UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
VANESSA GONÇALVES DOS SANTOS
EXPLORANDO NOVAS APLICAÇÕES PARA A TÉCNICA DE
ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAÇÃO/DESSORÇÃO POR LASER - LDI-MS
CAMPINAS 2016
EXPLORANDO NOVAS APLICAÇÕES PARA A TÉCNICA DE
ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAÇÃO/DESSORÇÃO POR LASER - LDI-MS
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA VANESSA GONÇALVES DOS SANTOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.
CAMPINAS 2016
“Não se deve dar ouvidos àqueles que aconselham ao homem, por ser mortal, que se limite a pensar coisas humanas e mortais, ao contrário, porém, à medida do possível, precisamos nos comportar como imortais e tudo fazer para viver segundo a parte mais nobre que há em nós”
Primeiramente a Deus por estar presente em todos os momentos da minha vida. Ao meu querido marido Henrique e a minha família por me apoiar sempre. Ao professor Marcos N. Eberlin pela orientação e amizade.
Ao Instituto de Química da UNICAMP e a CPG por todo apoio para a realização deste doutorado.
Aos amigos Mateus Sudano, Alessandra Tata, Humberto Milagre e Maíra Fasciotti pela contribuição que deram a minha formação nas diversas discussões que tivemos para a elaboração desses trabalhos.
Aos amigos do laboratório ThoMSon de espectrometria de massas que me ensinaram muito nesses anos de doutorado.
Aos amiguinhos do Lanagro, por aguentar toda minha “simpatia” nesses dias “difíceis”. Ao CNPq e a Petrobrás pelo financiamento nos anos iniciais do desenvolvimento dessa tese.
Esse trabalho aplicou a espectrometria de massas (MS) com ionização/dessorção por laser (LDI), na análise de compostos alvo presentes em matrizes complexas explorando novas aplicações práticas para a técnica. Foram empregadas duas abordagens, a análise por
fingerprinting que caracteriza as amostras por meio de seu perfil característico e análise por
imageamento (MSI).
A presença de fulerenos como constituintes de materiais carbonáceos ou sua formação como artefatos da análise por LDI-MS foi reinvestigada e revisada. Os resultados mostraram que, usando amostras de asfaltenos com diferentes composições ou padrões de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA), anéis fulerenos Cn são formados com frequência como artefatos predominantes sob a radiação do laser. Quando os presentes resultados são avaliados a luz da vasta literatura em LDI-MS de materiais carbonáceos, a formação de artefatos de fulerenos parece ser particularmente frequente, sendo mais comum em amostras com alta concentração de HPAs e variando de acordo com o tipo e a intensidade do laser utilizado.
O segundo trabalho utilizou a técnica de LDI assistida por matriz (MALDI) na análise de embrião único bovino cuja criopreservação pode ser influenciada por fatores como, subespécies envolvida, presença de gotas lipídicas e cultura in vitro. Porém, existe pouca informação disponível sobre lipídeos de membrana em embriões. O objetivo desse trabalho foi comparar os perfis de lipídeos de membrana e relacionar essa informação aos níveis de lipídeos citoplasmáticos presentes em blastocistos de Nellore e Simmental produzidos in vivo (ET) e in
vitro (IVP). Os resultados mostraram que o perfil fosfatidilcolinas e esfingomielinas de
membrana difere significantemente em nível de insaturação e composição da cadeia carbônica em blastocistos bovinos devido as subespécies e condições de cultura in vitro. O terceiro trabalho surgiu da necessidade de aperfeiçoamento da técnica de análise de embrião único buscando obter resultados mais compreensíveis de fingerprinting de lipídeos por MALDI-MS e aumentar consideravelmente a informação lipídica obtida de um único embrião.
Partindo, então para uma abordagem de análise por imageamento, a habilidade da espectrometria de massas LDI nanoassistida (NALDI-MS) em promover um monitoramento seletivo com uma distribuição espacial apropriada de perfis lipídicos de tecidos tumorais após fixação do tecido na placa, foi testada. O imageamento por NALDI-MS identificou e mapeou vários potenciais biomarcadores em um modelo de melanoma murino (B16/F10) tratados com suplemento sintético contendo fosfoetanolamina (PHO-S) frente ao tecido tumoral controle
resultados mostraram uma diminuição na abundancia relativa dos biomarcadores do tumor. Por fim, a técnica de imageamento por MALDI foi aplicada para determinar a distribuição espacial de peptídeos tais como microcistinas cíclicas e nudularinas liberadas por culturas de cianobactérias diretamente no ágar. Buscando um melhor entendimento da liberação desses peptídeos e outros metabólitos chave tais como aeruginosina 602 e o sideroforo anaquelin a MSI foi aplicada para mapear culturas individuais e a interação entre culturas mostrando um grande potencial em monitorar espacialmente detalhes bioquímicos de interações e mecanismos de defesa dessas cianobactérias.
This work applied laser desorption/ ionization mass spectrometry (LDI), in the analysis of target compounds present in complex matrices exploring new practical applications for the technique. Two approaches were employed: the fingerprinting analysis that characterizes the samples by means of their characteristic profile and mass spectrometry imaging (MSI).
The presence of fullerenes as constituents of carbonaceous materials or their formation as artifacts of the LDI-MS analysis was reinvestigated and reviewed. The results showed that, using asphaltenes samples with different compositions as well as polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) standards, Cn fullerene rings are often formed as predominant artifacts under laser radiation. When the present results are also evaluated in the light of the vast literature on LDI-MS of carbonaceous materials, the formation of fullerene artifacts appears to be particularly frequent, being more common in samples with high concentration of PAH and varying according to the type and intensity of the laser used.
The second work used matrix assisted LDI (MALDI) technique in the analysis of bovine single embryo whose cryopreservation can be influenced by factors such as subspecies involved, presence of lipid droplets and in vitro culture. However, little information is available on membrane lipids in embryos. The objective of this work was to compare the membrane lipids profiles and to relate this information to the levels of cytoplasmic lipids present in Nellore and Simmental blastocysts produced in vivo (ET) and in vitro (IVP). The results showed that the phosphatidylcholines and sphingomyelins profile differs significantly in the level of unsaturation and carbon chain composition in bovine blastocysts due to subspecies and in vitro culture conditions. The third work arose from the need to improve the single embryo analysis technique in order to obtain more comprehensible results of lipid fingerprinting by MALDI-MS and to considerably increase the lipid information obtained from a single embryo.
Starting from an imaging approach, the ability of nano-assisted LDI mass spectrometry (NALDI-MS) to promote selective monitoring with an appropriate spatial distribution of lipid profiles of tumor tissues after tissue fixation on plate was tested. NALDI-MS imaging has identified and mapped several potential biomarkers in a murine melanoma model (B16 / F10) treated with synthetic supplement containing phosphoethanolamine (PHO-S) against control (untreated) tumor tissue. This method provided good quality and chemical selectivity to the images, with preservation of spatial distribution and less interference from the tissue and the results showed a decrease in the relative abundance of the tumor biomarkers.
directly into the agar. Aiming for a better understanding of the release of these peptides and other key metabolites such as aeruginosine 602 and siderophore anaquelin the MSI was applied to map individual cultures and the interaction between cultures showing a great potential in spatially monitoring biochemical details of interactions and defense mechanisms of these cyanobacteria.
1 Introdução Geral...13
1.1 Os Componentes do Espectrômetro de Massas ...18
1.1.1 Ionização/Dessorção por Laser ...18
1.1.2 Ionização/Dessorção por Laser Assistida por Matriz (MALDI)...19
1.2 Diferentes Abordagens nas Análises por Espectrometria de Massas...23
1.2.1 Análise por Fingerprinting...23
1.2.2 Análise por Imageamento...25
2 Artigos Publicados...29
2.1 Fulerenos em asfaltenos e outros materiais carbonáceos: Constituintes naturais ou artefatos do laser? ...29
2.1.1 Autorização para reprodução do artigo...30
2.1.2 Material suplementar...39
2.2 Variação do Perfil de fosfatidilcolina e esfingomielina em blastocistos de Bos taurus indicus e Bos taurus taurus produzidos in vivo e in vitro...41
2.2.1 Autorização para reprodução do artigo...41
2.3 Otimização da análise de perfil de embrião único por espectrometria de massas...53
2.3.1 Autorização para reprodução do artigo...54
2.3.2 Material suplementar...65
2.4 Imageamento de tumores por dessorção/ionização por laser nanoassistida...68
2.4.1 Autorização para reprodução do artigo...68
2.5 Imageamento cianobacterias de água fresca por MALDI: Distribuição espacial de toxinas e outros metabolitos...74
5 Referências......97
1. Introdução Geral
A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica que permite discriminar íons de acordo com sua razão massa/carga (m/z). Essa técnica, que hoje tem seu papel consolidado não só na química como nos mais diversos campos da ciência, teve seu início com os trabalhos de J.J. Thomson sobre a descoberta do elétron em 18971 e se estabeleceu como uma ferramenta poderosa com os trabalhos de Francis Aston que possibilitaram a medição da massa dos átomos culminando na descoberta dos isótopos2. Aston recebeu em 1922 o prêmio Nobel em química momento em que já havia aperfeiçoado seu equipamento melhorando o poder de resolução e provando a existência de diversos isótopos. Nos anos seguintes essa tecnologia teria seu desenvolvimento acelerado pelo projeto Manhattan e a segunda guerra mundial3.
Até esse momento os espectrômetros de massas eram utilizados predominantemente na área da física para resolver questões acerca da natureza dos átomos. Foi Alfred Nier, um físico que iniciou seus estudos em engenharia elétrica, que tornou o espectrômetro de massas aplicável a outras áreas. Surgia o espectrômetro de massas Nier-Johnson que combinava analisadores magnéticos e eletrostáticos3.
Por volta dos anos 1940 os espectrômetros de massas já eram comerciais e empregados em industrias para controlar processos de produção. Nessa época ainda não se entendia muito bem o que acontecia dentro do equipamento e as aplicações se limitavam as análises quantitativas, que não eram tão úteis no meio acadêmico.
Assim, a relação entre a estrutura química e o espectro de massas foi alvo de muitas discussões nos anos subsequentes. Enfim, o trabalho dos americanos Freed McLafferty, Klaus Biemann e Carl Djerassi possibilitou o entendimento dos mecanismos de fragmentação de diferentes classes de moléculas orgânicas possibilitando aos químicos determinarem as estruturas de moléculas desconhecidas por espectrometria de massas ampliando grandemente o campo de aplicações da técnica3.
MacLafferty esteve focado em relacionar o espectro com estruturas de compostos conhecidos estabelecendo regras para a fragmentação dos compostos. Biemann, por sua vez, trabalhou na determinação da estrutura de moléculas complexas por MS estabelecendo os princípios para o sequenciamento de peptídeos que mais tarde serviriam de base para a proteômica moderna4. Djerassi trabalhou no entendimento de mecanismos de fragmentação e
Já nos anos 1980, pequenas moléculas eram analisadas por espectrometria de massas de forma rotineira tanto de modo quantitativo como qualitativo. Enquanto a indústria do petróleo utilizava largamente a cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas, no meio acadêmico a caracterização estrutural de moléculas era uma ferramenta de grande importância na química de produtos naturais, química orgânica sintética e no entendimento de mecanismos de reações orgânicas.
Nesse meio tempo outros analisadores de massas foram desenvolvidos e a tecnologia foi cada vez mais aperfeiçoada. O conceito dos analisadores por tempo de voo (TOF) surgiu em 1946 proposto por William E. Stephens da universidade da Pensilvania7. Nesse analisador os íons podiam ser separados em ordem crescente de sua razão massa/carga de acordo com o tempo que estes levavam para percorrer um tubo de voo de tamanho determinado partindo de um ponto de partida onde estes eram acelerados até o ponto de chegada que seria o detector (Figura 1). Entretanto, em seu surgimento, os analisadores TOF apresentavam uma resolução muito inferior sendo pouco utilizados.
Figura 1: Analisador de massas por tempo de voo.
Introduzido nos anos 1950 pelo físico Wolfgang Paul e H. Steinwedel8, o analisador de massas quadrupolar consiste em quatro barras cilíndricas paralelas. Um potencial de corrente direta é aplicado em duas dessas barras e nas outras duas aplica-se um potencial de radiofrequência alternado. A combinação de potencial DC, rf e frequência de alternância de carga das barras cria uma trajetória de oscilação complexa e específica para uma restrita faixa de m/z discriminando os demais íons que não possuem o valor de m/z específico para aquela trajetória. Em outras palavras o analisador quadrupolo funciona com um filtro de massa permitindo a determinação da m/z por meio da estabilidade na trajetória do íon até o detector.
Nos anos subsequentes o trabalho de W. Paul, possibilitou prever a força exercida por um íon no interior do quadrupolo de modo tridimensional, levando a percepção de que todos os íons no quadrupolo poderiam ser representados em um diagrama de estabilidade. Especificamente os cientistas podiam prever com base no diagrama de estabilidade se um íon
ficaria em uma trajetória estável (trapeado) ou instável. (ejetado). Baseado nessa descoberta surgia o analisador de massas íon trap quadrupolar e posteriormente o ion trap 3D que daria a Wolfgang Paul o prêmio nobel de física. Ao contrário do quadrupolo, o íon trap permite a análise dos íons devido à instabilidade na trajetória, já que os íons com uma faixa restrita de
m/z são ejetados e captados pelo detector9.
Nesse momento já haviam três tipos de íon traps: 1) o trap de Paul descrito anteriormente; 2) o trap de Penning que utiliza um campo magnético axial para confinar partículas carregadas radialmente e um campo elétrico quadrupolar para confinar as partículas axialmente10. Esse tipo de íon trap, utilizado atualmente no estudo de partículas subatômicas, deu origem ao analisador de massas por ressonância ciclotrônica de íons (ICR) descrito inicialmente por J. A. Hipple em 194911 e transformado em um analisador de massas de altíssima resolução por Melvin Comisarow e Alan Marshall em 197412; 3) e o trap de Kingdon que consiste em quatro eletrodos: um central fino, outro externo e dois fechando as extremidades13. Aplicando-se uma voltagem nos eletrodos interno e externo cria-se um
potencial logaritmo radial entre os dois eletrodos. O trap de Kingdon deu origem em 2000 ao último tipo de analisador de massas desenvolvido até o momento, o Orbitrap proposto por Alexander Makarov14.
Porém, apesar da instrumentação analítica ter se desenvolvido muito desde seu surgimento, até meados dos anos 1980 a análise de moléculas polares e de elevada massa molecular ainda era um grande desafio para a espectrometria de massas.
Nessa época a técnica de ionização ainda largamente empregada era a ionização por elétrons (EI) e a ionização química (CI). Técnicas cujo processo de ionização ocorre a pressão atmosférica surgiram na década de 1970, permitindo uma ionização branda, com baixa ou nenhuma fragmentação, porém ainda estavam limitadas a compostos relativamente voláteis e de baixa polaridade.
A técnica de ionização química a pressão atmosférica (APCI) surgiu em 1970 proposta por Evan Horning15 e inicialmente chamada de ionização a pressão atmosférica (API). Nessa técnica a amostra em solução passa por uma câmara de dessolvatação/vaporização onde as moléculas são vaporizadas. Após a dessolvatação, as moléculas em fase gasosa são ionizadas passando por uma descarga corona por um mecanismo semelhante ao da ionização química.
Tendo uma proposta semelhante, a técnica de fotoionização a pressão atmosférica16 (APCI) funciona de forma semelhante, porém a descarga corona é substituída nesse caso por uma fonte emissora de fótons (a mais utilizada é a lâmpada de criptônio).
Muito se buscava uma técnica que permitisse a ionização de proteínas e embora técnicas como bombardeamento de átomos rápidos (FAB)17, dessorção por plasma e ionização por termospray tenham tido alguns resultados tímidos na análise de proteínas de baixa massa molecular, pouco progresso havia sido obtido na época3.
Nessa época existia também a técnica de ionização/dessorção por laser (LDI) porém a alta energia do laser promovia extensa fragmentação da grande maioria das moléculas analisadas. Em 1985 os químicos alemães Karas e Hillikemp introduziram a técnica de ionização/dessorção por laser assistida por matriz (MALDI)18 na qual utilizava-se ácidos orgânicos aromáticos para absorver a energia do laser e promover a ionização dos analitos de forma branda. Porém, devido ao fato dessa técnica produzir íons monocarregados e limitação dos analisadores disponíveis na época, essa técnica levou ainda alguns anos para ser empregada em moléculas de alta massa molecular.
Finalmente em 1989 John Fenn e colaboradores publicaram um trabalho que abriu as portas para uma vasta gama de aplicações19. A técnica de ionização por eletrospray (ESI) tornou
possível a análise de moléculas de baixa ou alta massa molecular, alta polaridade e complexidade estrutural. No processo de ionização por eletropray a amostra é ionizada em solução e transferida diretamente para a fase gasosa através de um processo brando.
Com o surgimento da técnica de eletrospray a MS se viu com novos desafios na interpretação de espectros, assim como ocorreu do início dos anos 40. A detecção de moléculas multicarregadas, o conceito de íon quasimolecular ou molécula protonada abriu aos espectrometristas de massas um campo vasto e fértil de possibilidades.
John Fenn recebeu em 2002 o prêmio Nobel em química por sua contribuição no desenvolvimento me métodos brandos de análise de macromoléculas biológicas por espectrometria de massas. Esse prêmio foi compartilhado, nesse mesmo ano, com o químico japonês Koichi Tanaka que em 1988 descreveu um método brando de dessorção por laser utilizando uma suspensão de nano partículas metálicas em glicerol para a ionização de macromoléculas de até 100 kDa. Entretanto, embora o prêmio tenha sido tenha sido entregue a ele o método que hoje é largamente empregado na análise de proteínas foi desenvolvido alguns anos antes por Karas e Hillikemp.
As novas fontes de ionização impulsionaram ainda mais o desenvolvimento dos analisadores de massas principalmente aqueles que permitiam analise de moléculas com razão massa/carga elevada, como é o caso do TOF com a técnica de MALDI.
Nos anos seguintes houve um aumento impressionante na quantidade de fontes de ionização disponíveis. Principalmente com a introdução em 2004 das fontes de ionização ambiente tais como a ionização de dessorção por eletrospray (DESI) e análise direta em tempo real (DART) entre tantas outras. Essa nova área possibilitou a análise de amostras de forma direta, sem necessidade de preparo de amostra sendo largamente aplicada em diversas áreas20.
Assim, essa história de pouco mais de um século fez com que a espectrometria de massas, que até o final do século passado era limitada e restrita, se tornasse hoje uma técnica multidisciplinar difundida e essencial nas mais diversas áreas da ciência. Dentre as diversas aplicações dessa técnica podemos destacar a área de caracterização de complexos inorgânicos21 e polímeros22; caracterização de compostos polares do petróleo, área conhecida como petroleômica23; aplicações forense das mais diversas naturezas, tais como certificação de autenticidade de documentos, bebidas e outros itens de consumo, falsificação de moedas e análise de drogas de abuso24.
A MS recebe também bastante destaque na área de alimentos na quantificação de compostos garantindo não só uma maior qualidade dos produtos como também maior segurança alimentar para a população25.
As aplicações da espectrometria de massas na interface entre a química e as ciências médicas e biológicas podem ser citadas como as aplicações que mais se difundiram nos últimos anos, dentre elas podemos destacar a área das ômicas (genômica26, proteômica27, lipidômica28 e metabolômica29) nas quais a espectrometria de massas tem um papel crucial na identificação dos compostos e caracterização dos diferentes sistemas. A análise direta de bactérias30, fungos e protozoários31 já é hoje uma realidade na qual a identificação dos microrganismos e o diagnóstico de doenças pode ser feito em tempo recorde já na rotina de hospitais32.
A espectrometria de massas está também presente em cirurgias de alta complexidade detectando biomarcadores de câncer e determinando delimitações de corte para remoção de tumores33. A área de imageamento químico deu grande destaque a MS na área médica permitindo a caracterização espacial e tridimensional dos mais diferentes tecidos e doenças34. Com base nas diversas aplicações descritas aqui e muitas outras não mencionadas podemos constatar que a espectrometria de massas tem hoje no mundo todo um papel essencial na ciência. Esse papel tem crescido muito no Brasil com o aumento exponencial de laboratórios que utilizam a técnica de forma rotineira, seja nas universidades, nas industrias ou mesmo em laboratórios de hospitais.
1.1 Os Componentes do Espectrômetro de Massas
A técnica de espectrometria de massas permite discriminar íons de acordo com a razão massa-carga (m/z) de cada espécie analisada. O valor da m/z, atribuída a um íon, é um número adimensional, ou seja, a razão m/z não é uma unidade e sim um adjetivo do íon35. Isto é importante ressaltar, pois o que é medido em espectrometria de massas é a razão m/z e não a massa de um íon.
A Figura 2 apresenta um diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. Como a MS não analisa átomos neutros ou moléculas neutras, antes de discriminar os íons é necessário, primeiramente, gerá-los utilizando um sistema de ionização ou fonte de íons. Em geral a análise de um composto compreende cinco etapas: (i) a introdução da amostra, (ii) a ionização das moléculas, (iii) a passagem por um analisador de massas que separa os íons formados de acordo com a razão m/z, (iv) o detector que quantifica os íons e transforma o sinal em corrente elétrica e (v) o processador que converte a magnitude do sinal elétrico em função da razão m/z em dados proporcionando um espectro de massas correspondente.
Figura 2: Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas.
1.1.1 Ionização/Dessorção por Laser
Desde seu surgimento, muitos lasers têm sido usados para gerar íons na análise por espectrometria de massas. As primeiras tentativas de usar a ionização por laser na análise de compostos orgânicos ocorreram no início dos anos 1970. Principalmente a dessorção de íons protonados intactos de biomoléculas mais complexas tais como estaquiose e digitonina foram um marco nesse desenvolvimento36.
Porém, o processo de dessorção branda é limitado a uma pequena faixa de irradiância do laser (densidadede potência, ou seja, potência ótica do laser por cm2). Uma irradiância alta
resulta em extensiva fotoionização, com aumento e proeminente formação de íons inespecíficos de baixa massa molecular (produtos de recombinação no plasma de laser induzido)
Dessorção por laser (LD) é um método eficiente para produzir íons em fase gasosa. Geralmente o pulso de laser que gera de 106 a 1010 W cm-1 é focalizado diretamente sobre a superfície da amostra, normalmente um sólido, sobre uma área de 10-3 a 10-4 cm2. Esses pulsos de laser abrasam o material da superfície e criam um microplasma de íons e moléculas neutras que podem reagir entre elas na densa fase de vapor próxima a superfície da amostra. O pulso de laser realiza tanto a vaporização como a ionização da amostra37.
Essa técnica é usada no estudo de superfícies e na análise da composição local da amostra. Normalmente permite uma ionização seletiva ajustando-se o comprimento de onda do laser. Entretanto, em modos infravermelhos de LD, o laser cria um efeito térmico e não é necessário ajustar o comprimento de onda do laser para cada amostra37.
Uma vez que os sinais são produzidos em um curto espaço de tempo analisadores com detecção simultânea, tais como o analisador por tempo de voo são os mais utilizados. A probabilidade de se obter um espectro de massas satisfatório depende criticamente das propriedades físico-químicas do analíto (fotoabsorção, volatilidade, etc.). Além disso, os íons produzidos são quase sempre produtos de fragmentação da molécula original se sua massa molecular for acima de 500 Da37. Porém, essa situação mudou drasticamente com o desenvolvimento da técnica de MALDI.
1.1.2 Ionização/dessorção por laser assistida por matriz (MALDI)
Conforme mencionado anteriormente a técnica de ionização/dessorção por laser assistida por matriz, (MALDI) foi descrita por Karas e Hillenkamp em 198518. Nesta técnica, a amostra contendo a espécie de interesse e uma matriz (composto necessário para a ionização da amostra) são solubilizadas em solvente orgânico e/ou água e uma pequena quantidade de cada solução (normalmente 1µL) é depositada sobre uma placa. Com a evaporação do solvente, a matriz cristaliza e as moléculas da amostra se encontram inclusas nestes cristais (Figura 3). A matriz utilizada (geralmente ácidos orgânicos aromáticos) deve absorver no comprimento de onda do laser que incide sobre essa mistura e a energia do laser é absorvida pela matriz, o que promove a sua dessorção. As moléculas do analito, que estavam inclusas na matriz, são arrastadas para a fase gasosa e a formação dos íons ocorre através da transferência de carga
(transferência de prótons) das moléculas da matriz para o composto analisado que é, de forma geral, detectado na forma protonada [M+H]+.
Figura 3: Diagrama mostrando a ionização por MALDI.
O tipo de matriz, a técnica de deposição de matriz e os parâmetros do laser são fatores críticos do processo e podem afetar a análise. Dentre as matrizes mais utilizadas, no caso de UV-MALDI o ácido α-ciano-4-hidroxicinamico (CHCA) é largamente utilizado na análise de proteínas e peptídeos e tem sua aplicação otimizada em casos onde a concentração do analito é bem baixa, chegando a fentomols. Por outro lado, o ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB), que também é aplicado na análise de proteínas e peptídeos tem sua aplicação otimizada em amostras mais concentradas. O DHB também tem sido aplicado com sucesso na análise de carboidratos e peptídeos. No caso de amostras de DNA o ácido 3-hidroxipicolinico tem mostrado bons resultados38, já para proteínas intactas o ácido sinapinico é a matriz mais comumente utilizada. Existem dois mecanismos principais propostos para explicar o processo de ionização por MALDI. No modelo da protonação em fase gasosa39, o processo de produção dos íons envolve dois passos fundamentais: o primeiro consiste na fotoionização das moléculas de matriz no cristal formado pela matriz-analito pelo laser produzindo íons da matriz. O segundo passo consiste na transferência de carga dos íons da matriz para o analito neutro. Nesse modelo as moléculas da matriz tem um papel majoritário no processo de ionização. Portanto, a escolha da matriz ideal para cada tipo de aplicação, assim como o comprimento de onda especifico para uma determinada matriz é fundamental para se obter bons resultados.
Já o modelo do “sobrevivente sortudo” (do inglês: lucky survival model)40 é dependente do solvente utilizado na preparação da amostra bem como na basicidade do analito e, segundo proposto, ocorre em paralelo com o modelo da protonação em fase gasosa. Nesse modelo, o analito é ionizado durante a preparação de amostra e incorporado com os cristais matriz-analito junto com os correspondentes contra íons. A dessorção dos cristais, pela irradiação do laser, libera os íons do analito, os contra íons e as moléculas de matriz. Na fase gasosa ocorre uma
grande quantidade de neutralização entre o analito, contra íons e elétrons produzindo apenas íons de analito monocarregados (chamados de sobreviventes sortudos) como o resultado de um processo de neutralização de carga incompleto.
Esse modelo foi refinado para o chamado modelo do sobrevivente sortudo refinado. Os mesmos princípios do modelo original são aplicados onde as moléculas do analito são incorporadas nos cristais matriz-analito como moléculas precarregadas. Entretanto, no modelo refinado, as moléculas da matriz são incorporadas nos clusters dessorvidos na forma de moléculas ionizadas, contribuindo no processo de neutralização, levando a formação de apenas íons do analito monocarregado41.
Tanto o modelo de protonação em fase gasosa como o modelo do sobrevivente sortudo destaca a importância de matriz na ionização do analito em MALDI. Em 2011 Jaskolla and Karas provaram experimentalmente a ocorrência simultânea dos dois mecanismos previamente propostos. Nesse experimento, uma matriz deuterada foi usada para detectar e diferenciar entre os dois mecanismos. No modelo de protonação na fase gasosa, a carga é transferida do íons de matriz deuterada [ma+D] + para o analito neutro, formando o íon do analito deuterado [A+D] +
no lugar do íon [A+H]+. Entretanto, no modelo do “sobrevivente sortudo” indica que as
moléculas do analito já estão protonadas durante o preparo da amostra como [A+H]+. O espectro de massas mostrou a presença de ambas as espécies [A+H] + e [A+D] + validando assim os dois modelos41.
Outros parâmetros que podem determinar o mecanismo de ionização mais proeminente, incluem pH do solvente, basicidade do analito e fluência do laser (irradiância pelo tempo de exposição). Um analito de basicidade media (nicotinamida, m/z 122,05) foi investigado por MALDI-MS em soluções com diferentes pH usando uma matriz deuterada. Os resultados mostraram que uma diminuição no pH da solução de nicotinamida durante o preparo da amostra levava a um aumento das espécies [A+H] + de m/z 123,06 em comparação com a espécie [A+D]+. Isso indica que o modelo do sobrevivente sortudo seria o mecanismo de ionização predominante para soluções ácidas de nicotinamida. Entretanto, o aumento do pH da solução de nicotinamida ativa a transferência em fase gasosa durante o MALDI-MS, gerando significante quantidade de íons [A+D] + de m/z 124,06.
A fluência do laser também foi investigada nesse estudo, mostrando uma relação proporcional entre a fluência do laser e a formação de íons de nicotinamida via transferência em fase gasosa ([A+D] + íons) provavelmente devido ao aumento da ionização das moléculas da matriz42.
Embora a técnica de MALDI tenha aberto caminho para uma gama de aplicações tornando possível a análise de moléculas de elevada massa molecular, ela apresentava uma restrição no caso da análise de moléculas de baixa massa molecular devido a interferência casada pela ionização das moléculas da matriz. Além disso buscava-se a otimização de analises de compostos que pareciam não ionizar de modo satisfatório com as matrizes disponíveis43.
Nesse sentido surgiram algumas técnicas variantes da técnica de MALDI buscando alternativas para o uso de matriz. Ionização/dessorção por laser assistida por superfície (SALDI) é um método em espectrometria de massas livre de matriz que utiliza uma apenas uma superfície nanoestruturada para promover a ionização44. A espectrometria de massas com ionização por dessorção em silício (DIOS-MS) é um método de vaporização com laser para gerar íons na fase gasosa. As propriedades físico químicas da superfície de silício são cruciais para a performance da DIOS e podem ser controladas pela seleção do tipo de silício e das condições e gravura do silício45.
A técnica de NALDI46 foi a primeira técnica LDI livre de matriz disponível
comercialmente (Bruker). Voltada para a análise de compostos orgânicos de baixa massa molecular (< 3000 Da) a ionização ocorre na superfície de nanoestruturas de alumina densamente empacotadas (100/ µm2) com silanos perfluorinados. A cobertura perfluorinada adiciona propriedades hidrofóbicas a superfície nanoestruturada permitindo uma melhor deposição dos analitos e otimizando a ionização independentemente do tipo de solvente utilizado. A ionização em NALDI é similar à que ocorre em MALDI. A energia do lazer é absorvida pela superfície nanoestruturada da placa e parte dessa energia é transferida para o analito depositado na superfície causando sua dessorção. Acredita-se que a ionização ocorra logo acima da camada ativa da superfície da placa de NALDI por meio de reações de transferência de próton entre os analitos e espécies protonadas originadas da camada ativa que são geradas a partir de uma série de reações fotoquímicas47.
Ao contrário da análise por MALDI, NALDI e outras técnicas livres de matriz não apresentam um “ruído de fundo” devido a ionização da matriz na faixa de massa abaixo de m/z 700. Adicionalmente NALDI também apresenta a vantagem de não ter a formação de áreas de “hot spot” devido a deposição não uniforme de matriz. Além disso, não é necessário a etapa de desenvolvimento para escolha da matriz ideal para cada analito, permitindo uma análise mais rápida e sensível de compostos polares ou de média polaridade com o mínimo preparo de amostra.
Entretanto, apesar das vantagens descritas aqui, a técnica não ganhou popularidade devido ao custo elevado da placa e atualmente sua comercialização pela Bruker foi descontinuada.
1.2 Diferentes abordagens nas análises por espectrometria de massas
A técnica de espectrometria de massas pode ser empregada por meio de diferentes abordagens de análise. Entende-se aqui por abordagem a forma com que os dados são adquiridos no espectrômetro de massas e o modo com que o resultados gerados de determinação da massa dos compostos são tratados e interpretados.
Podemos citar por exemplo a abordagem quantitativa utilizando, por exemplo, o monitoramento de reações múltiplas (MRM) empregando injeção de amostra por meio de métodos cromatográficos. Nessa abordagem faz-se necessário o uso de analisadores de massas sequenciais que selecionam compostos de massa conhecida, que são fragmentados na câmara de colisão e um fragmento pré-determinado é monitorado ao decorrer da análise. Essa abordagem é largamente empregada em análises quantitativas que exigem alta sensibilidade e seletividade.
Podemos citar também a abordagem por full scan para análise de intermediários de reações orgânicas. Nessa abordagem, o espectro de massas é adquirido em determinada faixa de massa e os compostos detectados são interpretados um a um para a identificação dos intermediários formados durante a reação.
Nessa tese de doutorado foram empregadas duas abordagens de análise diferentes que serão descritas e comentadas a seguir, são elas a análise por fingerprinting e a análise por imageamento.
1.2.1 Análise por fingerprinting
O padrão de impressões digitais nas pontas dos dedos das mãos e dos pés é único para cada indivíduo. O desenvolvimento dessa marca registrada ocorre entre a 9° e a 24º semana de desenvolvimento do embrião. Como cada embrião experimenta diferentes condições de pressão e taxas de crescimento dentro do útero esse padrão de impressões digitais é diferente para cada indivíduo, mesmo no caso de gêmeos idênticos, e por essa razão tem sido utilizado em investigações forenses para estabelecer a identidade de indivíduos desde o final do século 19.
Esse conceito de identidade única, tem sido extrapolado para a química analítica em uma estratégia de analise não direcionada (non-target) cujo objetivo é detectar o maior número possível de compostos sem necessariamente identifica-los. O foco desse tipo de análise consiste na caracterização da amostra em comparação com outras amostras similares e não necessariamente na caracterização de cada composto detectado.
Essa abordagem é bastante empregada na análise de metabólitos sem a intenção de identificar cada metabólito detectado, mas sim comparar e classificar perfis ou modelos metabólicos que podem variar em resposta a uma doença, exposição a uma toxina, perturbações genéticas ou ambientais48, podendo ainda identificar substâncias discriminantes ou biomarcadores.
Figura 4: Esquema geral mostrando uma análise de fingerprinting49.
O fingerprinting pode ser obtido a partir de vários tipos de matrizes biológicas, seja de natureza humana, animal ou vegetal, como por exemplo, urina, plasma, saliva, tecidos, células, folhas, frutos, caule ou raiz. Esta metodologia de análise pode ser utilizada como ferramenta diagnóstica, por exemplo48, distinguindo diferentes estados fisiológicos entre organismos
submetidos à mutação e seus organismos originais50. Desta maneira o fingerprinting pode ser de grande valia comercial ou científica em estudos de caracterização de mutações genéticas, de respostas das plantas51 ou animais ao estresse ambiental, controle de qualidade, certificação de origem e verificação de autenticidade e/ou adulteração de extratos de plantas52, óleo de oliva, própolis, bebidas, perfume entre outros49.
A abordagem de análise por fingerprinting pode ser empregada em diversas técnicas como NMR53, FT-IR54 e espectrometria de massas acoplada a técnicas de separação (CE-MS55, GC-MS56 e LC-MS57) ou somente com infusão direta (ESI-MS58 e EASI-MS59), têm sido utilizadas para obtenção de fingerprintings. As vantagens mais importantes da espectrometria de massas em relação às demais técnicas são a alta sensibilidade e seletividade combinadas com a possibilidade de confirmar a identidade de componentes presentes em amostras biológicas complexas49.
A comparação entre os diferentes perfis obtidos para as amostras estudadas podem ser comparados utilizando ferramentas quimiométricas que ajudam a determinar as diferenças e semelhanças entre as amostras sem que seja necessário a identificação de cada composto. Esse tipo de tratamento de dados permite identificar quais íons presentes na amostra são realmente importantes para a diferenciação de uma determinada propriedade entre o conjunto de amostras estudado, economizando o tempo que seria gasto identificando cada um dos compostos detectados49. Esse tipo de abordagem é bastante empregado nas análises de petroleômica, metabolômica entre outras60.
1.2.2 Análise por imageamento
O imageamento por espectrometria de massas (MSI) é uma poderosa ferramenta, principalmente no estudo de amostras biológicas. Nesta técnica a habilidade de visualizar simultaneamente múltiplas distribuições moleculares ao longo da superfície de uma amostra sem a necessidade de marcadores químicos ou anticorpos é a principal vantagem desta técnica. Não são necessárias etapas de extração e homogeneização durante o preparo da amostra que resultariam na perda da relação espacial nas amostras estudadas61.
A técnica de imageamento por espectrometria de massas é, de certo modo, bastante simples. Um espectrômetro de massas precisa apenas ser equipado com uma placa (contendo a amostra) que é controlada por um computador e é capaz de se mover nas coordenadas x-y do plano trabalhando em conjunto com uma fonte capaz de produzir íons a partir da superfície da
amostra. Através da utilização de um software específico, a movimentação da placa com a amostra pode ser programada para permitir uma detecção continua ao longo da área da amostra permitindo que espectros de massas individuais possam ser adquiridos e atribuídos a áreas definidas da amostra criando, portanto, um pixel. O software é então utilizado para atribuir estes pixels a uma imagem na qual a intensidade relativa de um íon é mostrada como uma escala de cor falsa permitindo a visualização da distribuição molecular ao longo da superfície da amostra para uma dada massa observada, conforme mostra a Figura 5.
Figura 5: Visão geral das etapas de aquisição e tratamento de dados em um experimento geral de MSI62.
Desta forma, torna-se possível a obtenção de uma imagem molecular. A técnica de MSI apresenta muitas aplicações em ciências biológicas permitindo a conexão entre a informação molecular com fenótipos e revelando fenótipos moleculares totalmente novos que não poderiam ser observados através da histologia clássica.
Apesar dos primeiros trabalhos científicos de imagens moleculares terem sidos publicados há mais de 40 anos63, apenas recentemente a técnica de MSI tem sido largamente utilizada por espectrometristas de massas. O advento das imagens de tecidos baseadas em MALDI-MS no final da década de 1990 abriu espaço para amplas aplicações levando a rápida incorporação desta tecnologia em novas estratégias em pesquisa médica e bioquímica64. A histologia molecular por espectrometria de massas baseada em imagens se tornou uma nova tecnologia para o descobrimento de candidatos a biomarcadores65, perfil de metabólitos de
drogas66, análise de lipídeos67 e proteômica68. Atualmente MSI é uma técnica em constante desenvolvimento que tem sido aplicada não apenas em histologia molecular de tecidos, mas também para análise de bactérias69, produtos naturais (folhas e caules de plantas)70, materiais (vidros antigos, quartzo, circuitos)71 e até mesmo em química forense através da análise de impressões digitais72.
A técnica de MSI tem sido descrita na literatura utilizando diferentes tipos de espectrômetros de massas e diferentes fontes de ionização. As três fontes mais predominantemente empregadas nas mais diversas aplicações serão mostradas na figura 6.
A técnica de ionização mais antiga, denominada SIMS (Secondary Ion Mass
Spectrometry), utiliza um feixe focalizado de íons individuais ou clusters de partículas, tais
como Bi+, Au3+ e C60. O impacto deste feixe com a superfície da amostra leva a formação de
íons secundários que são comumente analisados via um analisador TOF (time-of-flight). O uso do feixe de íons primário permite aos instrumentos de SIMS obter imagens com uma resolução nanométrica, porém limita a faixa de massa de amostras biológicas a valores inferiores a 1000 Da devido à dificuldade de se ionizar moléculas de maiores massas moleculares (Figura 6B)73.
A técnica mais amplamente utilizada em estudos com imagens é MALDI que atualmente permite a obtenção de imagens com resolução de até 10 µm e a análise de proteínas intactas acima de 200 kDa (Figura 6A)74.
A mais recente das três é a técnica de DESI (Dessorption Electrospray Ionization). Esta é uma adaptação da ESI na qual o spray de solvente eletricamente carregado é direcionado para a superfície da amostra levando a solubilização do analíto. Colisões subsequentes das gotas carregadas, presentes no spray de solvente, com a superfície já úmida da amostra leva a dessorção de gotas secundárias que contém as moléculas carregadas do analito que serão, então, introduzidas no espectrômetro de massas para serem analisadas (Figura 6C)75. Embora DESI exija um preparo de amostras mais simples, atualmente a sensibilidade e a resolução espacial de DESI-MSI ainda se mantêm menor que a obtida por SIMS ou MALDI-MSI.
Figura 6: Representação esquemática das técnicas de ionização A) MALDI, B) SIMS e C) DESI.
A técnica MSI tem se tornado comum na pesquisa médica e biológica, isso graças aos regulares avanços em instrumentação, aplicações e ferramentas de análise de dados. Sua habilidade de monitorar simultâneamente centenas de distribuições moleculares ao longo da amostra sem a necessidade de marcadores químicos ou anticorpos tem permitido uma análise mais completa de sistemas biológicos levando a descoberta de novos candidatos a marcadores específicos de doenças, novos protótipos de fármacos e potencialmente visando um diagnóstico mais rápido, bem como um tratamento específico.
2
Artigos Publicados
Na sequência serão apresentados os artigos publicados que resultaram do trabalho desenvolvido durante essa tese de doutorado.
2.1 Fulerenos em asfaltenos e outros materiais carbonáceos: Constituintes naturais ou artefatos do laser?
2.2 Variação do Perfil de fosfatidilcolina e esfingomielina em blastocistos de Bos taurus indicus e Bos taurus taurus produzidos in vivo e in vitro.
Publicado originalmente em: Biology of Reproduction, 2012, 87(6):130, 1
2.2.1 Autorização para reprodução do artigo.
De acordo com o site da revista, autores e coautores não precisam de autorização formal para reproduzir o artigo em tese (informação retirada do site da revista em 29/11/2016 - http://www.biolreprod.org/site/misc/permissions.xhtml).
2.3
Otimização da análise de perfil de embrião único por espectrometria de massas.2.3.2 Material suplementar
Optimal Single-Embryo Mass Spectrometry Fingerprinting
Alessandra Tata*, Mateus J. Sudano, Vanessa G. Santos, Fernanda D.C. Landim-Alvarenga, Christina R. Ferreira and Marcos N. Eberlin.
Supporting Information
Figure S1. Comparison between MALDI (+) MS spectra of embryos washed with a) MeOH/H20 (1:1)
and b) just H2O. Changes in the bovine embryo profiles and an increase of the background noise can
be observed. The discrepancy of the ions observed in the two spectra can be explained by considering the formation of mainly potassiated and sodiated ions after water wash (spectrum B, ions of m/z 721, m/z 743, m/z 756) 760.6 782.6 810.6 788.6 725.5 734.5 796.6 754.5 806.6 703.5 768.6 832.6 746.5 C3 profile 0:C3 MS Raw 0 500 1000 1500 In te n s. [ a .u .] 725.6 782.6 760.7 756.6 743.1 788.9 734.6 703.6 837.6 721.1 808.6 798.6 902.9 749.1 765.0 772.6 709.1 881.6
Water wash_DHB POS 0:N1 MS Raw
0 200 400 600 800 1000 In te n s. [ a .u .] 700 750 800 850 900 950 m/z a) b)
a) b)
Figure S2. The optical pictures taken, using an Optical microscope Nikon E800 using a magnification X 200, show that the embryo washed with MeOH/H2O (1:1; v/v) still have an intact zone pullicida whereas with just Milli-Q water look damaged.
a) b) c)
Figure S3. The optical images of a) bovine embryo prolonged stored in PBS and washed with MeOH/H2O (1:1) taken before deposition of the matrix, b) after deposition of the binary matrix and after 12 hours in the vacuum. The embryo looks progressively damaged until almost disappearing because of the acidity of the matrix and the vacuum environment. Considering these results the authors suggest to run the single embryo MALDI MS analyses in a short time to avoid the fast degradation of the sample. The optical pictures were taken using an Optical microscope Nikon E800 using a magnification X 200.
a) b)
Figure S4. The optical pictures taken, using an Optical microscope Nikon E800 using a magnification X 100, clearly show an increased homogeneity of a) binary matrix compared to b) DHB.
Figure S5. MALDI(+)-MS recorded weekly after prolonged embryo storage in MeOH:H2O (1:1) solution
at –80°C .
2.4
Imageamento de tumores por dessorção/ionização por laser nanoassistida.Publicado originalmente em: Analytical Chemistry, 2013, 48, 844
2.5 Imageamento cianobacterias de água fresca por MALDI: Distribuição espacial de toxinas e outros metabolitos.
3
Discussão
Essa tese de doutorado teve seu início em 2011 em um contexto onde o laboratório ThoMSon de espectrometria de massas havia adquirido recentemente um espectrômetro de massas TOF/TOF modelo Autoflex III (Bruker). Nesse início havia a necessidade de explorar novas aplicações que vinham sendo reportadas em trabalhos de diversos pesquisadores pelo mundo e que ainda eram pouco ou inexploradas no Brasil. Em outras palavras, buscávamos dar início no laboratório em novas linhas de pesquisa.
Os trabalhos publicados escolhidos para compor essa tese de doutorado resumem o trabalho desenvolvido nos últimos anos, muitos dos quais não geraram publicações ou resultados satisfatórios, porém serviram de base para o aprendizado que resultou nos trabalhos apresentados nessa tese e outros também publicados ou em vias de publicação. Nesse sentido, buscamos explorar as aplicações do equipamento utilizando duas abordagens diferentes: a análise por espectrometria de massas por fingerprinting e a espectrometria de massas por imageamento químico.
O primeiro trabalho, apresentado no item 2.1 cujo título pode ser traduzido para o português como “Fulerenos em asfaltenos e outros materiais carbonáceos: constituintes naturais ou artefatos do laser?” Teve como objetivo inicial utilizar a técnica de MALDI ou LDI-MS para a análise de asfaltenos. Esse trabalho surgiu em um contexto onde o laboratório ThoMSon dava início a um novo projeto em parceria com a Petrobras e que buscava uma abordagem de análise tridimensional do petróleo. Utilizando o conhecimento já estabelecido e fundamentado na análise dos compostos polares do petróleo por FT-ICR MS, começamos a explorar a análise de outras frações empregando outras abordagens tais como a análise dos compostos polares por mobilidade iônica e a análise de das frações SARA (saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos) empregando outras fontes de ionização, como por exemplo, MALDI.
Os asfaltenos são, por definição, componentes do petróleo insolúveis em alcanos de baixa massa molecular tais como n-pentano e n-hexano. Assim, a primeira etapa desse trabalho consistiu em reunir diferentes amostras de petróleo com diferentes níveis de evolução térmica. Cerca de trinta amostras foram separadas e a fração de asfaltenos foi separada de cada amostra por precipitação.
Conforme mencionado anteriormente a abordagem de análise que pretendíamos utilizar com essas amostras era a análise por fingerprinting e assim, por quimiometria identificar possíveis marcadores de evolução térmica utilizando essas amostras iniciais para elaborar o modelo de estudo.
Em um primeiro momento escolheu-se aleatoriamente algumas amostras para otimizar as condições da fonte, maximizando a ionização. Uma vez que haviam diversos trabalhos publicados utilizando a análise por LDI e MALDI-MS a primeira etapa consistiu em testar qual das duas técnicas funcionaria melhor. Apesar das estruturas químicas dos asfaltenos não serem bem descritas, tínhamos uma ideia, com base na literatura que, assim como na fração polar ou no caso dos compostos aromáticos de baixa massa molecular, que o perfil obtido seria algo muito próximo a uma distribuição Gaussiana devido a presença de séries homologas de compostos com estruturas semelhantes que diferenciavam entre si pelo aumento no número de carbonos em suas estruturas.
O problema de se utilizar MALDI nesse caso estava na limitação da detecção de compostos na faixa de m/z abaixo de 600 Da. Essa limitação se deve a elevada interferência causada pela ionização da matriz que por estar em maior proporção que a amostra causa supressão dos componentes de interesse da amostra.
Os testes iniciais mostraram que não havia diferença alguma no perfil obtido para as amostras testadas tanto utilizando matriz (foram testadas dois tipos de matriz diferentes, a DHB e a 7,7,8,8-tetracyanoquinomethane) quanto na análise por LDI-MS obtendo-se sempre os mesmos resultados na faixa de m/z acima de 600 Da. Já era de certo modo esperado que mesmo na ausência de matriz fosse possível a análise dos compostos presentes nas amostras de asfaltenos. Isso porque acredita-se que estes sejam formados por estruturas poliaromáticas que absorveriam a energia do laser sendo assim fotoionizados.
A vantagem de se utilizar a técnica de LDI-MS, consistia também no fato de que na mesma análise poderíamos abranger uma maior faixa de massa sem ter que trabalhar com a possiblidade de formação de cluster dos asfaltenos com a matriz dificultando assim interpretações e atribuições errôneas do espectro.
Vale nesse ponto ressaltar que, devido a elevada complexidade da amostra e o fato do analisador de massas por tempo de voo não ter resolução suficiente para atribuição de formulas moleculares inequívocas (tal como o analisador FT-ICR MS), não era o nosso objetivo caracterizar a amostra nesse nível de detalhamento mas avaliar pequenas diferenças que fossem capazes de diferenciar as amostras e assim caracterizá-las de forma simples e rápida.
A grande vantagem da análise por LDI e MALDI-MS consiste na rapidez de análise e a possibilidade de se analisar concentrações muito baixas de amostras. Isso torna a análise mais simples e rápida sendo portanto o cenário ideal para a análise de petróleo devido a elevada demanda de amostras, que consomem um grande tempo de equipamento (no caso das análises
por ESI-MS) somando-se o tempo de análise ao tempo gasto com limpeza da fonte após cada amostra, a economia de tempo de equipamento e do analista superaria consideravelmente a análise por FT-MS que poderia ser empregada apenas em casos onde um maior detalhamento de caracterização da amostra fosse necessário.
Outro fato que nos impulsionou a avaliar esse tipo de análise reside no fato de não ser observado na análise convencional por ESI-MS uma ionização satisfatória dos asfaltenos. Deste modo caso fosse possível avaliar de fato os componentes presentes na fração asfaltenica de cada uma das amostras esse perfil poderia ser comparado com as informações obtidas nas análises dos componentes polares presentes em cada amostra analisados por ESI-FT-ICR MS.
Infelizmente, conforme reportado no artigo publicado na revista Analyst não havia diferenças consideráveis entre os perfis obtidos para as trinta amostras analisadas. A única diferença observada entre as amostras, obtida por PCA (principal componente analysis) residia na faixa de massa abaixo dos 500 Da. Em outras palavras, o que promovia a diferença não eram os compostos que atribuíamos aos asfaltenos, mas a análise da fração maltênica residual do processo de extração dos asfaltenos (chama-se “maltenos” os compostos solúveis em n-alcanos).
A análise quimiométrica nos deu um primeiro indício de que algo não estava correto, visto que esperávamos ao menos uma leve diferenciação entre amostras com características tão diferentes. Porém ainda trabalhávamos com a hipótese dos compostos presentes na fração de asfaltenos não serem afetados pelo processo de evolução térmica do petróleo. Porém, dando continuidade as análises tentamos caracterizar os compostos obtidos por meio de experimentos MS/MS e constatamos que independente do composto a fragmentação sempre era gerada por perdas sucessivas de m/z 24 caracterizando assim compostos fulerenicos.
Nesse momento demos início a um longo período de pesquisas bibliográficas até entendermos que de fato, o perfil observado para as amostras de asfaltenos eram na verdade artefatos formados na fonte de ionização. Porém, mais impressionante que isso foi constatar a quantidade de trabalhos publicados que, mesmo obtendo esses mesmos artefatos formados na fonte de ionização, consideravam esse perfil, devido ao total desconhecimento da amostra analisada, como real e característico de amostras de asfaltenos, chegando a propor estruturas para explicar a diferença de 24 Da entre os sinais observados no espectro.
Apesar de não termos conseguido obter sucesso no nosso objetivo inicial de análise de amostras de asfaltenos o trabalho foi de extrema importância para relatar essa formação de artefatos e alertar a comunidade científica que resultados errôneos estavam sendo publicados
com frequência. Em contrapartida, observamos que a formação desses artefatos parece ser inerente de alguns equipamentos devido a características específicas do laser. Existem trabalhos onde esses artefatos não parecem ser formados, porém, é algo que precisaria ser testado comparando-se as mesmas amostras. Isso porque o perfil de fulerenos parece ser formado em amostras com elevada concentração de compostos aromáticos policíclicos e sabe-se que a composição pode se alterar dependendo do método de obtenção das amostras de asfaltenos.
Ainda na abordagem de análise por fingerprinting, o perfil lipídico de embrião único era uma área de grande interesse em nosso laboratório. O primeiro trabalho de nosso grupo de pesquisa na análise por MALDI de embrião único foi desenvolvido em parceria com outro grupo de pesquisa76. Assim o trabalho apresentado no item 2.2 cujo título pode ser traduzido para o português como “variação do perfil de fosfatidilcolina e esfingomielina em blastocistos de Bos taurus indicus e Bos taurus taurus produzidos in vivo e in vitro” foi o primeiro trabalho desenvolvido no equipamento Autoflex III (Bruker) e cujas análises de MALDI foram realizadas em sua totalidade no laboratório ThoMSon.
Esse trabalho foi realizado em parceria com a faculdade de medicina veterinária da Unesp de Botucatu que nos trouxe a problemática inicial. Todas as etapas de obtenção e maturação dos oocitos, fertilização e cultura in vitro dos embriões, ou ainda a produção e coleta dos embriões produzidos in vivo foram inteiramente realizadas pelos pesquisadores da Unesp sem a participação do nosso grupo. De forma semelhante, a análise semiquantitativa utilizando o corante Sudan black e parte da análise estatística envolvendo ANOVA, embora discutida entre os dois grupos foi realizada pelos pesquisadores da Unesp.
Nosso papel nesse trabalho esteve focado na obtenção do perfil lipídico característico de cada embrião bovino analisado e na interpretação dos resultados obtidos utilizando para isso uma análise quimiométrica por componentes principais (PCA).
As etapas iniciais que estabeleciam condições de armazenamento, transporte e lavagem dos embriões antes da análise haviam sido estabelecidas no trabalho inicial76 e foram seguidas desde os primeiros testes realizados. Da mesma forma, a escolha da matriz (DHB) e sua concentração foram estabelecidas anteriormente e seguidas nesse trabalho.
Embora houvesse uma experiência anterior do nosso grupo de pesquisa nesse tipo de análise a transferência da metodologia para o novo equipamento não foi uma tarefa simples. Foi necessário a otimização da metodologia e isso que exigia, entre outras coisas, o entendimento do posicionamento correto do embrião na placa. Essa era uma etapa fundamental
visto que, devido a quantidade reduzida de material, era necessário direcionar o laser na posição correta onde estaria o embrião dentro do spot da placa de MALDI.
Residia no posicionamento do embrião na placa nossa primeira dificuldade no trabalho, visto que o embrião bovino com 7 dias se encontra na fase de blastocisto e mede aproximadamente 200 µm. Essa dificuldade foi superada utilizando o mapeamento da posição de cada embrião em seu respectivo spot na placa de MALDI utilizando uma lupa. Adicionalmente foram realizados diversos testes para entender o posicionamento final da placa dentro do equipamento e relacioná-lo com o “mapa” dos embriões. Resolvido esse problema e otimizado o método de obtenção do espectro, o novo desafio estava no tratamento dos dados para análise quimiométrica.
A matriz DHB apresenta uma desvantagem por formar, de modo não homogêneo, cristais em formato de agulha. Essa característica faz com que determinadas regiões na amostra possuam uma maior concentração de matriz (chamadas de hot spot) levando a uma ionização desigual que, se não tratada de forma correta pode acarretar em diferenças significativas em espectros de amostras que seriam consideradas equivalentemente semelhantes. Isso pode atrapalhar e muito a análise quimiométrica, levando a atribuições de resultados equivocados.
Assim, foi tomado o cuidado de realizar as análises dos embriões dos diferentes grupos de estudo em um mesmo dia. Isso evitou que diferenças de preparo da matriz, cristalização e nas condições de ionização afetassem o espectro e assim a interpretação dos resultados.
Outro cuidado que precisou ser tomado foi no momento do arredondamento das razões
m/z obtidas. A elevada proporção de hidrogênio nas estruturas químicas dos fosfolipídios leva
a um defeito de massa que varia entre 0,4 a 0,6 e pode causar erros devido ao arredondamento inadequado. Para solucionar esse problema a matriz de dados que seria analisada por quimiometria, era visualmente revisada por pessoas diferentes, garantindo com essa dupla checagem que não fosse atribuído como um íons diferente uma razão m/z consideravelmente próxima.
A identificação dos lipídeos foi realizada com auxílio do site lipidmaps.org e as atribuições foram confirmadas por meio de experimentos de MS/MS realizados no mesmo equipamento utilizando um pool de cerca de 10 embriões de um mesmo grupo de estudo.
Entretanto, em alguns casos mais de um fosfolipídio pode ser atribuído para uma mesma
m/z. Isso se deve ao fato desses lipídeos apresentarem massa nominal muito próxima ou mesmo
