EFEITO DE PUNICA GRANATUM L. (ROMÃ) NO SISTEMA REPRODUTOR DE CAMUNDONGOS

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_____________________________________________________________ Revista Interdisciplinar de Ciências Médicas - Anais - Teresina-PI CNPJ:14.378.615/0001-60

Registro:

EFEITO DE PUNICA GRANATUM L. (ROMÃ) NO SISTEMA REPRODUTOR DE CAMUNDONGOS

CUNHA, C.C.¹; SILVA, F.T.¹; SILVA, A.A.1_{OLIVEIRA, A. P.¹; RIBEIRO, E. P. P.¹;} FERREIRA, L. C.¹; RODRIGUES, M.C.D.¹; REIS, T. S.1; SILVA, S.N.1

Universidade Federal do Maranhão1

RESUMO

Introdução: A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é uma doença

reprodutiva e metabólica caracterizada por ovários policísticos, anovulação crônica e hiperandrogenismo, levando a sintomas de ciclos menstruais irregulares, infertilidade, obesidade e resistência à insulina. Várias terapias têm sido propostas até agora para a SOP. Entretanto, devido aos efeitos colaterais dos medicamentos, é fundamental identificar e fornecer medicamentos alternativos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do extrato de Punica granatum no sistema reprodutor de modelo experimental de SOP. Metodologia: Para a indução da SOP, utilizamos camundongos Mus musculus pré-púberes e fêmeas que receberam doses de testosterona, sob dieta hiperlipídica (DH). Foram divididos em 04 grupos, grupo SOP-IND (tratado com salina), grupo SOP-EH200 (SOP-IND, tratado com EH-200mg/kg), grupo SOP-EH400 (SOP-IND, tratado com EH-400mg/kg); e grupo CTRL (SOP-não-induzido, tratado com salina, controle), por via oral (v.o). Paralelo à indução da SOP, os animais foram tratados com o EH de P. granatum por 21 dias. Características reprodutivas foram avaliadas, como ciclo ovariano, o trofismo uterino e a histomorfometria ovariana e da vagina. Resultados e

Discussão: Na avaliação do ciclo estral, O grupo induzido (SOP-IND) se

manteve as fases não proliferativas do ciclo. Os grupos EH200 e SOP-EH400 apresentaram aumento das fases proliferativas. No ensaio uterotrófico, a indução da SOP promoveu uma redução do peso uterino e o tratamento promoveu um discreto trofismo uterino apenas na menor dose. Quanto à análise histológica, observou-se que o epitélio escamoso da vagina do grupo SOP-IND em relação à espessura, apresentou uma atrofia em relação ao grupo CTRL. Houve uma discreta proliferação do epitélio vaginal, quando comparado ao grupo SOP-IND. Na análise histomorfométrica ovariana, o número de corpos lúteos no grupo CTRL foi mais elevados do que no grupo SOP-IND. Os grupos SOP-IND, tratados apresentaram uma significativa redução do número de cístos. Conclusões: Estes dados dão suporte para validar P. granatum como um produto natural na regulação ovariana e utilizá-lo no tratamento ou manejo dos sintomas da síndrome dos ovários policísticos. Palavras-chave – síndrome do ovário policístico, anovulação, hiperandrogenismo

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Introduction: Polycystic ovarian syndrome (PCOS) is a reproductive and

metabolic disease characterized by polycystic ovaries, chronic anovulation and hyperandrogenism, leading to symptoms of irregular menstrual cycles, infertility, obesity and insulin resistance. Several therapies have been proposed so far for PCOS. However, because of the side effects of medications, identifying and providing alternative medicines is critical. Thus, the objective of the present study was to investigate the effects of the extract of Punica granatum on the reproductive system of experimental model of PCOS. Method: For the induction of PCOS, we used prepubertal Mus musculus mice and females that received doses of testosterone, under a hyperlipidic (DH) diet. They were divided into four groups, group SOP-IND (treated with saline), group SOP-EH200 (SOP-IND, treated with EH-200mg / kg), group SOP-EH400 ); and CTRL (SOP-non-induced, saline treated, control) group, orally (v.o). Parallel to the induction of PCOS, the animals were treated with P. granatum HD for 21 days. Reproductive characteristics were evaluated, such as ovarian cycle, uterine trophism and ovarian histomorphometry and vagina. Results and Discussion: In the evaluation of the estrous cycle, the induced group (SOP-IND) remained the non-proliferative phases of the cycle. The SOP-EH200 and SOP-EH400 groups showed increased proliferative phases. In the uterotrophic trial, the induction of PCOS promoted a reduction of uterine weight and the treatment promoted a discrete uterine trophism only at the lowest dose. As to the histological analysis, it was observed that the squamous epithelium of the vagina of the SOP-IND group in relation to the thickness, presented an atrophy in relation to the CTRL group. There was a slight proliferation of the vaginal epithelium when compared to the SOP-IND group. In ovarian histomorphometric analysis, the number of corpora lutea in the CTRL group was higher than in the SOP-IND group. The treated SOP-IND groups showed a significant reduction in the number of cystos. Conclusions: These data support the validation of P. granatum as a natural product in ovarian regulation and to use it in the treatment or management of polycystic ovary syndrome symptoms.

Keywords - polycystic ovary syndrome, anovulation, hyperandrogenism INTRODUÇÃO

A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é uma das mais frequentes causas de infertilidade anovulatória, que afetam entre 5 e 10% das mulheres de idade reprodutiva em todo o mundo. A SOP é uma doença endócrina caracterizada por hiperandrogenismo e anormalidades ovarianas relacionadas a uma ruptura no eixo hipotalâmico-hipofisário. (Baptiste et al., 2010; Franks, 1995; Glintborg, 2016). Estando relacionada a ovários policísticos, anovulação crônica e hiperandrogenismo, levando a sintomas de ciclos menstruais irregulares, infertilidade, obesidade e resistência à insulina

Em relação ao tratamento, recomenda-se que comece com modificações agressivas de dieta e estilo de vida pode regular os ciclos menstruais, diminuir a testosterona total, a insulinorresistência e aumentar a SHBG. No entanto, o

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uso destes medicamentos tem acarretado inúmeros efeitos colaterais, os quais se dão após o uso prolongado desse tipo de medicamento (Dunaif, 2008)

A espécie Punica granatum L., uma árvore de pequeno porte, que pertence à família Lythraceae (antiga Punicaceae), é conhecida popularmente como romanzeira, romeira e granado, e amplamente distribuída por todo Brasil sendo originária da Ásia (Braga, 1961). Dentre os fitoconstituintes presentes na planta, destacam-se flavonóides (apigenina e narigenina), antocianinas, taninos (ácidos gálico e elágico), alcalóides, ácido ascórbico, ácidos graxos conjugados (ácido púnico) e o ácido ursólico (Lansky & Newmann, 2007). Desta forma, o objetivo do presente estudo foi Investigar os efeitos do extrato de Punica granatum no sistema reprodutor de modelo experimental de síndrome de ovário policístico (SOP) em roedores induzida por drogas. Observar os efeitos dos extratos no desenvolvimento uterino das camundongas. Avaliar o efeito do extrato no ciclo estral das camundongas com SOP, avaliar as alterações histológicas e histomorfométricas do ovário em camundongas tratadas com o extrato.

METODOLOGIA

Material botânico: Folhas de Punica granatum L. foram coletadas. Para o

preparo do extrato hidroalcoólico (EH), as folhas foram secas em estufa em temperatura de 40ºC, sendo posteriormente trituradas. Após esta etapa, o pó das folhas foi macerado em etanol a 70% (v/v) na proporção variável pó das folhas/etanol (m/v) de 1/3, durante 72 horas, e filtrado. Este procedimento foi repetido três vezes e o filtrado das três extrações foi reunido, concentrado em rotaevaporador e denominado extrato hidroalcoólico (EH) de Punica granatum L. Em seguida, o extrato foi liofilizado a uma temperatura variando entre 50 e 20ºC, acondicionado em frasco âmbar e conservado a 4ºC. Animais: Foram utilizados camundongos da espécie Mus musculus, adultos, fêmeas, sadias ao exame clínico, com aproximadamente 25 dias de idade, fornecidos pelo

Biotério da Universidade Federal do Maranhão - UFMA. Os animais foram mantidos em gaiolas de polietileno, forradas com maravalha, com ração e água ad libitum e sob ciclo claro/escuro de 12hs, em temperatura de 22°C. O projeto registrado com o nº 23115.005975/2016-16 foi submetido e aprovado no

Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFMA. Indução do Modelo de

Síndrome do Ovário Policístico em Camundongas:Todos os animais

foram verificados diariamente para avaliação do ciclo ovariano de 04 (quatro) dias, por meio da citologia vaginal. Foram mantidos sob condições controladas de temperatura e luz e com acesso livre a alimentação e água. Inicialmente, os camundongos foram divididos em dois grupos experimentais: grupo controle (CTRL; não induzido; n = 10) recebeu, por via subcutânea, solução salina durante por 3 doses com intervalo de 72h e solução salina 0,9% por via oral, a partir do 24º dia do início do procedimento experimental; grupo induzido (SOP-IND; foi induzido com Testosterona - 10 mg/Kg, via subcutânea, 3 doses com intervalo de 72h, n = 8), recebeu solução salina 0,9% a partir do 24º dia do início da indução; grupo tratado com extrato (SOP-EH200 e SOP-EH400; foi

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induzido com Testosterona - 10 mg/Kg, via subcutânea, 3 doses com intervalo de 72h), foram tratados por via oral com EH-200mg/Kg e EH-400mg/kg). O tratamento foi intercalado a indução, teve início ao 24º dia da indução e durou 21 dias. Após a indução da SOP com testosterona, todos os animais SOP-IND ficram sob dieta hiperlipídica por 21 dias.Durante todo o desenvolvimento experimental, foi realizado o acompanhamento diário do ciclo estral dos animais. Ao final do tratamento, os camundongos foram anestesiados e sacrificados para retirada e dissecação de órgãos (útero, vagina e ovário).

Determinação do Ciclo Ovariano - Ciclo estral: A determinação das fases do

ciclo estral foi realizada diariamente pela manhã, entre 10 e 12 horas, durante todo o período experimental, pela análise da citologia vaginal a fresco. A coleta da secreção vaginal foi realizada com a inserção de pipeta de plástico com ponteira contendo 20μL de solução de NaCl 0,9% estéril, na vagina do animal. O material aspirado foi colocado sobre lâmina de vidro e visualizado a fresco, em microscópio óptico de luz comum, em aumento de 40 vezes (Marcondes, 2002). Sendo assim, determinado diariamente o tipo de célula predominante no material: células epiteliais nucleadas, células cornificadas e leucócitos. A

proporção entre estas células foi utilizada para determinar as fases do ciclo estral em: proestro, estro, metaestro e diestro (Hubscher et al., 2005). Teste

uterotrófico e peso dos órgãos: Os cornos uterinos e o corpo foram

dissecados e a gordura adjacente, retirada. Pesos uterinos de

camundongas individuais foram calculados dividindo o peso uterino úmido pelo seu respectivo peso corporal (no dia do sacrifício) e multiplicando por 10. Os ovários também foram removidos e pesados.Análise Histológica e

Histomorfométrica da Vagina e Ovário: Os ovários e vagina

foram removidos, limpos de gordura e tecido conjuntivo aderente e fixados em formalina tamponada a 10% por no mínimo 24horas. Os exames

histológicos de ovários de todos os grupos foram realizados usando métodos histológicos padronizados. Seções de 5 m de espessura foram cortados em blocos embebidos em parafina e corados com hematoxilina-eosina (Lillie, 1976).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na avaliação do ciclo estral, os animais do grupo Controle (CTRL) passaram por todas as fases do ciclo estral. Os animais induzidos (SOP-IND) se mantiveram predominantemente as fases não proliferativas do ciclo (metaestro e diestro=81,25%). Os grupos SOP-EH200 e SOP-EH400 apresentaram aumento das fases proliferativas de 21,24% e 12,5% respectivamente, comparados ao SOP-IND. No ensaio uterotrófico, a indução da SOP promoveu uma redução do peso uterino e o tratamento com P. granatum promoveu um discreto trofismo uterino de 25,00% apenas na menor dose (SOP-EH200: 0,055±0,007g vs SOP-IND: 0,044±0,008g /10g). Quanto à análise histológica, observou-se que o epitélio escamoso da vagina do grupo SOP-IND (21,3±3,8µm) em relação à espessura, apresentou uma atrofia em relação ao grupo CTRL (48,3±5,4µm). Após três semanas de administração de

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P.granatum, 200 e 400mg/kg, houve uma discreta proliferação do epitélio vaginal (28,2±6,82 e 27,3±5,5 µm), quando comparado ao grupo SOP-IND. Na análise histomorfométrica ovariana, o número de corpos lúteos no grupo CTRL foram significativamente mais elevados do que no grupo SOP-IND. Os grupos SOP-IND, tratados com o EH de P. granatum, apresentaram uma significativa redução do número de cístos.

CONCLUSÕES

Em conclusão, o presente estudo indica que o EH de P. granatum apresenta alto potencial na prevenção e manutenção da SOP e que, os fitoconstituintes contidos nas folhas da planta com ação antioxidante, podem estar diretamente relacionados com os efeitos positivos do extrato em ratas com SOP, no que se refere a regulação do ciclo estral e foliculogênese ovariana, podendo se tornar um eficaz fitoterápico no auxílio do tratamento das portadoras da SOP, com redução considerável dos efeitos colaterais.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Baptiste CG, Battista MC, Trottier A, Baillargeon, JP. Insulin and

hyperandrogenism in women with polycystic ovary syndrome. J. Steroid

Biochem. Mol. Biol. 2010. 122, 42e52.

Braga R 1961. Plantas do nordeste - Especialmente do Ceará. Rio Grande do Norte: Editora Universitária/UFRN.

Dunaif A. Drug Insight: insulin-sensitizing drugs in the treatment of polycystic ovary syndrome reappraisal. Nat RevEndocrinol, 2008, vol. 4; p. 272-283. Hubscher CH, Brooks DL, Johnson JR. A quantitative method for assessing stages of the rat estrous cycle.2005. Biotechnic&Histochemistry 80, p. 79-87 Lansky EP, Newmann RA. Punica granatum (pomegranate) and its potential

for prevention and treatment of inflammation and cancer. J

Ethnopharmacol. 2007. 109: 177-206

Marcondes, F.K., Bianchi, F.J. and Tanno, A.P., 2002. Determination of the

estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian