UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI PRÓ-REITORIA DE ENSINO
ENGENHARIA AGRONÔMICA
ROBERTA GRACIELA NOGUEIRA GUIMARÃES
QTLs associados com a tolerância ao alumínio em uma população de milho do Quênia
Sete Lagoas 2015
ROBERTA GRACIELA NOGUEIRA GUIMARÃES
QTLs associados com a tolerância ao alumínio em uma população de milho do Quênia
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del-Rei como requisito parcial para obtenção do título de bacharel em Engenharia Agronômica. Área de concentração: Ciências Agrárias. Orientador: Prof. Dr. Leonardo Lucas Carnevalli Dias
Co-orientadora: Dra. Claudia Teixeira Guimarães
Sete Lagoas 2015
ROBERTA GRACIELA NOGUEIRA GUIMARÃES
QTLs associados com a tolerância ao alumínio em uma população de milho do Quênia
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del-Rei como requisito parcial para obtenção do título de bacharel em Engenharia Agronômica.
Sete Lagoas, 03de dezembro de 2015. Banca Examinadora:
_________________________________________________ Profa. Dra. Nádia Nardely Lacerda Durões Parrella (UFSJ)
_________________________________________________ Pós.Doc. Flávia Ferreira Mendes (EMBRAPA / CNPq)
_________________________________________________ Prof. Dr. Leonardo Lucas Carnevalli Dias (UFSJ)
Dedico este trabalho à minha família e ao meu Noivo, além dos meus amigos que fizeram Essa jornada ser tão especial e saudosa.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela presença constante em minha vida.
À minha família, pela força, incentivo, carinho, amor e apoio em todos os momentos. Aos professores da Universidade Federal De São João Del Rei, pela formação profissional.
À Dra. Claudia Guimarães pela confiança em mim depositada, pelos ensinamentos e pela orientação na vida acadêmica.
À Embrapa Milho e Sorgo por proporcionar as condições de exercer meu trabalho e pela experiência adquirida.
A todos os amigos e pessoas especiais que estiveram presentes nessa importante etapa de minha vida.
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do
que parecia impossível”. (Charles Chaplin)
RESUMO
A produção de milho é reduzida em função da toxicidade de alumínio (Al) em solos ácidos. Estes solos cobrem mais de 50% das terras aráveis globais, que incluem o Cerrado brasileiro e 13% das áreas de cultivo de milho no Quênia. Compreender os mecanismos moleculares pode viabilizar o desenvolvimento de híbridos de milho mais tolerantes ao Al tóxico, aumentando a produtividade de grãos sem aumentar o custo de produção. No entanto, há um conhecimento limitado sobre regiões genômicas que controlam a tolerância ao Al em germoplasma de milho do Quênia. O presente trabalho teve como objetivo identificar QTLs associados à tolerância ao Al em 180 famílias F2:3 derivadas de um cruzamento entre
linhagens de milho do Quênia contrastantes para a tolerância ao Al, 203B-14 (tolerante), e SCH3 (sensível). Cinco QTLs associados com a tolerância ao Al foram mapeados nos cromossomos 1, 5, 8, 9 e 10, explicando cerca de 50% da variação fenotípica para crescimento líquido de raiz seminal (RNRG), incluindo os efeitos epistáticos. Os QTLs dos cromossomos 1 e 9 foram identificados apenas no presente trabalho, enquanto os QTLs mapeados nos cromossomos 5, 8 e 10 foram previamente detectados em outros estudos. O ZmNrat1, um homólogo de OsNrat1, que codifica um transportador de Al3+ envolvido na tolerância de Al em arroz, foi co-localizado com o QTL no cromossomo 5. Por outro lado, não foi detectada associação no cromossomo 6, onde está localizado o gene ZmMATE1 que explica uma importante proporção da tolerância ao Al em uma população de milho do Brasil. Assim, podemos concluir que outras regiões genômica, além do ZmMATE1, controlam a tolerância ao Al nessa população, que podem ser utilizadas em programas de melhoramento para aumentar a tolerância ao Al em milho.
ABSTRACT
Maize yield is reduced by aluminum (Al) toxicity in acid soils. These soils cover over 50% of global arable land, which include the Brazilian Cerrado and 13% of maize growing areas in Kenya. Understanding the molecular mechanisms may facilitate the development of more tolerant maize hybrid toxic aluminum, increasing grain yield without increasing the production cost. However, there is limited knowledge of genomic regions that control the Al tolerance in Kenya's maize germoplasm. This study aimed to identify QTLs associated with Al tolerance in 180 families F2:3 derived from a cross between Kenyan maize lines contrasting
for Al tolerance, 203B-14 (highly tolerant), and SCH3 (sensitive). Five Al tolerance QTLs were mapped on chromosomes 1, 5, 8, 9 and 10, explaining together approximately 50% of the phenotypic variation for relative net root growth (RNRG), including the epistatic effects. QTLs on chromosomes 1 and 9 were identified only by this study, whereas the QTLs mapped on chromosomes 5, 8 and 10 were previously detected by other studies. The ZmNrat1, a homolog to OsNrat1, which encodes an Al3+ specific transporter involved in rice Al tolerance, was co-localized with the QTL on chromosome 5. Moreover, no association was detected on chromosome 6 where the ZmMATE1 gene controls an important proportion of Al tolerance in a Brazilian maize population. Thus, we can conclude that other genomic regions, in addition to ZmMATE1, control the Al tolerance in this population, which can be used in breeding programs to increase the Al tolerance in maize.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 10
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 11
2.1 A cultura do milho ... 11
2.2 Solos ácidos e toxidez do alumínio ... 11
2.3 Mecanismos fisiológicos da tolerância ao alumínio ... 12
2.4 Genes de tolerância ao alumínio em plantas ... 13
2.5 Genéticas da tolerância ao alumínio em milho ... 15
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 16
3.1 Material genético ... 16
3.2 Avaliação da tolerância ao alumínio em solução nutritiva ... 16
3.3 Marcadores moleculares... 17
3.4 Mapa genético ... 18
3.5 Mapeamentos de QTLs ... 18
3.6 Análise de expressão de ZmNrat1 ... 18
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 20
4.1 Variabilidade da tolerância ao Al ... 20
4.2 QTLs associados com tolerância ao Al ... 21
5 6 CONCLUSÃO ... 26
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1. INTRODUÇÃO
Os solos ácidos estão amplamente distribuídos nas regiões tropicais e subtropicais, englobando cerca de 50% das terras agricultáveis no planeta. Nesses solos, a presença do alumínio tóxico (Al) inibe o crescimento da raiz, impedindo que a planta obtenha água e nutrientes necessários ao seu desenvolvimento ideal. Isso ocorre porque o Al é solubilizado na solução do solo na forma de cátion trivalente (Al3+), sendo altamente tóxico às raízes (Kochian, 1995). No Quênia, 13% das áreas de cultivo de milho são compostas por solos ácidos (Kisinyo et al., 2009), com alta saturação por Al (> 20%) (Kanyanjua et al, 2002; Schultze & Santana, 2004), onde a produção de grãos é baixa comparada com o rendimento potencial das culturas (Oluoch-Kosura, 1999).
O milho tem grande importância econômica e social, sendo o cereal mais produzido mundialmente. No Quênia, o milho é um alimento básico na dieta da população, porém sua produtividade é limitada pelo cultivo em solos ácidos e de baixa fertilidade da região. O desenvolvimento de genótipos tolerantes ao Al é uma alternativa sustentável para superar as limitações causadas pela toxidez ao Al. No entanto, há um conhecimento limitado sobre Locus de características quantitativas (QTLs) que controlam a tolerância ao Al em germoplasma de milho do Quênia.
A tolerância ao Al em milho é uma característica complexa, envolvendo vários genes e diferentes mecanismos. O primeiro gene de tolerância ao Al identificado em milho foi o ZmMATE1, co-localizado com um QTL de efeito maior mapeado no cromossomo 6 (Maron et al., 2010). No entanto, diferentes estudos mapearam QTLs de tolerância ao Al de efeitos menores em diferentes populações (Sibov et al., 1999; Ninamango-Cárdenas et al., 2003; Conceição et al., 2009; Guimarães et al., 2014).
A população utilizada no presente trabalho foi derivada de linhagens de milho do Quênia, representando um germoplasma até então inexplorado do ponto de vista genético-molecular como fonte de tolerância ao Al. Assim, o objetivo do presente trabalho foi identificar QTLs associadas com a tolerância ao Al em uma população segregante de milho originária do Quênia que possam ser utilizadas em estudos futuros na dissecação de novos mecanismos de tolerância ao Al3+ e posterior utilização em programas de melhoramento para aumentar a tolerância ao Al em milho.
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A cultura do milho
O milho (Zea mays L.) é o cereal mais produzido no mundo e de grande importância econômica e social. A produção mundial concentra-se basicamente em três grandes produtores que são EUA, China e Brasil, sendo que a produção chinesa não tem sido suficiente para atender sua demanda crescente, necessitando importar o grão de outros países. Para a safra de 15/16 é esperada uma produção de 974,9 milhões de toneladas e cerca de 70% da produção mundial, destina-se a alimentação animal de aves, suínos e bovinos, sendo o restante, destinado à indústria e ao consumo humano (USDA, 2015). O consumo em alguns países da África Oriental e Austral é de 90 a 180 kg de milho por pessoa anualmente (Awika et al., 2011). No Quênia, o setor da agricultura é responsável por 1/3 do produto interno bruto, onde os pequenos produtores contribuem com cerca de 85% do total de empregos na agricultura do país, sendo que o consumo de milho tende continuar a crescer, apesar dos esforços para diversificar a alimentação básica (Oluoch-Kosura, 1999). Mais de 36% dos agricultores nesse país atingem níveis de produtividade abaixo do potencial de produção relativo ao manejo técnico da cultura. Assim, tanto melhorias no manejo técnico da cultura quanto o desenvolvimento de cultivares adaptadas para a região representam alternativas para aumentar a produção de milho no país (Kibaara et al., 2005).
2.2 Solos ácidos e toxidez de alumínio
Solos ácidos são aqueles com valores de pH menores do que 5,0, que cobrem aproximadamente 50% das terras com potencial agrícola do mundo (von Uexküll & Mutert, 1995). Esses solos são comuns em regiões tropicais, onde a produção de grãos é baixa comparada com o rendimento potencial das culturas (Oluoch-Kosura, 1999), sendo a toxidez ao Al uma das principais restrições à produtividade das culturas.
Da área total do Quênia, 16% são classificadas como de alto a médio potencial para a produção agrícola, sendo que os outros 84% são constituídos por terras áridas e semiáridas. No entanto, nas áreas com potencial produtivo, a produtividade do milho é reduzida de 16 a 30% pela toxidade de alumínio (Al) (Oluoch-Kosura, 1999). Nesses solos, a presença de alumínio (Al) inibe o crescimento da raiz, impedindo que a planta obtenha água e nutrientes necessários ao seu desenvolvimento ideal. Isso ocorre porque o Al é solubilizado na solução do solo na forma de cátion trivalente (Al3+), sendo altamente tóxico às raízes (Kochian, 1995).
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Assim, a toxidez de Al pode causar danos indiretos associados com a ausência de chuvas, por restringir o aprofundamento do sistema radicular (Camargo et al., 1998; Mistro et al., 2001).
Apesar de haver estratégias agronômicas capazes de aumentar o pH do solo, como o manejo da fertilidade do solo, elas não são efetivas nas camadas subsuperficiais e aumentam o custo de produção. Assim, uma forma economicamente viável para o desenvolvimento agrícola em solos ácidos consiste no uso de cultivares mais tolerantes ao Al, e a identificação de regiões genômicas associadas com a tolerância ao Al é uma estratégia que pode auxiliar na obtenção dessas cultivares, pois permite compreender os mecanismos moleculares que conferem tal característica (Foy, 1984).
2.3 Mecanismos fisiológicos da tolerância ao alumínio
Dentre os métodos descritos para avaliar a tolerância ao Al em plantas, os ensaios em solução nutritiva são os mais utilizados em estudos moleculares e fisiológicos, uma vez que o efeito do Al pode ser avaliado independentemente de outros fatores (Aniol et al., 1984). O índice fenotípico normalmente utilizado é o crescimento relativo de raiz seminal, onde é quantificada a inibição do crescimento radicular em função da presença de níveis tóxicos de Al.
Os mecanismos fisiológicos de tolerância Al são classificados como apoplásticos ou simplásticos (Kochian, 1995; Kochian et al., 2004). Os mecanismos apoplásticos ou de exclusão são aqueles onde o Al é impedido de atravessar a membrana plasmática e entrar no simplasto, incluindo a imobilização do Al na parece celular, permeabilidade seletiva da membrana plasmática, indução de barreira de pH na rizosfera, efluxo de Al, exsudação de ácidos orgânicos e de compostos fenólicos na rizosfera. Dentre os mecanismos apoplásticos, a liberação de ácidos orgânicos, tais como malato, citrato e oxalato, formam complexos estáveis com os íons de Al3+ disponíveis na rizosfera, sendo um dos principais mecanismos de tolerância do Al nas plantas (Ma et al., 2001). A exsudação de malato ocorre em trigo (Sasaki et al., 2004), Arabidopsis (Hoekenga et al., 2006), colza (Ligaba et al., 2006) e centeio (Collins et al., 2008). A liberação de citrato pela raiz é responsável por conferir tolerância ao Al em milho (Pellet et al., 1995; Maron et al., 2010), soja (Yang et al., 2000), sorgo (Magalhães et al., 2007) e cevada (Furukawa et al., 2007). O trigo sarraceno (Zheng et al., 1998) e o taro (Ma et al., 1998) dependem da exudação de oxalato para conferir tolerância ao Al.
Os mecanismos simplásticos ou de tolerância interna são aqueles no qual o Al nas células são imobilizados no citosol, por meio da compartimentalização no vacúolo, ligação
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com proteínas e outros compostos orgânicos e pela atuação de enzimas tolerantes ao Al (Taylor, 1991). Vários compostos podem formar complexos estáveis com o Al no interior da célula, incluindo ácidos orgânicos (Foy, 1988; Taylor, 1988; Ma e Miyasaka, 1998) e proteínas (Suhayda e Haug, 1985). Os íons Al3+ ou na forma de complexos com agentes quelantes podem ser transportados para o vacúolo das células, onde são armazenados sem causar toxicidade (Kochian et al., 2004). Algumas espécies de plantas acumulam altas concentrações de Al, mas translocam esses íons para tecidos menos sensíveis à toxidez como folhas e sépalas. Esses mecanismos de tolerância interna foram observados em hortência e trigo sarraceno (Ma et al., 1997). As sépalas de hortência mudam para a coloração azul quando cultivadas em solos ácidos, por causa do acúmulo de Al nesses tecidos, que são quelados no citosol e armazenados no vacúolo (Ma et al., 2000). No entanto, os distúrbios induzidos por Al em rotas metabólicas são ainda pouco conhecidos.
Diferentes mecanismos de tolerância de Al podem ocorrer simultaneamente em algumas espécies. No arroz, a exsudação de citrato (Yokosho et al., 2011), bem como mecanismos de tolerância interna contribuem conjuntamente para os altos níveis de tolerância ao Al nesta espécie (Huang et al., 2009). Em milho, foi relatada a exudação de citrato (Piñeros et al., 2002) e de oxalato (Kidd et al., 2001) pelas raízes como mecanismos de tolerância ao Al, além disso, outros mecanismos devem existir nessa espécie (Piñeros et al., 2005; Guimarães et al., 2014).
2.4 Genes de tolerância ao alumínio em plantas
Vários genes de tolerância ao Al já foram identificados e caracterizados em plantas, incluindo aqueles que codificam para transportadores de ácidos orgânicos, transportadores do tipo ABC, transportadores de Al3+ e fatores de transcrição. No trigo (Triticum aestivum), o primeiro gene de tolerância ao Al a ser clonado em plantas foi designado TaALMT1 (Sasaki et al., 2004). O gene ALMT1 corresponde ao locus principal (AltBH), que controla cerca de 85% da variação fenotípica da tolerência ao Al em trigo, por meio da exudação de malato (Riede e Anderson, 1996). Esse gene foi mapeado no cromossomo 4, co-segregando com QTLs de tolerância ao Al identificados em diferentes populações de trigo (Raman et al., 2005; Ma et al., 2005). Homólogos ao gene ALMT foram implicados na exsudação de malato e na tolerância Al em Arabidopsis (AtALMT1; Hoekenga et al., 2006), colza (BnALMT1 e BnALMT2; Ligaba et al., 2006), centeio (ScALMT1; Collins et al., 2008), e cevada (HvALMT1; Gruber et al., 2010). Em milho, dois membros da família ALMT, ZmALMT1
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(Piñeros et al., 2008) e ZmALMT2 (Ligaba et al., 2012), não foram relacionadas com tolerância ao Al.
O SbMATE é o gene correspondente ao locus de maior efeito (AltSB) em sorgo, que responde por cerca de 80% da tolerância ao Al em uma população biparental (Magalhães et al., 2004). Os membros da família MATE são mediadores da exsudação de citrato ativado pelo Al em algumas espécies de plantas (Magalhães et al., 2007). Homólogos funcionais da família MATE associados com tolerância ao Al também foram identificados em Arabidopsis (AtMATE; Liu et al., 2009), trigo (TaMATE1; Ryan et al., 2009), centeio (ScFRDL2; Yokosho et al., 2010) e arroz (OsFRDL4; Yokosho et al, 2011).
Em milho, um homólogo do gene SbMATE foi co-localizado com um QTL de efeito maior para a tolerância ao Al no cromossomos 6, ZmMATE1, sendo caracterizado como transportador de citrato em milho (Maron et.al 2010). Três cópias de ZmMATE1 foram associados com alta expressão desse gene, que por sua vez resulta em nível superior de tolerância à Al na população de linhagens recombinantes (Maron et al., 2013) e em linhagens isogênicas (Guimarães et al., 2014). Por outro lado, QTLs de tolerância ao Al com efeitos menores foram mapeados em diferentes regiões genômicas do milho (Sibov et al., 1999; Ninamango-Cárdenas et al., 2003; Conceição et al., 2009; Guimaraes et al., 2014), ressaltando a herança complexa da característica.
O gene Nrat1 codifica um transportador específico para Al3+, contribuindo com a tolerância ao Al em arroz (Xia et.al 2010). Nrat1 é um transportador localizado na membrana plasmática das células apicais de raízes, e exibe atividade de transporte para o Al3+, mas não para metais divalentes ou para o complexo de Al-citrato (Xia et al., 2010). A expressão de Nrat1 é regulada por um fator de transcrição do tipo zinc finger C2H2 (ART1). O fator de transcrição ART1 regula 31 genes que estão relacionados com a resistência ao Al, além de regular Nrat1, ele também é responsável pela regulação do OsALS1, gene envolvido na tolerância ao Al em arroz (Huang et al., 2012). Linhagens com o gene Nrat1 mutado exibiram maior sensibilidade ao Al, maior acúmulo de Al na parede celular e diminuição da absorção de Al (Xia et al., 2010). Huang et al. (2012) sugeriram que o Nrat1 participa do mecanismo de desintoxicação interna do Al, que é translocado para o vacúolo, possivelmente mediado pelo OsALS1.
Em um estudo recente, o gene ZmNrat1, homólogo em milho para OsNrat1, foi co-localizado com um QTL de tolerância ao Al no cromossomo 5, cuja expressão foi induzida pelo Al uma hora após o tratamento com Al na linhagem tolerante (Guimarães et al., 2014). Tais resultados sugerem uma possível participação deste gene na tolerância Al em milho.
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Além dos genes citados anteriormente, outros genes também estão relacionados com a tolerância Al em plantas. Transportadores do tipo ABC foram associadas com a tolerância Al em Arabidopsis e arroz (ALS3; Larsen et al., 2005 e ALS1; Larsen et al., 2007), (STAR1 e STAR2; Huang et al., 2009; 2010). A expressão dos genes ALS1 e ALS3 é aumentada na raíz após tratamento com Al, sendo acumulado na raíz e na membrana vacuolar, indicando que esses transportadores são componentes importantes na redistribuição intracelular do Al em Arabidopsis, mantendo este metal longe dos tecidos mais sensíveis (Larsen et al., 2005; 2007). Em arroz, STAR1 interage com STAR2 para formar um transportador ABC responsável por modificações da parede celular (Huang et al., 2009).
Apesar de os genes AtALMT1 e AtMATE agirem independentemente para conferir tolerância ao alumínio em Arabidopsis, o fator de transcrição STOP1 participa da ativação transcricional de ambos os genes (Liu et al., 2009). Um homólogo de STOP1 em arroz, ART1, também regula a expressão de vários genes, possivelmente, envolvidos na tolerância Al em arroz (Yamaji et al., 2009). Embora os mecanismos desencadeados por estes transportadores não estejam completamente elucidados, as descobertas recentes sugerem que a desintoxicação interna de Al é um mecanismo complementar à tolerância de Al que pode estar presente em diferentes espécies.
2.5 Genética da tolerância ao alumínio em milho
Embora a exsudação de citrato seja o principal mecanismo de tolerância ao Al em milho, outros mecanismos de desintoxicação têm sido estudados e mostram evidências de agirem em conjunto, contribuindo para a complexidade genética da tolerância ao Al (Magnavaca et al., 1987; Pandey & Gardner, 1992; Lima et al., 1995; Piñeros et al., 2005). Desta forma, o mapeameto de QTL é uma estratégia importante para estudos de características quantitativas, e tem sido aplicado em diferentes populações. Sibov et al. (1999) identificaram dois QTLs de tolerância ao Al nos cromossomos 6 e 10, utilizando marcadores do tipo RFLP, enquanto Ninamango-Cárdenas et al. (2003) mapearam cinco QTLs nos cromossomos 5, 6 e 8 utilizando marcadores do tipo RFLP e SSR. Conceição et al. (2009) identificaram QTLs nos cromossomos 4, 5, 6, 8 e 10, utilizando marcadores SSR. Guimarães et al. (2014) mapearam cinco QTLs de tolerância à Al nos cromossomos 2, 3, 5, 6 e 8, em uma população de linhagens recombinantes derivados de Cateto Al237, utilizando uma alta densidade de marcadores SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único). Todos esses trabalhos foram realizados com germoplasma de milho brasileiro, e consistentemente identificaram um
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QTL de tolerância ao Al na extremidade do cromossomo 6, região genômica onde foi mapeado o gene de efeito maior para tolerância ao Al, ZmMATE1 (Maron et al., 2010).
A população utilizada no presente trabalho foi derivada de uma linhagem de milho do Quênia altamente tolerante ao Al, representando um germoplasma até então inexplorado do ponto de vista genético-molecular como fonte de tolerância ao Al. O uso de marcadores do tipo SNPs fornecem mapas saturados com base na sua elevada abundância na maioria dos genomas e facilitam a detecção de QTLs de tolerância ao Al que pode acelerar a sua utilização no programa de melhoramento por meio da seleção assistida.
3 . MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material genético
Foram utilizadas 180 famílias F2:3 derivadas do cruzamento entre duas linhagens de
milho contrastantes para a tolerância ao Al provenientes do Quênia, 203B-14 e SCH3. A linhagem 203B-14 apresenta alta tolerância ao Al, equivalente à tolerância da linhagem Cateto Al237, considerada como padrão de tolerância no Brasil. A linhagem SCH3 possui atributos agronômicos adequados para o programa de melhoramento do Quênia e alta sensibilidade ao Al, semelhante à L53, utilizada como padrão de sensibilidade ao Al.
3.2. Avaliação da tolerância ao alumínio em solução nutritiva
O experimento foi conduzido em câmara de crescimento com temperatura controlada 25/27 °C dia/noite e umidade relativa de 75%. As sementes foram desinfestadas com 0,5% de hipoclorito de sódio durante 5 minutos, enxaguadas com água destilada e germinadas durante três dias em rolos de papel de germinação umedecidos. As plântulas foram transferidas para copos de polietileno e mantidas em solução nutritiva descrita por Magnavaca et al. (1987) com pH 4,0 sob aeração contínua. Após aclimatização em solução nutritiva completa sem Al durante 24 h o comprimento inicial da raiz seminal (CIRS) foi medido em todas as plântulas, que foram transferidas para bandejas contendo solução nutritiva com atividade {39} µM Al3+ ou sem Al. O pH da solução foi ajustado para 4,0 e monitorado usando NaOH 1M. Após cinco dias, o comprimento final da raiz seminal (CFRS) foi medido em cada plântula. A tolerância foi avaliada como o crescimento relativo de raiz seminal (RNRG) medido como (CFRS - CIRS) com Al dividido por (CFRS - CIRS) sem Al.
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As progênies foram avaliadas em seis experimentos delineados em blocos casualizados com três repetições, e duas testemunhas comuns, L53 e Cateto Al237, em todos os experimentos. A análise de variância dos dados fenotípicos foi realizada utilizando Proc GLM (SAS Institute, Inc., 1999). A herdabilidade foi estimada com base nas médias dos tratamentos regulados.
3.3 Marcadores moleculares
O DNA foi isolado a partir de folhas jovens, utilizando o método de CTAB (Saghai-Maroof et al., 1984). As reações de PCR para os marcadores microssatélites foram realizadas de acordo com Ninamango-Cárdenas et al. (2003) e os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em géis de acrilamida a 10% e corado com prata. Os géis foram visualizados no sistema de fotodocumentação L-PIX-EX (Loccus Biotecnologia). As sequências dos iniciadores e localização genômica dos SSRs foram obtidas no Maize Genetics and Genomic Database (http://www.maizegdb.org/data_center/locus). Os SNPs foram mapeados na população usando Kompetitive Alelle-Specific PCR, denominado de ensaio KASP por meio da empresa LGC Genomics (www.lgcgenomics.com).
A reação de amplificação com os iniciadores fluorescentes para SSR foi realizada com 50 ng de DNA, tampão 1X, MgCl2 2,5 mM, 166 mM de cada dNTP, 0,2 mM de cada iniciador e 0,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) em um volume total de 15 µL. Os ciclos de amplificação consistiram de uma desnaturação inicial a 95°C durante 2 minutos, seguidos por oito ciclos de aterragem a 94°C durante 20 segundos, 60°C (-1°C / ciclo) durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, um adicional de 35 ciclos de amplificação a 94°C durante 20 segundos, 53°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, com um passo de extensão final a 72°C durante 5 minutos. Após a PCR, as reações foram diluídas em água (1:100), sendo aliquotado 2 µL de cada uma das amostras juntamente com 0,3 µL de GeneTAB500 (GeneID) e 9,7 µL de 0,1% de Tween 20. A mistura foi desnaturada a 94°C por 5 minutos e transferida para um banho de gelo antes da aplicação. A eletroforese capilar foi realizada em MegaBace 1000 (Amersham Biosciences), utilizando a injeção com 3kV por 45 segundos e corrida a 10kV por 75 minutos. Os resultados foram avaliados no software Fragment Profile 1.2 (Amersham Biosciences).
Para o gene candidato ZmNrat1, os fragmentos foram amplificados com o par de
primers F: 5’CGCGGAAACAGGAACCAAACCAAAA-3’ e R:
5’-CGGGTCTCTGCGTACCCCGA-3’ na população utilizando 30 ng de DNA, 1,0 mM Tris-HCl (pH 8,0); 50 mM KCl; 2,0 mM MgCl2; 125 µM de cada um dos dNTPs; 10 µM de cada
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um dos primers, 5% DMSO e 1U de enzima Taq DNA polimerase, para um volume total de 20 µL. Os ciclos de amplificação consistiram de uma desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos, 94°C por 30 segundos, seguidos pela temperatura de anelamento em função de cada par de primers por 30 segundos e 72°C por 1:30 minutos em 35 ciclos, com uma etapa de extensão final de 72°C por 5 minutos, seguido pela clivagem com a enzima HinfI. Os produtos amplificados foram separados em géis de agarose 1,5% (m/v) em tampão TAE (40 mM Tris-acetato; 1 mM EDTA, pH 8,0) e corados com GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium). Após a eletroforese realizada a 100V durante uma hora, o gel foi visualizado no sistema de fotodocumentação L-PIX-EX (Loccus Biotecnologia).
3.4 Mapa genético
Marcadores SNPs e SSRs foram testados quanto à segregação esperada de 1:2:1 na população F2 usando estatística qui-quadrado (p <0,05). O mapa genético foi construído
utilizando o software MAPMAKER / EXP 3.0b (Lander et al., 1987) com LOD mínimo de 3 e frequência de recombinação máxima de 0,40. A frequência de recombinação foi convertida em distância genética por meio da função Kosambi (Kosambi, 1944).
3.5 Mapeamento de QTLs
O mapeamento de QTLs foi realizado utilizando a metodologia de intervalos múltiplos (MIM) proposta por Kao et al. (1999) e implementada pelo QTL Cartographer versão 2.5 para Windows (Wang et al., 2012). O modelo final foi selecionado após os ajustes dos efeitos principais e das interações entre QTLs com base no critério de Bayesian Information Content (BIC), sendo obtidas a posição, os efeitos e a proporção da variância fenotípica (R2) explicada pelos QTLs individuais, bem como a proporção da variância fenotípica explicada pelo modelo (R2T) total do modelo. Os intervalos de confiança foram estabelecidos como um intervalo de suporte LOD (Lander & Botstein, 1989).
3.6 Análise da expressão do ZmNrat1
A expressão do gene ZmNrat1 foi avaliada nas mesmas condições da análise da tolerância ao Al em solução nutritiva nos tempos zero, após 1 e 6 horas de exposição a {39} μM de atividade de Al, e na solução sem alumínio. O RNA total foi extraído do primeiro centímetro do ápice radicular utilizando o kit de extração RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen,Hilden, Alemanha). As amostras foram quantificadas e a pureza do RNA verificada por meio da leitura a 260 e 280 ηm utilizando o espectrofotômetro NanoDrop 3000 (Thermo
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Fisher Scientific, Worcester, MA). A verificação da integridade do RNA foi feita por eletroforese em gel de agarose 1,5% com tampão Tris-acetato EDTA (TAE) 1x, corados com GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium). A eletroforese foi realizada a 200V por 15 min e o gel visualizado no sistema de fotodocumentação L-PIX-EX (Loccus Biotecnologia). Para a obtenção do cDNA, foi utilizado o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City, CA). A reação de síntese do cDNA foi efetuada para um volume final de 10 µL, utilizando 1 µg de RNA total, RT Random primers e Transcriptase Reversa. As condições de amplificação foram 25°C por 10 min, 37°C por 2h e 85°C por 5 min. A quantificação relativa da expressão do gene ZmNrat1 foi feita utilizando-se o kit Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) desenhado para o gene ZmNrat1, utilizando os primers F: 5’CGCGCTTCTGATCCAAACA-3’ e R: 5’-GCGAGATGCTTGCCTGTCTT-3’. Como controle endógeno foi utilizado o 18S RNA.
A expressão foi quantificada por RT-PCR quantitativo no equipamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando a metodologia Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram utilizados os parentais contrastantes 203B-14 e SCH3, juntamente com os padrões de tolerância ao Al Cateto Al237 e L53, tolerante e sensível ao Al, respectivamente. Cada amostra biológica foi representada por um conjunto de 14 plântulas, sendo realizadas três repetições técnicas.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Variabilidade da tolerância ao Al
A tolerância ao alumínio (Al) com base no crescimento relativo de raiz seminal (RNRG) em solução nutritiva apresentou uma ampla variabilidade genética, com baixo coeficiente de variação (8,82%) e alta herdabilidade (97,07%). Esses resultados indicam que a população alvo é adequada para o mapeamento de QTLs e que os dados fenotípicos possuem alta confiabilidade (Tabela 1).
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Tabela 1. Análise de variância agrupada com testemunhas comuns para a tolerância ao Al na população F2:3 derivada do cruzamento entre as linhagens 203B-14 e SCH3.
Fonte de Variação DF Quadrado médio
Rep/Experimento 12 26,86 Experimento(E) 5 1650,29** Controle x E 5 103,66** Genótipos ajustados 183 715,48** Controles 1 50912,12** Genotipos/E 176 357,79** (Controle Vs Genótipo)/E 6 2841,73** Resíduo 376 10,49 Média Geral 36,72
Média dos Genótipos 35,34
Média dos Controles 57,61
CV(%) 8,82
Herdabilidade (%) 97,07
** significativo a 1% do teste F
A distribuição da frequência de tolerância Al na população mostrou que a maior parte das famílias tendeu para o parental sensível ao Al pode ser explicada pelo efeito de dominância ser negativo (Figura 1). Das 182 famílias F2:3, apenas 6 possuíam RNRG maior
que 0,57 representando 3,33% da população com tolerância intermediária e que nenhuma família superou o pai tolerante.
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Figura 1: Distribuição da frequência de tolerância ao Al nas famílias F2:3 derivadas do
cruzamento entre as linhagens de milho SCH3 (sensível) e 203B-14 (tolerante).
4.2 QTLs associados com tolerância ao Al
Inicialmente, foram genotipados 182 marcadores do tipo SNPs, sendo adicionados marcadores SSR para melhorar a saturação do mapa. Um total de 106 marcadores SNPs, 12 SSRs e o gene do ZmNrat1 foram ordenados ao longo dos 10 cromossomos, cobrindo 1425,70 centiMorgans (cM) do genoma do milho (Figura 2). O cromossomo 1 apresentou uma melhor cobertura, com 22 marcadores ao longo de 268,5 cM. O cromossomo 6 teve 88.8 cM do genoma coberto com apenas 6 marcadores polimórficos.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0-0.19 0.2-0.29 0.3-0.39 0.4-0.49 0.5-59 0.6-0.69 1.02 F re q u ên cia RNRG SCH3 203B-14
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Figura 2. Mapa de ligação em uma população F2:3 derivada do cruzamento entre as linhagens
de milho SCH3 e 203B-14, incluindo com marcadores SNPs, SSRs e o gene ZmNRAT1.
Com a estratégia de mapeamento por intervalos múltiplos (MIM), foram detectados cinco QTLs associados com a tolerância ao Al nos cromossomos 1, 5, 8, 9 e 10, explicando aproximadamente 50% da variação fenotípica para RNRG, incluindo efeitos epistáticos (Tabela 2).
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Tabela 2. QTLs associados com tolerância ao Al em uma população de milho do Quênia utilizando o mapeamento por intervalos múltiplos.
QTL Cro Marcador Posição(cM) Tipo LOD Efeito R2 (%)
1 1 PZA00356_8 183.4386 A 3.91 3.7442 5.4 D 1.72 -3.5219 2.8 2 5 PHM1870_20 48.5719 A 3.49 3.7221 5.5 D 0.61 2.0878 1.2 3 8 PHM10525_11 70.7438 A 0.09 -0.5655 0.4 D 2.63 -4.1265 4.1 4 9 sh1_12 22.0100 A 2.35 -3.1995 5.2 D 0.96 -3.0371 1.9 5 10 PHM1752_36 3.2244 A 2.76 2.8508 4.8 D 0.34 1.4288 0.3 Interações 1x3 DD 2.821 8.8774 4.9 1x4 DA 2.6800 7.5037 6.8 3x4 DD 1.4700 7.3170 3.4 1x5 DA 1.1830 -5.3764 3.2 Total R2 (%) 49,9 Cro: Cromossomo
R2 (%): Proporção da variância fenotípica da tolerância ao Al explicada por QTLs individualmente.
R2 T(%):Proporção da variância fenotípica da tolerância ao Al explicada pelo modelo. A: Efeito aditivo.
D: Efeito de dominância.
Foram identificados QTLs com efeitos aditivos e de dominância, explicando relativamente pequena proporção da variância fenotipica da tolerância ao Al. Já, os efeitos epistáticos foram significativos e com elevada importância, sendo comparável aos efeitos principais. Alguns QTLs apresentaram efeito aditivo negativo, indicando que a linhagem SCH3 também possui alelos capazes de melhorar a tolerância ao Al.
Os QTLs identificados nos cromossomos 5, 8 e 10 são coincidentes com regiões previamente associadas com a tolerância ao Al em outros trabalhos (Sibov et al., 1999;
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Ninamango et al., 2003; Conceição et al., 2009). Dentre eles, podemos ressaltar o QTL mapeado no cromossomo 5, que tem os efeitos aditivos explicando uma das maiores proporções da variância fenotípica na população (R2 = 5,5%). Essa região genômica co-localiza com o ZmNrat1, também detectado em uma população de milho originária do Brasil (Guimarães et al., 2014) (Figura 3). A análise da expressão gênica revelou que o ZmNrat1 foi mais expresso no ápice radicular das linhagens de milho tolerantes ao Al em comparação com as linhagens sensíveis, 6 horas após a exposição ao Al em solução nutritiva (Figura 4). A expressão do ZmNrat1 foi induzida pelo Al a partir de uma hora de tratamento em todas as linhagens, sendo as diferenças mais evidentes após 6 horas.
Figura 3: QTL de tolerância ao Al mapeado no cromossomo 5, co-localizado com o gene candidato ZmNrat1.
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Figura 4: Padrão de expressão o gene candidato ZmNrat1 no ápice radicular de linhagens milho contrastantes quanto à tolerância ao Al ao longo do tempo após o tratamento com {39} µM Al3+ em solução nutritiva.
O gene ZmNrat1 é homólogo ao OsNrat1, que codifica um transportador de Al3+ associado a tolerância ao Al em arroz (Xia et al., 2010). Nrat1 é um transportador localizado na membrana plasmática das células apicais de raízes, sendo responsável por um dos mecanismo de desintoxicação interna de Al em arroz (Huang et al., 2012). A combinação dos resultados do mapeamento de QTLs com a expressão gênica, sugerem que o gene ZmNrat1 também pode estar envolvido com mecanismos de tolerância ao Al em milho.
Nenhum QTL de tolerância ao Al foi detectado no cromossomo 6, onde o gene ZmMATE1 foi mapeado em uma população de RILs derivada da linhagem brasileira Cateto Al237 (Maron et al., 2010). O gene ZmMATE1 é mais expresso na linhagem tolerante em relação à linhagem sensível (Maron et al., 2010; 2013) e aumenta significativamente a tolerância ao Al quando introgredido em linhagens isogênicas de milho (Guimarães et al., 2014). A ausência do QTL na extremidade do cromossomo 6 sugere que a tolerância ao Al na linhagem do Quênia 203B-14, não deve ser conferida pelo gene ZmMATE1.
Na população de milho do Quênia, todos os QTLs de tolerância ao Al apresentaram efeitos menores, enquanto que na população do Brasil derivada da linhagem Cateto Al237 foi detectado um QTL de efeito maior, coincidindo com o gene ZmMATE1. Talvez a ausência do alelo de tolerância do gene ZmMATE1 nessa população tenha contribuído para tal fato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que o alelo de tolerância ao Al do gene ZmMATE1 ter sido originado na América do Sul, uma vez que até o presente momento apenas duas
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linhagens Cateto do Brasil (Cat100-6 e Cateto Al237) e um linhagem da Bolívia (Il422a) (Maron et al., 2013).
Adicionalmente, novas regiões genômicas foram identificadas nos cromossomos 1 e 9, não sendo relatadas em trabalhos anteriores, indicando que a população do Quênia possui novos genes e/ou mecanismos de tolerância ao Al.
5. CONCLUSÃO
Três QTLs de tolerância ao Al foram coincidentes com trabalhos anteriores, e dois novos QTLs foram mapeados na população de milho do Quênia. Nenhuma associação foi encontrada no cromossomo 6 onde está localizado o ZmMATE1, um gene de efeito maior para tolerância ao Al. No entanto, o QTL mapeado no cromossomo 5 co-localiza com o gene ZmNRAT1, previamente associado com tolerância ao Al em arroz. Essas regiões genômicas poderão ser utilizadas em trabalhos futuros para dissecar novos mecanismos que conferem tolerância ao Al em milho e para programas de melhoramento para desenvolver cultivares de milho tolerantes ao Al e mais produtivos em solo ácido.
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