Qualidade de peixes: uma breve revisão

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Qualidade de peixes: uma breve revisão

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Ana Cláudia Silveira Alexandre

UFLA

Francielly Corrêa Albergaria

UFLA

Anderson Henrique Venâncio

UFLA

Ana Paula Lima Ribeiro

UFLA

Felipe Furtini Haddad

UFLA

Marcelo Stefanini Tanaka

UFLA

Roberta Hipólito de Souza

UFLA

Maria Emília de Sousa Gomes

UFLA

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Avanços em Ciência e Tecnologia de Alimentos - Volume 4

Palavras-chave: Índice de Qualidade, Frescor de Peixe, Rigor Mortis,

Metodo-logias Analíticas.

RESUMO

Qualidade e segurança alimentar são questões de grande importância para os con-sumidores, no caso do pescado, o aspecto frescor tem grande relevância pelo fato de constituir o principal critério que determina a sua aceitação. Os pescados são avaliados pelos consumidores com um rigor ainda maior do que muitos outros alimentos, pois o peixe é um alimento mais sensível e perecível quando comparado com outros produtos de origem animal, seja por fatores inerentes ao pescado, seja por fatores extrínsecos relacionados ao transporte e armazenamento. Como a carne de peixe é muito suscep-tível às alterações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas, é de grande importância a avaliação de sua qualidade e de seu frescor por meio de métodos sensoriais, químicos, físicos, físico-químicos e microbiológicos. Neste sentido, este capítulo buscou apresen-tar os principais fatores relacionados à perda de qualidade em pescado e as análises comumente utilizadas para avaliar o seu frescor e sua segurança. Reafirma-se que a utilização, em conjunto, de métodos objetivos e subjetivos torna-se essencial tanto para os consumidores, quanto para o setor pesqueiro e de serviços de inspeção.

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146 INTRODUÇÃO

O consumo de produtos oriundos da pesca tem sido impulsionado pelo reconhecimento da carne de peixe como um alimento saudável, em função do elevado teor de proteínas, a presença de aminoácidos essenciais, vitaminas, minerais, como ferro, fósforo e cálcio, devido à sua boa digestibilidade em comparação a outros produtos de origem animal e, em especial, a seus ácidos graxos poli-insaturados, como o ômega-3 (PASTRO et al., 2019). Todavia, os peixes são muito vulneráveis às modificações bioquímicas e à contaminação por microrganismos por terem um alto teor de umidade e de atividade de água, pH próximo à neutralidade, elevado conteúdo de nutrientes facilmente assimiláveis pelos microrganismos e menor percentual de tecido conjuntivo, quando comparado com carnes de outras espécies (VELIOĞLU, TEMIZ e BOYACI, 2015; SOARES e GONÇALVES, 2012; HUSS, 1995). Além disso, a carne de peixe é dominada pela abundância de músculo branco em segmentos relativamente curtos, conferindo à sua estrutura características similares a escamas, que apresentam menor barreira física de proteção (SOARES e GONÇALVES, 2012; HUSS, 1995). A rápida instalação do rigor mortis e a liberação de muco também são fatores impor-tantes que contribuem para a maior perecibilidade da carne de peixe (BARTOLOMEU, 2011).

Normalmente, o processo de deterioração do peixe segue quatro estágios: o rigor mor-tis, a dissolução do rigor, a autólise (perda de frescor) e a deterioração microbiana. Esses estágios podem ocorrer de forma rápida ou lenta, dependendo da espécie, das condições fisiológicas, das populações microbianas presentes no ambiente aquático ou da contami-nação durante o processamento e das temperaturas de transporte e estocagem, que além de afetar a qualidade da carne de peixe, reduzem sua vida útil (OCAÑO-HIGUERA et al., 2011). O músculo estéril do peixe se torna vulnerável à contaminação por microrganismos principalmente devido ao processo de autólise. Após a morte, os sistemas que controlam os processos vitais do pescado param de funcionar e as enzimas presentes nos tecidos e nas vísceras continuam agindo (GALVÃO e OETTTERER, 2014). A ação dessas enzimas resulta na hidrólise de proteínas (proteólise) e lipídeos (lipólise) e a deterioração prossegue devido à auto oxidação de lipídios insaturados e devido à atividade metabólica de micror-ganismos presentes no peixe, os quais causam alterações químicas e físicas irreversíveis (OCAÑO-HIGUERA et al., 2011; JAY, 2005). Essas reações podem ser aceleradas devido ao manuseio inadequado, condições de sangria, tempo de pós-processamento e em função da espécie de peixe (CHEN et al., 2017).

Logo, a decomposição da carne de peixe pode ocorrer por meio de processos enzi-máticos, microbiológicos e oxidativos, podendo oferecer riscos à saúde dos consumidores. Isso faz com que as pesquisas sejam concentradas no controle microbiológico e em rea-ções bioquímicas a fim de controlá-las e, desta forma, estender a vida útil da carne de peixe

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(TSIRONI e TAOUKIS, 2010). Para tanto, a avaliação da qualidade e do frescor da carne de peixe mostra-se indispensável para a garantia da segurança alimentar. Nesse sentido, diversos métodos sensoriais, químicos, físicos, físiquímicos e microbiológicos são co-mumente utilizados para avaliar o frescor do pescado (ZHELYAZKOV e STRATEV, 2018; Chen et al., 2017). Frente ao exposto, este capítulo teve como objetivo relatar os principais fatores que podem interferir na qualidade da carne de peixe e apresentar as principais aná-lises empregadas para mensurá-la.

DESENVOLVIMENTO

Qualidade sensorial, química, física e físico-química de peixes

Existem diversos fatores que podem expor o peixe ao risco de deterioração e, conse-quentemente, reduzir o seu frescor e sua qualidade, como os diferentes modos de captura, as áreas de pesca, o tempo de arraste, o método de resfriamento e as formas de processamento ou comercialização (SOARES e GONÇALVES, 2012). Após a captura, o peixe pode ser ar-mazenado no barco ou navio por períodos que variam de horas a várias semanas utilizando diferentes métodos de refrigeração, como o emprego de gelo, salmoura resfriada ou água do mar refrigerada a -2 °C. Se a salmoura refrigerada não circular adequadamente, pode resultar no crescimento de microrganismos anaeróbicos e, consequentemente, na produção de odores desagradáveis. Bactérias deterioradoras psicrotróficas também podem crescer na salmoura, não sendo recomendada a sua reutilização devido ao risco de contaminação cruzada de outros peixes com esses microrganismos. A fim de evitar a deterioração durante as capturas, é recomendada a utilização de instalações de congelamento (ASHIE, 1996).

Diversas técnicas de abate/atordoamento são utilizadas na aquicultura, como a hipo-termia (imersão em água salgada e gelo), atordoamento elétrico, narcose por gases, sangria por perfuração das brânquias, atordoamento percussivo, entre outros. As implicações do estresse decorrente da utilização de cada técnica determinam o metabolismo e a redução da qualidade do produto post mortem. Muitos dos métodos tradicionais de abate não são considerados humanitários, pelo fato de provocarem sofrimentos desnecessários, dor, es-tresse e além disso, impactarem na qualidade do produto final. No entanto, essas questões relacionadas ao abate humanitário, juntamente com o bem-estar durante toda a fase de desenvolvimento dos peixes, têm sido atualmente discutidas e avaliadas, principalmente em países europeus (VIEGAS et al., 2012).

Em relação ao processamento post mortem, deve-se realizar com muito cuidado a etapa de evisceração a fim de remover todo o conteúdo do intestino, sem que este seja perfurado. Posteriormente, a carcaça deve ser lavada completamente antes da refrigeração

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ou do congelamento (SAFAEIAN e KHANZADI, 2018), visto que a vida útil e a segurança dos peixes refrigerados estão diretamente relacionadas à presença de microrganismos de-terioradores e patogênicos. O crescimento destes microrganismos é indesejável, reduzindo a qualidade do produto e a aceitação do consumidor (GRAM e DALGAARD, 2002).

A deterioração do pescado é marcada por mudanças sensoriais, podendo acarretar modificação em cor, textura e odor. A aparência é um parâmetro utilizado para selecionar os peixes aptos para continuar na cadeia de produção, armazenamento e estocagem, e descartar os que possuem aspectos de deterioração (COSTA et al., 2013). Como as altera-ções que mais caracterizam a deterioração em peixes estão relacionadas principalmente a alterações sensoriais, a análise sensorial é o principal método de avaliação do frescor em peixes (DEHAUT et al., 2015; SOARES e GONÇALVES, 2010).

Entretanto, na análise de qualidade de pescados, geralmente, combinam-se um mé-todo sensorial (subjetivo) e um mémé-todo não sensorial (objetivo) (SOARES e GONÇALVES, 2010). Dentre os métodos objetivos, têm-se as análises químicas, físicas, físico-químicas e microbiológicas. A composição dos peixes pode ser avaliada por meio das metodologias de determinação da composição centesimal, incluindo umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos. A constituição da carne de peixe pode ser influenciada por muitos fatores, como o tamanho, a espécie, o gênero, o estado fisiológico, o ambiente aquático e a estação do ano. Entretanto, a composição aproxima-se muito da composição das carnes suína, bovina e de aves, em que o principal constituinte é a água, com percentuais variando entre 60 e 85%, seguido pelo percentual de proteínas, em torno de 20%, e pelos lipídeos, que podem apresentar uma ampla variação, entre 0,6 e 36%. Em relação as cinzas e aos carboidratos, os percentuais ficam em torno de 1 a 2% e 0,3 a 1%, respectivamente (CORRÊA et al., 2016).

Os métodos químicos mais utilizados para medir a qualidade de pescados são ni-trogênio das bases voláteis totais (N-BVT), nini-trogênio de trimetilamina, histamina, valor de K, hipoxantina (Hx), aminas biogênicas e aminoácidos livres, TBARS e reação de Éber para detecção de gás sulfídrico. Entre os métodos físicos, têm-se as análises de textura (tensão das fibras musculares e dureza do músculo), cor, propriedades elétricas, índice de rigor mortis, entre outros (SOARES e GONÇALVES, 2010). Já em relação aos métodos físi-co-químicos, citam-se principalmente as análises de pH e atividade de água. Considerando a alta perecibilidade da carne de peixe e a importância do controle de qualidade para garantir maior shelf life ao produto, reuniram-se informações relevantes encontradas na literatura em relação aos métodos sensoriais, químicos, físicos e físico-químicos mais comumente utilizados para avaliar o frescor e a qualidade de pescados.

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Método Sensorial

O Método do Índice de Qualidade (MIQ) é um método rápido e objetivo, considerado promissor na avaliação do frescor de peixes (AMARAL e FREITAS, 2013). Foi desenvolvi-do pelo Serviço Alimentar da Tasmânia (Tasmanian Food Research Unit) em meadesenvolvi-dos de 1980 e é utilizado na avaliação de parâmetros sensoriais de peixes brancos, peixes azuis, seláceos, crustáceos e cefalópodes (BRASIL, 2011). O MIQ destaca-se por ser específico para cada espécie, o que o torna mais fidedigno. É um teste muito utilizado para medir a qualidade do produto durante o tempo de armazenamento. Além de ter um baixo custo, re-quer pouco treinamento em relação aos outros métodos e não destrói a amostra (AMARAL e FREITAS, 2013).

De acordo com Amaral e Freitas (2013) e Araújo (2013), o MIQ deve ser realiza-do em três etapas:

1. Recrutamento e treinamento: no mínimo 8 provadores devem ser previamente treinados em relação aos atributos que serão avaliados, por exemplo odor, apa-rência e textura. O julgador será familiarizado com a espécie a ser analisada. Ele deve ser treinado para descrever cada atributo que representa a qualidade daquele pescado.

2. Protocolo de análise: será gerada uma tabela (protocolo de análise) com os atri-butos descritos pelos julgadores, como aparência da pele, limo, firmeza da carne, odor, cor e forma dos olhos, cor e odor das brânquias.

3. Aplicação do teste: para medir a qualidade do produto durante armazenamento, é necessário que o teste seja realizado durante o período de 30 dias, em intervalos pré-estabelecidos de acordo com o objetivo da pesquisa.

O objetivo do método é avaliar o pescado de maneira visual e olfativa utilizando uma escala que varia de 0 a 3 pontos. A pontuação de todos os atributos é somada para dar uma pontuação global sensorial, o chamado Índice de Qualidade (IQ). Dessa maneira, é possível realizar o teste durante a estocagem do produto, obtendo uma relação linear entre o índice de qualidade e o tempo de armazenamento em gelo, estimando a vida útil do pro-duto (BRASIL, 2011).

De acordo com Araújo (2013), após recrutar os provadores que estejam dispostos a participar do teste, se faz necessário informá-los sobre a importância da pesquisa e sobre a metodologia MIQ. Nessa etapa, o pescado em estudo será apresentado aos provadores e os principais atributos sensoriais (cor, aparência e odor) de um pescado fresco serão de-terminados em consenso pelos julgadores.

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Para cada teste realizado, uma nova lista com atributos deve ser implementada pelos julgadores, fazendo que este teste seja específico para cada espécie de pescado analisado. Sendo assim, atributos considerados importantes serão listados e utilizados posteriormente na fase final de aplicação do teste para avaliação da qualidade sensorial de pescado. O Quadro 1 mostra os principais atributos de tambaqui fresco avaliados por julgadores treinados, em trabalho realizado por Araújo (2013).

No teste final, o julgador deverá pontuar cada atributo separadamente, por meio de uma escala que varia de 0 a 3 pontos. Os atributos que receberem notas mais próximas de 0, significa que estão com melhores características sensoriais, de acordo com o pro-vador. Já as notas que se aproximam de 3, considera-se baixa qualidade sensorial para o pescado. Essas notas serão somadas para a pontuação global final do produto, resultando no Índice de Qualidade (TEIXEIRA et al., 2009). As respostas de cada julgador devem ser analisadas, apresentam-se as avaliações individuais, observando-se o aumento dos escores com o aumento do tempo de estocagem em gelo.

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Quadro 1. Protocolo de análise sensorial MIQ desenvolvido para o Tambaqui (C. macropomum) eviscerado e estocado em gelo.

Parâmetros Características Escore

Aspecto geral

Aspecto superficial

Brilho intenso, Pigmentação intensa 0 ( )

Brilhante, ligeira perda de cor, presença de muco transparente 1 ( )

Pouco brilho, perda de cor, muco opaco, pequenas lesões 2 ( )

Sem brilho, cor opaca, muco opaco e amarelado, lesões 3 ( )

Rigidez/ Firmeza da carne

Firme e elástica (a pressão digital a pele retorna rápida e completamente ao normal) 0 ( ) Redução na firmeza e elasticidade (a pressão digital a pele retorna completamente ao normal, mas

lentamente) 1 ( )

Pouco elástica (a pressão digital a pele não retorna completamente) 2 ( )

Flácida, com deformação no corpo 3 ( )

Olhos Transparência (globo ocular) Transparente, claro 0 ( ) Levemente opaco 1 ( ) Opaco 2 ( ) Pupila

Visível, bem delineada 0 ( )

Enevoada, delineada 1 ( )

Cinzenta, sem delineamento 2 ( )

Forma

Convexo 0 ( )

Plano 1 ( )

Côncavo 2 ( )

Côncavo, Deformado, com perda de volume 3 ( )

Sangue Ausente 0 ( ) Levemente sanguinolento 1 ( ) Sanguinolento 2 ( ) Brânquias (guel-ras) Cor

Vermelho vivo a púrpura 0 ( )

Vermelho menos vivo 1 ( )

De vermelho menos vivo a marrom, com bordas pálidas 2 ( )

Descoradas 3 ( )

Odor

Algas 0 ( )

Neutro, algas menos intenso 1 ( )

Ligeiramente metálico, acre ou rançoso 2 ( )

Rançoso, característico de putrefação 3 ( )

Forma Íntegra 0 ( ) Ligeiramente disforme 1 ( ) Disforme 2 ( ) Cavidade abdo-minal Cor Rósea claro 0 ( )

Rósea, ligeiramente opaco 1 ( )

Rósea, ligeiramente escuro 2 ( )

Odor

Algas 0 ( )

Neutro 1 ( )

Ligeiramente acre e rançoso 2 ( )

Acre e rançoso 3 ( )

Pele Escamas

Firme, fortemente aderidas 0 ( )

Aderidas 1 ( )

Levemente soltas 2 ( )

Soltas 3 ( )

Nadadeiras Elasticidade

Muito elástica (sob tensão retorna instantaneamente) 0 ( )

Elástica (sob tensão retorna mais lentamente) 1 ( )

Pouco elástica (sob tensão não retorna completamente) 2 ( )

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Fonte: ARAÚJO (2013).

Os dados do MIQ podem ser analisados por meio de regressão linear, em que é es-perado a pontuação aumentar durante o período de armazenamento, considerando que o peixe se deteriora e perde qualidade ao longo do tempo. Soares e Gonçalves (2012) e Araújo (2013) mostram que é possível obter dados de cada parâmetro separadamente, para avaliar como esses parâmetros se modificam no decorrer do tempo (Figuras 1, 2 e 3).

Figura 1. Representação gráfica da evolução das médias dos escores MIQ obtidos para o tambaqui eviscerado e estocado

em gelo, com modelo de equação de regressão linear.

Figura 2. Evolução dos escores médios do atributo “Brânquias” avaliados no protocolo MIQ do tambaqui (C. macropomum)

eviscerado e estocado em gelo por 30 dias.

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Figura 3. Representação gráfica da evolução dos escores médios obtidos por julgador para o tambaqui eviscerado e

estocado em gelo.

Métodos químicos Umidade

Todos os alimentos, independentemente do método de industrialização, contêm água em maior ou menor proporção. Uma das principais formas de se determinar a umidade de um alimento é por meio da perda de peso decorrente da secagem em estufa. Além da água que é evaporada, alguns compostos voláteis também são removidos, ficando somen-te um resíduo seco (ZENEBON et al, 2008). A umidade está diretamensomen-te relacionada com a vida útil, portanto, os alimentos com maior umidade deterioram-se mais rapidamente (FOGAÇA et al, 2009).

O método termogravimétrico para determinação da umidade de um produto se dá pela diferença de peso da amostra de peixe in natura e após o aquecimento em estufa a 105 ºC por 24 horas. Após esse período, o conjunto amostra e cadinho (previamente seco em estufa e pesado) deve ser pesado em intervalos de 1 hora, até obtenção de peso constante (PARTHASARATHY, NARAYANAN e AROCKIAM, 2013; FOGAÇA et al, 2009).

Cinzas

As cinzas representam o resíduo mineral presente na carne de peixe e sua determi-nação é feita por meio da incineração da amostra, em que ocorre a combustão da matéria orgânica. Essa análise não expressa o perfil de minerais no pescado, apenas representa o teor de minerais de maneira geral. A análise de cinzas é realizada a partir de 2 gramas de

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amostra em cadinho calcinado (previamente incinerado em forno mufla a 550 °C, resfria-do e mantiresfria-do em dessecaresfria-dor), carbonização da amostra em chama de bico de Bunsen e posterior incineração em forno mufla a 550 °C até obtenção de cinzas brancas (FOGAÇA et al, 2009; MÁRSICO et al., 2009). Alguns compostos inorgânicos podem sofrer redução ou volatilização durante o aquecimento (ZENEBON et al, 2008).

Proteínas

A análise de proteína geralmente é feita pelo método Kjeldahl, que consiste em três etapas: digestão, destilação e titulação. A amostra é adicionada de ácido sulfúrico juntamente com uma mistura de catalisadores e é submetida a aquecimento gradual de 50 em 50 °C, até cerca de 400 °C em bloco digestor. O carbono presente na amostra é oxidado e o nitrogênio é convertido em sulfato de amônio, fazendo com que a solução anteriormente de cor escura apresente coloração translúcida azul/verde clara após o término da digestão. Na etapa de destilação, a amônia é liberada do sal amoniacal quando reage com o hidróxido de sódio em aquecimento, sendo incorporada ao ácido bórico, formando o borato de amônio. Na última etapa da análise, a quantificação de nitrogênio é feita por meio da titulação do borato de amônio com solução de ácido clorídrico (HCl) padronizada, obtendo-se como produto final o nitrogênio total. Considera-se que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio. Logo, o teor de proteína bruta na amostra de peixe é calculado aplicando-se o fator de correção de 6,25 (MELO et al, 2020; FOGAÇA et al, 2009; ZENEBON et al, 2008).

Lipídeos

O método Soxhlet é um dos mais empregados na quantificação do teor de lipídeos de alimentos. A amostra (previamente seca em estufa) é pesada e colocada em cartucho de Soxhlet ou papel filtro. O material lipídico é extraído com éter, em lavagens consecutivas no aparelho extrator de Soxhlet por 8 horas. Após evaporação do éter, o balão contendo o material lipídico é pesado e o teor de lipídeos é calculado em relação à amostra inicial (BORGES et al, 2020; FOGAÇA et al, 2009; ZENEBON et al, 2008).

Teor de carboidratos

O conteúdo de carboidratos pode ser obtido pela diferença das porcentagens de pro-teína, lipídeos, umidade e cinzas (DA SILVA, 2008). De acordo com Corrêa (2016), o teor de carboidratos pode não ser significativo devido ao estresse pré-abate.

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Nitrogênio das Bases Voláteis Totais (N-BVT)

A determinação de Nitrogênio das Bases Voláteis Totais consiste na quantificação de aminas como a trimetilamina (TMA), dimetilamina (DMA) e amônia, que são produzidas devido a ação enzimática endógena ou a ação de microrganismos. É um importante parâ-metro para avaliação do frescor do pescado, embora algumas espécies possam apresentar valores elevados de N-BVT sem que estejam deterioradas (CÍCERO et al., 2014; ZENEBON, 2008). A metodologia para análise de N- BVT consiste em homogeneizar a amostra em ácido tricloroacético (TCA), filtrar e digerir a amostra em bloco digestor de proteínas. O TCA preci-pita as proteínas e libera o nitrogênio proteico da amostra, que depois de filtrada, resulta em um extrato contendo nitrogênio volátil. O óxido de magnésio (MgO) é utilizado como agente alcalinizante antes da destilação por arraste de vapor. A amostra destilada é titulada com ácido clorídrico e o resultado é expresso em mg de N em 100g de músculo (CÍCERO et al., 2014; FOGAÇA et al, 2009).

Nitrogênio de Trimetilamina

A trimetilamina pode ser resultado da ação enzimática bacteriana após a morte do pescado, sendo um parâmetro de qualidade (EVANGELISTA et al, 2000). A análise descrita por Malle e Tao (1987) consiste na mesma utilizada para determinação de N-BVT, sendo adicionado formaldeído ao filtrado para que apenas a TMA seja destilada. O teor de TMA é calculada a partir do volume de 0,1 N de ácido sulfúrico (n mL) utilizado na titulação da amostra, conforme a equação seguinte: TMA = n x 16,8 mg de nitrogênio/100 g.

Histamina

A histamina é formada principalmente por atividade bacteriana, devido à ação dos microrganismos sobre o aminoácido histidina. A presença dessa amina é correlacionada à deterioração do pescado, sendo mais comumente encontrada em pescados marítimos e de musculatura com coloração mais escura. A sua determinação se dá pelo método fluorimétrico, em que a histamina reage com o o-ftalaldeído (OPT) formando um composto fluorescen-te. As amostras são pesadas e homogeneizadas com metanol. Depois são aquecidas em banho-maria a 60 ºC, por 15 minutos, e após resfriamento, são filtrados. O reagente OPT é adicionado à amostra e a leitura é realizada em espectrômetro de fluorescência. É necessária a realização de uma curva padrão e o resultado é expresso em mg de histamina por kg de produto (SOUZA et al, 2015; FOGAÇA et al, 2009).

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Valor de K e Hipoxantina (Hx)

Os produtos formados pela degradação da adenosina trifosfato (ATP) podem ser usa-dos como parâmetro para monitorar o frescor do pescado, pelo fato do ATP ser degradado devido à ação tanto de enzimas endógenas quanto de enzimas bacterianas. Um dos produtos da degradação é a inosina monofosfato (IMP), que é convertida em hipoxantina por ação da enzima inosina ribohidrolase, de origem bacteriana. Essa relação pode ser descrita pelo valor K, definida pela soma da INO e hipoxantina pela razão de catabólitos ATP, adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP) e IMP. A cromatografia líquida de alta pre-cisão (HPLC) é utilizada para determinar a concentração de cada composto (SOARES e GONÇALVES, 2012; VARGAS, 2011).

Aminas biogênicas e aminoácidos livres

As aminas biogênicas são oriundas do metabolismo de microrganismos ou da ação de enzimas endógenas e são formadas devido à descarboxilação de aminoácidos, sendo sua presença em alimentos um indicativo de atividade bacteriana. As aminas biogênicas cadaverina, putrescina, histamina, espermina e espermidina podem ser utilizadas como parâmetro de qualidade, em que a soma das três primeiras aminas pela razão da soma das duas seguintes indica o índice QI, conforme a equação seguinte: QI = (cadaverina + putrescina + histamina)/ (1 + espermina + espermidina). Consideram-se valores inferiores a 1 de alta qualidade e valores acima de 10 indicam uma qualidade microbiológica muito ruim. A cromatografia em camada delgada (CCD) pode ser utilizada para quantificar as aminas biogênicas (GUIMARÃES, 2005).

Substâncias Reativas ao Ácido tiobarbitúrico

O processamento e a exposição dos alimentos ao ar e a luz são fatores que podem afetar a estabilidade dos lipídeos nos alimentos, sendo a mensuração da oxidação lipídica um importante indicador da qualidade do pescado. Entre as metodologias que avaliam a oxi-dação lipídica de peixes, a análise de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) é a mais comumente utilizada, na qual quantifica-se os produtos da oxidação lipídica, em que o malonaldeído é o principal deles. A amostra é homogeneizada com TCA 7,5%, filtrada e adicionada de ácido tiobarbitúrico (TBA). A mistura é aquecida em banho-maria por 10 minutos e resfriada em banho de gelo. Posteriormente, é realizada a leitura em espectro-fotômetro e o resultado é expresso em mg de malonaldeído/ kg de amostra (LIMA-JÚNIOR et al, 2013; FOGAÇA et al, 2009).

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Reação de Éber

A liberação do enxofre por bactérias deteriorantes no pescado leva a formação de enxofre, que em meio ácido, é convertido em gás sulfrídrico (H2S). A presença do gás sul-frídrico é avaliada por meio da reação de Éber, sendo essa também um indicativo do frescor do pescado. A amostra deve ser homogeneizada em frasco Erlenmeyer e tampada com papel filtro devidamente fixado, com uma solução de acetato de chumbo. O frasco deve ser aquecido em banho-maria, por 10 minutos, sem contato direto com a amostra. O apareci-mento de manchas pretas no papel de filtro indica presença do gás sulfídrico (SOARES e GONÇALVES, 2012; ZENEBON, 2008).

Métodos físicos Avaliação da textura

A textura e as propriedades reológicas são características importantes que determinam a qualidade e aceitabilidade de um alimento. Por definição, a textura, assim como a maciez, é um termo relacionado à percepção sensorial e, portanto, está ligada à impressão subje-tiva. Porém, a análise objetiva da textura de um alimento pode ser realizada utilizando-se instrumentos capazes de avaliar os diversos parâmetros reológicos envolvidos, sob condi-ções similares a que ele é submetido na prática (durante a degustação), gerando gráficos de força em razão do tempo ou distância, conhecidos como perfis de textura ou curvas de deformação (RAMOS e GOMIDE, 2017).

Quando um corpo é submetido a forças externas, diferentes tipos de forças internas podem ser distinguidas: tração, forças que tendem a esticar o material; compressão, forças que tendem a comprimir o material; e cisalhamento, forças que tendem a distorcer ou defor-mar a matéria de alguma forma. As técnicas instrumentais que têm sido usadas para tentar medir a resistência de carnes aos efeitos mecânicos e desagregação durante o ato de de-gustação podem ser baseadas em três tipos de teste: cisalhamento, compressão ou tração. Cada um desses métodos de análise possui suas vantagens, desvantagens e limitações e, nenhum deles, isoladamente, fornece informações completas (RAMOS e GOMIDE, 2017).

Dentre os testes realizados nos alimentos pelo texturômetro, tem-se os testes funda-mentais, os quais determinam uma ou mais constantes físicas, como módulo de Young (E) e módulo de cisalhamento (G); testes empíricos, como penetração, cisalhamento, compressão e tração; e testes imitativos, desenvolvidos na tentativa de se imitarem as condições a que o alimento é submetido na prática, ou seja, durante a degustação/mastigação, por exemplo o Teste de Perfil de Textura (TPA – Texture Profile Analysis). O teste de TPA, originalmente conduzido em um instrumento denominado General Food Texturometer, foi desenvolvido

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por Szczesniak e colaboradores no início da década de 1960, sendo constituído de uma abordagem completamente distinta da análise convencional que considerava um único pa-râmetro na curva de deformação. O método de TPA consiste em dois ciclos completos de compressão e descompressão de uma pequena amostra do alimento, de forma a simular a ação dos dentes durante o processo de mastigação. Uma vez que o método é usado na ten-tativa de refletir a percepção humana da textura, o primeiro e segundo ciclos de compressão são geralmente referidos como “primeira mordida” e “segunda mordida”, respectivamente, gerando gráficos relacionando força versus tempo (RAMOS e GOMIDE, 2017).

Da curva de deformação, conforme descrito em RAMOS e GOMIDE (2017), quatro parâmetros de textura primários são diretamente obtidos, além de outros três parâmetros de textura secundários, direta ou indiretamente associados à coesividade, conforme Tabela 1:

Tabela 1. Parâmetros e definições da Análise do Perfil de Textura (TPA).

Parâmetro Definição

Dureza - hardness (kgf) Firmeza, definida como a força necessária para_{se alcançar uma determinada deformação.}

Coesividade - cohesiveness Medida da força das ligações internas queconstituem o alimento (como o alimento responde à segunda com-pressão).

Adesividade – adhesiveness (kgf.mm) Energia necessária para superar as forças atrativas entre a superfície do alimento e outras superfícies (no caso, a sonda).

Elasticidade – springiness Grau em que o material deformado consegue_{retornar à sua condição inicial (forma e tamanho).} Fraturabilidade – fracturability (kgf) Força necessária para iniciar a fratura do alimento.

Gomosidade – gummines (kgf) Energia requerida para desintegrar um alimento semisólido a um _{estado pronto para ser engolido.} Mastigabilidade – chewiness (kgf.mm) Energia requerida para desintegrar um alimento sólido a um estado _{pronto para ser engolido.}

Fonte: RAMOS e GOMIDE (2017).

Além da Análise do Perfil de Textura (TPA), outros testes podem ser executados em pescados, como a análise de compressão a fim de se determinar apenas a firmeza, além da análise de cisalhamento, obtendo-se a resistência da amostra ao corte. A avaliação da textura instrumental é um método muito importante para mensurar a qualidade e o frescor da carne de peixe, especialmente por estar relacionada a um atributo de qualidade para a palatabilidade (VITAL et al., 2018). Por esse motivo, as alterações de textura podem ser percebidas sensorialmente (SANTOS, 2008).

A textura de peixes é uma propriedade complexa, que depende de uma série de fatores, tais como: conteúdos de gordura e colágeno, pH, atividade microbiana e processos autolíti-cos, que conduzem a degradação das proteínas miofibrilares e consequente amolecimento muscular (LI et al., 2012). Alguns pesquisadores associam a queda do pH muscular com

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textura firme e uma significativa perda de água no descongelamento, enquanto que outros sugerem a participação de várias enzimas na deterioração da textura da carne de peixe du-rante a estocagem (DE VIDO, PAREDI e CRUPKIN, 2001; SATO et al., 1991). De maneira geral, os consumidores tendem a avaliar negativamente os filés que apresentem textura suave (ASHTON, MICHIE e JOHNSTON, 2010).

Avaliação de cor

O primeiro contato do consumidor com um produto, geralmente, é com a apresentação visual, no qual se destacam cor e aparência. Todo produto possui uma aparência e uma cor esperadas que são associadas às reações pessoais de aceitação, indiferença ou rejei-ção. Se ele espera que o produto tenha determinada cor, por exemplo, poderá ocorrer extrema relutância caso exista diferença de tonalidade ou intensidade dessa (FERREIRA et al., 2000).

Aliando-se ao aspecto sensorial frente ao consumidor, a cor pode se tornar um impor-tante atributo de qualidade no que se refere à avaliação do frescor dos alimentos, uma vez que a deterioração, na maioria das vezes, gera mudanças na coloração do produto. Se a cor de um alimento não for atraente, dificilmente o sabor e a textura serão considerados (RAMOS e GOMIDE, 2017). Essa observação é bem recorrente na avaliação de peixes, visto que os consumidores frequentemente avaliam os produtos oriundos da pesca baseados em sua coloração e inferem sobre seu frescor, principalmente, porque as modificações micro-biológicas e autolíticas promovem alterações na cor da carne de peixes. A cor do pescado também pode ser alterada em função das condições de cultivo, no caso de animais oriundos de aquicultura (SKJERVOLD et AL., 2001; HALLIER et al., 2007).

De modo geral, os sistemas de cores tentam criar um modelo matemático abstrato capaz de representar numericamente as cores. O modelo define o espaço de cores (ou sólido de cores), que se refere simplesmente a um sistema organizado de cores, como um mapa, capaz de descrever toda a gama de cores que o modelo pode gerar a partir de seus componentes; a representação de cor pode, então, ser feita à custa da combinação desses componentes (RAMOS e GOMIDE, 2017).

Na área da indústria e pesquisa com alimentos, o sistema CIELAB (ou CIEL*a*b*), ori-ginado a partir do sistema Hunter Lab, se tornou o mais utilizado e adquiriu destaque. Esse sistema possui escala uniforme, em que os parâmetros e suas definições são expressos na tabela abaixo (Tabela 2).

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Tabela 2. Parâmetros e definições da análise colorimétrica do sistema CIEL*a*b* com cálculo de C* e h*.

Parâmetro Definição

L Luminosidade, variando entre 0 (preto puro) e 100 (branco puro). A Índice de vermelho, variando entre -60 (verde) e +60 (vermelho). B Índice de amarelo, variando entre -60 (azul) e +60 (amarelo). C Índice de saturação (intensidade) variando entre 0 e 60.

H Tonalidade, angulação no diagrama de cromaticidade, variando entre 0 e 360º.

Fonte: RAMOS e GOMIDE (2017).

Parâmetros como C* (Chroma) e h* (ângulo hue) são bastante utilizados no enten-dimento das cores nos alimentos, e podem ser calculados a partir dos valores de a* e b*, conforme seguintes equações: arctan .

Propriedades elétricas

A medição consiste em avaliar as mudanças na condutividade elétrica da pele e do tecido do pescado à medida que transcorre o tempo após a morte (INPA, 2013). Durante o armazenamento, as proteínas tendem a diminuir sua capacidade de retenção de água (CRA), portanto, existe maior quantidade de água livre no espaço tissular, atuando como meio transmissor de eletricidade (INPA, 2013).

As determinações se realizam diretamente no tecido com equipamento de corrente alternada que conta com uma ponte Wheatstone e eletrodos. É medida a resistência mus-cular ao passar a corrente, sendo a leitura expressa em ohms por cm. Em equipamentos comerciais, a escala de leitura varia entre 0 e 16, correspondendo o valor superior ao má-ximo de frescor (INPA, 2013). Têm sido realizados numerosos trabalhos de correlação dos valores da resistência elétrica com outros índices de frescor em bacalhau e arenque, sendo permitida a medição no pescado inteiro ou em filés. Porém, a variabilidade de valores pode ser influenciada por fatores como teor de gordura, período até o pescado ser resfriado, su-perfície de medição, congelamento, manipulação e forma de abate (INPA, 2013).

Índice de Rigor Mortis

O índice de rigor mortis é uma das maneiras de se avaliar o nível de frescor do pescado, que é caracterizado pela perda da plasticidade e extensibilidade dos músculos como resul-tado da alteração dos ciclos de contração e relaxamento muscular (CONTRERAS, 1994). Esse fenômeno inicia-se algum tempo após a morte, sendo a primeira transformação que ocorre no peixe, seguido pela ação autolítica das enzimas musculares e a ação dos micro--organismos, culminando com a total deterioração da qualidade do pescado. Neste sentido,

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observa-se que o retardo do início do rigor mortis é benéfico para a manutenção do frescor do pescado (FONTENELE, 2013).

Para a avaliação do índice de rigor mortis, o peixe inteiro deve ser colocado sobre uma mesa, num plano horizontal, de forma que a metade do corpo (região caudal) fique suspensa, como mostra a Figura 4.

Figura 4. Ilustração da metodologia proposta para determinação do índice de rigor mortis em pescados.

Fonte: BATISTA et al. (2004).

Em intervalos de tempos selecionados, define-se o índice de rigor mortis (IR) de acor-do com a seguinte equação: IR = [D₀ − D_t⁄D₀] x 100. Em que: D₀ = distância da base da nadadeira caudal à linha horizontal da mesa no início do pré-rigor mortis e Dt = distância da

base da nadadeira caudal à linha horizontal da mesa durante a estocagem. Antes de iniciar o rigor mortis, D₀ = D_t, então, IR = 0%. No início do rigor mortis, a parte caudal levanta e, consequentemente, há uma redução gradual da distancia D_t. Quando atinge o máximo, D_t = 0 e, com isso, IR = 100% (GONÇALVES, 2011).

Métodos físico-químicos Potencial hidrogeniônico (pH)

O potencial hidrogeniônico (pH) de um alimento é uma medida quantitativa dos íons H+_{que estão dissociados no alimento. Em peixes, essa característica físico-química}

indica se o músculo se encontra no estado alcalino (acima de 7), neutro (igual a 7) ou ácido (pH menor que 7). O pH é utilizado para avaliar a qualidade de vários alimentos, dentre eles, o frescor de pescado. A concentração dos íons de hidrogênio se altera quando ocorre a decomposição do pescado por ação hidrolítica, oxidativa ou fermentativa, sendo que quanto maior o pH, mais avançadas estão as reações de deterioração (GONÇALVES, 2017).

O conhecimento sobre o pH da carne de peixe pode fornecer informações valiosas sobre sua condição. As medições são realizadas com um peagâmetro, inserindo os eletrodos

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diretamente na polpa ou em uma suspensão de polpa de peixe em água destilada (FAO, 1995). Em pescados, os métodos eletrônicos são os mais utilizados para determinar o pH. O pH em peixes vivos é em torno de 7. Algumas horas após a morte do peixe acontece o rigor mortis, no qual ocorrem várias reações bioquímicas que utilizam o glicogênio muscular como fonte de energia e produzem ácido lático, resultando na redução do pH para valores em torno de 6,0 – 6,1. Maiores reservas de glicogênio resultam em uma maior acidificação do músculo e, consequentemente, na maior proteção dele contra à contaminação por mi-crorganismos. Desta forma, se há movimentação excessiva dos peixes na captura, ocor-rerá a redução das reservas de glicogênio muscular, tornando o produto mais susceptível ao ataque microbiano e à ação enzimática (ŠIMAT et al., 2012; RABELO, 1998; KYRANA, LOUGOVOIS e VALSAMIS, 1997).

Durante o armazenamento, transformações bioquímicas ocorrem, produzindo com-postos alcalinos provenientes da degradação do pescado (ŠIMAT et al., 2012). O pH de peixes tende a aumentar a partir do sétimo dia após o abate, podendo chegar a 6,6 em 24 dias. A mudança da acidez para a alcalinidade na carne de peixe ocorre devido a produção de metabólitos bacterianos alcalinos (KYRANA, LOUGOVOIS e VALSAMIS, 1997). Do ponto de vista sensorial, peixes que apresentam valores de pH mais próximos à neutralidade, como ocorre a partir do sétimo dia de congelamento, são mais aceitos pelos consumidores. No en-tanto, microbiologicamente, há uma redução da vida útil do produto (KAYIM e CAN, 2010).

Atividade de água (Aw)

A mensuração de atividade de água nos alimentos é utilizada para controle de qualidade e segurança alimentar, sendo um dos critérios avaliados no programa Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). A análise de atividade de água é realizada com um medidor de atividade de água.

Os peixes frescos são muito susceptíveis ao desenvolvimento de bactérias devido à alta atividade de água, enquanto que os peixes salgados e secos são mais propensos a deterioração por fungos (JAY, LOESSNER e GOLDEN, 2005). O correto monitoramento da Aw em pescado é muito importante, pois afeta sua qualidade sensorial, sua estabilidade microbiológica, as características físicas e o prazo de validade (ABBAS et al., 2009). A par-tir da regulação da atividade de água, podem-se controlar as taxas de reações químicas e enzimáticas, bem como o crescimento de bactérias, fungos filamentosos e leveduriformes. Além disso, é extremamente útil na definição de condições de estocagem ideais, a fim de garantir maior vida útil ao produto (BJÖRKLUND e WADSÖ, 2011).

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Qualidade microbiológica de peixes

A microbiota do peixe está intimamente relacionada com a contaminação oriunda do seu ambiente de origem. Peixes provenientes de águas temperadas apresentam micror-ganismos psicrotróficos, aeróbios ou anaeróbios facultativos Gram-negativos, e, comu-mente, Pseudomonas, Acinetobacter, Shewanella putrefaciens, Flavobacterium, Vibrio, Photobacterium phosphoreum e Aeromonas. Em peixes de águas salgadas podem ser en-contrados Vibrio, Photobacterium e Shewanella putrefaciens, já em peixes de águas doces são normalmente encontradas Aeromonas spp. Em ambientes que apresentam temperaturas mais elevadas, entre 15 e 30 °C, pode-se encontrar espécies de bactérias mesofílicas per-tencentes às famílias Vibrionaceae e Enterobacteriaceae, e microrganismos Gram-positivos deterioradores (GHALY et al., 2010; HUSS, 1997).

As bactérias psicrotróficas participam diretamente do processo de deterioração em pescado refrigerado, pelo fato de se multiplicarem bem nessas condições (FRANCO e LANDGRAF, 2008). As bactérias deste grupo que são mais intimamente relacionadas com peixes e derivados são Pseudomonas spp., Alteromonas spp., Shewanella putrefasciens, Acinetobacter spp., Moraxella spp. (FORSYTHE, 2013). Embora a legislação brasileira não exija um limite para microrganismos psicrotróficos, elevadas contagens desses micror-ganismos contribuem para a redução da vida útil dos produtos, em função das atividades proteolíticas e lipolíticas, mesmo em condições refrigeradas (LANZARIN et al., 2011).

A legislação internacional da Food and Drug Administration - FDA (2011) preconiza que o peixe fresco deve ser refrigerado em temperaturas inferiores à 4,4 °C, condições inferiores às requeridas para a multiplicação da maioria de bactérias patogênicas. Por outro lado, a Food and Agriculture Organization of the United Nations – FAO (2009) ressalta que a tem-peratura deve ser mantida a 0 °C e deve ser frequentemente monitorada. Para o pescado refrigerado, comissões internacionais como a International Commission on Microbiological Specifications Foods (ICMSF, 1986), estabelecem como padrão microbiológico a contagem de microrganismos mesófilos máxima de 107_UFC.g–1_.

Diversas bactérias patogênicas, como Clostridium, Aeromonas e Vibrio estão presentes naturalmente em ambientes terrestres e, em particular, em ambientes aquáticos. A conta-minação por bactérias patogênicas como Salmonella, Escherichia coli e Shigella ocorre, comumente, por meio do contato com a matéria fecal ou com água poluída. Essa contami-nação pode ocorrer antes ou após a captura do peixe, enquanto que o manuseio inadequado durante a preparação do produto pode resultar na contaminação por Staphylococcus aureus (ONYANGO et al., 2009). Huss (1997) divide as bactérias patogênicas presentes no pescado em dois subgrupos, sendo o Grupo 1 aquelas que são frequentemente encontradas em am-bientes aquáticos, como Clostridium botulinum, Vibrio sp., V. cholerae, V. parahaemolyticus,

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Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides e Listeria monocytogenes; e o Grupo 2, aquelas oriundas da contaminação pelo homem ou por animais, como Salmonella sp., Shigella, E. coli e Staphylococcus aureus.

Outro fator que favorece o desenvolvimento de microrganismos é a fração de azoto não proteico, que são aminoácidos livres ou nucleotídeos, usados como substratos por alguns microrganismos. O óxido de trimetilamina (OTMA) é um dos constituintes dessa fração, o qual pode ser reduzido a trimetilamina (TMA) pela ação de enzimas endógenas ou por ação de determinadas bactérias, como Shewanella putrefaciens, Photobacterium phosphoreum, entre outras, em condições de refrigeração e anaerobiose (GHALY et al., 2010).

O frescor microbiológico é um importante critério de qualidade em peixe, já que o desenvolvimento microbiano é um dos principais fatores que levam à deterioração deste produto alimentar (GONÇALVES, 2011). Neste sentido, a legislação brasileira vigente que estabelece os padrões microbiológicos para alimentos, a Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019, regulamenta que pescados (peixes, crustáceos, moluscos) e miúdos (ovas, moela, bexiga natatória) crus, temperados ou não, frescos, resfriados ou congelados devem atender aos parâmetros apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Parâmetros microbiológicos para pescados (peixes, crustáceos, moluscos) e miúdos (ovas, moela, bexiga

natatória) crus, temperados ou não, frescos, resfriados ou congelados.

Microrganismo n* c** m M

Salmonella/25 g 5 0 Ausente

-Staphylococcus coagulase positiva/g 5 2 102 ₁₀3

Escherichia coli/g, para produtos não consumidos crus 5 2 50 5x102

Escherichia coli/g, para produtos consumidos crus 5 2 10 102

*n: número de unidades retiradas de um lote que serão analisadas independentemente; **c: número máximo aceitável de unidades do lote que estejam acima do limite mínimo (m) e abaixo do limite máximo tolerado (M).

Fonte: BRASIL (2019).

Neste contexto, é de extrema importância o monitoramento da qualidade microbioló-gica do pescado por meio da realização de análises frequentes para verificar a presença de microrganismos deterioradores e patogênicos em peixes, com o intuito de promover a segurança e a qualidade dos alimentos, dada a séria implicação na saúde pública.

Métodos microbiológicos

Salmonella

A análise de Salmonella pode ser realizada conforme o método da International Organization for Satandardization (ISO) 6579:2007(E) para alimentos, rações e diversas amostras do ambiente de fabricação.

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O primeiro passo para análise de Salmonella é o pré-enriquecimento, que consiste em homogeneizar 25 g da amostra em 225 mL de água peptonada (0,1% m/v) tamponada e posteriormente, encuba-la em um frasco de vidro a 37 ºC por cerca de 18 horas. Em seguida, realiza-se o enriquecimento seletivo, que consiste em agitar cuidadosamente o frasco que sofreu a fase de pré-enriquecimento (0,1% m/v) e transferir 0,1 mL para tubos contendo 10 mL de Caldo Rappaport- Vassilidis Soja (RVS) e 1 mL para tubos contendo 10 mL de Caldo Tetrationato Muller Kauffmann Novobiocina (MKTTn). Posteriormente, deve-se incubar os tubos com caldo RVS a 41,5 ºC/24h e para o MKTTn, a 37 ºC/24h.

Após a incubação, realiza-se o plaqueamento diferencial de cada cultura que permane-ceu em RVS. Deve-se realizar uma estria de esgotamento em Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), e uma alçada em meio opcional. Repetir também este mesmo procedimento em caldo MKTTn. A placas devem ser incubadas invertidas a 37 ºC por 24 horas. A seleção de colônias típicas e purificação das culturas consiste em selecionar as colônias com caracte-rísticas definidas e fazer estrias de esgotamento em placas contendo Ágar Nutriente (NA) para ocorrer a purificação. As placas são incubadas por 24 horas a 37 ºC. As colônias bem características são selecionadas para realização dos testes de confirmação de Salmonella.

Testes de confirmação de Salmonella

• Teste de crescimento em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)

Inocula-se a cultura em tubos inclinados de TSI, incubar por 24 horas e manter condi-ções aeróbicas com as tampas afrouxadas. Verificar a produção de gás e se há presença de Salmonella em rampa de cor alcalina (vermelha) e com produção de gás.

• Teste de uréase

Inocula-se a cultura em tubo Ágar Uréia de Christensen inclinado. Incubar os tubos, observar a mudança de cor de pêssego para o rosa-escuro, no caso de teste positivo para Salmonella. Se o Ágar permanecer sem alteração, o resultado é negativo para Salmonella.

• Teste de lisina Descarboxilase

Inocula-se a cultura em tubo de Caldo Descarboxilase, incubar à 37 ºC por 24 horas e observar a alteração de cor para roxo azulado, no caso de teste positivo, ou cor amarela, em caso de teste negativo.

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Inocula-se a cultura em tubos com 3 mL de Caldo VM-VP e incubar a 37 ºC por 24 horas. Após a incubação, adicionar 2 gotas de solução aquosa 0,5% de creatina monoidrato, 3 gotas de solução α-naftol 5% e 2 gotas de solução KOH 40%. Agitar o tubo. A cor rosa escura indica teste positivo, e o não desenvolvimento da cor, teste negativo.

• Teste Indol

Inocula-se a cultura em tubo com 5 mL de Caldo Triptona 1% e incuba-lo à 37 ºC por 24 horas. Adicionar 1mL do Reagente de Kovacs. Se verificar a presença de um anel ver-melho-violeta, o teste é positivo e se o anel for amarelado, teste negativo.

• Teste β-galactosidase

Suspender uma alçada da cultura, em tubo com 0,25 mL de solução salina à 0,85% estéril. Adicionar uma gota de tolueno, agitar e incubar em banho a 37 ºC por 5 min. Inserir no tubo 0,25 mL reagente ONPG de β-Galactosidase, agitar e incubar em banho à 37 ºC por 24 horas. A cor amarela no líquido após o intervalo de 20 minutos indica teste positivo.

• Sorológica

Os últimos testes incluem a confirmação sorológica, a detecção dos antígenos somá-ticos (poli O), a detecção do antígeno VI e a detecção dos antígenos flagelares (poliH).

Staphylococcus coagulase positiva

O método utilizado é o de número mais provável (NMP). É recomendado para alimentos com baixa contagem de Staphylococcus e alta quantidade de microrganismos competidores.

A primeira etapa consiste na pesagem de 25 g da amostra e homogeneização desta em 225 mL de água peptonada, sendo considerada a diluição 10–1_{. Desta, retira-se 1 mL e}

transfere-se para uma sequência de tubos contendo 9 mL de água peptonada. Em seguida, alíquotas de 1 mL são retiradas dos tubos das diluições e transferida em uma série de 3 tubos com 10 mL de Caldo Tripticase de Soja (TSB) em cada e incubados a 35 ºC por 48 horas.Nos tubos em que houver o crescimento, deve-se estriar uma alçada da cultura em placas de Ágar Bird-Parker (BP) por esgotamento, incubar a 37 ºC por 48 horas e observar se há colônias características. Caso não houver colônias típicas, considerar os tubos como não confirmado. Quando confirmadas, retirar uma alçada da cultura e passar para tubos contendo Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) e incubar a 37 ºC por 18 a 24 horas. Retirar 0,2 mL da cultura e inserir em tubos contendo 0,5 mL de Coagulase Plasma EDTA e deter-mina-lo através de técnicas de contagem de microrganismos pelo NMP (SILVA et al., 2017).

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Coliformes a 45ºC

Inicialmente, prepara-se as amostras e a diluição seriada, em que 25 g da amostra são homogeneizados em 225 mL de água peptonada, seguida das diluições seriadas, selecio-nando 3 diluições e inoculando 1 mL da diluição em cada tubo contendo 10 mL de Caldo Lauril Sultato Triptose (LST). Incubam-se todos à 35 ºC por 24 a 48 horas, e observa-se o crescimento e produção de gás. Em caso de tubos positivos, passar para as outras sequên-cias. Em caso negativo, reincubar por 48 horas. Para a contagem de coliformes totais a partir dos tubos contendo LST com produção de gás, é transferido uma alçada da cultura para tubos contendo Caldo Verde Brilhante (VB). Incuba-se à 35 ºC por 24 horas e observa-se o crescimento e a produção de gás. Quando for negativo, reincubar por mais 48 horas. Deve-se anotar os tubos positivos e confirmativos sobre a preDeve-sença de coliformes totais. Usando as tabelas de NMP, deve-se determinar o número mais provável em g ou mL da amostra (SILVA et al., 2017).

Contagem de coliformes termotolerantes

Verificando os tubos com presença de gás em LST, deve-se transferir uma alçada da cultura, para tubos contendo Caldo E. coli (EC), e incubá-los por 24 horas em banho-maria a 44,5 ºC para alimentos como água, crustáceos e moluscos, e observar a produção de gás. Determinar o número mais provável (NMP) em g ou mL, usando as tabelas de NMP.

Contagem de Escherichia coli

A partir de cada tubo com caldo EC, com crescimento e produção de gás, estriar uma alçada da cultura e transferir para Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (EMB). Incubar a 35 ºC por 24 horas e verificar a forma das colônias com característica verde metálica brilhante. Havendo colônias típicas, transferir uma alçada da cultura para Ágar Padrão para Contagem (PCA), com tubo inclinado e incubar à 35 ºC por 24 horas. Após, realizar a coloração de Gram e os testes de confirmação.

Testes de confirmação de Escherichia coli

• Teste de citrato (caldo citrato de koser)

Inocular uma alçada dentro do tubo contendo caldo e incubar à 35 ºC por 96 ho-ras. Se há crescimento, teste positivo. Se não, teste negativo. A E. coli é citrato negativa.

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Inocular uma alçada da cultura e incubar a 35 ºC por 24 horas. Adicionar 5 gotas do reagente de Kovacs e agitar devagar. Se houver a observação do anel vermelho-violeta na superfície do meio, o teste é positivo. Se o anel apresentar coloração amarelada, o teste é negativo. E. coli pode ser tanto positiva quanto negativa quando submetidas ao teste de indol.

• Teste de vermelho de metila e Voges-Proskauer (caldo VM-VP)

Consiste em inocular uma alçada da cultura e incubar à 35 ºC por 48 horas. Transferir assepticamente 1 mL da cultura para tubo de ensaio. Adicionar 0,6 mL de solução de α-naftol 5% e agitar bem. Em seguida, adicionar 0,2 mL de solução de KOH 40%. Deve-se agitar os tubos e adicionar uma pequena quantidade de cristais de creatina para que a reação se acelere. Observar por 1 hora. É característico do teste positivo o desenvolvimento de cor vermelha ou rósea. Já a coloração amarelada ou esverdeada indica teste negativo. As cepas de E. coli são VP negativas.

Só pode-se considerar E. coli quando todas as culturas apresentarem as características a seguir: serem bastonetes Gram-negativas, sendo indol positivo ou negativo, VM positivo e citrato negativo.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A carne de pescado possui uma constituição química que lhe confere riqueza nutricional, porém com alto potencial de deterioração, aliado à iminente contaminação após a captura, manipulação inadequada do produto em temperaturas altas de estocagem e condições pre-cárias de higiene. Dessa forma, os benefícios nutricionais deste grupo alimentar só podem ser aproveitados quando os fatores segurança e qualidade forem garantidos.

A qualidade envolve a soma dos atributos físicos, químicos, sensoriais e microbiológi-cos. Para mensurar a qualidade, a indústria de pescados deve dispor de conhecimentos das reações e agentes deterioradores da matéria-prima, e assim, estudar métodos e barreiras que diminuam a perecibilidade da carne de peixe e prolongue a sua vida útil. Quanto aos métodos de avaliação do frescor dos peixes, os métodos sensoriais (qualitativos) devem ser utilizados juntos com os métodos quantitativos para detectar mudanças no produto que possam causar rejeição sensorial pelo consumidor.

A presente revisão reafirma que, por meio do consumo de pescado, diversos micror-ganismos apresentam-se como um risco potencial para a saúde do consumidor. Dessa forma, a manutenção e o controle de qualidade do pescado são aspectos importantes, pois é desse conjunto que depende a qualidade do produto final e a minimização de qualquer tipo de contaminação que poderia ocorrer no decorrer do processamento.

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168 AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o suporte das instituições: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Universidade Federal de Lavras (UFLA, Lavras, Minas Gerais, Brasil).

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