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XVIII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA 19 a 23 de outubro de 2009

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IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS ZIGÓTICAS E NUCELARES DE CITROS POR MEIO DE MICROSSATELITES

XIMENA MAIRA DE SOUZA VILELA(1), MOACIR PASQUAL(2), EDMILSON RIBEIRO TOSCANO DE BRITO(3), LUCIANE VILELA RESENDE(4), BRUNO OLIVEIRA CARVALHO(5),

FABÍOLA VILLA(6)

RESUMO - Para agilizar os programas de melhoramento de citros e reduzir custos, torna-se premente o estabelecimento de um protocolo que viabilize a eficiência do processo de identificação precoce de plântulas híbridas e nucelares. O uso de marcadores moleculares, pode ser uma ferramenta eficiente para melhoristas e produtores para certificarem, se plântulas a serem utilizadas são híbridas ou nucelares. O objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência de marcadores de microssatélites no processo de identificação precoce de plântulas híbridas e nucelares de citros oriundas de cruzamentos. .As plantas foram obtidas a partir dos cruzamentos ‘Folha Murcha’ x ‘Ponkan’, ‘Pêra Rio’ x ‘Ponkan’, ‘Natal’ x ‘Ponkan’; pertencentes à coleção de cítricos do Setor de Fruticultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA). Dos cinco primers de microssatelites previamente selecionados, dois pares (SSR 3F/3R e SSR 70F/70R) foram selecionados, por proporcionaram uma melhor resolução na separação e identificação das bandas polimórficas apresentando boa nitidez e alta repetibilidade do padrão de bandas desejados, significando um eficácia de 40% da prévia seleção de primers. Desse modo foram encontrados 21,74% e 54,55% de plantas híbridas para os cruzamentos Ponkan x Folha Murcha e Ponkan x Pera Rio, respectivamente com uma média de 38,14% de híbridos para ambos os cruzamentos. Já para o cruzamento Ponkan x Natal todas as plantas avaliadas eram nucelares.

Palavras-chaves: citros, marcador molecular, poliembrionia. INTRODUÇÃO

O Brasil lidera a produção e as exportações mundiais de suco concentrado de laranja. De acordo com dados divulgados pela Secretaria de Comércio Exterior (Secex) em 2008, a receita com as exportações brasileiras de suco de laranja foi de US$ 1,996 bilhão e o volume negociado com o exterior atingiu 2,05 milhões de toneladas, evidenciando a importância da cultura para o país.

É importante salientar que, apesar de o gênero Citrus apresentar uma grande diversidade de espécies, apenas um pequeno número é utilizado comercialmente. Desse modo os programas de melhoramento de citros correspondem a principal alternativa para inserção de caracteres desejáveis em variedades cultivadas nos plantios comerciais de citros desenvolvendo cultivares melhoradas.

A grande maioria das variedades cítricas produz sementes poliembriônicas devido ao forte potencial embriogênico do tecido nucelar do ovário circundante ao saco embrionário, que normalmente origina de um a múltiplos embriões adventícios ao redor do embrião sexual (KOLTUNOW, 1993), o que é um problema para os programas de melhoramento em virtude da dificuldade para a distinção precoce entre ambos os tipos de embriões (CHAGAS et al., 2007). Contudo ferramentas avançadas da biotecnologia vêm sendo amplamente empregadas com intuito de vencer essa barreira, como exemplo: o cultivo in vitro de embriões e a identificação de genótipos por meio de marcadores moleculares.

_______________________

¹ Mestranda em Fitotecnia, DAG/ UFLA, ximenavilela@yahoo.com.br 2

Professor Tilular, DAG/UFLA, mpasqual@ufla.br 3

Professor Adjunto, DBI/UFRPE, atoscano@codai.ufrpe.br 4

Professora Associada, DAG/UFLA, luciane.vilela@ufla.br 5

Mestrando em Fitotecnia, EPAMIG, brunoagroufla@hotmail.com 6

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Os marcadores moleculares possibilitam a avaliação da similaridade genética entre genótipos nos primeiros estágios de desenvolvimento, o marcador SSR (Single Sequence Repeat) vêm sendo utilizado para análise de diversidade genética em muitas espécies vegetais, pela sua alta reprodutibilidade e elevada taxa multiplex, ou seja, número de marcadores simultaneamente analisados em um mesmo gel (OLIVEIRA et al., 2002). Devido a base genética das espécies economicamente importantes serem muito estreitas os genomas apresentam se muitos semelhantes, dificultando ainda mais a identificação de primers eficientes para detecção de marcadores polimórficos entre essas espécies.

Nesse contexto, com intuito de agilizar os programas de melhoramento de citros, na redução de custos, na otimização do tempo e no estabelecimento de um protocolo que viabilize a eficiência do processo de identificação precoce de plântulas híbridas e nucelares, torna-se crucial a obtenção de primers eficientes para serem usados como ferramentas que proporcione aos melhoristas, geneticistas e produtores interessados a certeza de que as plântulas a serem utilizadas são realmente as indicadas pela presença ou ausência das bandas polimórficas. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência de marcadores de microssatélites no processo de identificação precoce de plântulas híbridas e nucelares de citros oriundas de cruzamentos.

Materiais e Métodos

1-Cruzamento, cultivo in vitro do embrião e formação de mudas

As plantas foram obtidas a partir de cruzamentos artificiais controlados entre ‘Folha Murcha’ x ‘Ponkan’, ‘Pêra Rio’ x ‘Ponkan’, ‘Natal’ x ‘Ponkan’; pertencentes à coleção de cítricos do Setor de Fruticultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), Lavras, MG.

Aproximadamente 118 dias após a polinização, os frutos foram coletados e armazenados em refrigerador a 5±1ºC. As sementes foram removidas e foi feito o resgate e cultivo dos embriões, estes foram individualizados e inoculados em 15 mL do meio de cultura MT (MURASHIGE & TUCKER, 1969) vertidos em tubos de ensaio (25x150mm), tal procedimento foi desenvolvido no Laboratório de Culura de Tecidos no Departamento de Agricultura da UFLA.

Aos 90 dias, as plântulas foram retiradas dos tubos de ensaio, transplantadas em células isopor contendo vermiculita e mantidas em casa de vegetação, com temperatura e umidade controladas. Após a aclimatização, as plântulas foram transferidas para sacos de plástico perfurados para produção de mudas (28x18cm), contendo uma mistura de terra e areia na proporção de 3:1. 2-Preparação do material e extração de DNA

Para extração do DNA foram coletadas folhas jovens e sadias dos genitores (‘Folha Murcha’, ‘Pêra Rio’, ‘Natal’ e ‘Ponkan’) e das progênies que sobreviveram e se encontravam a campo. Os tecido foliares foram lavados, secos e retirada a nervura principal para se fazer a extração do DNA genômico. O trabalho de extração de DNA foi conduzido no Lab. de Genética Molecular do Departamento de Biologia da UFLA. A extração foi realizada de acordo com metodologia descrita por Faleiro et al. (2003).

3-Testes preliminares, reação de amplificação, corrida no gel e coloração.

Foram utilizados cinco pares de ‘primers’ SSR, desenvolvidos no laboratório de Biotecnologia do Centro APTA Citros ‘Sylvio Moreira’ a partir de DNA genômico de laranja ‘Pêra’ (C. sinensis Osbeck) e Poncirus trifoliata ‘Rubidoux’ contendo seqüências repetidas de di, tri ou tetranucleotídeos (AG/TC, GT/CA, TCA/AGT, TTAC/AATG) e pré selecionados por Boava et al. (2003).

Os ‘primers’ foram testados quanto à eficiência para identificação de plantas zigóticas e nucelares, de modo que foram selecionados os que proporcionaram melhor padrão de bandas, boa visibilidade e resolução na separação e diferenciação entre as progênies dos cruzamentos obtidos no presente trabalho. Os ‘primers’ testados estão descritos na Tabela 1:

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Tabela 1 - Primers utilizados na identificação das plantas zigóticas e nucelares.

IDENFICAÇÃO SEQUÊNCIA NUCLEOTIDICA (5’→3’)

SSR3F GCAATGCACCTTGTCATTAG SSR3R CATACAGGCACTTTATGCAG SSR9F GACTGGATTAGAGTTCTCTG SSR9R ATGGATGTGTTATCTCACTC SSR40F ACAAGAGTCGCAACAATC SSR40R GACAACAGTGGCAATACC SSR70F GCAAGGAGTTAGTAATGTGG SSR70R CCATTCCTGAGACAGTGAAG SSR75F ACCTTGGAATTCATCTCTCT SSR75R GCAATTTCCAAATGTAGC

Os testes com os primers foram feitos ponderando características desejáveis como melhor padrão de bandas, maior número de bandas polimórficas e bom padrão de qualidade de imagem do gel para identificar a melhor combinação de pares de "primers".

Foram testados ainda parâmetros como temperatura de anelamento concentração do gel, voltagem de corrida na eletroforese, o mix mais adequado, além de avaliar a enzima Taq Polimerase que melhor amplificaria o material genético, sendo elas: a clonada no Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Biologia da UFLA e a enzima comercial.

Diante dos resultados, as reações de PCR consistiram de 10ng de DNA, 4,8 µL água ultra pura, 0,3 µL de cada primer; 0,5µL de dNTP, 1 µL tampão 10X e 0,1 µL da enzima Taq polimerase comercial, em um volume total de 10µL. As amplificações foram realizadas no termociclador NJ RESEACH modelo PTC 200 na seguinte programação: 94°C 4 min, seguido de 10 ciclos, sendo no primeiro a desnaturação a 94°C por 20 seg, anelamento do primer a 65°C por 20 seg e elongação a 72°C por 20 seg, seguido do tochdown de 10C por ciclo. Mais 24 ciclos adicionais foram utilizados sendo a desnaturação a 94°C por 20 seg, anelamento do primer a 55°C por 20 seg e a elongação a 72° C por 20 seg. A reação foi concluída a 72° C por 5 min.

Os produtos de amplificação foram separados em gel de poliacrilamida na concentração de 10%, sendo 27mL de água,16 mL de acrilamida 30%, 4,8mL de TBE 10X, 480L de APS (Persulfato de amônio) e 30 µL de Temed em eletroforese a 60V por 4 horas.

Para a revelação dos géis utilizou-se o método de coloração com nitrato de prata.

A identificação de plântulas zigóticas e nucelares dos cruzamentos foi realizada mediante a comparação dos padrões de bandas entre os indivíduos da progênie e os genitores.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após os testes com os primers previamente escolhidos foram selecionados dois pares (SSR 3F/3R e SSR 70F/70R) os quais proporcionaram uma melhor resolução na separação e identificação das bandas polimórficas apresentando boa nitidez e alta repetibilidade do padrão de bandas desejados. O que corresponde a 40% de eficácia quanto aos primers testados. Evidenciando a eficiência de escolha inicial de primers para detectar diversidade entre as espécies pesquisadas.

Os primers escolhidos apresentaram duas e três bandas polimórficas na reação de PCR, amplificando alelos com seqüências de aproximadamente 650 bp, e 280 bp (SSR 70F/R) como pode

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ser observado na Figura1 e 800 bp, 500 bp e 250 bp (SSR 3F/R) (Figura2), referentes ao cruzamento oriundo entre ‘Folha Murcha’ x ‘Ponkan’. Neste cruzamento, entre as 46 plantas avaliadas, detectou-se 10 plantas híbridas, que correspondem a 21,74% de embriões zigóticos viáveis, através dos primers SSR 70F/R e SSR 3 F/R, respectivamente, conforme observado nas Figuras 1 e 2.

Figura 1 Padrão de amplificação do primer SSR 70F/R, sendo: M- marcador; 1- genitor feminino; 2- genitor masculino; 4,9,11 e 13 zigóticos e os demais nucelares. Lavras – MG , 2009.

Figura 2 Padrão de amplificação do primer SSR 3F/R, sendo: M- marcador; 1- genitor feminino; 2- genitor masculino; 4,9,11 e 13 zigóticos e os demais nucelares. Lavras – MG , 2009.

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Para o cruzamento entre ‘Pera Rio’ e ‘Ponkan’ as bandas polimórficas foram detectadas pela amplificação dos alelos na altura 650 bp e 280 bp referente ao primer 70 F/R e 800 bp, 500 bp e 250 bp referente ao primer 3 F/R, conforme pode ser visto na figura 3, respectivamente. Dentre as 22 plantas avaliadas, foram detectados 12 híbridos, o que corresponde a 54,55% de plantas zigóticas.

Figura 3 Padrão de amplificação do primer SSR 70F/R e SSR 3F/R, respectivamente, sendo: M- marcador; 1- genitor feminino; 2- genitor masculino; 5 e 6 zigóticos, 3 e 4 nucelares. Lavras – MG , 2009.

A partir dos cruzamentos: ‘Folha Murcha’ x ‘Ponkan’ e ‘Pera Rio’ x ‘Ponkan’ observou-se na prole, uma média de 38,14% de indivíduos híbridos e 61,86% de clones nucelares. Já a partir do cruzamento entre ‘Natal’ e ‘Ponkan’ observaram-se na descendência, 100% das plantas avaliadas, a presença exclusiva do genótipo referente ao genitor feminino, ou seja, clones nucelares da mãe (Figura 4).

Figura 4 Padrão de amplificação do primer SSR 70F/R e SSR 3F/R, respectivamente, sendo: M- marcador; 1- genitor feminino; 2- genitor masculino; 3 e 4 clones nucelares. Lavras – MG, 2009.

Sobre a eficácia dos primers selecionados, o primer SSR 70F/R também apresentou eficiência na identificação de híbridos de Poncirus trifoliata, conforme relatado por Boava et al. (2003) e confirmado por Cristofani et al. (2001) quando concluiu que a utilização de um único par de primer SSR é suficiente para selecionar plantas zigóticas em uma população, em casos de polinização cruzada.

O número de plantas zigóticas observado entre os cruzamentos ‘Folha Murcha’ x ‘Ponkan’ e ‘Pera Rio’ x ‘Ponkan’ (média de 38,14%), sobrepõem-se aos resultados obtidos por Cristofani et al. (2001), que em estudo semelhante obteve 6% de indivíduos híbridos a partir do cruzamento entre laranja ‘Caipira’ e ‘Azeda’ e 9,6% a partir do cruzamento entre laranja ‘Caipira’ e limão ‘Cravo”. A ausência de identificação de plantas zigóticas a partir do cruzamento entre ‘Natal’ x ‘Ponkan’ coincide com resultado apresentado por Boava et al. (2003), que após estudos de identificação de plantas zigóticas de P. trifoliata com marcador SSR observou exclusivamente a presença de plantas nucelares. No entanto comparações entre esse tipo de trabalho, torna-se subjetiva, visto que a proporção de embriões zigóticos e nucelares varia com as espécies/variedades de citros, com as condições climáticas do período em que se

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realizou o cruzamento, além do manejo e eficiência de táticas empregadas no resgate de embriões zigóticos

Os marcadores moleculares são atualmente uma ferramenta que vêm incrementando, agilizando e sofisticando cada vez mais os métodos de melhoramento, quer seja clássico ou moderno, nesse contexto o marcador SSR pode ser considerado o marcador que agrega maiores características desejáveis aliado a facilidade de execução do processo e confiabilidade dos resultados.

CONCLUSÃO

Dentre os cinco pares de primers selecionados e avaliados para identificação de plantas zigóticas e nucelares nas espécies cítricas estudadas no presente trabalho, dois pares se mostraram altamente eficientes para tal identificação (SSR 3F/3R e SSR 70F/70R), distinguindo com eficácia plantas nucelares e híbridas, apresentando bons padrões de bandas e com ótima repetibilidade de resultados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BOAVA, L.P.; MASUDA,Y.; SIVIERO, A.; CRISTOFANI, M.; FURTADO, E.L.; MACHADO, M.A. Identificação de embriões zigóticos e nucelares em Citrus limon, citrus Sunki e Poncirus trifoliata, utilizando marcadores microssatélite. In: CONGRESSO DE MELHORAMENTO DE PLANTAS, 2., 2003, Porto Seguro. Anais, Porto Seguro : Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas, 2003.

CHAGAS, E.A.; CAZETTA, J.O.; LEMOS, E.G.M.; PASQUAL, M.; GOES, A.; RAMOS, J.D.; PIO, R.; BARBOSA, W.; MENDONÇA, V.; AMBROSIO, L.A. Identificação de híbridos de citros resistentes à mancha-marrom-de-alternária por meio de fAFLP e testes de patogenicidade. Pesquisa Agropecurária Brasileira, Brasília, v. 42, n.7, p.975-983, 2007. CRISTOFANI-YALY, M.; NOVELLI, V.M.; OTAVIANO, A.R.; OLIVEIRA, A.C.; SOUZA, A.A. de ; MACHADO, M.A. Identificação de híbridos de cruzamentos interespecíficos em citros utilizando marcadores RAPD e SSR. Laranja, Cordeirópolis, SP, v.22, n.1, p.231-242, 2001.

FALEIRO. F. G.; FALEIRO, A.S.G.; CORDEIRO, M.C.R.; KARIA, C. T. (2003). Operacionalização da Extração de DNA de Espécies Nativas do Cerrado Visando Análises Moleculares. II Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas, Anais. Porto Seguro. CD ROM.

KOLTUNOW, A.M. Apomixis: embryo sacs and embryos formed without meiosis or fertilization in ovules. Plant Cell, Rockville, v.5, p.1245-1467, 1993.

MURASHIGE, T.; TUCKER, D. P. H. Grow factor requeriment of Citrus tissue culture. Proceedings of the First International Citrus Simposium, v.3, p.1155-1669, 1969.

OLIVEIRA, A.C.; NOVELLI, V.M.; GARCIA, A.N.; CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A. Identification of citrus hybrids through the combination of a leaf apex morphology and SSR markers. Euphytica, v.128, p.397-403, 2002.

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