UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ADELINE DE ANDRADE CARVALHO
VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFEITO DE
UM NOVO DISPOSITIVO FECHADO E ADIÇÃO DE CATALASE
FORTALEZA 2013
ADELINE DE ANDRADE CARVALHO
VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFEITO DE
UM NOVO DISPOSITIVO FECHADO E ADIÇÃO DE CATALASE
FORTALEZA 2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho Bibliotecária Responsável – Leila Sátiro – CRB-3 / 544
C391v Carvalho, Adeline de Andrade.
Vitrificação de tecido ovariano caprino: efeito de um novo dispositivo fechado e adição de catalase/Adeline de Andrade Carvalho. — 2013.
CD-ROM :190f.il. (algumas color.); 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Profª. Drª. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. Co-orientação: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
1. Criopreservação. 2. Antioxidante. 3. Folículo pré-antral. 4. Cabra. Título.
À minha família e ao meu namorado pelo apoio eterno e incondicional Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar coragem para buscar meus objetivos, força para superar as adversidades e serenidade para desfrutar dos momentos felizes;
A todas as instituições de ensino as quais frequentei, bem como aos professores e servidores das mesmas, pois todos têm colaboração na pessoa que hoje sou;
À Universidade Federal do Piauí, especialmente aos Professores Rômulo José Vieira e Amilton Paulo Raposo Costa, pelos ensinamentos e por me instigarem a visão crítica e a curiosidade, características tão necessárias a um pesquisador;
À Universidade Estadual do Ceará (UECE), ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) e ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais (LAMOFOPA), pela oportunidade de fazer meu doutorado;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de doutorado concedida, pois sem esta dificilmente conseguiria concluir meu almejado doutorado;
Ao Professor José Ricardo de Figueiredo, por sempre me incentivar e me estimular a crescer e me aperfeiçoar;
Aos Professores Cláudio Cabral Campello, Francielli Weber Santos e Vilceu Bordignon, pela valorosa contribuição nas publicações;
À Professora Regiane Rodrigues Santos, por sua contribuição tão valorosa e por sempre estar tão próxima ao longo de todo o doutorado;
À Professora Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pela orientação, confiança e apoio, principalmente nesta etapa final;
Aos Doutores Carlos Henrique Lobo e Cláudio Afonso Pinho Lopes, pela contribuição científica e amizade;
A toda a equipe do LAMOFOPA, incluindo os servidores, alunos que fizeram parte da equipe, os que ainda estão na equipe e os que estão chegando agora, todos agregam novos ensinamentos e novas experiências, tanto profissionais quanto pessoais;
À minha equipe de trabalho, Luciana R. Faustino, Cleidson M. G. Silva e Simone V. Castro, pelo apoio, pelas noites de sono e finais de semana perdidos, e, principalmente, por tamanho esforço ser realizado sempre de bom humor;
À Simone, pelo companheirismo, nos momentos difíceis e nos momentos alegres, tanto no âmbito profissional quanto pessoal;
Ao Cleidson e sua esposa, Liliane, pela amizade, pelo carinho, pelo ombro amigo e por me fazerem sentir como parte da família;
À Luciana, por ser amiga, no sentido mais real e completo da palavra. Em você encontrei uma amizade tão espontânea e sincera que acredito que nem mesmo a distância nos afaste;
Aos meus padrinhos (Paulo e Mônica), por estarem sempre ao meu lado e não me abandonarem em um dos momentos mais difíceis por que já passei. Um muito obrigado sempre será insuficiente perto da generosidade de vocês;
Aos amigos Alencar, Lurdinha, Socorro, Malu, Mário, Priscilla e Polliana, por serem meu porto seguro e pessoas que, apesar da minha ausência, sei que me têm afeto e se preocupam comigo;
Aos amigos que fiz durante toda a vida, apesar do cotidiano insistir em nos separar, nosso carinho sempre nos aproxima;
Ao meu namorado, Kleverton, por conseguir, mesmo à distância, ser um namorado sempre presente, compreensivo, por me apoiar a cada instante e me ajudar a
levantar nos momentos árduos. Apesar da distância, você consegue me conquistar cada vez mais, dia após dia;
A toda a minha família, incluindo meus avós (in memorian), meus tios e primos. A estrutura familiar que tenho me faz mais forte e serena;
Aos meus irmãos, Aline e André, pois a palavra “irmão” significa um companheirismo eterno e um laço de amor indissolúvel; exatamente a relação que temos;
À minha sobrinha, Maria Eduarda, por sempre ser motivo de orgulho e de alegria. Amo tanto e cada dia mais!
Aos meus pais, Adelaide e Luiz. Para estes, nem todas as palavras, por mais fortes, mais sinceras e mais verdadeiras, jamais serão suficientes. Sou eternamente grata e amo de forma inexplicável.
“Porque eu sou do tamanho do que vejo, e não do tamanho da minha altura...”
Alberto Caeiro (heterônimo de Fernando Pessoa)
RESUMO
O desenvolvimento de uma técnica segura e prática para a vitrificação de tecido ovariano caprino que previna o contato direto da amostra com o nitrogênio líquido, bem como a contaminação da amostra biológica é uma necessidade da criopreservação de tecido ovariano. Assim, os objetivos deste estudo foram: 1) desenvolver uma nova técnica de vitrificação em um sistema fechado e avaliar a morfologia e viabilidade folicular após a vitrificação de tecido ovariano em fragmento, hemi e ovário inteiro (Fase 1); 2) avaliar a morfologia e ultraestrutura folicular após vitrificação de tecido ovariano em fragmento, hemi e ovário inteiro e cultivo in vitro de curta duração (Fase 2) e 3) analisar o efeito da adição de catalase na solução de vitrificação e/ou remoção do agente crioprotetor sobre a morfologia e viabilidade folicular bem como sobre os níveis de espécies reativas de oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e integridade do DNA (Fase 3). Na Fase 1 não foi observada diferença no percentual de folículos morfologicamente normais e viáveis (P>0,05) após a vitrificação quando comparado ao tecido ovariano fresco, independente da forma do tecido ovariano vitrificado. Na Fase 2, antes do cultivo in vitro, foi observada uma redução (P<0,05) no percentual de folículos morfologicamente normais, em todas as formas vitrificadas (fragmento, hemi e ovário inteiro), quando comparado ao controle fresco. Além disso, foram verificadas grandes alterações ultraestruturais quando o tecido ovariano foi vitrificado em ovário inteiro. Após o cultivo in vitro, a morfologia folicular foi melhor preservada quando o tecido ovariano foi vitrificado em fragmento, comparada à vitrificação em hemi ou ovário inteiro (P<0,05) e a ultraestrutura revelou que a vitrificação de hemi-ovário resultou em maior presença de vacúolos do que a vitrificação de fragmentos. Na Fase 3 observou-se que a vitrificação sem a presença de catalase resultou em maior nível de ROS do que no tecido fresco, contudo, a presença de catalase, independente do momento de adição, manteve os níveis de ROS similares ao controle fresco. Não houve diferença quanto à viabilidade folicular (P>0,05) e proteínas sinalizadoras de dano (γH2AX) e reparo (53BP1) do DNA entre os tratamentos testados. Resultados similares foram observados para a morfologia folicular e fragmentação do DNA quando avaliados os grupos criopreservados. Em conclusão, a técnica de vitrificação Ovarian Tissue Cryossystem (OTC) é eficaz para a criopreservação de tecido ovariano caprino, pois mantém a morfologia, a ultraestrutura e a viabilidade folicular, compatíveis ao tecido fresco, após
aquecimento. O uso de catalase no protocolo de vitrificação também é necessário para manter os níveis de ROS similar ao observado no tecido ovariano fresco.
ABSTRACT
The development of a safe and practical technique for the caprine ovarian tissue vitrification that prevents direct contact of the sample with liquid nitrogen, as well as contamination of the biological sample is needed for cryopreservation of ovarian tissue. Then, the objectives of this study were: 1) to develop a new vitrification technique in a closed system and evaluate the follicular morphology and viability after vitrification of ovarian tissue of fragment, hemi and whole ovary (Phase 1), 2) to evaluate the follicular morphology and ultrastructure after vitrification of ovarian tissue of fragment, hemi and whole ovary and after short-term in vitro culture (Phase 2), and 3) to analyze the effect of addition of catalase in the vitrification solution and/or removal of cryoprotectant agent on the follicular morphology and viability, as well as on the levels of reactive oxygen species (ROS) and DNA integrity (Phase 3). In Phase 1, there was no difference in the percentage of morphologically normal and viable follicles (P>0.05) after vitrification when compared to fresh ovarian tissue, regardless of the form of ovarian tissue vitrification. In Phase 2, before in vitro culture, a reduction (P<0.05) in the percentage of morphologically normal follicles was observed in all forms of vitrification (fragment, hemi and whole ovary), when compared to the fresh control. In addition, major ultrastructural changes were observed when the ovarian tissue was vitrified in whole ovary. After culture in vitro, the follicular morphology was better preserved when the ovarian tissue was vitrified as fragment compared to vitrification as hemi or whole ovary (P<0.05) and ultrastructure showed that vitrification of hemi-ovary resulted in increased number of vacuoles compared with fragments. In Phase 3, the vitrification without the presence of catalase resulted in higher levels of ROS than fresh tissue. However, the presence of catalase, regardless of the step of addition, maintained ROS levels similar to control fresh. There was no difference in follicular viability (P>0.05) and proteins DNA damage signaling (γH2AX) and repair (53BP1) between treatments. Similar results were observed for follicular morphology and DNA fragmentation when evaluated cryopreserved groups. In conclusion, the vitrification technique Ovarian Tissue Cryosystem (OTC) is effective for vitrification of goat ovarian tissue, causing little cellular damage when assessed follicular morphology, viability and ultrastructure. Furthermore, the presence of catalase is necessary to maintain ROS levels similar to that found in fresh ovarian tissue.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1. Desenho esquemático da morfologia do ovário da maioria dos mamíferos. Observar a região medular, e os folículos em diferentes estágios de desenvolvimento, localizados na região cortical (adaptado de GUYTON; HALL, 2006)...28
Figura 2. Técnicas desenvolvidas para vitrificação de tecido ovariano. (A) vitrificação convencional por palhetas e (B) por criotubos, (C) Cobertura direta, (D) agulhas de acupuntura, (E) Cryosupport e (F) Fibreplug. Imagens obtidas de SAKI; RAHIM; ZERGANI, 2009; WANG et al., 2008; CHEN et al., 2006; http://www.cryoguard.com/products/; HASHIMOTO et al., 2010; BEEBE; NOTTLE, 2010...35
Figura 3. Representação esquemática de um octâmero de histonas consistindo de duas moléculas de H2A, H2B, H3 e H4. Adaptado de ZAIDI et al., 2013...40
Figura 4. Via de checkpoint 53BP1-dependente. A DSB resulta na fosforilação da H2AX próximo ao dano do DNA, culminando com o recrutamento e fosforilação da 53BP1 no foco nuclear. A 53BP1, por sua vez, recruta outros fatores, como a p53, e culmina com a parada do ciclo celular, ativação do checkpoint e reparo do DNA. Adaptado de ABRAHAM, 2002...43
CAPÍTULO 1
Figura 1. Imagem ilustrativa de uma célula eucariótica evidenciando as organelas internas no citoplasma e no núcleo. Imagem concedida por Thibodeau e Patton [103]...56
Figura 2. Fotomicrografias demonstrativas da ultraestrutura de folículos ovarianos e oócitos submetidos a procedimentos de criopreservação. (A) Folículo primordial de
mulher incluso em ovário inteiro congelado/descongelado evidenciando um oócito (O) com ruptura de membrana nuclear e condensação da cromatina (seta preta) no núcleo do oócito (N). Entre as células foliculares (Fc) percebe-se célula folicular alterada com condensação da cromatina (seta branca). Imagem concedida por Martinez-Madrid [62] e autorizada pela Elsevier. (B) Oócito bovino imaturo congelado/descongelado com gotícula lipídica intacta (1) e com lipólise parcial (2). Observam-se áreas de lipólise (seta branca) e mitocôndrias (m). Aumento de 8000x. Figura adaptada de Isachenko [48] e autorizada por Wiley Job Network. (C) Oócitos equinos maturos vitrificados/aquecidos com enturgecimento de mitocôndrias e redução de elétron-densidade da matriz mitocondrial (setas pretas). Figura concedida por Hochi [46] e autorizada pela Elsevier. (D) Folículo suíno incluso em tecido ovariano congelado/descongelado com mitocôndrias túrgidas (m). (l): gotículas lipídicas, (Nu): núcleo, (CG): células da granulosa e (*): espaços vazios. Figura concedida por Borges [13] e autorizada pela Elsevier. (E) Folículo ovariano humano incluso em tecido vitrificado/aquecido com presença de poros na membrana nuclear (setas pretas) e retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias (M) bem preservados, semelhante ao tecido fresco. Figura concedida por Sheikhi [95] e autorizada pela Oxford Journals...59
Figura 3. Imagens representativas do padrão de citoesqueleto de oócitos felinos imaturos submetidos à criopreservação evidenciando microfilamentos em vermelho e microtúbulos em verde. Microfilamentos difusos no ooplasma com uma concentração ligeiramente maior na zona pelúcida (A), microtúbulos uniformemente distribuídos por todo ooplasma (A’). Microfilamentos e microtúbulos distribuídos de forma irregular no citoplasma (B e B’). Barras representativas de 50µm. Figura concedida por Luciano [59] e autorizada pela Elsevier...62
Figura 4. Padrão de organização do fuso meiótico e de cromossomos em oócitos ovinos maturos submetidos à vitrificação. Fuso normal (A) com cromossomos alinhados na placa metafásica (A’). Fuso assimétrico (B e B’). Coluna da direita: marcação de β-tubulina, coluna da esquerda: marcação do DNA com Hoechst. Figura concedida por Asgari [6] e autorizada pela Elsevier...68
CAPÍTULO 3
Figure 1. Morphological characteristics and viability of preantral follicles enclosed in different dimensions of goat ovarian tissue. (A1-A2) Photomicrograph of morphologically normal goat preantral follicles in the fresh control (A1) and atretic preantral follicle after the cryopreservation of the whole ovary (A2). Note the measurement of follicular diameter in A1, obtained by performing by 2 transverse measurements. In A2, the follicular degeneration is evidenced by a retraction of the ooplasm (black arrow) and nuclear pyknosis (*) [Bar = 15 µm]. (B1-B2) Photomicrographs of ovarian stroma with normal (fresh control; B1) and reduced (whole ovary; B2) cell density. Observe the marking areas randomly selected for evaluation [Bar= 50 µm]. (C1-C2) Images of preantral follicles unstained, viable follicle (fresh control; C1) and stained, non-viable follicle (hemi-ovary; C2), with trypan blue [Bar = 20 µm]...93
CAPÍTULO 4
Fig. 1. Experimental design to assess the effect of vitrification of different dimensions of ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, whole ovary) on the morphology of goat preantral follicles. LM: light microscopy; TEM: transmission electronic microscopy; IVC: in vitro culture...105
Fig. 2. Ovarian Tissue Cryosystem: New stainless steel device developed for the vitrification procedures. (A) OTC opened enabling the visualization of its 3 constituent parts: basis (a), insert (b) cover (c). Note the perforations in the upper portion of the insert to facilitate placement and removal of solutions. (B) Exposure of the tissue (hemi-ovary) to vitrification solution in the basis of the OTC. (C) Inclusion of the insert in the basis of the OTC allows for observation of aseptic handling of the insert. (D) Closure of the basis, with the insert already enclosed, with the cover of the OTC. (E) Storage of OTC, containing the sample to be vitrified in the liquid nitrogen dewars. Note that this system prevents contact of the vitrified sample with liquid nitrogen...108
Fig. 3. Photomicrographs of goat ovarian cortical histological sections. (A) Normal primordial follicle. (B) Degenerated follicles with retraction of ooplasm. Nu, nucleus; GC, granulosa cells; arrows, shrunken ooplasm...109
Fig. 4. Electron micrographs of goat preantral follicles from fresh control (A) and after vitrification of fragments (B), hemi-ovary (C), and whole ovary (D). Note in A, B and C the normal follicular ultrastructure with round mitochondria and intact granulosa cells, and a degenerated preantral follicle in D. GC: granulosa cells; O: oocyte; Nu: nucleus; n: nucleolus; m: mitochondria; V: vacuole; arrow: nuclear envelope; *: empty spaces. Scale bars = 5 µm...111
Fig. 5. Electron micrographs of goat preantral follicles of in vitro cultured tissues after vitrification of fragments (A) and hemi-ovary (B). Note in (A), a well-preserved preantral follicle and in (B), a follicle in advanced stage of degeneration. GC: granulosa cells; O: oocyte; m: mitochondria; V: vacuole; *: empty spaces. Scale bars = 5 µm...112
CAPÍTULO 5
Fig. 1. ROS levels expressed as fluorescence intensity in non-vitrified (fresh control) and vitrified ovarian tissues in the presence or absence of catalase in vitrification/washing solutions. A,B indicate statistical difference (P<0.05) between groups...131
Fig. 2. Follicular morphology analysis (A-B), apoptosis detection (C-D) and follicular viability evaluation by trypan blue (E-F) and fluorescent markers (G-H). Morphologically normal (A) and degenerate (B) preantral follicle stained with HE. Note in (B) granulosa cells disorganization and ooplasm shrinkage (asterisk). Positive (C) and negative (C') control for TUNEL assay. Vitrified ovarian tissues were analyzed by TUNEL assay (D). Arrows indicate TUNEL-positive reaction; arrowhead indicates TUNEL-negative reaction. Viable (E) and non-viable (F) follicles unstained and stained by Trypan blue, respectively. Viable follicle (G) and non-viable follicle (H) labeled with calcein-AM (green) and ethidium homodimer-1 (red), respectively. GC – granulosa cells, O – oocyte; Nu – nucleus. Scale bars = 30 µm...131
Fig. 3. Percentage (mean ± SEM) of morphologically normal preantral follicles. Goat ovarian tissues were non-vitrified (fresh control) or vitrified-thawed in the presence or absence of catalase in vitrification/washing solutions. A,B indicate statistical difference (P<0.05) between treatment...132
Fig. 4. Relative Bcl2/Bax mRNA expression in non-vitrified (fresh control) and vitrified ovarian tissue in the presence or absence of catalase in vitrification/washing solutions...134
Fig. 5. Immunodetection of 53BP1 protein (green bright fluorescent spots) in goat ovarian tissue from the fresh control and after vitrification. (A) Preantral follicle from a negative control sample showing a follicle without fluorescent signal for 53BP1. (B-D) Goat ovarian follicles positively labeled for 53BP1. Note primordial (B), primary (C) and secondary (D) follicles with granulosa cells labeled and the absence of fluorescence signal in the oocytes. GC – granulosa cells; O – oocyte. Scale bars = 30 µm...135
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 3
Table 1. Morphology, viability, follicular diameter, and stromal cell density after ovarian tissue vitrification at different dimensions (fragment, hemi-ovary, and whole ovary). *Five animals were used. †For each treatment, two samples: one sample to histological analysis and another one to viability analysis were used for each animal. Ovarian tissues samples were obtained from hemi-ovary and whole ovary after vitrification. A,B,C Different superscripts letters indicate statistically significant differences (P< 0.05)...94
CAPÍTULO 4
Table 1 Percentage of morphologically normal preantral follicles enclosed in fresh ovarian tissue and vitrified into fragments, hemi-ovary or whole ovary, before and after in vitro culture. Data are mean ± SEM. A,B,C Different upper-case letters within a column indicate significant difference (P < 0.05).a,b Different lower-case letters within a row indicate significant difference before and after culture in the same treatment (P < 0.05)...110
CAPÍTULO 5
Table 1. Oligonucleotide primers for GADPH, BCL-2 and BAX used in the gene expression analyses. *S sense; AS antisense. GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase...129
Table 2. Stromal cells density and follicular viability (Trypan blue, Calcein AM/ethidium and TUNEL-positive follicles) in non-vitrified (fresh control) and vitrified ovarian tissues in presence or absence of catalase. Different superscripts within columns indicate statistical difference between treatments (P<0.05)...133
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % - Percentagem ~ - Aproximadamente = - Igual a ± - mais ou menos × - Vezes < - Menor que > - Maior que ≥ - Maior ou igual °C - Graus Celsius µg - Microgramas µL - Microlitros µm - micrômetros
53BP1 - p53 binding protein 1 (Proteína Ligada a p53) ANOVA - Análise de variância
ATP - Adenosina trifosfato
BRCT - Breast cancer 1 carboxyl-terminal domain BSA - Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) CAD - Caspase-activated DNase (DNase ativada por caspase)
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior cDNA - DNA complementar
CG - Células da granulosa cm - Centímetros
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2 - Dióxido de carbono
C-terminal - Carboxi-terminal
DCHF-DA - 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate DMSO - Dimethylsulfoxide (Dimetilsulfóxido)
DNA - Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) DSB - Double-strand breaks (Quebra da fita dupla)
e.g. - Exempli gratia (Por exemplo) EG - Ethylene glycol (Etilenoglicol)
Fc - Follicular cells (Células foliculares) Fig. - Figura
FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos G2/M - Fase do ciclo celular entre Gap 2 e Mitose
GAPDH - Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gliceraldeído-2-fosfato desidrogenase)
GC - Granulosa cells (Células da granulosa) H - Histona
h - Hour (Hora)
H2O2 - Hydrogen peroxide (Peróxido de hidrogênio) HCl - Ácido clorídrico
HE - Hematoxylin-eosin (Hematoxilina-eosina) i.e. - Id est (isto é)
ITS - Insulin-transferrin-selenium (Insulina-transferrina-selênio) IU - International unit (Unidade internacional)
IVC - In vitro culture (Cultivo in vitro) kV - Kilovolt
l - Gotículas lipídicas L - Litro
LAMOFOPA - Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais
LM - Light microscopy (Microscopia de luz) m - Mitochondria (Mitocôndria)
M - Mitocôndrias M - Molar
MEM - Minimum essential medium (Meio essencial mínimo) mg - Miligramas
MII - Metáfase II min - Minutes (minutos) mL - Mililitros
mm - Milímetro mM - Milimolar
mm3 - Milímetros cúbicos mmol - Milimol
MOIFOPA - Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais MRN - Complex MRE11-RAD50-NBS1 (Complexo MRE11-RAD50-NBS1) mRNA - Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
n - número n - Nucleolus (Nucléolo) N - Núcleo do oócito ng - Nanogramas nm - nanômetros Nu - Nucleus (Núcleo) O - Oocyte (Oócito) O2 - Oxigênio molecular •
O2- - Radical ânion superóxido
OH• - Hydroxyl radical (Radical hidroxila) OPS - Open pulled straws
OTC - Ovarian Tissue Cryosystem P - Probabilidade de erro
pág. - Página
PBS - Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino)
PCR - Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase) pH - Pressão de hidrogênio
PPGCV - Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias qPCR - Quantitative PCR (PCR quantitativa)
rFSH - Recombinant follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante recombinante)
ROS - Reactive oxygen species (Espécies reativas de oxigênio) RT - Room temperature (Temperatura ambiente)
s - Seconds (Segundos)
SCID - Severe combined immunodeficient SD - Standard deviation (Desvio padrão) sec - Seconds (Segundos)
SEM - Standard error of means (Erro padrão da média) SNK - Student-Newman-Keuls
SSB - Single-strand breaks (Quebra da fita simples)
Tm - Transição da fase cristalina líquida para a fase cristalina gel
TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphates nick end-labeling
UECE - Universidade Estadual do Ceará V - Vacuole (Vacúolo)
VG - Vesícula germinativa (Germinal vesicle) vol - Volume
VS - Vitrification solution (Solução de vitrificação) w/v - Weight/Volume (Relação peso/volume) WS - Washing solution (Solução de lavagem)
α-MEM - Minimum essential medium alpha (Meio essencial mínimo alfa) γ-H2AX - H2AX fosforilada
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 25 2. REVISÃO DE LITERATURA... 27 2.1. Estrutura e fisiologia do ovário dos mamíferos... 27 2.1.1. Morfologia ovariana... 27 2.1.2. Dinâmica folicular... 28 2.2. Criopreservação na reprodução assistida... 30
2.2.1. Importância da criopreservação a preservação da fertilidade para mulheres e animais domésticos... 31 2.2.2. Vitrificação de tecido ovariano... 33 2.2.3. Crioinjúrias... 37
2.2.3.1. Aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen
species - ROS)... 37 2.2.3.2. Danos ao DNA... 39 3. JUSTIFICATIVA... 45 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 47 5. OBJETIVOS... 48 5.1. Objetivo geral... 48 5.2. Objetivos específicos... 48 6. CAPÍTULO 1
Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após criopreservação... 49 7. CAPÍTULO 2
Desenvolvimento de um novo dispositivo de vitrificação... 82 8. CAPÍTULO 3
A espessura do tecido pode influenciar o resultado da vitrificação de córtex ovariano caprino... 86 9. CAPÍTULO 4
Novo método de grande capacidade inovadora para vitrificação de ovários caprinos: Ovarian Tissue Cryosystem (OTC)...……... 99 10. CAPÍTULO 5
Adição de catalase às soluções de vitrificação mantém a estabilidade dos folículos pré-antrais ovarianos... 119 11. CONCLUSÕES... 146 12. PERSPECTIVAS... 147 13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 148 14. ANEXOS... 180 14.1. Anexo 1 - Depósito de Patente... 181 14.2. Anexo 2 - Consulta à base de dados do INPI... 185 14.3. Anexo 3 - Aprovação do Comitê de Ética... 186 14.2. Anexo 4 - Publicações de resultados parciais... 187
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento e os avanços obtidos nas últimas duas décadas acerca da reprodução assistida têm resultado em grandes conquistas, tanto para a reprodução humana (DONNEZ et al., 2004) quanto animal (DELA PEÑA et al., 2002). Além disso, já foi demonstradoo nascimento de descendentes saudáveis após procedimentos de criopreservação. Especificamente para a reprodução animal, pesquisas em animais domésticos de grande valor zootécnico (BORDES et al., 2005) e animais em risco de extinção (SILVA et al., 2012a) têm representado um avanço extremamente significativo para a agropecuária e preservação de espécies.
Dentre as técnicas de reprodução assistida, pode-se destacar a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), que envolvea preservação, o crescimento e a maturação de folículos ovarianos em estágios iniciais de desenvolvimento (folículos pré-antrais), antes que tenham seu mecanismo de morte naturalmente acionado (FIGUEIREDO et al., 2008). Com a MOIFOPA é possível criopreservar o tecido ovariano, permitindo a conservação do material genético de fêmeas por longos períodos (RUBINSKY, 2003). O processo de criopreservação, especificamente no que diz respeito ao método de vitrificação, tem sido investigado desde o início da década de 40 (LUYET et al., 1940), e, desde então, várias pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de entender e reduzir os danos causados às células pela exposição a baixas temperaturas.
A criopreservação de tecido ovariano pode ser realizada tanto por congelação lenta (SALLE et al., 2003) quanto por vitrificação (LORNAGE et al., 2006). Nos últimos anos, a vitrificação tem se destacado como método de escolha para a criopreservação de tecido ovariano por sua praticidade de aplicação e baixo custo de execução, bem como pelos resultados satisfatórios, inclusive com obtenção de nascimentos em espécies domésticas, como os ovinos (BORDES et al., 2005; LORNAGE et al., 2006) e até mesmo em humanos (KAWAMURA et al., 2013). Além disso, a vitrificação possui como grande vantagem a nula ou baixa formação de cristais de gelo (KEROS et al., 2009), extremamente danosa para a célula (LUNARDI et al., 2012). Em função dessa característica, várias técnicas de vitrificação têm sido desenvolvidas (MONIRUZZAMAN et al., 2009; TSANG; CHOW, 2009, RAHIMI et al., 2003) com a finalidade de maximizar os resultados obtidos.
A vitrificação de tecido ovariano tem obtido valiosos resultados como a preservação da morfologia folicular em humanos (SALEHNIA et al., 2012), bem como o nascimento de crias saudáveis em ovinos (BORDES et al., 2005; LORNAGE et al., 2006). Apesar dos nascimentos relatados, verifica-se baixa repetibilidade dos resultados em animais domésticos, provavelmente por características inerentes ao processo de vitrificação, como as altas concentrações de agentes crioprotetores. Ademais, as técnicas desenvolvidas até então exigem uma excessiva manipulação do material biológico e, em sua maioria, os dispositivos são constituídos de polipropileno (como por exemplo, palhetas e criotubos), material caracterizado por não ser um bom condutor de calor (SANSINENA et al., 2012). Assim, têm sido desenvolvidas técnicas que visam o contato com o nitrogênio líquido na tentativa de acelerar a redução de calor. Contudo, o contato com o nitrogênio líquido pode ocasionar a contaminação do material biológico (BIELANSKI et al., 2000; BIELANSKI; VAJTA, 2009), impossibilitando um posterior transplante ou mesmo a utilização do material para o cultivo in vitro. Os estudos atuais têm visado o aperfeiçoamento da técnica de forma a garantir a perfeita integridade morfológica, molecular e funcional dos gametas criopreservados. Dessa forma, danos como a produção de espécies reativas de oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e danos à integridade do DNA tem ganhado amplitude nos estudos sobre a criopreservação aplicada à reprodução assistida (RAHIMI et al., 2003; SALEHNIA et al., 2012).
Para melhor evidenciar a contribuição científica e tecnológica desta tese, a revisão de literatura a seguir constitui-se de um levantamento sucinto acerca da estrutura e fisiologia do ovário dos mamíferos, dinâmica folicular, criopreservação na reprodução assistida, vitrificação de tecido ovariano e crioinjúrias, com destaque para a produção de ROS e danos ocasionados ao DNA.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. ESTRUTURA E FISIOLOGIA DO OVÁRIO DOS MAMÍFEROS
O ovário é um dos órgãos mais importantes do sistema reprodutor feminino e possui duas funções fundamentais para a manutenção da fertilidade: (i) função gametogênica ou exócrina e (ii) função endócrina (GOUGEON, 2004). Quanto à sua função exócrina, este órgão é responsável por garantir o desenvolvimento dos folículos ovarianos e possibilitar a ovulação de um oócito apto a ser fertilizado (SAUMANDE, 1991). Do ponto de vista endócrino, o ovário possui a capacidade de produzir fatores de crescimento e hormônios responsáveis por dar suporte ao crescimento folicular e preparação do organismo feminino para receber o possível embrião (HIRSHFIELD, 1991).
2.1.1. MORFOLOGIA OVARIANA
A dimensão do ovário dos mamíferos possui uma variação dependente da espécie e da fase do ciclo ovariano (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Porém, de forma geral, esse órgão é ovoide, apresenta uma forma de amêndoa (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004) e é dividido em duas regiões (Figura 1), uma cortical e uma medular (GARTNER; HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Na grande maioria dos mamíferos, a região cortical é localizada externamente (FIGUEIREDO et al., 2008). A região cortical é pouco vscularizada, na qual estão presentes células do estroma e folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Já a região medular, em geral localizada na parte interna do ovário, é responsável pela sustentação, vascularização e inervação do órgão, sendo constituída por numerosos vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e tecido conjuntivo frouxo (GARTNER; HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A superfície do ovário é revestida por epitélio cúbico simples em sua maior extensão e, sob esse epitélio, o estroma forma uma camada de tecido conjuntivo denso e sem vasos, a albugínea do ovário (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Figura 1. Desenho esquemático da morfologia do ovário da maioria dos mamíferos. Notem-se a região medular, e os folículos em diferentes estágios de desenvolvimento, localizados na região cortical (adaptado de GUYTON; HALL, 2006).
2.1.2. DINÂMICA FOLICULAR
O processo de formação e crescimento folicular é denominado foliculogênese (FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo é considerado a unidade morfofuncional do ovário e é caracterizado por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e da teca) e, com o avançar do desenvolvimento, nota-se nessa estrutura a zona pelúcida e a cavidade antral preenchida por fluido folicular (McGEE; HSUEH, 2000). O folículo é responsável por albergar o oócito, permitindo que o mesmo complete seu desenvolvimento e maturação (CORTVRINDT; SMITZ, 2001). Com o desenvolvimento, o folículo passa por mudanças morfológicas, resultando em diferentes categorias foliculares de acordo com o seu estágio de evolução (HULSHOF et al., 1994).
Os folículos ovarianos podem ser classificados em duas grandes categorias: (i) folículos pré-antrais e (ii) folículos antrais. Essa grande classificação diz respeito à presença ou não de uma cavidade antral, sendo que somente os folículos antrais possuem essa cavidade (VARGHESE et al., 2008). Os folículos pré-antrais representam a fase inicial do desenvolvimento folicular e podem ser subdivididos em primordiais, intermediários, primários e secundários (FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo
ovariana. Os folículos nesse estágio são caracterizados por um oócito localizado centralmente circundado por células da granulosa de formato pavimentoso (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Através de mecanismos ainda completamente não elucidados, alguns folículos são selecionados para deixarem o estágio de quiescência e prosseguirem seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al., 2008). Esse desenvolvimento é marcado pela mudança conformacional das células da granulosa, que passam do formato pavimentoso para uma forma cúbica. Assim, um folículo que possui células da granulosa tanto de formato pavimentoso quanto cúbico é denominado intermediário. Quando o oócito passa a ser circundado somente por células da granulosa de formato cúbico os folículos são então denominados primários. A partir dessa fase, o desenvolvimento é caracterizado pela multiplicação das células da granulosa, passando o folículo a apresentar duas ou mais camadas de células da granulosa cúbicas. Nessa fase, o folículo passa a ser denominado secundário. Na fase subsequente já pode ser observada a cavidade antral e o folículo é então denominado de terciário (fase antral inicial) e, com o aumento do líquido folicular, o oócito fica preso ao folículo por um pedículo constituído por células foliculares e passa a ser denominado folículo
pré-ovulatório (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; MAGOFFIN et al., 2005; RAJKOVIC et
al., 2006).
Numericamente, a população folicular, na maioria dos mamíferos, é estabelecida ainda na vida intrauterina (ZUCKERMAN, 1951) e, a partir de então, ocorre uma redução sistemática nesse pool folicular (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000). Somente a minoria dos folículos chega à ovulação (0,1%), enquanto a grande maioria é perdida pelo processo de atresia (FIGUEIREDO et al., 2008). A depleção folicular decorre principalmente da apoptose, processo também conhecido como morte celular programada (KIESS; GALLAHER, 1998). Esse evento acomete tanto folículos pré-antrais quanto folículos antrais (TILLY, 1996; MAGOFFIN et al., 2005) e exerce um papel importante no controle e regulação do número de folículos que serão ovulados (KIESS; GALLAHER, 1998, GLAMOCLIJA et al., 2005). Assim, a depleção folicular, na maioria das espécies permite que apenas um oócito seja ovulado em cada ciclo. Portanto, a grande maioria dos folículos é naturalmente eliminada, representando uma limitação para as técnicas de reprodução assistida.
Felizmente, a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA) é uma alternativa de grande relevância para a reprodução assistida uma vez que permite a preservação e o desenvolvimento dos folículos pré-antrais em
um ambiente extraovariano, ausente de fatores que permitam a dominância folicular e apoptose dos folículos subordinados (FIGUEIREDO et al., 2008). Assim, a MOIFOPA, além do isolamento folicular consiste ainda em: (i) criopreservação, que permite salvaguardar o material genético feminino, e (ii) cultivo in vitro, que possibilita o desenvolvimento dos folículos ovarianos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2007). A criopreservação de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano caracteriza-se como uma biotécnica de grande importância por permitir preservar milhares de oócitos a partir de um único ovário (FIGUEIREDO et al., 2007). Desta forma, pode contribuir para a manutenção da função ovariana (ARAV et al., 2010), permitindo a retomada da função reprodutiva após a descongelação e transplante.
2.2. CRIOPRESERVAÇÃO NA REPRODUÇÃO ASSISTIDA
A criopreservação é uma técnica que visa a preservação celular a temperaturas ultrabaixas, também conhecidas como temperatura criogênicas (RUBINSKY, 2003). Em geral, utiliza-se a temperatura do nitrogênio líquido (-196°C), mas sabe-se que abaixo de -40°C a atividade físico-química das células já se encontra suspensa, podendo, então, essas células serem preservadas por períodos indeterminados (BAKHACH, 2009). Essa preservação celular está diretamente relacionada à capacidade da célula de resistir às etapas do procedimento de criopreservação, que se resumem em cinco: (i) exposição aos agentes crioprotetores; (ii) resfriamento; (iii) armazenamento; (iv) aquecimento, e (v) remoção dos agentes crioprotetores (SANTOS et al., 2008).
A primeira etapa é a exposição aos agentes crioprotetores. Nesta fase, o objetivo é garantir que a célula perca água, para reduzir a formação de cristais de gelo intracelular, e que a mesma seja substituída por substâncias que proporcionem uma maior estabilidade às células em baixas temperaturas. A segunda etapa consiste no resfriamento das células. Nesta etapa, a água passa do estágio líquido para o sólido, na qual podem ocorrer danos em virtude da redução da temperatura e formação de cristais de gelo intracelular. Em seguida, o material é armazenado em baixas temperaturas (terceira etapa), podendo permanecer nesta condição por períodos indefinidos. No momento adequado, o material criopreservado é então aquecido, com o intuito de que as células voltem à sua temperatura adequada e retomem seu metabolismo normal. Por
fim, é realizada a remoção do agente crioprotetor do interior da célula ou tecido, sendo substituído por água, e a célula é, portanto, reidratada (SANTOS et al., 2008).
A criopreservação pode ser realizada por dois métodos, a congelação lenta e a vitrificação (congelação ultra-rápida) (RAHIMI et al., 2003; SALLE et al., 2003). Independente do método adotado, a criopreservação tem sido bastante utilizada na reprodução assistida por permitir que o material genético de animais e humanos sejam preservados por longos períodos e possam ser resgatados para, no momento mais oportuno, propiciar o nascimentos de descendentes saudáveis (DELA PEÑA et al., 2002; SALLE et al., 2003; BORDES et al., 2005). A criopreservação tem se mostrado uma técnica segura e satisfatória e tem sido amplamente empregada para a preservação de embriões (TSANG; CHOW, 2009), sêmen (BILODEAU et al., 2000), oócitos (GUPTA et al., 2010) e tecido ovariano (BORDES et al., 2005).
2.2.1. IMPORTÂNCIA DA CRIOPRESERVAÇÃO A PRESERVAÇÃO DA FERTILIDADE PARA MULHERES E ANIMAIS DOMÉSTICOS
Desde o princípio dos anos 2000, a criopreservação de tecido ovariano tem ganhado grande destaque para aplicação da reprodução assistida no sexo feminino por salvaguardar um grande número de oócitos (DELA PEÑA et al., 2002). Além disso, a criopreservação de tecido ovariano também permite, após o transplante, a revascularização tecidual (ARAV et al., 2010; RAHIMI et al., 2010) bem como a restauração da função reprodutiva. Este fato já foi evidenciado pela retomada da função endócrina (dosagens hormonais), acompanhamento dos ciclos ovarianos após a criopreservação (ARAV et al., 2010; DONNEZ et al., 2011), gestação e obtenção de descendentes em murinos (CHEN et al., 2006; HASEGAWA et al., 2006), ovinos (BORDES et al., 2005; LORNAGE et al., 2006) e humanos (ERNST et al., 2010).
Esta biotécnica tem sido bastante indicada para utilização em mulheres com câncer (SALLE et al., 2003), pois as drogas utilizadas nos tratamentos oncológicos atuam interrompendo o ciclo de proliferação celular normal (MALTARIS et al., 2009) atingindo não apenas as células cancerosas, mas também a capacidade reprodutiva, por serem gonadotóxicas (BEN-AHARON et al., 2010). Assim, preservar as células germinativas femininas antes da administração desses medicamentos gonadotóxicos é uma alternativa de grande relevância para mulheres que desejam gerar uma criança após a cura da doença. A criopreservação de tecido ovariano tem ganhado destaque na
reprodução humana por não necessitar de estimulação hormonal (ZHOU et al., 2010), como ocorre para a criopreservação de oócitos maturos ou embriões. Assim, nos casos emergenciais, não há atrasos no início do tratamento oncológico, bem como evita a estimulação de células cancerosas dependentes de estradiol (ZHOU et al., 2010). Além de não depender da fase do ciclo reprodutivo, a criopreservação de tecido ovariano também pode ser realizada em mulheres muito jovens (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000), sendo, por isso, recomendada para meninas que ainda não tenham atingido a maturidade sexual (VARGHESE et al., 2008). Esta técnica também pode ser realizada em mulheres adultas, contudo, é aconselhável para pacientes até os 38 anos, uma vez que a partir dessa idade ocorre uma abrupta perda dos folículos ovarianos (FADDY, 2000). Somada às vantagens já mencionadas, a criopreservação de tecido ovariano também supera questões éticas, legais e religiosas, especialmente quando realizada em humanos (ZHANG et al., 2009).
A criopreservação também tem ganhado destaque por preservar genótipos valiosos e/ou raros (SILVA et al., 2012a). Dessa forma, evidencia-se que sua aplicação também é de grande importância para animais zootecnicamente valiosos, bem como animais em risco de extinção (COZZI; WHITE, 1995; WANDERLEY et al., 2012, SILVA et al., 2012b). Na reprodução animal, a criopreservação de tecido ovariano tem sido utilizada com o intuito de preservar o material genético de animais de alto valor zootécnico que venham a óbito inesperado (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000). Dessa forma, mesmo após sua morte, o animal pode continuar propagando sua genética por meio da reprodução assistida e possibilitar o melhoramento genético de rebanhos em diferentes localizações geográficas. Além disso, a criopreservação de tecido ovariano também tem grande relevância para espécies ameaçadas de extinção (COZZI; WHITE, 1995), viabilizando menor manipulação desses animais, por não necessitar de tratamentos hormonais (ZHOU et al., 2010), permitindo a obtenção do material genético de forma mais rápida e segura.
Partindo dessa ideia geral, a criopreservação de tecido ovariano permite a preservação do pool folicular por períodos indeterminados (RUBINSKY, 2003), bem como possibilita a retomada da função endócrina quando associada ao transplante de ovário previamente criopreservado (BORDES et al., 2005). A reserva folicular é constituída principalmente por folículos na fase inicial de desenvolvimento (cerca de 90%), isto é, folículos primordiais (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006). Apesar de oferecer riscos à função celular, a criopreservação de folículos nesse estágio de
desenvolvimento é mais segura, uma vez que os oócitos presentes nesses folículos são mais crioresistentes. Essa resistência é conferida por fatores tais como: (i) o pequeno tamanho do oócito; (ii) a baixa taxa metabólica; (iii) o estágio do ciclo celular (parado em prófase I e, portanto, sem presença do fuso meiótico); (iv) o pequeno número de células de suporte; (v) a ausência de zona pelúcida; (vi) a ausência de grânulos corticais e (vii) a pequena quantidade de lipídios intracitoplasmáticos (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000; KAGAWA; SILBER; KUWAYAMA, 2009).
2.2.2. VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO
A congelação lenta tem sido utilizada com sucesso há décadas (GOSDEN et al., 1994; COX; SHAW; JENKIN, 1996; SALLE et al., 2003), contudo, a formação intracelular de cristais de gelo é uma das maiores desvantagens desse método e pode resultar em severos danos celulares (LUNARDI et al., 2012). Ao contrário, a vitrificação tem ganhado destaque por ser um método de criopreservação ultra-rápido que resulta na solidificação sem cristalização, ou seja, sem formação intracelular de cristais de gelo (BAGCHI; WOODS; CRITSER, 2008; KEROS et al., 2009).
A etapa crítica da vitrificação é a velocidade de redução da temperatura, que deve ser superior à taxa de resfriamento crítico da solução para permitir a formação do estado vítreo antes da organização dos cristais de gelo (POSILLICO et al., 2010). A água possui uma alta taxa de resfriamento crítico, sendo de extrema dificuldade sua solidificação e, portanto, necessária sua substituição por agentes crioprotetores, que possuem uma menor taxa de resfriamento crítico (KIM et al., 2006). Assim, os crioprotetores são componentes chave para o sucesso da vitrificação e devem possuir uma baixa toxicidade e e alta facilidade de transpor a membrana celular, a fim de permitir a penetração de concentração adequada no interior da célula com menores danos (MUKAIDA; OKA, 2012).
As leis da termodinâmica revelam que, se um líquido é resfriado suficientemente rápido, pode-se obter um estado sólido amorfo, conhecido como estado vítreo (RUBINSKY, 2003; BALABAN et al., 2008). Por essa característica, a vitrificação tem sido amplamente adotada na reprodução assistida pela simplicidade e rapidez do procedimento (VAJTA et al., 1998). Este método tem sido aplicado com sucesso para a criopreservação de tecido ovariano (DELA PEÑA et al., 2002; BORDES
et al., 2005, LORNAGE et al., 2006) e diversas técnicas já foram desenvolvidas para este fim (SUGIMOTO et al., 1999; CHEN et al., 2006; CHOI et al., 2007).
As técnicas de vitrificação podem ser subdivididas em três grupos: (i) técnicas sem o contato direto com o nitrogênio líquido, (ii) técnicas com contato direto com o nitrogênio líquido e (iii) técnicas com o contato com o vapor de nitrogênio líquido (Figura 2). As técnicas de vitrificação que não têm contato direto com o nitrogênio líquido possuem como principal vantagem a ausência de contaminação do material biológico por patógenos resistentes à temperatura extrema do nitrogênio líquido (BIELANSKI et al., 2000). Contudo, as técnicas inicialmente desenvolvidas, por serem constituídas principalmente por polímeros sintéticos, apresentam como desvantagem a dificuldade de reduzir a temperatura de forma adequada (SANSINENA et al., 2012). Visando aperfeiçoar essa redução de temperatura, algumas equipes têm investido em dispositivos fechados fabricados em materiais metálicos, por serem melhores condutores de calor. Outras equipes têm mantido pesquisas utilizando dispositivos que mantêm o contato direto do material biológico com o nitrogênio líquido (CHEN et al., 2006; CHOI et al., 2007; KIM et al., 2011) mesmo correndo o risco de contaminação das amostras (BIELANSKI et al., 2000; BIELANSKI; VAJTA, 2009). Visando acelerar a redução de temperatura e reduzir a contaminação do material biológico, têm sido utilizadas técnicas que permitam apenas o contato parcial com o nitrogênio líquido, ou seja, com o vapor de nitrogênio. Contudo, já foi demonstrada a resistência de vírus ao vapor de nitrogênio (GROUT; MORRIS, 2009), indicando que essa alternativa pode não apresentar adequada biossegurança.
Figura 2. Técnicas desenvolvidas para vitrificação de tecido ovariano. (A) vitrificação convencional por palhetas e (B) por criotubos, (C) Cobertura direta, (D) agulhas de acupuntura, (E) Cryosupport e (F) Fiberplug. Imagens obtidas de SAKI; RAHIM; ZERGANI, 2009; WANG et al., 2008; CHEN et al., 2006; http://www.cryoguard.com/products/; HASHIMOTO et al., 2010; BEEBE; NOTTLE, 2010.
Dentre as técnicas de vitrificação de tecido ovariano que não permitem o contato direto com o nitrogênio líquido, podemos destacar a vitrificação convencional (Figura 2A e B). Esta técnica é amplamente utilizada e consiste da utilização de dispositivos comumente empregados na congelação lenta (palhetas, criotubos ou macrotubos) imersos diretamente no nitrogênio líquido (BORDES et al., 2005; CARVALHO et al., 2011) ou expostos ao vapor de nitrogênio (MAZOOCHI et al., 2008; SALEHNIA et al., 2012). Em 2008, Kader et al. (2008) desenvolveram a técnica de vitrificação Ohio-Cryo que mantém os fragmentos ovarianos em um dispositivo que permite uma rápida substituição dos meios de vitrificação e comprime as amostras no interior deste recipiente buscando acelerar a redução de temperatura por redução do espaço no qual estão os fragmentos ovarianos. Para também acelerar a redução de
temperatura, foi recentemente desenvolvida a técnica de dispositivo de metal fechado, que consiste em sobrepor o material biológico em uma folha de alumínio que é, então, fechada e sobreposta em nitrogênio líquido. Em seguida, essa folha é inserida em criotubos para o armazenamento da amostra (BOS-MIKICH et al., 2012).
As técnicas que possuem o propósito de acelerar a redução de temperatura por contato direto com o nitrogênio líquido são variadas (CHEN et al., 2006; KEROS et al., 2009; KIM et al., 2011). Visando reduzir a quantidade de solução crioprotetora e facilitar a redução de temperatura, foi desenvolvido o método de hemi-palheta, no qual uma palheta de 0,25 mL tem uma extremidade cortada na forma de bisel (constituindo uma hemi-palheta) e uma gota contendo o material a ser vitrificado é então colocada nessa superfície e imediatamente posta em contato com o nitrogênio líquido. Após a vitrificação a hemi-palheta é armazenada no interior de uma palheta maior (0,5 mL) e estocada em botijões criogênicos (KEROS et al., 2009). Para acelerar ainda mais a redução de temperatura, foi desenvolvida a técnica de cobertura direta (Figura 2C), na qual um criotubo, contendo o tecido ovariano, é preenchido por nitrogênio líquido (CHEN et al., 2006; ZHOU et al., 2010). Além desta técnica, também tem sido utilizada a imersão direta do tecido ovariano no nitrogênio líquido sendo estes fragmentos manipulados com pinças (COURBIERE et al., 2006; ISACHENKO et al., 2003) ou perfurados com agulhas de acupuntura (Figura 2D) (WANG et al., 2008; XIAO et al., 2010), ou, ainda, em um Cryosupport (Figura 2E), que consiste em agulhas acopladas a um criotubo, as quais perfuram o tecido ovariano permitindo maior facilidade no manuseio e imersão no nitrogênio (HASHIMOTO et al., 2010). Utilizando o mesmo princípio, a vitrificação por grades de microscopia eletrônica é uma alternativa para maximizar a redução de temperatura, uma vez que essas grades são constituídas de metal e apresentam perfurações que possibilitam o contato direto com o nitrogênio líquido (CHOI et al., 2007; KIM et al., 2011).
A utilização do contato da amostra com o vapor de nitrogênio também tem sido amplamente empregada. A vitrificação de tecido ovariano por superfície sólida consiste na imersão parcial de uma superfície metálica em nitrogênio líquido e a sobreposição do tecido ovariano nesta superfície, sendo a vitrificação realizada através da boa condutibilidade de calor, própria do metal (HUANG et al., 2008; CARVALHO et al., 2011; AMORIM et al., 2012). Similarmente, a técnica de Fiberplug (Figura 2F) consiste de uma haste com a extremidade em forma de gancho na qual é colocada a solução de vitrificação e o tecido ovariano a ser criopreservado. Em seguida, o
Fibreplug é colocado em contato com um bloco de metal imerso em nitrogênio líquido
(WANG et al., 2011).
Apesar das inúmeras estratégias utilizadas por diferentes equipes para minimizar as crioinjúrias celulares decorrentes da criopreservação, a vitrificação, assim como a congelação lenta, ainda acarreta danos celulares que podem ser letais às células, evidenciando a necessidade de estudos visando encontrar estratégias para solucionar tais problemas.
2.2.3. CRIOINJÚRIAS
Embora a criobiologia tenha evoluído e resultado no nascimento de crias saudáveis tanto por congelação lenta (GOSDEN et al., 1994; SALLE et al., 2003) quanto por vitrificação (BORDES et al., 2005, LORNAGE et al., 2006, KAWAMURA et al., 2013), os processos de exposição aos crioprotetores, redução de temperatura e posterior aquecimento do material criopreservado resultam em danos celulares tanto do ponto de vista estrutural, quanto metabólico (ELLIOTT, 2010; TATONE et al., 2010). Os danos estruturais estão descritos em maiores detalhes no Capítulo 1 desta tese. Portanto, nesta revisão, dentre os danos metabólicos, serão abordados o aumento das ROS e os mecanismos moleculares de identificação de dano e reparo do DNA, os quais estão envolvidos com a perda da viabilidade celular.
2.2.3.1. AUMENTO NA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (Reactive Oxygen Species - ROS)
Os processos biológicos de forma geral resultam na produção de ROS (TATONE et al., 2010), além de serem produzidas também durante o metabolismo anaeróbico (RAHIMI et al., 2003). As ROS são compostos formados durante etapas intermediárias da redução do oxigênio molecular (O2) e são exemplificadas, principalmente pelo radical ânion superóxido (•O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o radical hidroxila (OH•), que correspondem às etapas de redução por um, dois ou três elétrons, respectivamente (KOWALTOWSKI; VERCESI, 1999). O H2O2, por ser uma molécula apolar, possui a capacidade de atravessar a membrana celular (VEAL; DAY; MORGAN, 2007) e pode ser convertido em OH• (YAN; CHEN; HUA, 2009). Esses radicais possuem uma valência livre e por esta característica são altamente reativos.
Essa reatividade implica em sequestro de moléculas e início de várias reações de oxidação e redução (TATONE et al., 2010) que podem resultar em alterações nas células, sobretudo com danos nas membranas celulares (DINARA et al., 2001; LANE et al., 2002).
O balanço entre moléculas oxidadas e reduzidas no citoplasma da célula (estado redox) é um dos fatores que pode influenciar a sobrevivência celular após a criopreservação. O dano oxidativo à célula já foi descrito durante a criopreservação de tecidos (WHITELEY; FULLER; HOBBS, 1992; LUZ et al., 2012). O processo de criopreservação (resfriamento e aquecimento) aumenta a produção de ROS e causa alterações no metabolismo oxidativo (DOWLING; SIMMONS, 2009). Por essa razão, o estresse oxidativo é um importante fator a ser avaliado com relação às crioinjúrias (TATONE et al., 2010). O aumento das ROS está relacionado com o estresse osmótico em várias células somáticas, assim como em gametas, e pode funcionar como um mecanismo responsável pela resposta adaptativa das células (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; BALL; 2008). Além disso, também acredita-se que o reparo das estruturas celulares danificadas pela criopreservação requer geração de energia e subsequente aumento de ROS (ODANI et al., 2003).
Após a criopreservação tem sido observada perda da integridade e da viabilidade de espermatozoides (BAIARDI et al, 1997), oócitos (GUPTA et al., 2010) e embriões (LANE et al., 2002). Essas alterações estão, por vezes, associadas à peroxidação lipídica (DINARA et al., 2001; LANE et al., 2002). Em espermatozoides criopreservados foi observada uma redução de 50% dos níveis de antioxidantes dessas células (BILODEAU et al., 2000), o que pode resultar em alteração das propriedades da membrana, interferindo no transporte celular e regulação do pH, em virtude da peroxidação lipídica (LANE et al., 2002). Durante a criopreservação, o estresse oxidativo pode ser gerado através de diferentes mecanismos, como o estresse osmótico e o aumento do metabolismo oxidativo (TATONE et al., 2010). Análises de microarranjo revelaram que células eucarióticas submetidas à criopreservação tem um aumento na expressão de genes associados ao metabolismo energético e à defesa antioxidante (ODANI et al., 2003).
A criopreservação pode aumentar as taxas de peroxidação lipídica por aumentar os níveis de ROS (LANE et al., 2002) que degradam os ácidos graxos polinsaturados da membrana plasmática (BAUMBER et al., 2003). O processo de criopreservação altera as condições físico-químicas da célula (STEPONKUS; LYNCH,
1989; FERNÁNDEZ-SANTOS et al., 2008) e as concentrações elevadas de crioprotetores permeáveis e não permeáveis resultam em estresse osmótico e toxicidade que podem ser responsáveis por crioinjúrias durante a vitrificação de células e tecidos (FAHY et al., 1984). A sensibilidade exacerbada (GUERIN; EL MOUATASSIM; MENEZO, 2001) das células às ROS durante o processo de criopreservação é decorrente do próprio aumento na produção desses compostos (SOMFAI et al., 2007; AHN et al., 2002) ou alteração do potencial antioxidante, resultando em danos a enzimas antioxidantes que protegem as células da peroxidação lipídica (DINARA et al., 2001).
Os efeitos de ROS são dose-dependentes e, em níveis elevados, estas moléculas altamente reativas promovem profundas mudanças na célula (TATONE et al., 2010), inclusive, induzindo a expressão de genes envolvidos com a defesa e a regulação do ambiente celular e metabolismo energético (ODANI et al., 2003). Os níveis de ROS parecem aumentar principalmente após o aquecimento celular, uma vez que há a reintrodução do oxigênio nas células criopreservadas bem como a retomada das reações de oxidação-redução, culminando com a produção de ROS como subprodutos dessas reações (EL-WAHSH, 2003; STOREY, 2004, TATONE et al., 2010), evidenciando a necessidade do aumento das defesas antioxidantes após o aquecimento celular.
As ROS são originadas tanto intracelularmente, por decorrência do metabolismo celular, quanto extracelularmente, devido a fatores estressantes e agressivos. Seus principais alvos incluem DNA, lipídeos, proteínas e açúcares, sendo que a ordem de preferência de ataque depende de muitos fatores, como o local onde a espécie reativa é gerada, a habilidade relativa de uma biomolécula ser oxidada e a disponibilidade de íons metálicos associados a essa biomolécula (EVANS; DIZDAROGLU; COOKE, 2004). No entanto, enquanto lipídeos, proteínas e açúcares podem ser removidos via degradação, o mesmo não ocorre com o DNA, uma vez que é a molécula responsável por todas as informações genéticas de todas as células de um organismo vivo (BERRA; MENCK, 2006). Desta forma, o dano ao DNA se mostra mais severo e letal às células.
2.2.3.2. DANOS AO DNA
O molde de DNA para a propagação da informação genética no núcleo de células eucariotas é a cromatina, um polímero dinâmico que serve como uma plataforma
de controle central para todos os processos intracelulares como replicação e reparo do DNA (KHORASANIZADEH, 2004; WOODCOCK; DIMITROV, 2001). A unidade fundamental da cromatina é o nucleossoma, que consiste de 147 pares de base de DNA envolvendo um octâmero de histona (Figura 3). Esse octâmero é formado por um heterotetrâmero central de histonas H4 e H3, circundado por dois heterodímeros das histonas H2A e H2B (BEDNAR et al., 1995; LUGER et al., 1997). O nucleossoma é uma estrutura dinâmica regulada por inúmeras modificações pós-traducionais das histonas, como, por exemplo, no processo de reparo do DNA. Após o dano ao DNA, a cromatina é modificada para permitir o acesso de proteínas de reparo ao sítio de lesão do DNA (SMERDON et al., 1983).
Figura 3. Representação esquemática de um octâmero de histonas consistindo de duas moléculas de H2A, H2B, H3 e H4. Adaptado de ZAIDI et al., 2013.
A molécula de DNA sofre danos constantemente e o estresse oxidativo resulta não apenas em dano às bases e açúcares, mas também pode causar danos à fita simples (single-strand breaks - SSB) ou danos à fita dupla (double-strand breaks - DSB) (HASSA; HOTTIGER, 2005). Contudo, uma DSB pode também ocorrer a partir de replicação de uma SSB não reparada (BILSLAND; DOWNS, 2005; HASSA; HOTTIGER, 2005). Por ser observada na dupla fita (HASSA; HOTTIGER, 2005) a DSB é a lesão mais deletéria ao DNA para a sobrevivência celular e integridade do genoma (KHANNA; JACKSON, 2001; JACKSON, 2002).
A resposta celular global à DSB tem sido considerada como uma cascata de transdução de sinal clássica onde as lesões são detectadas por sensores proteicos que ativam cascatas de proteínas quinases, o que resulta em amplificação e a diversificação do sinal através de uma série de moléculas efetoras (KHANNA; JACKSON, 2001; JACKSON, 2002). Esse mecanismo de detecção e sinalização dos danos, conhecido como checkpoint (ponto de verificação), representa a primeira resposta celular contra lesões no DNA (SHACKELFORD et al., 2001). O checkpoint permite que as células interrompam o ciclo celular e tenham tempo para reparar os danos, antes de recomeçar o ciclo e completar eventos subsequentes, como a replicação de DNA e mitose (SHACKELFORD et al., 2001).
Dentre os sinais de amplificação, as modificações na cromatina e suas histonas parecem exercer um papel crucial na sinalização do dano do DNA. Modificações nas histonas podem servir como um sinal de amplificação para marcar posições específicas de dano ao DNA e proporcionar uma interação ou um sítio de localização para os mecanismos de reparo correspondentes (HASSA; HOTTIGER, 2005). A histona H2A possui três subfamílias, a H2A1-H2A2, a H2AZ e a H2AX (RAGAKOU et al., 1998). Em mamíferos, de acordo com o tipo celular, a H2A1-H2A2 varia em função do percentual de H2AZ e H2AX (RAGAKOU et al., 1998) e estas representam, respectivamente, cerca de 10% e 2-25% do total de histonas (ZWEIDLER, 1976). A H2AX constitui uma das principais variantes da histona H2A (FERNANDEZ-CAPETILLO et al., 2004) e tem grande relevância por possuir um resíduo de serina altamente conservado que é rapidamente fosforilado, um processo que parece ser essencial para a sinalização de dano e recrutamento de fatores de reparo (BERRA; MENCK, 2006, RAGAKOU et al., 1998).
A fosforilação da histona H2AX ocorre no resíduo de serina 139 da região carboxi-terminal (C-terminal), resultando na γ-H2AX (KARAGIANNIS; EL-OSTA, 2007), cuja modificação está relacionada especificamente à DSB (FERNANDEZ-CAPETILLO et al., 2004). A γ-H2AX atua como um marcador sensível à DSB sendo considerada uma ferramenta valiosa para a identificação deste tipo de dano (KARAGIANNIS; EL-OSTA, 2007). A fosforilação da H2AX é essencial para a retenção e posterior aumento na concentração de fatores de reparo aos sítios de dano do DNA e para amplificar o sinal de DSB (BILSLAND; DOWNS, 2005).
Quando ocorre uma DSB, em poucos minutos forma-se um foco nuclear de γ-H2AX que recruta fatores de reparo como o complexo MRN, MDC1 e 53BP1
