UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E DO
DESENVOLVIMENTO
NATHÁLIA RONCONI ZILLI KRÜGER
TOXICIDADE DO METILMERCÚRIO DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DO CORAÇÃO: UMA ABORDAGEM
CELULAR E TECIDUAL UTILIZANDO EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS COMO MODELO EXPERIMENTAL
FLORIANÓPOLIS
Nathália Ronconi Zilli Krüger
TOXICIDADE DO METILMERCÚRIO DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DO CORAÇÃO: UMA ABORDAGEM
CELULAR E TECIDUAL UTILIZANDO EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS COMO MODELO EXPERIMENTAL
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de mestre em Biologia Celular e do Desenvolvimento. Orientadora: Profª Drª Evelise Maria Nazari Coorientadora: Drª Carmem Simioni
Florianópolis 2019
Nathália Ronconi Zilli Krüger
TOXICIDADE DO METILMERCÚRIO DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DO CORAÇÃO: UMA ABORDAGEM
CELULAR E TECIDUAL UTILIZANDO EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS COMO MODELO EXPERIMENTAL
O presente trabalho em nível de Mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Profª Elisa Cristiana Winkelmann Duarte, Drª. Universidade Federal de Santa Catarina
Profª Yara Rauh Müller, Drª. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
____________________________ Profª Drª Evelise Maria Nazari
Coordenadora do Programa
____________________________ Profª Drª Evelise Maria Nazari
Orientadora
Florianópolis, 13 de dezembro de 2019.
Documento assinado digitalmente Evelise Maria Nazari
Data: 10/02/2020 15:15:27-0300 CPF: 716.091.489-91
Documento assinado digitalmente Evelise Maria Nazari
Data: 10/02/2020 15:16:06-0300 CPF: 716.091.489-91
Este trabalho é dedicado a minha família, que me apoia ao longo da trajetória.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina, pela oportunidade de continuar contribuindo com a minha formação e por todos os recursos utilizados durante a graduação e a pós-graduação.
Em especial, à minha orientadora, a Profª Drª Evelise Maria Nazari, que me acolheu durante a graduação e sempre acreditou na minha capacidade, me mostrando os caminhos a percorrer.
À minha coorientadora, a Drª Carmem Simioni, que com toda sua paciência, me ensinou muito com a sua experiência.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, que através de todos os professores, viabilizou este trabalho com o conhecimento compartilhado.
Às agência de fomento CAPES e CNPq, pelo apoio financeiro.
Aos Professores, Dr. Jamil Assreuy e Dr. Geisson Marcos Nardi, pela doação de anticorpos.
Aos membros da banca examinadora, agradeço ao tempo disponibilizado.
Aos colegas de Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal, desde os alunos de iniciação científica aos doutorandos, presentes nas trocas de ideia. Especialmente, à minha colega Giuliam que esteve comigo muitas noites e finais de semana no LRDA, aos estudantes de iniciação científica Jacqueline e Wiliam e Doutoras Luciane e Manuela, que colaboraram durante alguns experimentos.
Ao corpo técnico do Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB) e do Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME), pelo atendimento e colaboração para a realização das análises necessárias.
À minha mãe, Karin, pela confiança, incentivo e carinho concedido durante toda a minha vida.
Aos meus irmãos Gabriel e Marx, pela troca de abraços despretensiosos. Ao meu marido, Francisco, que com paciência aguenta minhas loucuras.
Às minhas amigas da vida, Pâmela e Karoline, que me apoiaram mesmo de longe. Às minhas colegas de Secretaria-Geral, que sempre entenderam as minhas ausências. Em especial à Márcia, que esteve comigo à cada amanhecer.
Agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para que este trabalho se tornasse possível, muito obrigada!
Amamos mais aquilo que com mais esforço conseguimos (Aristóteles).
RESUMO
O metilmercúrio (MeHg), forma mais tóxica do mercúrio orgânico, está associado a danos morfológicos, metabólicos e comportamentais nos indivíduos expostos. A neurotoxicidade do MeHg é um fenômeno bem documentado. No entanto, o efeito do MeHg sobre o desenvolvimento do coração ainda é pouco explorado. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do MeHg sobre a organização subcelular, os eventos do ciclo celular e da indução à apoptose nos cardiomiócitos das paredes ventriculares do coração em desenvolvimento, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo experimental. Ovos fertilizados foram incubados em condição de 37,5º C (± 0,5) de temperatura e 65% de umidade. Após 33 horas de incubação, os embriões foram expostos in ovo a 0,1 µg MeHg/50 µL de solução salina a 0,9%, sendo analisados no 10º dia embrionário (E10). Embriões controle foram expostos exclusivamente a 50 µL de solução salina a 0,9% e analisado em E10 (Comitê de Ética da Universidade Federal de Santa Catarina, CEUA - protocolo número 5843231018). Previamente a retirada dos embriões dos ovos, foi avaliado o número de batimentos cardíacos por minuto (bpm). Após, o tecido cardíaco foi destinado às análises teciduais, celulares e subcelulares, bem como marcações celulares por imunohistoquímica, TUNEL (Terminal Transferase dutp Nick end Labeling) e citometria de fluxo. Nos embriões expostos ao MeHg houve redução significativa de 76 bpm, quandocomparado aos 104 bpm nos embriões controles. Cerca de 60% dos embriões expostos ao MeHg apresentaram alterações na organização tecidual do coração. Além disso, o MeHg induziu em 100% dos embriões expostos, o aparecimento de alterações ultraestruturais na organização das trabéculas ventriculares, bem como alterações subcelulares nas mitocôndrias (dilatações nas cristas mitocôndrias), aumento no espaço perinuclear e aumento do número de vesículas (eletrontransparentes, eletrondensas e autofágicas). Foi observada redução significativa no número de células em proliferação em ambos os ventrículos, concomitante ao aumento significativo da proteína p53, envolvida na checagem do ciclo celular. Foi observada redução significativa no número de células em apoptose no ventrículo direito (VD) nos embriões expostos ao MeHg. Ainda, o MeHg induziu estresse celular reconhecido pelo aumento significativo do número de células NOS3-positivas e pela redução significativa no número de células NOS1-positivas. Os resultados demonstraram que a exposição a uma única dose de 0,1 µg de MeHg in ovo induziu danos teciduais, celulares e subcelulares nas paredes ventriculares, que de modo sinérgico acarretaram na redução dos batimentos cardíacos, o que sem dúvida compromete o funcionamento do coração e o aporte sanguíneo necessário ao desenvolvimento embrionário.
Palavras-chave: embriotoxicidade, MeHg, ventrículos cardíacos, proliferação celular, morte
ABSTRACT
Methylmercury (MeHg), the most toxic form of organic mercury, is associated with morphological, metabolic and behavioral damage in exposed individuals. MeHg neurotoxicity is a well-documented phenomenon. However, the effect of MeHg on heart development is still poorly understood. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of MeHg on subcellular organization, cell cycle events and induction of apoptosis in ventricular wall cardiomyocytes of the developing heart, using Gallus domesticus embryos as an experimental model. Fertilized eggs were incubated at 37.5 ° C (± 0.5) temperature and 65% humidity. After 33 hours of incubation, the embryos were exposed in ovo to 0.1 µg MeHg / 50 µL 0.9% saline and analyzed on the 10th embryonic day (E10). Control embryos were exposed exclusively to 50 µL of 0.9% saline and analyzed in E10 (Ethics Committee of the Universidade Federal de Santa Catarina, CEUA - protocol number 5843231018). Prior to the removal of egg embryos, the number of heartbeats per minute (bpm) was evaluated. Afterwards, cardiac tissue was destined to the tissue analysis, cellular and subcellular analysis, as well as cellular markings by immunohistochemistry, TUNEL (Terminal Transferase dutp Nick end Labeling) and flow cytometry. In embryos exposed to MeHg there was a significant reduction of 76 bpm, when compared to 104 bpm in control embryos. About 60% of the embryos exposed to MeHg showed alterations in the heart tissue organization. In addition, MeHg induced in 100% of the exposed embryos, the appearance of ultrastructural changes in the organization of ventricular trabeculae, as well as subcellular changes in mitochondria (dilatations in the mitochondrial ridges), increase in the number of vesicles (electron-transparent, electron-dense and autophagic). Significant reduction in proliferating cell number was observed in both ventricles, concomitant with the significant increase in p53 protein involved in cell cycle checking. Significant reduction in right ventricular (RV) apoptotic cell number was observed in embryos exposed to MeHg. In addition, MeHg induced cellular stress recognized by the significant increase in NOS3-positive cell numbers and the significant reduction in NOS1-positive cell numbers. The results showed that exposure to a single dose of 0.1 µg MeHg in ovo induced tissue, cellular and subcellular damage to the ventricular walls, which synergistically led to a reduction in heart rate, which undoubtedly compromises the functioning of the heart and the blood supply necessary for embryonic development.
Keywords: embryotoxicity, MeHg, heart ventricles, cell proliferation, cell death.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação do desenvolvimento do coração em embriões de Gallus domesticus
entre o 2º e o 10º dias de desenvolvimento ... 19
Figura 2. Representação esquemática do tempo do desenvolvimento de Gallus domesticus,
destacando as características dos embriões em E1,5 (idade de tratamento) e E10 (idade de análise), bem como do coração em desenvolvimento. ... 26
Figura 3. Representação da abertura do ovo de Gallus domesticus... ... 27 Figura 4. Representação do coração em desenvolvimento em secção frontal.. ... 28 Figura 5. Micrografia do tecido cardíaco submetido à imunomarcação com sobreposição da
imagem da Gratícula de Weibel. ... 28
Figura 6. Representação esquemática do coração em desenvolvimento...30 Figura 7. Secção frontal do coração de embriões de Gallus domesticus em E10, corado com
HE. ... 33
Figura 8. Espessura média da parede dos ventrículos do coração de embriões de Gallus
domesticus em E10 dos grupos controle e exposto ao MeHg.. ... 34
Figura 9. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas envolvidas na ocorrência
de dano ao DNA no coração de embriões de Gallus domesticus em E10... 35
Figura 10. Análise por imuno-histoquímica da proliferação celular utilizando anticorpo
anti-PHH3 no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. ... 36
Figura 11. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas envolvidas no ciclo
celular no coração de embriões de Gallus domesticus em E10.. ... 37
Figura 12. Análise por imuno-histoquímica da ocorrência de morte celular utilizando
anticorpo anti-Caspase3 no coração de embriões de Gallus domesticus em E10.. ... 38
Figura 13. Análise quantitativa por citometria de fluxo da proteína Caspase-3 no coração de
embriões de Gallus domesticus em E10.. ... 39
Figura 14. Análise pelo método de TUNEL da ocorrência de apoptose no coração de
embriões de Gallus domesticus em E10. ... 40
Figura 15. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas NOS1 e NOS3 no
coração de embriões de Gallus domesticus em E10.. ... 41
Figura 16: Eletromicrografias de varredura das trabéculas ventriculares do coração de
embriões de Gallus domesticus em E10, após exposição ao MeHg. ... 42
Figura 17. Eletromicrografias de transmissão do ventrículo direito (VD) do coração de
Figura 18. Eletromicrografias de transmissão do ventrículo esquerdo (VE) do coração de
embriões de Gallus domesticus em E10. ... 45
Figura 19. Frequência de alterações subcelulares em cardiomiócitos de embriões de Gallus
domesticus em E10 após exposição ao MeHg. ... 47
Figura 20. Frequência de perfis mitocondriais com alterações nas cristas mitocondriais. ... 48 Figura 21. Efeito do MeHg sobre o número médio de batimentos cardíacos por minuto (bpm)
de embriões de Gallus domesticus em E10 ... 49
Figura 22. Resumo gráfico das alterações observadas no coração de embriões de G.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Anticorpos primários utilizados nas análises por imuno-histoquímica (IH) e
citometria de fluxo (CF)...29
Quadro 2: Anticorpos secundários utilizados nas análises por imuno-histoquímica (IH) e
citometria de fluxo (CF)...29
Quadro 3: Análises morfológicas e morfométricas comparativas entre coração de embriões
G. domesticus controle e exposto ao MeHg, em E10...33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Frequência de perfis mitocondriais com alterações nas cristas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AD Átrio Direito AE
Bpm
Átrio Esquerdo Batimento por minuto DAB 3,3’Diaminobenzidina E Dia Embrionário HE Hematoxilina-Eosina HH Hamburger e Hamilton Hg0 Hg+ Hg2+ Mercúrio Metálico
Íon Inorgânico de Mercúrio Íon Inorgânico de Mercúrio MeHg
MET MEV
Metilmercúrio
Microscopia Eletrônica de Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura N
NOS1 NOS3
Tamanho Amostral Nitric Oxide Synthase 1
Nitric Oxide Synthase 3
PBS Tampão Fosfato Salino, do inglês phosphate buffered saline PHH3 Fosfohistona H3, do inglês phospho histone h3
SAV Septo Atrioventricular SIA Septo Interatrial SIV Septo Interventricular SNC
T
Sistema Nervoso Central Trabécula
TUNEL Terminal Transferase dutp Nick end Labeling VD Ventrículo Direito
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ... 17
1.1. TOXICIDADE DO MeHg ... 177
1.2. DESENVOLVIMENTO DO CORAÇÃO ... 199
1.3. TOXICIDADE DO MeHg NO SISTEMA CARDIOVASCULAR ... 211
1.4. MODELO ANIMAL ... 222
2. OBJETIVOS ... 244
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...24
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 255
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO...25
3.2. DELINEAMENTO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 255
3.3. ANÁLISE DOS BATIMENTOS CARDÍACOS ... 277
3.4.PROCESSAMENTO DO CORAÇÃO PARA FIXAÇÃO E INCLUSÃO EM PARAFINA ...27
7 3.5. ANÁLISE MORFOLÓGICA DO CORAÇÃO ... 277
3.6. MARCAÇÕES CELULARES POR IMUNO-HISTOQUÍMICA ... 288
3.7. ANÁLISE DE CÉLULAS APOPTÓTICAS POR TÉCNICA DE TUNEL ... 30
3.8. ANÁLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO ... 311
3.9. ANÁLISE POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ... 311
3.10. ANÁLISE POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ... 322
3.11. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 322
4. RESULTADOS ... 33
4.1. EFEITO DO MeHg SOBRE A ORGANIZAÇÃO DAS PAREDES DAS CÂMARAS CARDÍACAS...33
4.2. EFEITO DO MeHg SOBRE O CONTEÚDO DAS PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA INDUÇÃO DE DANO AO DNA...35
4.4. EFEITO DO MeHg SOBREO CONTEÚDO DE PROTEÍNAS DO CICLO
CELULAR...37
4.5. EFEITO DO MeHg SOBREA INDUÇÃO DE MORTE CELULAR POR APOPTOSE...38
4.6. ANÁLISE DO CONTEÚDO PROTEICO DE NOS1 E NOS3...42
4.7. EFEITO DO MeHg SOBRE A ULTRAESTRUTURA DAS TRABÉCULAS VENTRICULARES E DOS CARDIOMIÓCITOS...43
4.8. EFEITO DO MeHg SOBRE OS BATIMENTOS CARDÍACOS...49
5. DISCUSSÃO ... 511
6. CONCLUSÕES ... 577
1. INTRODUÇÃO
O mercúrio (Hg) é um metal proveniente de fontes naturais e antropogênicas. As fontes naturais estão relacionadas aos processos químicos e físicos de desgaste da crosta terrestre e as fontes antropogênicas estão relacionadas com as atividades industriais (ASCHNER E ASCHENER, 1990; MOREL et al., 1998; ATKINS e JONES, 2012; WILDEMANN et al., 2014). O Hg é um dos metais mais tóxicos presentes na tabela periódica, que se apresenta de três formas principais, o mercúrio metálico (Hg0), íons inorgânicos (Hg+ e Hg2+) e o mercúrio orgânico (etilmercúrio e metilmercúrio), as quais diferem quanto à sua toxicocinética, bem como distribuição, acúmulo e ciclagem no ambiente (FRIBERG e MOTTET, 1989; ROCHA et al., 2012; SYVERSEN e KAUR, 2012; DUAN et
al., 2016).
Dentre as formas orgânicas, a mais tóxica é o metilmercúrio (MeHg), normalmente encontrado na natureza, devido à metilação de bactérias sulforredutoras (MOREL et al., 1998; ACHÁ et al., 2011; GENCHI et al., 2017). Uma vez disponível no ambiente, o MeHg pode entrar na cadeia alimentar e através de um complexo intracelular interagir com os grupamentos sulfidrila nas hemácias, levando ao acúmulo nos tecidos biológicos e uma baixa excreção (WOOD et al., 1968; CLARKSON, 1997; ASCHNER et al., 2000; KEHRIG et al., 2011; CHENG et al., 2013).
Uma vez incorporado aos organismos, o MeHg induz a ocorrência de danos morfológicos, metabólicos e comportamentais, sendo o sistema nervoso um dos principais alvos dos estudos já realizados. Assim, considerando a preocupação acerca da toxicidade induzida por metais pesados, esta dissertação de Mestrado apresenta uma abordagem integrada das respostas celulares frente à exposição ao MeHg e seu impacto na organização tecidual das paredes ventriculares e no funcionamento do coração. Especificamente, serão avaliadas as respostas referentes ao ciclo celular, apoptose e estresse celular, utilizando diferentes ferramentas de análises subcelulares, celulares e tecidual.
1.1. TOXICIDADE DO MeHg
A toxicidade do MeHg recebeu atenção da comunidade científica desde meados do século XIX, principalmente após a ocorrência de exposição acidental de organismos a esse metal. Relatos mostraram que em 1860 na cidade de Londres, houve a exposição humana em laboratório, em decorrência da produção sintética de MeHg (CLARKSON et al., 2003) o qual era utilizado pelos seus efeitos antifúngicos, fazendo com que fosse utilizado pelo setor
agrícola, como base para fungicidas (GOLDMAN e SHANNON, 2001). Quase 100 anos após, no Japão na década de 1950 houve a contaminação de peixes por resíduos industriais que continham MeHg; estes peixes foram consumidos pela população local, que apresentou sintomas de intoxicação e distúrbios neurológicos. Na década de 1970 no Iraque, grãos contaminados por fungicidas contendo MeHg foram utilizados na produção de pães, que após consumidos pela população, induziu sintomas semelhantes à população contaminada no Japão (SAKAMOTO et al., 2002; CLARKSON et al., 2003).
No Brasil, atividades de garimpo artesanal e de mineradoras geram resíduos de metais, que são descartados no meio ambiente e que são potenciais formas de contaminação por MeHg (MAURO et al., 2001; BARKAY et al., 2003; MENDES et al., 2016), a exemplo do consumo de peixes contaminados por rejeitos da exploração de ouro na região amazônica brasileira (MICARIONI et al., 2000; PINHEIRO et al., 2009). Ainda, os acidentes ambientais decorrentes dos rompimentos das barragens de Fundão/MG em 2015 e Brumadinho/MG em 2019 geraram aumento da concentração de Hg na bacia do rio Doce, que chegou a 1465 vezes mais que o previsto pela legislação para qualidade da água, segundo a Resolução do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) nº 396/2008) (IBAMA, 2015; FREITAS et al., 2016; HATJE et al., 2017), contaminando o meio ambiente e expondo as populações humanas a este metal.
Os acidentes e casos de contaminações por MeHg, demonstram-se ainda mais preocupantes quando observadas as revisões de Costa et al., (2004), Grandjean e Herz (2011), Dos Santos et al., (2016), que apresentam o MeHg como um importante neurotóxico durante o desenvolvimento, relatando casos nos quais mães expostas à contaminação não demonstraram nenhum tipo de sintoma, enquanto que os bebês nasciam com distúrbios neurológicos. Trabalhos experimentais demonstram que mesmo em pequenas concentrações (3 μM) por 24 horas, o MeHg afeta os mecanismos básicos para a formação do sistema nervoso central (SNC), como proliferação celular, diferenciação celular e apoptose (CRESPO-LOPEZ et al., 2009; XU et al., 2010; HE et al., 2012; MÜLLER et al., 2012; FERREIRA et al.,2018; LIU et al., 2019). Além disso, foram analisados os processos celulares e moleculares envolvidos na estruturação e formação dos tecidos e órgãos embrionários quando expostos ao MeHg (PATEL e REYNOLDS, 2013; HUYCK et al., 2015).
Neste panorama existem ainda poucos trabalhos que indicam que o sistema cardiovascular também seja alvo da toxicidade induzida pelo MeHg, o que sugere que a sua
exposição pré-natal, poder afetar a homeostase no desenvolvimento do coração (SORENSEN
et al., 1999; ROMAN et al., 2011; MOREIRA et al., 2012; GHIZONI et al., 2017).
1.2. DESENVOLVIMENTO DO CORAÇÃO
O coração, é o primeiro órgão funcional nos embriões de vertebrados (BUCKINGHAM, et al. 2005; MOORE, 2013), sendo o seu desenvolvimento descrito em diferentes modelos animais, como roedores e aves, onde foram reconhecidas semelhanças na formação das quatro cavidades, das trabéculas ventriculares e dos vasos sanguíneos (HOLMES, 1975; ROWLATT, 1990;YUTZEY et al., 1995; GESSERT e KÜHL, 2010; WU,
et al. 2011; POELMANN et al., 2014).
O coração em desenvolvimento é inicialmente uma estrutura tubular de origem mesodérmica, denominada tubo cardíaco primitivo (YUTZEY et al., 1995; AL NAIEB et al., 2013; LINDSEY et al., 2014). Este tubo em aves e mamíferos é composto pelo endocárdio, localizado mais internamente; pela geleia cardíaca, que dará origem aos coxins endocárdicos, as valvas e os septos; pelo miocárdio, que dará origem às células musculares cardíacas, as quais estarão presentes nas paredes dos átrios e ventrículos (com uma rede de trabéculas); e pelo epicárdio, que dará origem as fibras musculares lisas e aos vasos coronarianos (GARCIA-MARTINEZ e SCHOENWOLF, 1993; SEDMERA e MCQUINN, 2008; SADLER, 2010).
A região cefálica do tubo cardíaco primitivo é formada pelo ventrículo primitivo e a porção caudal é formada pelo átrio primitivo. Para aquisição da posição anatômica definitiva, deverá ocorrer o reposicionamento ântero-posterior das câmaras cardíacas, através de dobramentos chamados de “looping” cardíaco (Figura 1). O “looping” cardíaco contribui ainda para que esse o coração tenha características assimétricas relacionadas à lateralidade, esquerdo-direito (ICARDO et al., 2002). A individualização das quatro câmaras cardíacas depende da proliferação celular para a formação do septo interatrial (SIA), do septo interventricular (SIV) e do septo atrioventricular (SAV) formando dois átrios e dois ventrículos (MARTINSEN, 2005; CARLSON, 2014). O crescimento e a expansão das câmaras e a formação das valvas cardíacas, viabilizam o bombeamento sanguíneo com fluxo unidirecional (AL NAIEB et al., 2013). O bombeamento sanguíneo depende da atividade dos cardiomiócitos durante a circulação atrioventricular (MALTSEV et al., 1993). Os cardiomiócitos são células com formato alongado com projeções citoplasmáticas multiangulares, com extensa cadeia de sarcômeros (GUAN et al., 1999).
Figura 1. Representação do desenvolvimento do coração em embriões Gallus domesticus entre o 2º e o 10º dias
de desenvolvimento, destacando os principais eventos para a formação do coração tetracavitário.
Fonte: modificado de Lindsey et al., (2014).
A organização do coração em um órgão tetracavitário requer eventos de proliferação, diferenciação e morte celular programada (YUTZEY et al., 1995; GESSERT e KÜHL, 2010; WU, et al., 2011). Durante as fases do ciclo celular, especificamente na interfase, proteínas como a p21 e a p53 atuam nos pontos de verificação de danos ao DNA (checkpoints), conduzindo a célula para vias de reparo ao dano ou para vias apoptóticas, quando do não reparo (VOUSDEN e LANE, 2007; ZHANG et al., 2017), prevenindo que os danos ao DNA prossigam até a fase da mitose. Além destas, a proteína PCNA (do inglês proliferating cell
nuclear antigen), também está envolvidas com a manutenção da integridade do material
genético (ZHANG et al., 2011), enquanto a proteína histona ɣH2AX, auxilia na manutenção celular após o dano ao DNA (TURINETTO e GIACHINO, 2015). Já na fase mitótica, a histona H3 quando fosforilada (fosfo histona H3) participa da condensação da cromatina, essencial para a formação do fuso mitótico (PAULSON e TAYLOR, 1982).
Assim como a proliferação celular, a morte celular programada é necessária para determinação do número e localização celular, removendo as células excedentes durante a modelagem de órgãos ao longo do desenvolvimento embrionário (JACOBSON et al., 1997). A indução à apoptose envolve a participação de proteínas ativadoras e efetoras, como as caspases (DOSEFF, 2004). Em particular, durante a formação do tubo cardíaco primitivo, a apoptose é necessária para manutenção da cavidade cardíaca primitiva (TUCKA et al., 2012). Ainda na formação do coração, a apoptose contribui para a formação dos septos cardíacos, o remodelamento das câmaras cardíacas, e em especial nos ventrículos, para a formação das trabéculas (YANG et al., 2013; LORDA-DIEZ et al., 2019).
1.3. TOXICIDADE DO MeHg NO SISTEMA CARDIOVASCULAR
Os efeitos da toxicidade do MeHg foram associados principalmente ao SNC (COSTA et al., 2004; GRANDJEAN e HERZ, 2011; RICHTER et al., 2014; DOS SANTOS
et al., 2016; JACKSON, 2018). No entanto, estudos relacionados aos efeitos do Hg e suas
formas orgânicas demonstram o potencial tóxico deste metal no sistema cardiovascular (ROMAN et al., 2011; AZEVEDO et al., 2012), relacionados com o risco aumentado à hipertensão para crianças e adultos, arteroesclerose e infarto do miocárdio (SORENSEN et
al., 1999; GUALLAR et al., 2002; FILLION et al., 2006; THURSTON e KUBZANSKY,
2007; CHOI et al., 2009; AFRIDI et al., 2014; VALERA et al., 2014; FARIA et al., 2017; TRDIN et al., 2019).
O MeHg possui efeitos vasculares relacionados ao estresse oxidativo que incluem inflamação e disfunção endotelial (HOUSTON, 2011). Essa disfunção leva à redução na formação e migração de células endoteliais, o que contribui para a perda de vasodilatação, redução no reparo endotelial vascular e redução de óxido nítrico (NO, do inglês nitric oxide), uma molécula sensível ao estresse oxidativo (KIMURA, 2000; GOLPON et al., 2003; HOUSTON, 2007; OMANWAR et al., 2011).
O NO é um mediador inflamatório e um potente vasodilatador, além disso pode atuar como um fator anti-inflamatório, agindo principalmente sobre a vasoregulação e a homeostase vascular. Existem isoformas produzidas pelo processo inflamatório, destacamos a nNOS ou NOS1 (NOS, do inglês nitric oxide synthase), encontrada pela primeira vez no tecido neuronal; iNOS ou NOS2, induzível na maioria das células e tecidos; e a eNOS ou NOS3, encontrada principalmente nas células endoteliais vasculares (LIND et al., 2017; IVY, 2019), com função de regulação da liberação catecolaminas no coração (BALLIGAND e CANNON, 1997).
As células endoteliais possuem fatores parácrinos, como NO, que modulam a contractilidade dos cardiomiócitos (WYSS, 1993). Em pequenas concentrações, o NO faz com que o coração tenha uma freqüência cardíaca estável. No entanto, quando as concentrações de NO aumentam, os cardiomiócitos respondem com uma hipertrofia cardíaca, relacionada à insuficiência e hipertensão cardíaca (SEGERS et al., 2018). Este contexto está relacionado aos níveis de estresse que o tecido está condicionado, exigindo, ainda uma hipertensão sanguínea (DIBONA, 2013). Sendo assim, existem estudos que relacionam populações humanas de idades diferentes, a variabilidade de freqüência cardíaca e a
hipertensão com a exposição ao MeHg (SORENSEN et al., 1999; FILLION et al., 2006; CHOI et al., 2009; VALERA et al., 2014).
1.4. MODELO ANIMAL
O uso de embrião de G. domesticus como modelo experimental surgiu em 384 a.C com os registros de que Aristóteles foi o primeiro a observar o desenvolvimento da espécie, abrindo os ovos em diferentes tempos de incubação (HAMBURGER e HAMILTON, 1951). Esse modelo experimental se sobressai nos estudos de embriologia, devido às suas características de desenvolvimento (SCHOENWOLF, 1999), tais como, o desenvolvimento externo ao organismo materno, o que favorece práticas laboratoriais, bem como a isenção de influências fisiológicas maternas (SIMONS et al., 2015; HEANUE et al., 2016; VANCAMP e DARRAS, 2017); a similaridade do embrião de G. domesticus com o embrião humano nos níveis molecular, celular e anatômico durante às primeiras semanas de desenvolvimento, o que permite estudos translacionais (BURT, 2004; ZHANG et al., 2014; CHENG e BURT, 2018); facilidade e o baixo custo pra obtenção dos ovos a disponibilidade de informações sobre o estagiamento do desenvolvimento, como o proposto por Hamburguer e Hamilton (1951), que possibilita o reconhecimento das estruturas embrionárias e o tempo em que se formam; a possibilidade de incubação artificial, viabilizada pelo suporte nutricional do vitelo (RUTKIEWICZ e BASU, 2013), que associado ao tempo de desenvolvimento de 21 dias, permite o acompanhamento sistemático das etapas do desenvolvimento do embrião (MOODY, 1999); a disponibilidade do genoma sequenciado de Gallus gallus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=gallus+gallus), bem como a existência de banco de dados online como Geisha (http://geisha.arizona.edu/geisha/), que possibilita a realização de estudos com ferramentas de análises moleculares.
Sendo assim, com intuito de contribuir com os conhecimentos sobre a toxicidade do MeHg no desenvolvimento do coração, são utilizados embriões de G. domesticus como modelo experimental, cujas células progenitoras cardíacas estão presentes nas primeiras 12 horas de desenvolvimento (GARCIA-MARTINEZ e SCHOENWOLF, 1993; COHEN-GOULD e MIKAWA, 1996).
Estudos prévios realizados durante o Trabalho de Conclusão de Curso em Ciências Biológicas (dados não publicados), despertaram para novas perspectivas de estudos, que foram a base para este estudo, na busca por compreender melhor a toxicidade do MeHg no desenvolvimento embrionário do coração e os comprometimentos induzidos pelo MeHg nas
células cardíacas. Para tal, propõe-se como hipóteses científicas para esta dissertação que o MeHg causa (i) alterações nos compartimentos subcelulares das células cardíacas; (ii) diminuição do conteúdo de proteína fosfohistona H3 (PHH3) e aumento do conteúdo proteico de p53 e p21, envolvidas no ciclo celular e proliferação celular; (iii) ocorrência de danos ao DNA, (iv) aumento no conteúdo de caspase-3 em resposta a indução à apoptose e (v) diminuição no conteúdo das proteínas mediadoras de inflamação, para o reconhecimento do estresse celular.
2. OBJETIVOS
Caracterizar a toxicidade do MeHg sobre a organização ultraestrutural das paredes ventriculares e de seus cardiomiócitos, enfocando os eventos do ciclo celular e da indução à apoptose, utilizando embriões de G. domesticus como modelo de estudo.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Quantificar os batimentos cardíacos e analisar a organização micromorfológica do coração, como parâmetros gerais de funcionalidade do órgão;
- Analisar a organização das trabéculas ventriculares e a organização subcelular dos cardiomiócitos ventriculares;
- Analisar e quantificar o conteúdo de proteínas indicadoras de alteração nos processos de proliferação, ciclo celular e apoptose;
- Reconhecer a ocorrência de estresse celular nos cardiomiócitos através do conteúdo de proteínas mediadoras de inflamação.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO
Neste trabalho foram utilizados embriões de galinha doméstica da espécie G.
domesticus como modelo de estudo, provenientes de ovos fertilizados doados pela Fazenda
Experimental da Ressacada, do Centro de Ciências Agrárias UFSC. Os ovos foram transportados ao Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal (LRDA) do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, do Centro de Ciências Biológicas da UFSC. Em laboratório, os ovos foram mantidos em repouso por 24 horas a temperatura de 20ºC e posteriormente incubados a 37,5ºC (± 0,5) e 65 % de umidade do ar em incubadora Golden. Os procedimentos adotados neste estudo foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – UFSC CEUA nº 5843231018.
3.2. DELINEAMENTO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Previamente, foi testada a sobrevivência dos embriões expostos ao MeHg em 33 h, 40 h e 48 h de incubação. Os resultados foram semelhantes para os três períodos testados, razão pela qual optou-se neste trabalho por adotar o período o mais precoce de incubação para o estudo dos efeitos do MeHg. Para tal, foram propostos os seguintes grupos experimentais:
- Grupo exposto ao MeHg (n = 30 embriões, em 3 repetições experimentais independentes, com 10 embriões cada): embriões com 33 h de incubação receberam 0,1 µg MeHg/50 µL de solução salina a 0,9% administrado junto à vascularização extraembrionária, conforme Carvalho et al., (2008).
- Grupo controle (n = 30 embriões, em 3 repetições experimentais independentes, com 10 embriões cada): embriões com 33 h de incubação receberam 50 µL de solução salina a 0,9%, administrado junto à vascularização extraembrionária.
Neste estudo, foi adotado o estagiamento dos embriões por dia embrionário (E), onde cada 24h de incubação correspondeu a um dia embrionário. Para validar esse estagiamento, foram utilizadas como referência as características morfológicas externas descritas por Hamburger e Hamilton (1951).
A administração do MeHg in ovo foi realizada através de uma abertura na casca dos ovos, por meio de pipetagem de 50 µL da solução de tratamento, próximo à artéria vitelínica. Após, a abertura da casca foi fechada com fita adesiva transparente e atóxica e os ovos permaneceram na incubadora até o 10º dia embrionário (E10) (Figura 3). Diariamente, os
embriões foram monitorados através da abertura da casca, para controle da sobrevivência pela análise do aspecto do embrião e da vascularização embrionária.
As idades de tratamento e análise escolhidas para este trabalho se justificam pelo fato de que em 33 h (E1,5) (idade de tratamento), o coração está em processo inicial de formação e caracteriza-se por ser um tubo cardíaco primitivo com câmara única, e em E10 (idade de análise), o coração apresenta os ventrículos cardíacos individualizados e com trabéculas nas suas paredes internas (AL NAIEB et al., 2013).
Em E10, os embriões tiveram seu desenvolvimento interrompido através da retirada dos ovos da incubadora e dessensibilização dos embriões a 4ºC por 15 min. Após, os embriões foram removidos dos ovos e das membranas extraembrionárias e foram dispostos em placas de Petri com solução salina a 0,9%. O coração foi dissecado e submetido aos procedimentos de preparo para as técnicas de imuno-histoquímica, TUNEL, citometria de fluxo e microscopia eletrônica.
Figura 2. Representação esquemática do tempo do desenvolvimento de Gallus domesticus, destacando as
características dos embriões em E1,5 (idade de tratamento) e E10 (idade de análise), bem como do coração em desenvolvimento. Linha pontilhada representa tempo que restaria para o desenvolvimento até o dia da eclosão (E21).
3.3. ANÁLISE DOS BATIMENTOS CARDÍACOS
Para quantificar o número de batimentos cardíacos por minuto (bpm), foi realizada a observação in ovo através de abertura na casca, sendo quantificados os batimentos em 3 intervalos de 1 minuto (n = 18 embriões/grupo) (Figura 3).
Figura 3. Representação da abertura do ovo de Gallus domesticus. Tamanho da abertura. (a), representação do
embrião em E10 (b). * indica região de observação dos batimentos cardíacos.
Fonte: da própria autora (2019).
3.4. PROCESSAMENTO DO CORAÇÃO PARA FIXAÇÃO E INCLUSÃO EM PARAFINA
O coração foi fixado em formaldeído a 4 % por 24 h, mantido em etanol a 70 %, para inclusão em parafina. Realizou-se a desidratação em série crescente de etanol (70 % - 100 %) por 1 h em cada álcool, a diafanização em dois banhos de xilol por 5 min cada, ou até que a peça estivesse translúcida. Após, foram realizados três banhos em parafina por 1 h cada, o coração foi orientado para realização de secções frontais (6 µm de espessura) em micrótomo rotativo (Olympus CUT 2020A). As secções foram dispostas em lâminas histológicas de modo que em cada lâmina tivessem secções dos grupos controle e exposto ao MeHg. As secções foram destinados às análises de morfologia do coração, morfometria dos ventrículos, imuno-histoquímica e TUNEL.
3.5. ANÁLISE MORFOLÓGICA DO CORAÇÃO
Para caracterização da micromorfologia do coração foi realizada a coloração de um conjunto das lâminas com HE (n = 5 embriões/grupo). As secções foram desparafinizadas com dois banhos de xilol por 5 min cada, seguidos da re-hidratação em série decrescente de etanol (100% - 70%) por 10 min cada. A seguir, as lâminas foram embebidas em água
corrente por 10 min, imersas em Hematoxilina de Harris por 25 seg, lavadas com água corrente por 10 min, imersas em Eosina aquosa a 1% por 20 seg e lavadas em água destilada por 5 min. As secções foram desidratadas em série de etanol crescente (70% - 100%) por 5 min, diafanizadas em xilol por 5 min e montadas com Entelan®.
Para realização das análises morfológicas e morfométricas foram realizadas fotografias ao microscópio invertido Olympus IX83 (4 X e 100 X) (Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia, LAMEB) das lâminas com secções do coração corados com HE. A espessura das paredes do ventrículo direito (VD) e do ventrículo esquerdo (VE) foi determinada (aumento de 4 X) utilizando o software CellSens (LAMEB). Considerando que a espessura das paredes ventriculares não é uniforme, optou-se por determinar a espessura em três alturas de cada ventrículo. Foi considerada como a espessura da parede do ventrículo, a média dos valores obtidos para as três alturas mensuradas (Figura 5).
Figura 4. Representação do coração em desenvolvimento em secção frontal. Linhas horizontais na parede do VE
indicam as três alturas mensuradas em ambos os ventrículos. AD, átrio direito; AE, átrio esquerdo; SAV, septo atrioventricular; SIA, septo interatrial; SIV, septo interventricular; VD, ventrículo direito; VE, ventrículo esquerdo.
Fonte: da própria autora (2019).
3.6. MARCAÇÕES CELULARES POR IMUNO-HISTOQUÍMICA
Para identificar e quantificar o conteúdo das proteínas envolvidas na proliferação celular e ciclo celular, as secções (n = 9 embriões/grupo) foram desparafinizados com dois banhos de xilol por 5 min cada, seguidos da re-hidratação em série decrescente de etanol (100% - 70%) por 10 min cada. O bloqueio de peroxidases endógenas foi feito com banho de peróxido de hidrogênio:metanol (1:2), seguido da inativação dos sítios inespecíficos, com soro fetal bovino (BSF, do inglês bovine fetal serum) a 5% com tampão PBS Triton X-100 a 0,1% por 40 min. Em seguida, foi realizada a incubação com os anticorpos primários (Quadro
1) a 4ºC por 12 h em câmara úmida. Decorrido este tempo, as secções foram lavadas três vezes em tampão PBS Triton X100® a 0,1% por 10 minutos e incubadas com anticorpo secundário correspondente (Quadro 2), conjugados à peroxidase por 3 hs à temperatura ambiente. As marcações foram evidenciadas com solução de 3-3’ diaminobenzidina (DAB) diluído em PBS com peróxido de hidrogênio a 10%. As lâminas foram montadas com meio de montagem Entelan®.
A quantificação das imunomarcações foi realizada em microscópio de luz marca Olympus CBA, com auxílio da gratícula de Weibel nº 2 – M42, sendo quantificadas as células que coincidiam com as extremidades das barras da gratícula (Figura 6). Foram quantificadas as células imunomarcadas em 5 campos visuais alternados, sendo os dados apresentados em valor absoluto.
Figura 5. Micrografia do tecido cardíaco submetido à imunomarcação com sobreposição da imagem da
Gratícula de Weibel. Círculo vermelho indica célula imunomarcada que coincide com a extremidade das barras da gratícula, a qual é considerada para contagem. Apenas as células imunomarcadas que ficarem sobrepostas às extremidades da gratícula foram quantificadas. Barra de escala = 40 μm.
Quadro 1: Anticorpos primários utilizados nas análises por imuno-histoquímica (IH) e citometria de fluxo (CF). ANTICORPO ESPÉCIES ISOTIPO DILUIÇÃO DESENVOLVIDA ORIGEM IH CF
Anti-Fosfohitona H3 Coelho Humana IgG 1:100 1:1000
Anti-p21 Camundongo Humana IgG - 1:1000
Anti-PCNA Coelho Humana IgG - 1:1000
Anti-Caspase 3 Coelho Humana IgG 1:100 1:1000
Anti-p53 Coelho Humana IgG - 1:1000
Anti-ɣH2A.X Coelho Humana IgG - 1:1000
Anti-NOS1 Coelho Humana IgG - 1:1000
Anti-NOS3 Coelho Humana IgG - 1:1000
Quadro 2: Anticorpos secundários utilizados nas análises por imuno-histoquímica (IH) e
citometria de fluxo (CF).
ANTICORPO ESPÉCIES DE
ORIGEM ISOTIPO DILUIÇÃO
Anti-camundongo Alexa-fluor 488 Cabra IgG 1:1000
Anti-camundongo Alexa-fluor 488 Cabra IgG 1:1000
Anti-coelho Alexa-fluor 568 Burro IgG 1:1000
Anti-camundongo Alexa-fluor 633 Cabra IgG 1:1000
Anti-camundongo Alexa-fluor 633 Cabra IgG 1:1000
3.7. ANÁLISE DE CÉLULAS APOPTÓTICAS POR TÉCNICA DE TUNEL
Lâminas histológicas (n = 9 embriões/grupo) foram desparafinizadas em xilol por 5 min cada e reidratadas em série crescente de etanol (100% - 70%) por 10 min cada. As secções foram embebidas em solução NaCL a 0,85% por 5 min. A permeabilização das membranas celulares foi realizada através de um banho de 5 min de PBS a 0,1M pH 7,4, e por um banho de 30 seg em proteinase K diluída em tampão Tris a 10 mM, pH 8,0 (1:1000). Após, as secções foram imersas por 5 min em PBS a 0,1 M e fixadas em formaldeído a 4%. Para reação de equilíbrio, as secções passaram por um banho de 5 min em tampão de equilíbrio e incubadas com enzima de marcação (TdT reaction mix – Equilibrate Buffer
Nucleotide Mix + rTdTEnzyme) a 37ºC em câmara úmida por 60 min. Para a reação de
marcação, foi utilizada uma solução de NaCl e citrato de sódio diluída em água miliQ por 15 min, seguida de um banho em PBS pH 7,4 a 0,1M, por 5 min. As células apoptóticas foram identificadas em fluorescência verde, utilizando o microscópio invertido Olympus IX83
(Laboratório Multiusuário de Estudo de Biologia - LAMEB). A quantificação direta das células apoptóticas foi realizada a partir de micrografias obtidas no microscópio invertido Olympus IX83 (aumento de 40 X) (LAMEB) de três regiões dos tecidos do VD e VE e da região da base septo interventricular (SIV) entre VD e VE (Figura 6).
Figura 6. Representação esquemática do coração em desenvolvimento. Quadrados indicam as regiões de ambas
as paredes dos ventrículos onde foram realizadas as contagens das células apoptóticas. AD, átrio direito; AE, átrio esquerdo; SAV, septo atrioventricular; SIA, septo interatrial; SIV, septo interventricular; VD, ventrículo direito; VE, ventrículo esquerdo.
Fonte: da própria autora (2019).
3.8. ANÁLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO
O coração dissecado (n = 24 embriões/grupo) foi macerado e submetido a três banhos consecutivos de PBS a 0,1 M. Em seguida, as células foram dissociadas com tripsina a 0,25% durante 30 min para facilitar a dissociação das células. Foram adicionados 100 μL de BSF nas amostras, as quais permaneceram em agitação por 30 min. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 640 x g por 5 min, foi coletado o sobrenadante, que foi ressuspendido em PBS/BSF a 10 %. As amostras foram incubadas com anticorpo primário (Quadro 1) durante 1 h, após foram incubadas com o anticorpo secundário (Quadro 2) durante 40 min. As leituras foram realizadas no citômetro de fluxo FASCanto II (LAMEB) e as análises dos dados, no programa Flowing Software 2.
3.9. ANÁLISE POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
As amostras de coração foram fixadas em glutaraldeído a 2,5 % em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,2). Em seguida, as amostras foram desidratadas em série crescente de etanol (70 % - 100 %), após as amostras foram secas com o ponto crítico, e, em
seguida, foram revestidas com ouro. As amostras de coração foram analisadas no microscópio eletrônico de varredura (MEV) modelo JEOL JSM-6390LV (Laboratório Central de Microscopia Eletrônica da UFSC - LCME).
3.10. ANÁLISE POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Para a observação dos compartimentos subcelulares, fragmentos dos ventrículos cardíacos foram fixados em glutaraldeído a 2,5 %, paraformaldeído a 4 % e sacarose a 2 % em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,2), durante 12 h à 4ºC. Em seguida, foram realizadas lavagens com o tampão de cacodilato de sódio, com concentrações decrescentes de sacarose por 10 min. As amostras foram pós-fixadas em tetróxido de ósmio (OsO4) a 1% em tampão cacodilato de sódio, por 2 h a temperatura ambiente. Após, as amostras foram desidratadas em uma série acetônica crescente (30% - 100%) por 15 min cada. Logo, as amostras foram infiltradas com resina Spurr em séries graduais de acetona-resina Spurr por 72 h, seguidas de infiltrações em resina pura por 12 h e polimerizadas em estufa a 70ºC por 24 h. As secções ultrafinas foram realizadas com navalha de diamante em ultramicrótomo e, posteriormente, foram contrastados com acetato de uranila a 5% e citrato de chumbo a 1%. As secções foram observadas e fotografadas no microscópio eletrônico de transmissão (MET), modelo JEM-1011 TEM (TEM 100 kV) (LCME/UFSC).
Foi realizada a contagem direta das alterações ultraestruturais relacionadas à presença de espaço perinuclear, vesículas eletrontransparentes, vacúolos autofágicos e vesículas eletrondensas, bem como dos perfis mitocondriais (n = 3 embriões/grupo; 10 micrografias/ventrículo/embrião).
3.11. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados morfométricos e quantitativos foram analisados no programa Statistica®, versão 13, sendo a normalidade dos dados testada previamente. Foi realizada análise de variância ANOVA uma via, seguido do teste post-hoc de Tukey. A interação entre o tratamento com MeHg e a lateralidade dos ventrículos foi avaliada através de ANOVA duas vias. Diferenças significativas foram consideradas, quando p ≤ 0,05. Os dados foram apresentados em valores de média ± erro padrão da média.
4. RESULTADOS
A toxicidade do MeHg sobre o coração durante o desenvolvimento foi avaliada através de diferentes parâmetros celulares e teciduais, que incluem a organização morfológica das paredes ventriculares, a análise do ciclo celular e apoptose, a indução ao estresse vascular e a organização subcelular dos cardiomiócitos,. Além desses parâmetros e, considerando a importância da integridade celular/tecidual para o funcionamento cardíaco, foi avaliada também a funcionalidade do coração por meio da quantificação dos batimentos cardíacos.
4.1. EFEITO DO MeHg SOBRE A ORGANIZAÇÃO DAS PAREDES DAS CÂMARAS CARDÍACAS
A análise do coração em secção frontal dos embriões do grupo controle evidenciou os átrios com o tecido das paredes mais finas e um septo interatrial com espessura continua. O tecido das paredes dos ventrículos apresentavam trabéculas com aspecto esponjoso, presentes desde o septo atrioventricular até a base do ventrículo; o tecido do septo interventricular não apresentou trabéculas (Figura 7a). Quando comparados VE e VD, observou-se que o VE possuía trabéculas mais finas e longas e a espessura da parede do tecido ventricular foi aproximadamente três vezes maior que a do VD. Diferentemente, os embriões do grupo exposto ao MeHg (Figura 7b), apresentaram coração com as trabéculas do VE semelhantes às do VD. Adicionalmente, as trabéculas do VD não apresentam aspecto esponjoso e não foram observadas em toda a extensão desse ventrículo.
Ainda, observou-se alterações na morfologia das trabéculas nos ventrículos dos embriões expostos ao MeHg (3 embriões com alteração/5 embriões analisados), quando comparados aos embriões do grupo controle (0 embriões com alteração/5 embriões analisados).
A análise morfométrica (Quadro 3) demonstrou que a exposição ao MeHg induziu redução significativa na espessura média das paredes do VE (61,78 μm; ± 17,86; p = 0,01) em relação ao grupo controle (154,83 μm ± 25,90) (Figura 8).
Figura 7. Secção frontal do coração de embriões de Gallus domesticus em E10, corado com HE. Destaque para
a organização das câmaras cardíacas e trabéculas ventriculares nos embriões dos grupos controle (a), exposto ao MeHg (b). AD, átrio direito; AE, átrio esquerdo; SAV, septo atrioventricular; SIA, septo interatrial; SIV, septo interventricular; VD, ventrículo direito; VE, ventrículo esquerdo; #, trabéculas. Barras de escala = 200 μm.
Quadro 3: Análises comparativas entre a morfologia e morfometrias do coração de embriões
G. domesticus controle e exposto ao MeHg, em E10.
Número de corações com alteração/ Número de corações analisados
Características teciduais Espessura das paredes
(μm) (média ± erro padrão)
VE VD VE VD
Controle 0/5
- Parede mais espessa com aspecto esponjoso - Trabéculas contínuas, conservadas, espessas e alongadas
- Parede mais espessa com aspecto esponjoso - Trabéculas contínuas, conservadas, espessas e alongadas 154,83 (± 25,90) (± 16,17) 96,37 MeHg 3/5
- Parede mais fina e alongadas, com aspecto dissociado
- Trabéculas finas alongadas
- Parede um pouco mais fina, com aspecto dissociado
- Trabéculas pouco visíveis
61,78
Figura 8. Espessura média da parede dos ventrículos do coração de embriões de Gallus domesticus em E10 dos
grupos controle e exposto ao MeHg. VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito. Dados apresentados em média ± erro padrão. * indica p < 0,01.
4.2. EFEITO DO MeHg SOBRE O CONTEÚDO DAS PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA INDUÇÃO DE DANO AO DNA
A ocorrência de danos ao DNA induzidos pelo MeHg nas células do coração de embriões em E10 foram avaliadas através de dois marcadores, γH2A.X e PCNA. Os embriões do grupo exposto ao MeHg, apresentaram média de 180,6 (± 38,15) células reativas para γH2A.X, um marcador que identifica quebra da dupla fita de DNA, enquanto os embriões do grupo controle apresentaram média de 194 (± 19,94) células reativas para γH2A.X (Figura 9 c, d).
Ainda, foi observado que os embriões do grupo exposto ao MeHg apresentaram média de 915,5 (± 104,8) células reativas para PCNA, um marcador que é um antígeno nuclear de proliferação celular, que atua na replicação e também no reparo de moléculas de DNA que possuem dano, enquanto os embriões do grupo controle apresentaram em média 765,3 (± 86,28) células reativas para PCNA (Figura 9 e, f).
Figura 9. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas envolvidas na ocorrência de dano ao DNA
no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a – b) A região do quadrado vermelho indica a região da população das células de interesse reativas para as proteínas γH2A.X e PCNA. (c –f) Número total de células reativas para as proteínas γH₂AX e PCNA, respectivamente. (g) Representação gráfica da quantificação (média ± erro padrão) das células reativas para as proteínas analisadas.
4.3. EFEITO DO MeHg SOBRE A PROLIFERAÇÃO CELULAR
Neste estudo foram realizadas análises de marcações celulares por imuno-histoquímica, a fim de verificar alterações induzidas pelo MeHg no conteúdo da proteína PHH3, envolvida na condensação da cromatina no processo de proliferação celular. A exposição ao MeHg promoveu redução significativa do número de células PHH3-positivas no VE, onde os embriões expostos ao MeHg apresentaram média de 15,62 células PHH3-positivas (± 0,75, p = 0,01), enquanto que os embriões controle apresentaram média 19,12 células PHH3-positivas (± 0,39). No VD, também foi observada a redução significativa do número de células PHH3-positivas, onde os embriões expostos ao MeHg apresentaram média de 17,50 células PHH3-positivas (± 0,42, p = 0,02), enquanto que os embriões controle
apresentaram média de 21,12 células PHH3-positivas (± 1,43) (Figura 8). A análise ANOVA de duas vias demonstrou que houve interação entre o tratamento com o MeHg e a lateralidade dos ventrículos (F(5,915) = 28; p = 0,02), que quando comparadas as diferenças do número de células em proliferação dos embriões expostos ao MeHg nos VE e VD, a exposição induziu redução da proliferação celular diferenciada no VE (Figura 10).
Figura 10. Análise por imuno-histoquímica da proliferação celular utilizando anticorpo anti-PHH3 no coração
de embriões de Gallus domesticus em E10. (a) Secção frontal do coração de Gallus domesticus em E10, com quadrado demonstrando a região destacada em c e d. (b) Gráfico, indica o número médio de células PHH3-positivas para VE e VD, com dados apresentados em média ± erro padrão. * indica diferença significativa (p < 0,05). # indica a interação entre o tratamento com MeHg e a lateralidade dos ventrículos. (c) Secções frontais do coração dos embriões do grupo controle e exposto ao MeHg (d) mostrando as células PHH3-positivas (cabeça de seta). Barras de escala = 20 μm. VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito.
4.4. EFEITO DO MeHg SOBRE O CONTEÚDO DE PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR Os conteúdos de duas proteínas-chaves do ciclo celular, p21 e p53, foram avaliados nas células do coração, após o tratamento com MeHg. Não foram observadas alterações significativas no conteúdo proteico de p21, onde os embriões do grupo exposto ao MeHg
média de 543 (± 93,02) células reativas, enquanto que os embriões controle apresentaram média de 500,8 (± 74,84) células reativas (11 a, c).
Quanto ao conteúdo proteico de p53, verificou-se um aumento significativo nos embriões expostos ao MeHg, que apresentaram média de 688,8 (± 93,5; p = 0,01) células reativas, comparado aos embriões controle que apresentaram média de 414,4 (± 49,9) células reativas (Figura 11 b,d).
Figura 11. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas envolvidas no ciclo celular no coração de
embriões de Gallus domesticus em E10. (a - d) Número total de células reativas para as proteínas p21 e p53, respectivamente. (e) Representação gráfica da quantificação (média ± erro padrão) das células reativas para as proteínas analisadas. * indica p < 0,05.
Foram realizadas análises de marcações celulares por imuno-histoquímica e por citometria de fluxo, a fim de verificar as alterações induzidas pelo MeHg no conteúdo da proteína Caspase-3, esta que é uma das caspases efetoras da apoptose.
Através da análise de imuno-histoquímica, não foram observadas alterações significativas quando observados o VE dos embriões expostos ao MeHg, que apresentaram média de 8,16 células Caspase-3-positivas (± 1,49), enquanto que os embriões controle apresentaram média de 10,83 células Caspase-3-positivas (± 2,52) e expostos ao MeHg (12 b, c). No VD, também não foi observada alterações significativas para Caspase-3, entre expostos ao MeHg que apresentaram média de 8,33 células Caspase-3-positivas (± 1,75), enquanto que os embriões controle apresentaram média de 14,50 células Caspase-3-positivas (± 2,71) (Figura 12 b, d).
Através da análise de citometria de fluxo, a qual foi macerado o coração do embrião por inteiro, foram observadas alterações significativas no conteúdo proteico de Caspase-3. Nesta análise observou-se que os embriões do grupo exposto ao MeHg apresentaram média de 579,1 células reativas (±102,7; p = 0,05), enquanto que os embriões do grupo controle apresentaram média de 382,5 células reativas (±59,28) (Figura 13 a-c).
Figura 12. Análise por imuno-histoquímica da ocorrência de morte celular utilizando anticorpo anti-Caspase3
no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a) Secção frontal do coração de Gallus domesticus em E10, com quadrado demonstrando a região destacada em c e d. (b) ) Gráfico, indica o número médio de células Caspase-3-positivas para VE e VD, com dados apresentados em média ± erro padrão. (c) Secções frontais do coração dos embriões do grupo controle e exposto ao MeHg (d) mostrando as células Caspase3-positivas (cabeça de seta). Barras de escala = 20 μm. VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito.
Figura 13. Análise quantitativa por citometria de fluxo da proteína Caspase-3 no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a – b) Número total de células reativas para a proteína Caspase3. (c) Representação gráfica
da quantificação (média ± erro padrão) das células reativas para a proteína analisada. * indica p < 0,05.
A fim de verificar a ocorrência de apoptose induzida pela exposição ao MeHg, foi utilizado o método de TUNEL para marcações celulares no coração de embriões de G.
domesticus. Não foi observado um aumento significativo no VE dos embriões expostos ao
MeHg, que apresentaram média de 33,83 células positivas/mm2 (± 4,40), enquanto que os embriões controle apresentaram média de 27,17 células positivas/mm2 (± 6,66).
Por outro lado, o VD dos embriões expostos ao MeHg apresentaram média de 32,50 células positivas/mm2 (± 19,8, p = 0,03), enquanto que os embriões controle apresentaram
média de 59,50 células positivas/mm2 (± 18,8), demonstrando uma redução significativa de células apoptóticas (Figura 14 a,b,f).
Figura 14. Análise pelo método de TUNEL da ocorrência de apoptose no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a) Secção do VD do grupo controle, mostrando as células TUNEL-positivas (cabeça de
seta), (b) secção do VD do grupo exposto ao MeHg. (c) Secção do VE do grupo controle, (d) secção do VE exposto ao MeHg. (e) Secção frontal do coração de Gallus domesticus em E10, com quadrado demonstrando a região destacada em a, b, c e d. (f) Gráfico, indica o número médio de células TUNEL-positivas para VE e VD, com dados apresentados em média ± erro padrão. * indica p < 0,05. Barras de escala = 20 μm. VE, ventrículo esquerdo; VD, ventrículo direito.
4.6. ANÁLISE DO CONTEÚDO PROTEICO DE NOS1 E NOS3
Foram realizadas análises de marcações celulares por citometria de fluxo, a fim de verificar as alterações induzidas pelo MeHg no conteúdo das proteínas NOS1 e NOS3. A NOS1 e NOS3, estão relacionadas ao estresse vascular.
Foram observadas reduções significativas no conteúdo proteico da NOS1, observou-se que os embriões do grupo exposto ao MeHg apreobservou-sentaram média de 190,5 células reativas (± 10,52; p = 0,02), enquanto que os embriões do grupo controle apresentaram média de 242,3 células reativas (± 19,61) (Figura 15 a, c).
Quanto ao conteúdo proteico da NOS3, observou-se que os embriões do grupo exposto ao MeHg apresentaram média de 299,8 células reativas (± 40,46; p = 0,03), enquanto que os embriões do grupo controle apresentaram média de 204,3 células reativas (± 10,19) (Figura 15 b, d), demonstrando aumento significativo no conteúdo proteico da NOS3.
Figura 15. Análise quantitativa por citometria de fluxo das proteínas NOS1 e NOS3 no coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a - d) Número total de células reativas para as proteínas NOS1 e NOS3,
respectivamente. (e) Representação gráfica da quantificação (média ± erro padrão) das células reativas para as proteínas analisadas. * indica p < 0,05.
4.7. EFEITO DO MeHg SOBRE A ULTRAESTRUTURA DAS TRABÉCULAS VENTRICULARES E DOS CARDIOMIÓCITOS
Através da análise por MEV dos ventrículos, observou-se que nos embriões controle as trabéculas do VE e VD apresentaram-se com formato de feixes espessos e alongados, arranjados irregularmente na forma de um emaranhado (Figura 16 a, b). No VD dos embriões expostos ao MeHg, a única alteração observada foi na espessura dos feixes (Figura 16 c). No entanto, no VE dos embriões expostos ao MeHg, a morfologia das trabéculas apresentou orientação e arranjo circular (Figura 16 d).
Figura 16: Eletromicrografias de varredura das trabéculas ventriculares do coração de embriões de Gallus domesticus em E10, após exposição ao MeHg.
Através da análise de MET, foram observados os cardiomiócitos das trabéculas ventriculares organizados em duas ou três camadas, alongados e de delimitação irregular, e com espaços intercelulares (Figura 17).
No VD dos embriões expostos ao MeHg, os cardiomiócitos apresentaram núcleos com dilatações no espaço perinuclear e em seu citoplasma as mitocôndrias foram visualizadas com cristas dilatadas (Figura 17 d, e). Foram observadas vesículas contendo mitocôndrias no seu interior, com as aspecto compatível à mitofagia (Figura 17 f), vesículas com presença de corpos residuais em seu interior (Figura 17 g), vesículas eletrontransparentes (Figura 17 h vesículas eletrondensas, em maior concentração no citoplasma dos embriões expostos ao MeHg (Figura 17 i). No VD dos embriões controle, os cardiomiócitos apresentaram núcleos com a presença de nucléolo e sem dilatações no espaço perinuclear (Figura 17 b), citoplasma com miofibrilas e perfis mitocondriais com cristas sem dilação (Figura 17 a).
No VE dos embriões expostos ao MeHg, os cardiomiócitos apresentaram núcleos íntegros sem dilatação no espaço perinuclear, no citoplasma foi observada a presença de mitocôndrias com cristas com dilatação evidentes, presença de vesículas eletrondensas, eletrontransparentes e membranas concêntricas (Figura 18 c, d). No VE dos embriões controle, os cardiomiócitos apresentaram as mesmas características do VD, com a presença de mitocôndrias com cristas íntegras próximas as miofribilas (Figura 18 a, b).
Figura 17. Eletromicrografias de transmissão do ventrículo direito (VD) do coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a) Eletromicrografia do VD do grupo controle, mostrando a visão geral do cardiomiócito,
presença de núcleo (N) com nucléolo e citoplasma com inúmeras mitocôndrias (M). (b) Detalhe da integridade na membrana nuclear. (c) Detalhe da mitocôndria e das cristas mitocôndrias íntegras. (d) Eletromicrografia do VD do grupo exposto ao MeHg, mostrando a visão geral do cardiomiócito. (e) Detalhe do espaço perinuclear (setas), mostrando mitocôndrias com cristas dilatadas (M). (f-g) Detalhe das vesículas autofágicas (asterisco), mostrando mitocôndrias com cristas dilatadas (M). (h) Detalhe de vesículas eletrontransparentes (setas), mostrando mitocôndrias (M). (i) Detalhe de vesículas eletrondensas (setas), mostrando mitocôndrias com cristas dilatadas (M).
Figura 18. Eletromicrografias de transmissão do ventrículo esquerdo (VE) do coração de embriões de Gallus domesticus em E10. (a) Eletromicrogradia do VE do grupo controle, mostrando a visão geral do cardiomiócito,
com citoplasma com inúmeras mitocôndrias (M). (b) Detalhe de mitocôndrias com cristas íntegras (M). (c) Eletromicrografia do VE do grupo exposto ao MeHg, mostrando a visão geral do cardiomiócito com vesícula eletrondensa (seta) e mitocôndrias (M). (d) Detalhe das mitocôndrias com cristas dilatadas (M) e presença de vesículas eletrondensas (seta). (e) Detalhe das vesículas eletrontransparentes (setas) e mitocôndrias com cristas dilatadas (M). (f) Detalhe de membranas concêntricas (asterisco) e mitocôndrias com cristas dilatadas (M). Mf; miofibrilas.
Neste estudo foram observadas a presença de dilatações no espaço perinuclear, presença de vesículas eletrondensas, eletrontransparentes e autofágicas nos cardiomiócitos dos ventrículos. No VE dos embriões do grupo exposto ao MeHg, 24/30 (80%) dos cardiomiócitos apresentaram dilatações no espaço perinuclear, enquanto que no VE dos embriões controle, 6/30 (20%) dos cardiomiócitos apresentaram dilatações no espaço
