ÉRICO VINÍCIUS DE SOUZA CARMO
“Avaliação da capacidade leishmanicida de neutrófilos sobre a
Leishmania (Leishmania) amazonensis in vitro e em um modelo de
resistência in vivo.”
Tese apresentada à Escola Paulista
de Medicina - Universidade Federal
de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Microbiologia e
Imunologia
São Paulo
2010
ÉRICO VINÍCIUS DE SOUZA CARMO
“Avaliação da capacidade leishmanicida de neutrófilos sobre a
Leishmania (Leishmania) amazonensis in vitro e em um modelo de
resistência in vivo.”
Orientadora: Profa. Dra. Clara Lúcia Barbiéri Mestriner
Tese apresentada à Escola Paulista
de Medicina - Universidade Federal
de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Microbiologia e
Imunologia
São Paulo
2010
Carmo, Érico Vinícius de Souza
“Avaliação da capacidade leishmanicida de neutrófilos sobre a
Leishmania (Leishmania) amazonensi in vitro e em um modelo
de resistência in vivo”
/ Érico Vinícius de Souza Carmo. -- São Paulo, 2010.
xvii, 124f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo.
Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia.
Título em inglês: Evaluation of neutrophil leishmanicidal activity
on Leishmania (Leishmania.) amazonensis in vitro and in a
resistance model in vivo.
1.
Leishmania (L.) amazonensis. 2. neutrófilos. 3. cocultura.
Trabalho realizado na Disciplina de
Parasitologia
do
Departamento
de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Escola Paulista de Medicina - Universidade
Federal de São Paulo, com auxílios
financeiros concedidos pela Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
“A diferença entre o possível e o impossível é a vontade humana.”
À minha família, em especial à minha esposa Andréa e minha filha Manuela,
por seu apoio incondicional e compreensão durante esses anos.
À Dra. Clara Lúcia Barbiéri Mestriner por sua orientação, pelo exemplo
de profissionalismo e pela crença em meu trabalho.
Aos docentes da disciplina de Parasitologia: Dra. Nobuko Yoshida, Dr. Michel
Rabinovitch, Dr. José Franco da Silveira e Dr. Renato Arruda Mortara pelo convívio
durante esses anos e pelo exemplo de dedicação a Ciência.
Aos amigos Paulo Henrique, Josie Haydeé, Carlos Fedelli, Luciana, Carolina
e Isabella, pelo convívio, pela paciência, apoio constante e pelos momentos de
descontração.
À Simone Katz, pelo apoio em todos os momentos, pelos incentivos
constantes e pela amizade.
Ao amigo Fernando Real, pelas discussões científicas, cafés e companhia
durante os trabalhos de fim de semana e horários alternativos.
À Sandrinha, pela amizade e convívio em todos os momentos.
Ao colega Ricardo Russo, pelo apoio com CBA e pelas discussões musicais.
Aos colegas Cláudio, Fanny, Esteban, Daniella, Daniela, Roberto, Rafael,
Vanessa, Cristiane, pelo convívio em nosso andar e nas disciplinas.
À Mércia e Regiane pela atenção e disponibilidade em me ajudar ao longo
desses anos, especialmente nos momentos difíceis.
Aos amigos Joel, Eduardo, Loren e Adriana, que sempre tiveram palavras de
apoio durante os desafios.
Aos colegas Adilson, Cidinha, Solange, Henrique e Lima pelo convívio e apoio
técnico, sem os quais esse trabalho não seria possível.
Resumo...1
Abstract...4
Introdução...7
1 – Aspectos Gerais...8
2 – Modelos experimentais de infecção pela Leishmania (Leishmania)
amazonensis...10
3 – Resposta imune na leishmaniose causada pela Leishmania (Leishmania)
amazonensis...13
4 – O papel dos neutrófilos nas leishmanioses cutâneas...14
Objetivos...18
Materiais e Métodos...20
1 - Animais de experimentação...21
2 – Obtenção dos amastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (L.)
chagasi...21
3 – Anticorpos e Reagentes...22
4 – Histologia das lesões de patas...22
5 – Microscopia eletrônica das lesões de patas...23
6 – Cultura de macrófagos de medula óssea...23
7 – Obtenção de exudato de neutrófilos...24
8 – Macrófagos inflamatórios, infecção e cocultura macrófagos/neutrófilos...24
9 – Avaliação de citocinas...25
10 – Dosagem de óxido nítrico (NO)...26
11 – Microscopia de imunofluorescência...26
12 – Depleção de células Gr-1+...27
13 – Ativação dos animais com KC pela técnica do “air pounch”...27
14 - Análise estatística...27
Resultados...28
1 – Cinética da infecção de camundongos BALB/c e C3H/HePas...29
2 – Análise histológica em cortes de lesões de pata de camundongos C3H/HePas e
BALB/c infectados com a L. (L.) amazonensis...32
3 – Curso da infecção pela L. (L.) amazonensis in vitro em macrófagos de
camundongos BALB/c e C3H/HePas...38
4 – Curso da infecção pela L. (L.) amazonensis em macrófagos de camundongos
BALB/c e C3H/HePas ativados...39
5 – Atividade leishmanicida em cocultura de macrófagos e neutrófilos...40
6 – Análise das citocinas em coculturas de macrófagos infectados com L. (L.)
amazonensis e neutrófilos...43
7 – O papel do TNF-α na destruição dos amastigotas nas coculturas de macrófagos
infectados com a L. (L.) amazonensis e neutrófilos...45
8 – O papel do óxido nítrico e dos radicais de oxigênio na atividade leishmanicida
das coculturas...46
9 – Efeito do TNF-α na infecção dos macrófagos infectados por Leishmania (L.)
amazonensis...47
10 – Efeito da elastase do neutrófilo e do fator ativador de plaquetas no efeito
leishmanicida das coculturas de neutrófilos/macrófagos infectados com a L. (L.)
amazonensis...48
11 – A participação do TLR-4 no controle da infecção pela L. (L.) amazonensis nos
camundongos C3H/HePas...50
12 – Perfil de citocinas nas lesões dos camundongos BALB/c e C3H/HePas
infectados com a L. (L.) amazonensis...52
13 – Depleção de granulócitos em camundongos C3H/HePas e BALB/c...54
14 – Ativação de neutrófilos nos camundongos BALB/c...56
Discussão...58
Referências Bibliográficas...67
Anexo...81
AcMo
anticorpo monoclonal
AG aminoguanidina
AM
amastigota
BSA
albumina sérica bovina
DAB
Diaminobenzidina
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMSO
dimetilsulfóxido
DNA
ácido desoxirribonucléico
ELISA
ensaio imunoenzimático
EDTA
ácido etileno diamino tetracético
h
hora
HEPES 4- (2-hydroxyethyl) - ácido 1-piperazinetanesulfonico
HIV Virus da imunodeficiência humana
IFN
interferon
IL
interleucina
IPTG
isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
KC Quimiocina derivada de queratinócitos
LCCM meio condicionado de células L929
LPS Lipopolissacarídeo
MCP Proteína quimiotáctil de macrófagos
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
NE elastase de neutrófilo
NO óxido nítrico
OPD O-fenilenodiamina
PAF fator de ativação de plaquetas
PBS
salina em tampão fosfato 10 mM, pH 7,2
PGE prostaglandina E
RNA
ácido ribonucléico
SOD superóxido desmutase
T.A.
temperatura ambiente
TGF fator de crescimento tumoral
TNF fator de necrose tumoral
U
NIDADES DE
M
EDIDA
cm
centímetro
g
grama
g
aceleração da gravidade (9,8 m/s
2)
h hora
kDa
kilodalton
L
litro
M
molar
mg
miligrama
min minuto
mL
mililitro
mM
milimolar
ng
nanograma
rpm
rotações por minuto
seg
segundo
U
unidade
µg
micrograma
µL
microlitro
µM
micromolar
v
volume
Resumo
1
Resumo
2
O enfoque do nosso trabalho foi estudar a participação de neutrófilos na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis utilizando-se linhagens de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C3H/HePAs).
Inicialmente, comparamos a evolução das lesões causadas pela L. (L.)
amazonensis nas linhagens BALB/c e C3H/HePas, demonstrando-se que os
camundongos BALB/c apresentam aumento gradativo das lesões, enquanto que a doença não evolui na linhagem C3H/HePas. A análise histológica das lesões dos camundongos BALB/c mostrou grande infiltração de macrófagos parasitados, com vacúolos repletos de amastigotas da L. (L.) amazonensis, poucos linfócitos, poucos neutrófilos e hiperplasia de células epiteliais. Por outro lado, as lesões dos camundongos C3H/HePas mostraram características de reação inflamatória intensa, com o início de processo do tipo granulomatoso, onde se observam células epitelióides, alguns linfócitos e raros amastigotas da L. (L.) amazonensis.
A cinética da infecção de macrófagos de medula óssea in vitro ativados ou não com IFN-! mostrou o aumento progressivo da carga parasitária nas culturas de ambas as linhagens de camundongos. Esses resultados demonstraram que a resistência dos camundongos C3H/HePas à L. (L.) amazonensis não se deve a um mecanismo intrínseco de destruição pelos macrófagos e tampouco pode ser atribuída à ativação dos macrófagos por IFN-!.
Acentuada destruição da L. (L.) amazonensis foi observada nas coculturas de macrófagos infectados e neutrófilos. Demonstrou-se que a atividade leishmanicida nas coculturas não depende do perfil de resistência dos animais, pois não houve diferença na destruição dos parasitas entre os camundongos BALB/c e C3H/HePas. Além disso, essa destruição não depende do contato entre os macrófagos infectados e os neutrófilos, estando relacionada à secreção de fatores solúveis.
Enquanto que a análise das citocinas nas coculturas mostrou que a proteína quimiotáctil de monócitos (MCP-1) predomina nos sobrenadantes dos macrófagos 24 horas após a infecção com a L. (L.) amazonensis, a detecção de IL-6 e TNF-! indicou o ambiente inflamatório nas coculturas. Corroborando esses resultados, a inibição significante da atividade leishmanicida nas coculturas em presença do anticorpo anti-TNF-! mostrou o envolvimento dessa citocina na destruição dos parasitas. Por outro lado, a atividade leishmanicida das coculturas foi independente da ação do óxido nítrico, ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, indicando que a destruição da L. (L.) amazonensis não está correlacionada à ativação clássica do
Resumo
3
macrófago pelo TNF-!. A participação da elastase do neutrófilo (NE) e do fator ativador de plaquetas (PAF) na atividade leishmanicida das coculturas também foi demonstrada.
A análise das citocinas nas lesões das duas linhagens estudadas mostrou a secreção do TGF-" no início da infecção nos camundongos BALB/c, enquanto que o TNF-! predominou na linhagem C3H/HePas. Esses achados reforçam os resultados iniciais que mostraram a persistência de um processo inflamatório nas lesões dos camundongos C3H/HePas, com infiltração de neutrófilos, resultando na destruição da L. (L.) amazonensis nesses animais.
A depleção de neutrófilos com anti Gr-1 mostrou a diminuição significante dessas células nos animais tratados, porém sem alteração no curso da infecção em ambas as linhagens. Por outro lado, a ativação de neutrófilos nos camundongos BALB/c tratados com o KC retardou a evolução das lesões nesses animais.
Os dados desse trabalho demonstram que a interação dos neutrófilos com os macrófagos infectados exerce um eficiente efeito leishmanicida sobre a L. (L.)
amazonensis. Pode-se ressaltar ainda que esse trabalho abriu perspectivas de
explorar o papel dos neutrófilos na imunidade inata da infecção por esse parasita, constituindo a linhagem C3H/HePas uma ferramenta muito útil para a continuidade desse estudo.
4
Abstract
5
The present study focused on the role of neutrophils in Leishmania (Leishmania) amazonensis infection by use of susceptible (BALB/c) and resistant (C3H/HePas) mouse strains.
Comparison of the outcome of L. (L.) amazonensis infection between the two mouse strains demonstrated a gradual increase of foot lesions in BALB/c mice, whereas the disease did not develop in the C3H/HePas strain. Histopathological analysis of foot lesions showed a predominance of macrophages harboring a high number of L. (L.) amazonensis amastigotes, few lymphocytes and neutrophils and hyperplasia of epithelial cells in BALB/c mice. In contrast, an intense inflammatory reaction with a large infiltrate of neutrophils, an initial granulomatous process exhibiting epithelioid cells and lymphocytes and rare L. (L.) amazonensis amastigotes were observed in C3H/HePas mice.
Kinetics of in vitro infection of bone marrow macrophages was carried out in the presence or in the absence of IFN-! and showed increased parasite burden in the cultures from both mouse strains. These results demonstrated that the resistance of C3H/HePas mice to L. (L.) amazonensis could not be attributed either to an intrinsic mechanism of L. (L.) amazonensis macrophage destruction or to the macrophage activation by IFN-!.
An effective destruction of L. (L.) amazonensis amastigotes was observed in cocultures of macrophages with inflammatory neutrophils in vitro. The leishmanicidal activity of the cocultures did not depend on the animal resistance profile since the parasite destruction was similar when cells were obtained from BALB/c or C3H/HePas mice. Furthermore, amastigote killing did not require contact between infected macrophages and neutrophils, indicating that the parasite destruction is mediated by soluble factors.
The cytokine analysis showed that the MCP-1 protein was detected in the supernatants of macrophages 24 hours after infection with L. (L.) amazonensis, whereas secretion of IL-6 and TNF-! indicated a predominance of an inflammatory environment in the cocultures. These results were corroborated by the significant inhibition of the leishmanicidal activity of the cocultures in the presence of anti-TNF-!. However, the L. (L.) amazonensis destruction did not depend on generation of nitric oxide, superoxide or oxygen peroxide, indicating that parasite clearance did not involve the classical pathway of macrophage activation by TNF-!. The implication of
Abstract
6
neutrophil elastase (NE) and platelet activating factor (PAF) in parasite destruction in the cocultures was also demonstrated.
The cytokine analysis in the foot lesions of BALB/c and C3H/HePas strains infected with L. (L.) amazonensis showed an early secretion of TGF-! in BALB/c mice whereas TNF-" predominated in the C3H/HePas strain. These results support our initial observations on the persistence of an inflammatory environment in foot lesions of C3H/HePas mice with infiltration of neutrophils resulting in L. (L.)
amazonensis destruction.
Depletion with anti Gr-1 in BALB/c and C3H/HePas mice led to a significant decrease of neutrophils in both mouse strains but did not change the course of L. (L.)
amazonensis infection. On the other hand, the neutrophil activation with KC delayed
the development of foot lesions in BALB/c mice.
In conclusion, our data demonstrated that interaction between neutrophils and
L. (L.) amazonensis-infected macrophages induces an effective parasite destruction.
It is still important to emphasize that our findings opened perspectives to explore the role of innate immunity in L. (L.) amazonensis infection and the C3H/HePas strain constitutes an useful tool for the extension of this study.
7
Introdução
8
1. Aspectos Gerais
As leishmanioses compreendem um grupo de parasitoses causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania. Estima-se que existam atualmente 12 milhões de casos de leishmanioEstima-ses, com mortalidade anual de aproximadamente 60.000. Segundo a Organização Mundial da Saúde as leishmanioses ocorrem em 88 países e sua notificação é compulsória em apenas 30 deles. Anualmente surgem 2 milhões de novos casos e 350 milhões de pessoas encontram-se sob o risco de adquirir alguma forma da doença (WHO, 2001). A coinfecção Leishmania/HIV agrava ainda mais esse quadro, considerando-se o número de pessoas HIV positivas (Desjeux, 2004).
O gênero Leishmania pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, e compreende parasitas digenéticos que se desenvolvem alternadamente em hospedeiros vertebrados mamíferos e insetos vetores. Nos hospedeiros mamíferos, entre eles o homem, os parasitas assumem a forma amastigota, arredondada e imóvel, que se multiplica obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário em um vacúolo parasitóforo. À medida que os amastigotas se multiplicam por divisão binária os macrófagos se rompem liberando os parasitas que são fogocitados por outros macrófagos. Os vetores das leishmanioses são representados por insetos dípteros da sub-família Phlebotominae (gênero Lutzomya nas Américas e Phlebotomus no Velho Mundo). Nos flebotomíneos os parasitas vivem no trato digestivo onde as formas amastigotas, ingeridas durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro mamífero infectado, diferenciam-se em promastigotas, formas alongadas, flageladas e móveis. Os promastigotas são inoculados pela fêmea do vetor juntamente com a saliva na pele dos mamíferos durante a picada, completando o ciclo. Além do homem, vários mamíferos são suscetíveis à infecção por
Leishmania. Entre esses alguns representam reservatórios importantes das
leishmanioses, principalmente os roedores silvestres, edentados (tatu, tamanduá, preguiça), marsupiais (gambá) e canídeos. O ciclo biológico de
Introdução
9
Figura 1. Ciclo biológico de Leishmania spp. Entre os hospedeiros mamíferos destacam-se o homem e os vários reservatórios das leishmanioses (adaptado de Handman, 2001).
As manifestações clínicas determinadas pela infecção por Leishmania apresentam uma evolução dependente de fatores como a espécie do parasita, a carga genética do hospedeiro e a imunidade adquirida durante o desenvolvimento da doença. As leishmanioses podem ser encontradas nas formas visceral, cutânea com lesões abertas e ulceradas, cutânea com lesões
Introdução
10
nodulares, cutânea difusa e na forma mutilante mucocutânea (Pearson & Souza, 1996).
No presente trabalho a espécie estudada é Leishmania (Leishmania)
amazonensis que normalmente produz lesões cutâneas nodulares com
tendência à autocura, podendo em alguns hospedeiros evoluir para a forma cutânea difusa. A forma difusa constitui uma forma clínica rara, porém grave que ocorre em pacientes com anergia à resposta imune celular a antígenos de
Leishmania. A L. (L.) amazonensis é encontrada principalmente na Bacia
Amazônica em regiões de florestas primárias e secundárias, nos estados do Nordeste (Bahia), Sudeste (Minas Gerais e São Paulo), Centro-Oeste (Goiás) e Sul (Paraná) (Lainson e Shaw, 1987) e dados recentes indicam que está aumentando a sua área de distribuição no Brasil (Azeredo-Coutinho et al, 2007).
A grande complexidade da leishmaniose tegumentar que envolve diferentes espécies de vetores, reservatórios e espécies de Leishmania e a alta letalidade, incidência e urbanização da leishmaniose visceral tornam essas parasitoses um grande desafio de Saúde Pública e refletem o investimento crescente dedicado à pesquisa dessas doenças (Secretaria de Vigilância em Saúde, 2010).
2. Modelos experimentais de infecção pela Leishmania (Leishmania)
amazonensis
Vários animais são utilizados como modelos experimentais para o estudo de infecções e resposta imune do hospedeiro à Leishmania. A possibilidade de controle das condições que influenciam os fenômenos imunológicos relacionados à infecção pela utilização de animais geneticamente idênticos (isogênicos) ou modificados contribui para a compreensão dos processos relacionados à doença ou à cura. Nesse contexto, o camundongo é o modelo experimental mais utilizado para o estudo da infecção por Leishmania devido a seus padrões distintos de resposta à infecção entre as diferentes linhagens (Perez et. al., 1978; Behin et al., 1979; Bjorvatn & Neva, 1979; Handman et al., 1979; Barral et al., 1983; Childs et al., 1984).
Introdução
11
A resposta imune nas leishmanioses é dependente da espécie do parasita e do genótipo do hospedeiro e várias linhagens de camundongos são utilizadas nos estudos de imunidade à Leishmania. O modelo murino utilizado como o protótipo de suscetibilidade ou resistência à Leishmania foi estabelecido com a espécie Leishmania (L.) major. Nesse modelo, observou-se que os camundongos C57BL/6 são resistentes e desenvolvem resposta mediada por linfócitos T CD4+ da subpopulação Th1, produtores de IFN-!, IL-2 e TNF-" (Heinzel et al, 1989; Wang et al, 1994). O IFN-! ativa macrófagos levando à produção de óxido nítrico (NO) e produtos reativos de oxigênio (H2O2
e O2-) que são os principais compostos envolvidos com a morte dos
amastigotas intracelulares (Murray et al., 1982; Liew et al., 1990). Por outro lado, em camundongos BALB/c, suscetíveis, a resposta é mediada por linfócitos T da subpopulação Th2, produtores de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que levam à inativação dos macrófagos (Sadick et al, 1990; Chatelain et al, 1992; Kopf et al, 1996).
Além da suscetibilidade à L. (L.) major, os camundongos BALB/c podem ser infectados por diferentes espécies cutâneas de Leishmania (Nasseri & Modabber, 1979; Barral-Netto et al., 1987), exibindo um processo infeccioso persistente com lesões de evolução progressiva e possibilidade de disseminação. A análise histológica da lesão cutânea dos camundongos BALB/c infectados com a L. (L.) amazonensis mostra numerosos macrófagos com vacúolos grandes contendo muitos parasitas em seu interior, desestruturação do tecido, além da presença de poucos neutrófilos e linfócitos (Andrade et. al., 1984; Barral-Netto et. al., 1987). Enquanto o fenótipo de suscetibilidade dos camundongos BALB/c à L. (L.) major é relacionado à expressão de IL-4 e ausência de receptores de IL-12 (IL-12R) com o direcionamento para a resposta Th2 (Launois et al., 1997; Himmelrich et al., 1998), na infecção por L. (L.) amazonensis não existem evidências de uma polarização para essa subpopulação de linfócitos CD4+ (Ji et al., 2002).
A resistência ou suscetibilidade dos camundongos C57BL/6 e C57BL/10 à infecção pela L. (L.) amazonensis é dependente da cepa utilizada. Quando infectados com a cepa “Maria” (MHOM/BR/1979/Maria) os animais da linhagem C57BL/6 apresentam um padrão de resistência à infecção e a análise
Introdução
12
histológica da lesão após 4 semanas revela o predomínio de fibroblastos e formação de granuloma, com presença de macrófagos parasitados e numerosos linfócitos. Após 10 a 14 semanas o número de macrófagos parasitados diminui e observa-se a formação de reação fibrótica (Barral-Netto et al., 1987). Por outro lado, a infecção dos camundongos C57BL/6 com a cepa MHOM/BR/00/LTB0016 leva à evolução crônica da lesão com persistência do parasita e possibilidade de lesões metastáticas na linhagem C57BL/10J (Calabrese e Costa, 1992). Esse comportamento pode estar mais relacionado a uma deficiência na resposta Th1 do que a uma expansão da subpopulação Th2 (Afonso & Scott, 1993) ou a outros fatores ainda não descritos.
Os camundongos da linhagem isogênica CBA infectados com L. (L.)
major apresentam comportamento semelhante aos animais da linhagem
C57BL/10, com secreção de IFN-! e IL-2 e controle da infecção, porém quando infectados com a L. (L.) amazonensis esses camundongos secretam principalmente IL-4 e IL-10 e não controlam a infecção (Souza et al., 2000).
Assim como os camundongos C57BL/10 e CBA, os da linhagem C3H/HeN apresentam uma resistência natural à infecção por L. (L.) major (Belosevic et al., 1989; Hondowicz et al., 1997). Entretanto, quando infectados com a L. (L.) amazonensis esses animais desenvolvem uma lesão persistente, não ulcerativa e de curso crônico (Calabrese e Costa, 1992), apresentando uma diminuição na expressão do mRNA da subunidade IL-12R!2 que independe de IL-4, ao contrário do que ocorre quando são infectados com a L. (L.) major (Jones et al., 2000).
Observações de nosso laboratório sugerem que o curso da infecção por
L. (L.) amazonensis (cepa MHOM/BR/1973/M2269) em camundongos
isogênicos da linhagem C3H/HePas difere expressivamente do observado nos demais modelos e a compreensão do (s) mecanismo (s) pelo (s) qual (is) esses animais são mais resistentes à infecção é importante para a elucidação da relação parasita-hospedeiro no modelo L. (L.) amazonensis que induz um padrão de resposta imune bastante diverso do apresentado por L. (L.) major.
Introdução
13
3. Resposta imune na leishmaniose cutânea causada pela Leishmania (L.) amazonensis
Ao contrário dos camundongos infectados com L. (L.) major, em que ocorre uma diferenciação polarizada a Th1 e Th2, respectivamente, em animais resistentes e suscetíveis, os camundongos suscetíveis à L. (L.) amazonensis não apresentam o padrão Th2 exacerbado e são capazes de gerar respostas do tipo Th1 (Afonso e Scott, 1993; Ji et al., 2002; Soong et al.,1996; Soong et al., 1997). Foi também demonstrado que a deleção dirigida dos genes codificadores da IL-4 ou IL-10 em camundongos C57BL/6 infectados com a L. (L.) amazonensis não impede o desenvolvimento das lesões nesses animais (Jones et al., 2000, Jones et al., 2002). Recentemente foi observada a expressão diminuída da cadeia !2 do receptor da IL-12 dos linfócitos CD4+
(IL-12R !2) em camundongos C3H infectados com a L. (L.) amazonensis, assim como em linfócitos CD4+ de camundongos C57BL/6 depletados de IL-4. Esses resultados sugerem que um mecanismo independente da IL-4 é responsável pela resposta reduzida a IL-12 e a consequente resposta Th1 prejudicada nos animais infectados com L. (L.) amazonensis (Jones et al., 2000). Além disso, o tratamento dos camundongos com IFN-! (Barral-Neto et al., 1996) ou IL-12 (Jones et al., 2000) não teve efeito significante sobre o curso da infecção com
L. (L.) amazonensis nesses animais. Esses dados sugerem que os mecanismos imunes responsáveis pela suscetibilidade desses camundongos à
L. (L.) amazonensis são complexos e diferem significativamente em
comparação à L. (L.) major.
A participação dos linfócitos CD8+ como células produtoras de IFN- ! na
resposta imune à infecção por L. (L.) amazonensis também foi demonstrada em camundongos C57BL/6 (Chan, 1993). A imunização dos camundongos CBA com o antígeno GP46/M-2 de L. (L.) amazonensis gerou linhagens de linfócitos T CD8+ específicas a esse antígeno capazes de reconhecer macrófagos infectados com a L. (L.) amazonensis, tendo sido demonstrada a participação desses linfócitos nas respostas protetoras dos camundongos CBA imunizados com a GP46/M-2 e desafiados com a L. (L.) amazonensis (Champsi e McMahon-Pratt, 1988; Kima et al., 1997). Proteção significante
Introdução
14
contra a L. (L.) amazonensis também foi observada em camundongos C57BL/6 imunizados com o antígeno P8 associado à membrana da L. (L.) pifanoi, tendo sido demonstrado o envolvimento de linfócitos CD4+ e CD8+ nas respostas protetoras dos animais imunizados. Nesse trabalho foi demonstrada a produção de perforina, além de IFN-!, pelos linfócitos CD8+ no sítio da infecção, sendo ambas as moléculas efetoras na proteção dos animais vacinados (Colmenares et al., 2003).
4. O papel dos neutrófilos nas leishmanioses cutâneas
Componentes da resposta imune inata têm sido implicados no controle ou progressão das leishmanioses. No início da infecção por L. (L.) major tem sido demonstrado que elementos da resposta inata desempenham um papel importante na evolução da leishmaniose. Infiltrado de neutrófilos foi demonstrado no sítio da infecção por esse parasita, apresentando diferenças qualitativas e quantitativas entre os camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6) (Beil et al., 1992; Lima et al., 1998). Foi também demonstrado que a depleção de neutrófilos nos camundongos BALB/c infectados com L. (L.) major inibiu a proliferação de linfócitos CD4+ Th2
normalmente induzida nesses animais, enquanto que esse tratamento não afetou o desenvolvimento das respostas mediadas por linfócitos CD4+ Th1 nos
camundongos C57BL/6 infectados. Esses dados sugeriram que os neutrófilos poderiam desempenhar um papel inicial na indução de respostas Th2 desenvolvidas nos animais suscetíveis infectados com L. (L.) major (Tacchini-Cottier et al., 2000). Mais recentemente foi investigado o papel de neutrófilos inflamatórios, apoptóticos e necróticos sobre a ativação de macrófagos e a replicação da L. (L.) major em linhagens murinas suscetíveis e resistentes. Os resultados mostraram que em camundongos BALB/c a interação de neutrófilos apoptóticos e macrófagos exacerba o crescimento de L. (L.) major mediado pela produção de PGE2 e TGF-" pelos macrófagos, enquanto que os
neutrófilos apoptóticos induziram a destruição dos parasitas nos animais resistentes (camundongos C57BL/6) mediada pela secreção de elastase do neutrófilo (NE) e TNF-# (Ribeiro-Gomes et al., 2004). Esses resultados
Introdução
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corroboram dados anteriores que demonstraram um papel supressor da resposta imune por células apoptóticas em L. (L.) major (Aga et al., 2002). Além disso, Belkaid et al. (2000) demonstraram que a modulação das funções do macrófago por neutrófilos apoptóticos poderia contribuir para o estabelecimento da fase inicial da infecção por L. (L.) major e uma multiplicação silenciosa antes do surgimento das lesões. Todos esses resultados indicam que a interação dependente de contato de macrófagos com neutrófilos mortos desempenham um papel importante nas respostas do hospedeiro à infecção por L. (L.) major. Por outro lado, Ribeiro-Gomes et al. (2007) também demonstraram a atividade protetora de neutrófilos apoptóticos independente de contato e dependente do reconhecimento da NE pelo receptor do tipo Toll 4 na superfície do macrófago. O envolvimento de neutrófilos também foi demonstrado na infecção de camundongos BALB/c por L. (L.)
infantum in vivo, tendo sido observado que essas células contribuem para o
controle da carga parasitária no baço desses animais apenas no início da infecção, não tendo efeito significante na fase tardia (Rousseau et al., 2001).
Dados mais recentes obtidos por citometria de fluxo e microscopia intravital, após a inoculação de L. (L.) major em camundongos BALB/c pela picada de flebótomos infectados, demonstraram a fagocitose da maioria dos parasitas pelos neutrófilos durante a fase aguda da infecção. Logo após os promastigotas são liberados e fagocitados pelos macrófagos. Esses dados demonstraram a participação dos neutrófilos no estabelecimento da infecção pela L. (L.) major (Peters et al., 2008). Além disso, utilizando os camundongos C57BL/6 resistentes à L. (L.) major, os autores documentaram o aumento da produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1! e IL-1", além de uma melhora na resposta protetora desses animais após a depleção de neutrófilos. Esses dados reforçam a hipótese de que essas células possuem um papel fundamental na patogênese da doença causada pela L. (L.) major.
Os dados disponíveis sobre o envolvimento dos neutrófilos na infecção por L. (L.) amazonensis têm sido escassos. Foi demonstrado o predomínio de neutrófilos em lesões de camundongos BALB/c infectados com L. (L.)
amazonensis nos primeiros dias após a infecção (Pompeu et al., 1991). A
interação de L. (L.) amazonensis com neutrófilos de rato in vivo mostrou que os neutrófilos rapidamente ingerem e destroem os parasitas em vacúolos
