RESUMO
Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e à Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Laboratório de Controle de Qualidade Genética e Sanitária Animal
Autor para correspondência:
Milena Coutinho da Motta
milena@biot.fm.usp.br
Recebido para publicação: 07/12/2011 Aceito para publicação: 28/07/2012
DEtECçãO DE PROtEUS MiRABiLiS nAS FEzES DE
CAMUnDOngOS SPF
milena coutinho da motta, marilda osti Spinelli, cyntia marques dos Santos corrêa de Godoy, robison José da cruz, Juliana bortolatto
O presente estudo teve como objetivo apresentar os resultados de pesquisa de positi-vidade do microorganismo Proteus mirabilis em camundongos das linhagens C57BL/6, BALB/c e BALB/c Nude, originários do setor de criação de camundongos livres de patógenos específicos (SPF) do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP e relatar a importância do isolamento deste microorganismo em colônias de animais. Para tanto, amostras de fezes de 71 camundongos da linhagem C57BL/6, 48 camundongos da linhagem BALB/c e 26 camundongos da linhagem BALB/c Nude, foram semeadas em meios específicos para bactérias gram negativas e diagnosticado no Enterokit B da Probac do Brasil. Nossos resultados mostraram que, as linhagens de camundongos C57BL/6, BALB/c e BALB/c Nude apresentaram P.mirabilis nas fezes, nas porcentagens de 80,3%, 62,5% e 73,1% respectivamente, sendo inadequadas para utilização em protocolos experimentais das áreas de radiobiologia, imunologia, oncologia e cirurgias experimentais invasivas, por interferirem potencialmente nos resultados destas áreas. CEUA nº 251/11.
Palavras-chave: Proteus mirabilis. Interferências na pesquisa. BALB/c. C57BL/6.
BALB/c Nude.
1 intRODUçãO
O gênero Proteus se divide em 5 espécies:
Pro-teus vulgaris, ProPro-teus mirabilis, ProPro-teus penneri, Proteus myxofaciens e Proteus hauseri. Esses
microorganismos são normalmente encontrados na microbiota intestinal do homem e de animais, solo e água poluída1,2,3.
Proteus mirabilis é uma bactéria
Gram-nega-tiva, pertencente à família Enterobacteriaceae, onde os movimentos dos seus flagelos através da superfície do meio sólido apresentam uma aparência de “véu”2,3. Organismos deste gênero são considerados patógenos oportunistas. Ca-mundongos em experimentação,
imunocompro-metidos ou imunossuprimidos, são altamente sus-cetíveis a esses agentes4. Foram isolados do trato respiratório superior, inclusive de camundongos imunocompetentes, podendo causar significante morbidade e mortalidade2,4. Camundongos iso-gênicos da linhagem C3H/HeJ, com deficiência na resposta imune, podem apresentar também colonização por P. mirabilis nos pulmões, sem sinais clínicos de doença4. No homem, provoca infecção no trato urinário, principalmente em indivíduos com catéter ou anormalidades estru-turais no trato urinário.
Foram relatados casos de P. mirabilis provo-cando pielonefrites, em camundongos machos, da linhagem MM, propensa a desenvolver Diabetes
pelo P. mirabilis, dá-se pelo fato desses animais apresentarem uma deficiência na molécula TLR-4 (Toll-like receptor 4), responsável pelo reconheci-mento dos lipopolissacarídeos, presente na parede de bactérias gram-negativas6.
Em camundongos transgênicos da linhagem C57BL/6N, que expressam doença granuloma- tosa, o Proteus mirabilis foi isolado do pulmão e do trato genital de camundongos machos. Devido a este quadro infeccioso, os animais dessa linhagem apresentaram mutilação do pênis7.
Os sinais clínicos da infecção, não são especí-ficos, incluem: apatia, pêlos arrepiados e desidra-tação. Os sinais patológicos encontrados são: áreas mais escuras, focais ou coalescentes no fígado, esplenomegalia, caquexia, áreas multifocais, bem delineadas, ligeiramente escurecidas nos rins; as le-sões histológicas incluíram pneumonia intersticial, peritonite fibrinopurulenta, meningite focal, ne-crose hepática multifocal e tromboflebitis8.
As portas de entrada do P. mirabilis são as vias respiratórias e o trato digestório, através da inges-tão de comida e/ou água contaminada pelo micro-organismo9, afetando assim a saúde do animal.
2 OBJEtivO
O presente estudo teve como objetivo apresen-tar os resultados de pesquisa de positividade do microorganismo Proteus mirabilis em camundon-gos das linhagens C57BL/6, BALB/c e BALB/c Nude, originários do setor de criação de camun-dongos livres de patógenos específicos (SPF) do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP e relatar a importância deste isolamento em colônias de animais.
3 MAtERiAL E MétODOS
Foram utilizados 71 camundongos da linha-gem C57BL/6, 48 camundongos da linhalinha-gem BALB/c e 26 camundongos da linhagem BALB/c
Nude, machos e fêmeas, com idade entre 2 e 4 meses, originários do Biotério SPF do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Uni-versidade de São Paulo, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2010. Todos os procedi-mentos foram realizados de acordo com princí-pios internacionais de ética e bem estar animal e aprovados pelo Comitê de Ética do complexo HC/FMUSP, certificado nº 251/11.
Os camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram recebidos da Taconic, em 22 de fevereiro de 2011 e os camundongos BALB/c Nude, foram recebidos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP, em 08 de janeiro de 2009. Todas as matrizes foram mantidas em isoladores flexíveis (Alesco, Campinas, BR) e as linhagens foram expandidas em racks ventiladas (Tecni-plast®, Itália). A área onde esses animais são mantidos possui um sistema fechado, estabelecido com barreiras sanitárias restritas. A temperatura das salas varia em torno de 22ºC ± 2ºC, ciclo de 12 horas luz e 12 horas escuridão. A água e a ração (Nuvital®, Paraná, BR), com formulação ade-quada para espécie e acrescida de vitaminas que podem ser inativadas pelo calor, foram fornecidos
ad libitum. Todo material utilizado foi esterilizado,
inclusive a ração e a água.
A cada dois meses, as amostras de camundon-gos coletadas dos isoladores foram enviadas à triagem sanitária. Os animais foram submetidos a eutanásia em câmara de CO2 e após a assepsia com etanol 70%, em cabine de fluxo laminar, realizou-se uma incisão mento-pubiana mediana. A cavidade abdominal foi exposta, procedendo--se à retirada do intestino, desde o duodeno até o reto. Em uma placa de Petri, as alças intestinais foram abertas longitudinalmente, expondo-se o conteúdo. Foram coletadas 2 alçadas de fezes, do intestino delgado, ceco e grosso. O material coletado foi semeado em meio BHI caldo (Difco) e incubados por 24 horas em estufa bacteriológica à 37ºC. Posteriormente a esse período, o material foi semeado nos seguintes meios de cultura: ágar SS (Salmonella & Shigella da Difco), ágar Mac-Conkey (Difco) e ágar Sangue de carneiro 5% (Brain Agar Infusion - Difco). Os mesmos foram
incubados novamente e após 24 horas observou--se a morfologia das colônias. Para a detecção de resultados presuntivos, foram observados o aparecimento de colônias negras (H2S +) em ágar SS e a detecção de colônias em forma de “véu”, no ágar sangue de carneiro 5%. Caso ocorresse o aparecimento dessas colônias, foi realizado o diag-nóstico definitivo utilizando testes bioquímicos específicos para o diagnóstico de enterobactérias (Enterokit B - Probac do Brasil).
4 RESULtADO E DiSCUSSãO
A bactéria Proteus mirabilis foi detectada nas fezes de camundongos SPF nas linhagens C57BL/6, BALB/c e BALB/c Nude, nas percenta-gens de 80,3, 62,5 e 73,1 respectivamente (Tabela
1). Em todos os animais examinados não foram
encontrados sinais clínicos de doenças ou lesões patológicas nos órgãos.
O potencial etiológico da presença de
Pro-teus mirabilis em fluidos corporais ou lesões
profundas não chama tanto a atenção quando comparados com outros membros da família
Enterobacteriaceae, declaradamente
patogêni-cos, por serem microorganismos encontrados no meio ambiente1.
Um dos principais fatores de virulência do
P. mirabilis incluem: aderência na superfície da
mucosa, lesão e invasão nos tecidos, utilização de ferro dos hospedeiros, acesso a capilares estabele-cendo uma bacteremia, podendo expressar toxinas
e inibição da resposta imune do hospedeiro3. Outra estratégia de sobrevivência do P. mirabilis nas mucosas, se faz pela evasão das defesas imunes do hospedeiro através de uma protease que degrada a imunoglobulina IgA10.
Um dos principais obstáculos em se utili-zar animais portadores de P. mirabilis, seria a possibilidade deste microorganismo exacerbar respostas durante o experimento, aproveitan-do a oportunidade da baixa de resistência aproveitan-do hospedeiro e instalando uma infecção. Animais portadores de P. mirabilis, são inadequados para trabalhos que envolvam experimentos na área de irradiação, pois devido a imunosupressão podem ocorrer infecções generalizadas, provavelmente por bacteremia de origem entérica ou respiratória, ou em ambos9. Em 2008, Bradner et al.11, confir-maram o conceito de que animal irradiado tinha como fonte de infecção P. mirabilis, oriundas da microbiota intestinal.
Em 1977, Dabard et al.12, estabeleceram pela Association Française pour La Gnotoxenie, a definição do estado sanitário específico para expe-rimentos nas áreas de radiobiologia, imunologia e oncologia, nas quais os animais devem ser livres dos vírus Reo 3 e Sendai; e das bactérias P.
mira-bilis, Pseudomonas sp e Staphylococcus aureus.
O boletim técnico da Charles River13 descreve que experimentos que envolvam animais imu-nocompetentes e portadores de P. mirabilis, não apresentam alteração em seus resultados, porém em experimentos com animais imunossuprimidos ou submetidos a cirúrgicas invasivas, devem estar livres de P. mirabilis.
tabela 1: número de animais positivos e porcentagens sobre o total analisados por cultura bacteriana para
detecção de Proteus mirabilis
espécie Linhagens de camundongos isogênicos
Linhagem c57bL/6 baLb/c baLb/c Nude
Positivos/Total de animais 57/71 30/48 19/26
ABS
tRAC
t
No mesmo período em que se realizou o moni-toramento bacteriológico de camundongos SPF no presente estudo, também foram coletadas amostras das mesmas linhagens, porém, oriundas do bioté-rio convencional. Surpreendentemente, não foram detectadas bactérias do gênero Proteus. Essas diferenças de resultados sugerem que a presença de uma determinada bactéria, que utiliza o mesmo substrato para sobrevivência, pode se apresentar reduzida na população concorrente, tornando-se indetectável.
5 COnCLUSãO
Os camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e BALB/c Nude, livres de patógenos específicos, apresentaram P.mirabilis nas porcentagens de 80,3%, 62,5% e 73,1%, res-pectivamente, sendo sua utilização inadequada para os procedimentos que envolvam protocolos experimentais nas áreas de radiologia, imunologia, oncologia e cirurgias experimentais invasivas.
DEtECtiOn OF PROtEUS MiRABiLiS in SPECiFiC PAthOgEn
FREE MiCE FECES
This study aimed to present the positive results of Proteus mirabilis research from strains inbred mice C57BL/6, BALB/c and BALB/c Nude, originating from the sector of Specific Pathogen Free (SPF) mice - Animal Facilities of Faculdade de Medicina (USP – University of São Paulo) and report the importance of isolation of this microorganism in colonies of animals. For this, stool samples from: 71 C57BL/6, 48 BALB/c and 26 BALB /c Nude inbred mice, were inoculated in cultural bacteria specific media and diagnosed in the B Enterokit Probac-Brasil. Our results showed that the strains of C57BL/6, BALB/c and BALB/c Nude presented P.mirabilis in stool, percentages of 80.3%, 62.5% and 73.1% respectively, being unsuitable for use in experimental protocols in the fields of radiobio-logy, immunoradiobio-logy, oncoradiobio-logy, and experimental invasive surgeries by interfering mainly on the results of these areas. CEUA No. 251/11.
Keywords: P.mirabilis. Interference in the study. BALB/ c. C57BL/ 6. BALB/ c Nude.
1. O’Hara CM, Brenner FW, Miller M. Classification, Identification and Clinical Significance of Proteus,
Providencia, and Morganella. Clin
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Immunofluorescent Evidence of
Proteus mirabilis Swarm Cell
Formation on Sterilized Rat Feces. Appl Environ Microb. 1981 Mar;41(3): 801-6.
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REFERê
nCi
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Disponível em: http://www.criver. com/SiteCollectionDocuments/ rmldrProteusmirabilis.pdf
