas bibliotecas
metagenômicas, estas são analisadas com o objetivo de compreender a fisiologia
dessas diferentes formas de vida, buscar novos compostos com atividade biológica
e, até mesmo, criar condições para interferir nos processos biológicos. A triagem das
bibliotecas metagenômicas na busca de produtos de interesse pode ser realizada
por duas abordagens complementares: através da mineração da informação
genética por sequenciamento e PCR (Polymerase Chain Reaction), ou pela
expressão da atividade biológica pelos clones (Lorenz et al., 2002; Lewin et al.,
2013). Na primeira, a busca por uma função biológica ou uma proteína em particular
é feita por similaridade com sequências disponíveis em bancos de dados públicos
através de ferramentas de bioinformática. A segunda, denominada como triagem
funcional de clones, consiste de ensaios biológicos nos quais os clones são testados
para uma determinada característica de interesse, como reações catalisadas por
enzimas, ou propriedades atribuídas a metabólitos como antibióticos e agentes
antitumorais. Esta última estratégia oferece a vantagem de poder acessar
sequências gênicas ainda totalmente desconhecidas e de detectar apenas enzimas
que estão ativas, enquanto a primeira depende da existência de dados de
sequências homólogas, sendo normalmente insuficiente para identificar novas
enzimas que têm a mesma função, mas uma estrutura diferente do que já é
conhecido (Ferrer et al., 2005). A partir da varredura de bibliotecas metagenômicas,
uma variedade maior de compostos bioativos de interesse pode ser encontrada
quando comparado ao método tradicional baseado em isolamento, cultivo e triagem
de linhagens puras de micro-organismos (Lorenz et al. 2002) (Figura 2). A utilização
de ambas as abordagens, rastreamento funcional e/ou in silico de bibliotecas
metagenômicas, tem resultado na identificação de novos biocatalisadores
enzimáticos e moléculas em um ritmo crescente com diversas aplicações industriais,
como na área de biocombustíveis (Xing et al., 2012), alimentícia e de detergentes
(Lorenz e Eck, 2005), bem como novos antibióticos (Gillespie et al., 2002; Traxler e
Kolter, 2015), pigmentos (Handelsman, 2007) e substâncias antitumorais (Chang e
Brady, 2011).
A metagenômica tem sido aplicada para compreender a estrutura (riqueza e
distribuição de espécies) e potencial metabólico de comunidades microbianas
ambientais. Contudo, análises baseadas no DNA não refletem a real atividade
metabólica do ambiente, pois não permitem diferenciar genes expressos e não
expressos de uma comunidade microbiana em determinado momento, assim, o
papel funcional de genes ou organismos no ambiente continua incerto. Como
alternativa para este problema, estudos de metatranscriptômica baseiam-se no
isolamento e sequenciamento em larga escala do RNAm (RNA mensageiro) de um
ecossistema microbiano para avaliar quais genes estão sendo expressos naquela
comunidade (Warnecke & Hess, 2009).
Figura 2 | Comparação das estratégias de cultivo (esquerda) e de metagenômica (direita) para
obtenção de novos biocatalisadores. Utilizando a abordagem de cultivo, apenas uma fração da diversidade microbiana podem ser isolada e cultivada em cultura pura para obtenção de compostos de interesse. Através da Metagenômica, o material genético isolado do ambiente é clonado em hospedeiros para subsequente triagem e expressão de enzimas de interesse oriundas de diferentes micro-organismos. (Fonte: Lorenz et al. 2002).
Esta abordagem permite vincular o potencial genético com a atividade
biogeoquímica de micro-organismos nos ambientes, além de contribuir para elucidar
quais bióticos e/ou abióticos são capazes de desencadear as respostas funcionais
em uma determinada comunidade microbiana. Sendo assim, uma análise integrada
de metagenômica e de metatranscriptômica fornece uma visão mais abrangente da
estrutura e funcionalidade de uma comunidade microbiana (Shi et al., 2011).
A aplicação dessa abordagem para estudos de comunidades microbianas
envolve as seguintes etapas experimentais: 1) Extração de RNA total de uma
amostra ambiental: esse produto final pode conter RNAm, RNAt, RNAr e outros
pequenos RNAs; 2) Enriquecimento do RNAm: nessa etapa ocorre a remoção de
RNAr, RNAt e outros pequenos RNAs. Pode ser realizada por métodos físicos e/ou
químicos, sendo que no primeiro caso é realizado pelo tamanho do fragmento, e no
segundo, por digestão sítio-específica, poliadenilação preferencial de RNAm ou
hibridização magnética; 3) Síntese de cDNA: pode ser realizada por poliadenilação
das caldas 3’e 5’, posteriormente amplificação utilizando-se iniciadores poli-T, ou por
iniciadores randômicos, sendo estes últimos mais indicados para células
procarióticas. Os adaptadores são ligados às extremidades dos fragmentos após a
síntese de cDNA; 4) Sequenciamento “high-throughput”: nessa etapa são utilizadas
as plataformas comerciais disponíveis para produzir um grande volume de dados
biológicos que serão analisados por ferramentas de bioinformática (Warnecke e
Hess, 2009). Recentemente, a análise de um grande volume de dados de
metatranscriptômica têm revolucionado o entendimento da ecologia microbiana e o
papel de micro-organismos tanto em amostras clínicas como ambientais, como por
exemplo, de água oceânica (Shi Y et al., 2011), solos (Urich et al., 2008; Tveit et al.,
2014), lodo de esgoto (Yu e Zhang, 2012) e intestino humano (Gosalbese et al.,
2011; Franzosa et al., 2014).
Enzimas envolvidas na degradação da lignina e suas potenciais
1.5.
aplicações
A lignina é um heteropolímero aromático de ocorrência natural, altamente
recalcitrante, que compreende um componente importante das paredes celulares de
todas as plantas vasculares. É o segundo biopolímero mais abundante na biosfera,
sendo superado apenas pela celulose, desempenhando um papel central no ciclo do
carbono na natureza (Ruiz-Dueñas e Martínez, 2009). A sua estrutura heterogênea
composta por unidades de p-hidroxifenilpropanóides unidas por ligações carbono–
carbono (C–C) e éter (C–O–C) confere às plantas uma maior rigidez estrutural, além
de proteger a celulose e hemicelulose da digestão enzimática por micro-organismos
(Jeffries, 1990; Martínez et al., 2005).
A degradação microbiana da lignina tem sido bastante estudada em fungos
que causam a podridão branca e a podridão marrom, sendo a maioria deles
pertencente à subdivisão Basidiomicetos (Sanchez, 2009). Entre as enzimas-chaves
responsáveis pelo processo de oxidação de compostos fenólicos e não fenólicos da
lignina estão as lignina-peroxidases (LiP), as manganês-peroxidases (MnP) e as
lacases, todas genericamente chamadas de ligninases (Martínez et al., 2005;
Sanchez, 2009). O processo enzimático de degradação da lignina exercido por
bactérias ainda é pouco conhecido e explorado, no entanto uma série de relatos na
literatura indica que a lignina também é degradada por sistemas enzimáticos
bacterianos bastante similares aos dos fungos (Bugg et al., 2011a; Bugg et al.,
2011b; Ausec et al., 2011). Trabalhos publicados recentemente demonstram que
uma gama de bactérias do solo, frequentemente bactérias que degradam compostos
aromáticos, é capaz de decompor a lignina. Esta observação fornece uma ligação
entre a degradação de compostos aromáticos e a degradação da lignina, o que é
esperado, dado que é a maior fonte de aromáticos presentes no solo (Bugg et al.,
2011a,b). Dessa forma, o material ligninocelulósico derivado da biomassa vegetal
renovável constitui uma fonte valiosa e sustentável de energia alternativa ao
combustível fóssil. A hidrólise combinada e a oxidação dos principais polímeros
derivados da parede celular da planta (celulose, hemicelulose e lignina) é um passo
crítico básico no ciclo global do carbono em ecossistemas terrestres e de valor
crescente para aplicações industriais “eco-friendly”. O interesse na utilização de
enzimas ligninolíticas tem crescido devido à grande versatilidade destas enzimas em
oxidar tanto compostos fenólicos e não fenólicos presentes na biomassa de plantas,
como também poluentes ambientais altamente recalcitrantes, tornando-as
extremamente úteis para utilização em vários processos biotecnológicos
sustentáveis (Canas e Camarero, 2010). Tais aplicações incluem a desintoxicação
de efluentes industriais contendo compostos xenobióticos e corantes têxteis (Mester
e Tien, 2000), na indústria de papel e celulose através da deslignificação seletiva e
branqueamento da celulose, na conversão da massa lignocelulósica em
biocombustíveis como o bioetanol (Burton e Fincher, 2014) e na degradação de
herbicidas utilizados na agricultura (Pizzul et al., 2009) (Figura 3).
Figura 3 | Ilustração da aplicação das enzimas ligninolíticas em diversos processos biotecnológicos
sustentáveis, incluindo a desintoxicação de efluentes industriais contendo compostos xenobióticos e corantes têxteis, no branquemanto do papel através da deslignificação seletiva, na conversão da biomassa lignocelulósica em biocombustíveis como o bioetanol e na degradação de herbicidas utilizados na agricultura.
Do ponto de vista microbiológico, o processo de mineralização da
lignocelulose é realizado por um sinérgico sistema enzimático carreado por um
complexo de múltiplas espécies microbianas. A aplicação de técnicas “ômicas” tem
possibilitado a prospecção de novas enzimas de conversão da biomassa a partir de
comunidades microbianas de habitats com altas taxas de material recalcitrante
derivado de plantas (Xing et al., 2012). O uso de métodos independentes de cultivo
ENZIMAS ligninolíticas Indústria Têxtil Desintoxicação de efluentes industriais Degradação de herbicidas e pesticidas Indústria de papel e celulose Produção de biocombustível
aliados ao sequenciamento em larga escala de DNA e RNA ambiental têm revelado
a diversidade e o potencial da microbiota não cultivada de diversos ambientes, como
o trato digestivo de animais herbívoros (Raychoudhury et al., 2013) solos (Cardenas
et al., 2015; Lacerda Junior et al., 2016), compostagem (Wang et al., 2016) e
fermentadores industriais (Güllert et al., 2016), bem como o papel desses micróbios
na degradação da biomassa lignocelulósica. Esses estudos revelaram uma enorme
quantidade de informações relacionadas aos mecanismos de degradação da lignina
adotados por vários micro-organismos. Verificou-se que linhagens do filo
Actinobacteria e Proteobacteria despolimerizavam uma ampla gama de compostos
relacionados com lignina através de da expressão de enzimas relacionadas às vias
de degradação de compostos aromáticos, como lacases, monoxigenases,
catecol-2,3-dioxigenase, DyP-peroxidases, B-esterases, O-demetilase de vanilato, feruloil
esterases, citocromo P450 e cloroperoxidase.
Nesse contexto, devido à grande volume de matéria orgânica vegetal
derivada das folhas que caem durante o período de seca, microrganismos residentes
do solo semiárido da Caatinga envolvidos na ciclagem desse material podem
fornecer um recurso genético único e especializado para a descoberta de novas
enzimas lignocelulolíticas termoestáveis.
2. APRESENTAÇÃO DA TESE
Este trabalho empregou abordagens independentes de cultivo para analisar o
microbioma do solo semiárido da Caatinga, um bioma exclusivamente brasileiro,
utilizando um enfoque tanto biotecnológico quanto ecológico. Na primeira
abordagem, utilizamos diferentes estratégias da metagenômica funcional para o
rastreamento de genes/enzimas relacionadas à degradação do material
lignocelulósico, em uma biblioteca metagenômica de DNA de alto peso molecular
construída a partir de amostras de solos da Caatinga do período chuvoso. No
Capítulo 1 serão apresentados os resultados da triagem funcional dos clones
metagenômicos via ensaios biológicos usando corantes poliméricos semelhantes à
lignina utilizados como substratos das reações enzimáticas indicadores para
atividade ligninolítica. Ainda nesse capítulo, serão apresentados os resultados de
triagem molecular baseada na similaridade de sequência através do isolamento do
DNA fosmidial a partir de pools de clones e o uso de primers degenerados para
rastrear via PCR os clones carreando genes de interesse. No capítulo 2 serão
apresentados os dados da composição filogenética e potencial genético da
biblioteca metagenômica para produção de enzimas lignocelulolíticas, os quais
foram publicados na revista FEMS Microbiology Ecology. Análises de bioinformática
utilizando bancos de dados específicos foram usadas para explorar o largo repertório
de micro-organismos e genes putativos que podem atuar na degradação de
polissacarídeos derivados de plantas e da lignina no microbioma do solo da
Caatinga. O capítulo 3 envolve o sequenciamento direto de DNA ambiental para
avaliar a composição da comunidade e o papel funcional de micro-organismos que
habitam solos semiáridos do bioma de Caatinga submetidos à sazonalidade e ação
antrópica, contribuindo com informações sobre a resistência ao estresse ambiental e
cliclagem de nutrientes, com possíveis impactos nos ciclos biogeoquímicos. Por fim,
as principais conclusões obtidas do trabalho serão apresentadas de maneira
integrada no item Conclusões Gerais e as próximas etapas que serão realizadas a
fim de obter resultados conclusivos de experimentos ainda em andamento serão
pontuadas em Perspectivas Futuras.
CAPÍTULO 1
___________________________________________________________________
TRIAGEM DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA
METAGENÔMICA DO SOLO DA CAATINGA
1. INTRODUÇÃO
O bioma Caatinga é pouco estudado e representa uma das regiões semiáridas mais
populosas e biologicamente diversas do mundo, com altos níveis de endemismo
(Leal et al., 2005; Santos et al., 2011). Situado na região semiárida dos estados do
nordeste do Brasil, cobre uma área de aproximadamente de 900.000 km
2, cerca de
10% do território nacional (MMA, 2010). A biodiversidade deste ecossistema
continua subestimada e desprotegida, além disso, o uso inadequado da terra já
causou sérios danos ambientais e desertificação acelerada (Leal et al., 2005).
A vegetação da Caatinga consiste em floresta tropical sazonal seca composta
principalmente por mosaicos de árvores e arbustos espinhosos com características
de sobrevivência xerofítica (savana-estépica), como longos espinhos para reduzir a
perda de água e tecidos suculentos para armazenamento de água (da Costa et al.,
2007). A irregularidade das chuvas, juntamente com a alta temperatura e radiação
solar, provoca um déficit hídrico durante uma grande parte do ano, resultando em
dois períodos bem definidos: chuvoso e seca (Moura e Ramos, 2004; Salgado et al.,
2015). Durante a estação seca algumas plantas perdem completamente as folhas,
formando uma densa camada de serapilheira constituída por polímeros derivados da
parede celular da planta (celulose, hemicelulose e lignina), representando a maior
fonte de matéria orgânica nos solos deste bioma (Salgado et al., 2015). A lignina,
segundo constituinte mais abundante da parede celular das plantas vasculares,
protege a celulose em relação ao ataque hidrolítico por micro-organismos saprófitos
(Ruiz-Dueñas e Martínez, 2009). Desse modo, a sua remoção representa um passo
fundamental para a reciclagem de carbono nos ecossistemas terrestres, bem como
um problema central para a utilização industrial da biomassa vegetal. A biotecnologia
baseada em micro-organismos degradadores de lignina e suas enzimas pode
contribuir para uma utilização mais eficiente e ambientalmente correta de
matérias-primas lignocelulósicas renováveis para produção sustentável de materiais, produtos
químicos, biocombustíveis e energia (Abdel-Hamid etal., 2013; Burton e Fincher,
2014). Entretanto, devido à natureza química recalcitrante da lignina, um complexo
processo enzimático é necessário para despolimerização da parede celular de
plantas através da interação sinérgica de múltiplas espécies microbianas (de
Gonzalo et al., 2016). Embora tenha sido acumulado uma grande quantidade de
conhecimento bioquímico sobre a degradação da lignina, principalmente por fungos
da podridão branca (Martínez et al., 2005), evidências revelam que as bactérias
também são capazes de deslignificação. Trabalhos publicados recentemente
demonstram que uma gama de bactérias do solo, frequentemente bactérias que
degradam compostos aromáticos, é capaz de decompor a lignina. Esta observação
fornece uma possível ligação entre a degradação de compostos aromáticos e a
decomposição da lignina, o que é esperado, dado que a lignina é a maior fonte de
aromáticos presentes no solo (Bugg et al., 2011a,b; de Gonzalo et al., 2016).
Devido ao grande volume de matéria orgânica vegetal derivada das folhas que
caem durante o período de seca e as condições ambientais poli-extremas, a
microbiota residente do solo semiárido da Caatinga envolvida na ciclagem dessa
biomassa pode fornecer um recurso genético único e especializado para a
descoberta de novas enzimas ligninolíticas termoestáveis. Dessa forma, esse
trabalho teve como objetivo a triagem funcional de uma biblioteca metagenômica
construída a partir de amostras do solo da Caatinga coletado durante estação
chuvosa, a qual concentra um maior depósito de biomassa vegetal oriunda da
abscisão foliar, na busca por novas enzimas relacionadas à degradação da lignina.
A abordagem funcional envolveu ensaios biológicos usando corantes poliméricos
semelhantes à lignina foram utilizados como substratos das reações enzimáticas
para detecção da atividade ligninolítica. Em paralelo, a abordagem molecular se
baseou no uso de primers degenerados para rastrear via PCR os clones carreando
genes de lacases do tipo multicobre oxidases (LMCOs), um grupo de enzimas
capazes de oxidar uma ampla gama de substratos fenólicos derivados da lignina, e
com diversas aplicações biotecnológicas, como na despolimerização da biomassa
lignocelulósica para produção de biocombustível, na indústria de papel, no
tratamento de águas residuárias e degradação de herbicidas (Abdel-Hamid e
Solbiati, 2013; Chandra e Chowdhary, 2015).
2. MATERIAL E MÉTODOS
Réplica da biblioteca metagenômica
2.1.
Para início das atividades foi necessário fazer uma réplica de uma biblioteca
metagenômica do solo da Caatinga (referente à época chuvosa) contendo 40.000
clones, previamente construída pelo grupo de pesquisa do Dr. Itamar Soares de
Melo em parceria com a Dra. Valéria Maia Merzel do CPQBA/UNICAMP
(supervisora desse projeto). Esta foi utilizada com sucesso na busca por celulases
termoestáveis pela estudante de doutorado Mirian Lobo Saber (Saber, 2012). Os
clones da biblioteca metagenômica foram icolulados em placas de 96 poços
contendo 150 µL
de meio Luria Bertani suplementado com 12,5 μg/mL de
cloranfenicol, e incubadas por 16-18h a 37 ºC. Posteriormente, foi adicionado glicerol
(concentração final de 10%) às culturas, e as placas forama armazenadas em
ultrafreezer a – 80 ºC.
Extração do DNA fosmidial
2.2.
Para extração fosmidial, todos os clones da biblioteca metagenômica foram
cultivados em placas de 96 poços (deep well) contendo 1,0 mL de meio Luria Bertani
líquido suplementado com 12,5 μg/mL de cloranfenicol + 0.01% de L-arabinose
(indutor do
número de cópias do vetor fosmídeo). Posteriormente, 500 μL de cada
poço (96 poços) da placa foram recolhidos em tubos de 50 mL (o volume de uma
placa de 96 poços ocupa um tubo de 50 mL). Os clones foram combinados em 40
pools (agrupando 1.000 clones por pool) os quais foram submetidos à extração do
DNA fosmidial utilizando o kit Qiagen Large-Construct Kit (Qiagen, Cat: 12462), de
acordo com as instruções do fabricante. O DNA fosmidial purificado de todos os
pools foi utilizado como molde nas reações de PCR para detecção de genes de
interesse.
Screening de enzimas envolvidas na degradação de lignina
2.3.
A triagem da biblioteca metagenômica foi realizada utilizando as abordagens
baseadas em atividade biológica (fenótipo) e em similaridade de sequência. Os
ensaios foram realizados na busca por um coquetel de enzimas chaves envolvido no
processo de degradação da lignina, a saber: lacases (EC 1.10.3.2), lignina
peroxidases (LiP, EC 1.11.1.14) e Manganês peroxidases (MnP, EC 1.11.1.13),
embora seja possível encontrar outros tipos de enzimas, visto que novas vias
ligninolíticas de degradação têm sido descobertas em bactérias atuando na lignina e
seus subprodutos (de Gonzalo et al., (2016).
a. Triagem funcional dos clones
A atividade ligninolítica dos clones foi avaliada através da descoloração de
corantes poliméricos utilizados como substratos das reações enzimáticas. Para isto
foram utilizados o corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR), um importante grupo de
organopoluentes industriais, e o guaiacol. A oxidação destes compostos é resultado
da ação de sistemas enzimáticos que participam do processo de despolimerização
da lignina, como por exemplo, lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacases
(peterncentes à família das multicobre oxidases). Os clones foram inoculados em
placas de Petri contendo meio LA suplementado com 12,5 μg/mL de cloranfenicol +
0,01% de L-arabinose + 0.05% RBBR (Sigma) e/ou guaicol, e incubados a 37 ºC por
cinco dias. A detecção dos clones positivos se deu com base na descoloração do
Remazol Brilliant Blue R (RBBR), conforme Borokhov e Rothenburger (2000) ou na
produção de coloração marrom derivada da oxidação do guaiacol.
b. Triagem baseada em similaridade de sequencia (PCR com primers
degenerados)
Foram realizadas buscas de primers degenerados na literatura para posterior
detecção via PCR de clones carreando genes de multicobre oxidases do tipo lacase
(Tabela 1). Estes primers foram utilizados com sucesso para avaliar a diversidade e
distribuição de genes bacterianos de solos, detectando uma grande variedade
taxonômica (Kellner et al., 2008; Ausec et al., 2011). Essa abordagem foi utilizada
como uma forma alternativa de detecção dos genes de interesse na biblioteca.
Tabela 1. Primers degenerados utilizados para amplificação de genes que codificam lacases.
Primer Aplicação Sequência (5’- 3’) Referência
Cu1AF
Bacterial laccase-like genes diversity in soils samples
ACMWCB GTYCAYTGGCAYGG (Kellner et al., 2008)
Cu2R
Bacterial laccase-like genes diversity in soils samples
GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC (Kellner et al., 2008)
Cu4R
Diversity of bacterial genes for laccase-like enzymes
O DNA fosmidial extraído dos pools de clones (seção 2.2) foi utilizado como
molde para triagem por PCR utilizando os primers degenerados. O fragmento
metagenômico do clone carreando genes de interesse foi sequenciado para
posterior identificação da região codificadora completa, já que estes primers
contemplam apenas a amplificação de domínios conservados de ligação ao cobre.
Clonagem e expressão heteróloga do gene de interesse
2.4.
Clones metagenômicos carreando genes de interesse detectados via PCR
foram submetidos à extração do DNA fosmidial, sequenciamento, montagem dos
contigs. Para anotação funcional foi utilizada a base de dados de servidores do
RAST (http://rast.nmpdr.org/). A ORF completa do gene foi amplificada usando
primers desenhados com sítios de enzimas de restrição, de forma que mantivesse o
quadro de leitura correto e a adição da cauda de Histidina (6x) na região n-terminal
da proteína. Posteriormente, os amplicons foram inserido no vetor pET28a
(Novagen) para posterior transformação em células de E. coli BL21 e E. coli Rosetta,
de acordo com técnicas padrão (Sambrook et al., 1989).
2.4.1. Anotação, predição de ORF e desenho de primers específicos:
Após anotação do gene de ligninase pelo RAST a partir do DNA fosmidial, a
identificação da ORF foi confirmada utilizando a ferramenta Open Reading Frame
Finder do NCBI. Para definir a região para clonagem foi necessário a análise de
peptídeo sinal, para isso a sequência foi submetida ao programa online SignalP 4.1
Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Posteriormente o mapa de restrição
para escolha da enzima de forma que fossem evitadom sítios de clivagem dentro do
inserto
foi
obtido
com
auxílio
do
programa
RestrictionMapper
(http://www.restrictionmapper.org/). Após a escolha das enzimas de restrição foi feita
uma digestão teórica do possível constructo (inserto + vetor) para confirmação do
quadro
de
leitura
correto
utilizando
a
ferramenta
WebMap
(https://pga.mgh.harvard.edu/web_apps). A partir das sequências anotadas e
identificação dos códons de iniciação (start codon) e de terminação (stop codon),
foram desenhados os primers específicos com sítios de clivagem para as enzimas
NdeI (forward primer) e XhoI (reverse primer).
2.4.2. Amplificação do gene alvo a partir do DNA fosmidial:
Nessa etapa foram realizadas reações de PCR utilizando os primers
específicos desenhados anteriormente (item 2.4.1), sintetizados na EXXTEND
(Exxtend Inc., São Paulo, Brasil). O produto de PCR foi visualizado por eletroforese
em gel de agarose e purificado utilizando o GFX PCR and Gel Band Purification Kit
(GE Healthcare). Após a purificação, foram feitas as reações de digestão dos
produtos de PCR e do vetor de clonagem pET-28a(+) contendo os sítios de restrição
para as enzimas NdeI e XhoI (Figura 1). A digestão das amostras se deu em
reações contendo: 1 µg de produto de PCR; 3 µL de tampão Fast Digest 10X; 2
unidades de NdeI; 1,5 unidade de XhoI; 6,7 µLde água ultrapura. As reações foram
incubadas a 37°C por 1 hora e 30 minutos. Logo a seguir, as amostras foram
submetidas à eletroforese para confirmação da digestão.
Figura 1 |. Mapa do vetor de expressão pET-28a(+). Seta preta indica o sítio múltiplo de clonagem
2.4.3. Reação de ligação:
O produto da digestão foi ligado no vetor pET-28a(+) em reações contendo:
40 ng de vetor; 120 ng de inserto; 4 µL de tampão 10X; 1 unidade de T4 DNA ligase;
7,35 µL de H
2O. A reação de ligação foi incubada a 15°C por 16-18 h.
2.4.4. Procedimento de Eletroporação:
Foram adicionados 1,5 µL do produto da reação de ligação em 40 µL da
suspensão de células E. coli DH10B eletrocompetentes. Após a eletroporação, 960
µL de meio LB foram imediatamente adicionados e a solução foi incubada por 1 hora
e 20 minutos a 37°C. Após o crescimento, 200 µL da cultura foram plaqueadas em
meio LB sólido contendo canamicina (50 µg/mL), seguido de incubação a 37°C por
16-18 h, até o aparecimento de colônias recombinantes.
2.4.5. Procedimento de PCR de colônia para confirmar a clonagem:
Doze colônias foram coletadas aleatoriamente das placas e diluídas em 15 ul
de LB. A amplificação foi realizada em reações contendo: 2 µL da solução de
células, 2,5 µL de tampão (10X), 1,25 µL de MgCl
2(25 mM MgCl), 0,5 µL de solução
de dNTP (100 µM), 2,5 µL dos primers T7 Forward e Reverse (5 µM), 0,4 µL de Taq
DNA polimerase (5 U/µL), 13,35 µL de água ultrapura. As condições de amplificação
foram: desnaturação inicial 95°C por 3 min, desnaturação subsequente a 95°C por 1
min.; anelamento a 55°C por 1,5 min.; extensão a 72°C por 1,5 min e extensão final
de 72°C por 3 min.
2.4.6. Testes de expressão em E. coli para indução da proteína recombinante:
Após a confirmação da clonagem, um clone positivo foi cultivado em meio LB
com canamicina a 37°C por 16-18 h para posterior extração plamidial. Após o
período de incubação 2 mL da cultura foram centrifugados a 10.000 rpm por 8
minutos e o pellet foi submetido à extração de DNA plasmidial utilizando o Invisor
Spin Plasmid Mini Kit (Stratec Molecular). Posteriormente, 0,5 µL da solução de DNA
plasmidial foram misturados a 40 µL da cultura de células de expressão E. coli
BL21(DE3) para eletroporação. Imediatamente a seguir, foram adicionados 960 µL
de meio LB, seguido de incubação a 37°C por 1 hora e 20 minutos. Após essa
incubação preliminar, 50 µL do cultivo foram plaqueados em meio LB sólido com
canamicina e a cultura foi incubada a 37°C por 16-18 h. Uma colônia foi repicada em
5 mL de meio LB líquido suplementado com canamicina e incubada a 37°C por
cerca de 18 h para preparar um pré-inoculo para o teste de expressão da proteína
recombinante. Cerca de 1 mL do pré-inoculo foi adicionado em 50 mL de meio LA
contendo canamicina, e incubado a 37°C até atingir a fase exponencial (DO
600nmentre 0,6 e 0,8), na qual foi realizada a indução da expressão hetoróloga por 3 h com
Isopropil-tio-β-D-galactosídeo (IPTG) a 0,4 mM e CuSO
4(0.5 mM). A expressão da
proteína recombinante será confirmada por meio de SDS-PAGE, observando a
presença de uma banda cujo peso molecular corresponde a aproximadamente 34
kDa.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1.
Ensaio funcional para prospecção de enzimas ligninolíticas
Trabalhos publicados recentemente demonstram que bactérias isoladas do
solo, frequentemente bactérias que degradam compostos aromáticos, são capazes
de decompor a lignina. Esta observação fornece uma ligação entre a degradação de
compostos aromáticos e a degradação da lignina, o que é esperado, dado que a
lignina é a maior fonte de aromáticos presentes no solo (Bugg et al., 2011a,b).
Dessa forma, um total de 40.000 clones da biblioteca metagenômica do solo da
Caatinga foi submetido à triagem de alto desempenho para análise de atividade
biocatalítica de lacases, uma enzima relacionada à oxidação da lignina e seus
subprodutos, através da descoloração de substratos como guaiacol e RBBR. Após 5
dias de incubação a 37ºC, nenhum clone positivo foi revelado. Os resultados obtidos
são corroborados com dados da literatura, visto que até o momento um limitado
número dessas enzimas foi identificado e caracterizado por ensaios biológicos a
partir de clones metagenômicos: Lac15 e Lac21 de uma biblioteca metagenômica
marinha (Fang et al., 2012), RL5 e Lac51 da microflora do rúmen bovino (Beloqui et
al. 2006) e do microbioma fecal de panda gigante (Fang et al., 2012a),
respectivamente, e Lac591 do metagenoma do solo de manguezal (Ye et al., 2010).
Entretanto,
estudos
de
diversidade
utilizando
abordagens
moleculares
independentes de cultivo geram evidências que solos representam uma grande fonte
de genes de lacases. Além disso, tem sido demonstrado que estes genes podem ser
carreados por a uma gama de filos bacterianos (Ausec et al.2011b). Nesse sentido,
o screening funcional baseado na busca por similaridade de sequência, através da
amplificação dos genes alvos com primers degenerados desenhados a partir de uma
grande diversidade de grupos bacterianos do solo, oferece uma alternativa na
prospecção dessas enzimas em bibliotecas metagenômicas.
3.2.
Clones com fenótipos diferenciados
Durante a prospecção da biblioteca metagenômica do solo da Caatinga
(época chuvosa) na busca de enzimas ligninolíticas, alguns clones com fenótipo
diferenciado foram identificados. Essas alterações incluíam produção de pigmento e
alteração morfológica com aspecto esbranquiçado (Figura 2).
Figura 2 | Clones que foram detectados apresentando fenótipo diferenciado durante a prospecção da
biblioteca para enzimas ligninolíticas. Os clones foram cultivados a 37 oC em placas de Petri contendo meio LB + 25 μg/mL de cloranfenicol + 0,01% de L-arabinose durante cinco dias.
Dois clones produziram pigmentos de coloração marrom, apresentando uma
produção extracelular, e acúmulo dentro da célula (Figura 3 a,b), o que indica serem
duas vias biossintéticas diferentes. Outro clone apresentou alterações na morfologia
e um aspecto esbranquiçado, que será investigado com maiores detalhes no
andamento do projeto para possíveis aplicações (Figura 3 c).
(a) (b) (c)
Figura 3 | Detalhes dos clones apresentando fenótipo diferenciado (a) Pigmento sendo secretado
para fora da célula. (b) Acúmulo de pigmento marrom dentro da célula. (c) Clone apresentando alterações morfológicas e aspecto esbranquiçado.
Sabe-se que as lacases contêm átomos de cobre no sítio ativo, auxiliando a
enzima no processo de catálise. Um grande aumento na expressão de pigmento
pelo clone (a) foi observado com adição deste metal no meio de cultura (dados não
demonstrados). Portanto, apesar de não oxidar os compostos análogos da lignina
nos ensaios funcionais, não descartamos a possibilidade do clone produzir alguma
ligninase, uma vez que estas também possuem o papel de formação de pigmentos
como a melanina em bactérias (Claus, 2003; Sharma et al., 2007; Fower et al.,
2011). O DNA fosmidial desses clones foi extraído com QIAGEN® Large-construct
kit, e enviado para sequenciamento e os dados de sequência serão analisados na
busca de ORFs de interesse.
3.3.
Extração do pigmento e análise de espectrometria de massa
(MALDI-TOF)
O sobrenadante filtrado do clone produtor de pigmento e do controle (clone sem
produzir o pigmento) (Figura 4) foi utilizado para extração com solvente (metanol) e
posterior análise comparativa por espectrometria de massa em MALDI-TOF.
(a) (b) (c)
Figura 4 | Sobrenadante do clone produtor de um pigmento marrom. (a) controle, (b) clone após
secretar pigmento para o sobrenadante, e (c) sobrenadante após armazenamento em geladeira.
Não foi observada diferença nos espectros de massa obtidos entre as
amostras (Figura 5). Serão necessários outros métodos de extração dos compostos
para possibilitar uma melhor resolução e detecção de diferenças significativas entre
os espectros dos sobrenadantes avaliados.
Figura 5 | Análise comparativa dos espectros de massa obtidos por Maldi/TOF dos extratos
metanólicos dos sobrenadantes.
388.669 177.345 137.333 348.479 522.814 284.635 764.640 979.826
MeOH black_3 23.03.15 0:B24 MS Raw
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 x10 In te n s. [ a .u .] 137.291 254.414 348.377 550.694 1144.842 215.235 304.516 696.368 214.228 911.535 780.422 1047.718 1305.180
MeOH brown_2 23.03.15 0:C5 MS Raw
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 In te n s. [ a .u .] 177.313 550.728 137.300 254.421 348.396 1144.888 696.404 780.454 911.580 1305.233 466.666 1047.764 598.403 1396.457 MeOH C_1 23.03.15 0:C7 MS Raw 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4 x10 In te n s. [ a .u .] 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Futuramente, na tentativa de detecção de um possível pigmento serão
utilizados os valores massa-carga (m/z) de cada íon para identificação dos
metabólitos de cada extrato em softwares específicos que comparam os resultados
contra uma base de dados (MeltDB 2.0).
3.4.
Extração de DNA fosmidial dos clones da biblioteca metagenômica
Os precipitados celulares dos clones agrupados em 40 pools foram
submetidos à extração fosmidial. Foi obtido DNA de alto peso molecular e com três
bandas intactas (não foram observados rastros de degradação) características de
DNA circular (Figura 6).
Figura 6 | Eletroforese em gel de agarose (0,8%) do DNA fosmidial extraído a partir dos
pools de clones. Poços 1-10 correspondem aos respectivos pools. Poços 11-14 extrações
não satisfatórias (ilustrativo).
3.5.
Triagem de genes via PCR e sequenciamento das bandas
Para prospecção de genes biossintéticos de lacase, primers degenerados
descritos pela literatura e desenhados a partir de sequências oriundas de bactérias
de solo (Tabela 1) foram utilizados para rastrear via PCR os pools de clones. Para
isto, o DNA fosmidial extraído dos 40 pools foi utilizado como molde para as
reações. Várias bandas inespecíficas foram detectadas em diferentes pools (Figura
7). As condições de amplificação, bem como a concentração dos reagentes e DNA
molde foram utilizadas conforme Ausec e colaboradores (2011).
Figura 7 | Eletroforese em gel de agarose (1%) dos produtos da PCR obtidos com os primers
degenerados Cu1AF e Cu4R. Foi utilizado como molde o DNA fosmidial isolado dos 39 pools de clones.
