Em alternativa a virgem pode usar-se o termo inglês correspondente, naive.
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Imunologia
9. Interacção entre as células apresentadoras de antigénios e os linfócitos T
Resumo da aula teórica: 11 de Março de 2008A interacção entre as células apresentadoras de antigénios e os linfócitos é um evento muito importante para a activação da resposta imune, fenómeno caracterizado por uma reorganização molecular que torna possível a comunicação destas células.
Temas a abordar:
Fases físicas da interacção entre APC (células apresentadoras de antigénios) e linfócitos T Estrutura do TCR
Sinalização pelo TCR
Estrutura molecular da sinapse imune (SI) Formação da SI e respostas das células T
Porque é que as APC e os linfócitos T precisam de interagir? Sempre que há necessidade de desencadear uma reacção imunitária a um antigénio. A APC capta o antigénio (em muitos casos a APC é uma célula dendrítica), migra e complexa-o com uma molécula do MHC para expressar à superfície o chamado complexo péptido-MHC. É apenas no todo de um complexo péptido-MHC que o linfócito T consegue reconhecer o antigénio, sendo que apenas o péptido não consegue estimular o desencadear de um sinal. O reconhecimento do complexo péptido-MHC pelo TCR resulta numa sinalização intracelular no linfócito T iniciando a proliferação e diferenciação. Se o linfócito T for virgem (células que acabaram de abandonar o timo e que ainda não estiveram em contacto com um antigénio), necessita de ser instruído, o que acontece com o contacto com a APC - é o chamado
priming, que requer células dendríticas. O
priming resulta em proliferação e diferenciação, sendo o resultado final uma
população de células efectoras e de células memórias. Este é um evento raro pois linfócitos T específicos para um dado péptido são extremamente raros – portanto, o priming das células T é um evento raro. O objectivo do priming é obter uma população clonal de linfócitos T, que é toda igual entre si, em que todas as células expressam o mesmo TCR e que podem ter quer uma função efectora quer uma função de memória.
Como é que ocorre a interacção entre APC e linfócitos T? Há um primeiro evento, que é a aquisição de contacto havendo depois 3 diferentes possibilidades: as células virgens formam lenta e dinamicamente um contacto com as APC pois necessitam de procurar o complexo péptido-MHC correcto, que conseguem reconhecer, evento este que ocorre com uma velocidade de menos de 1µm/min. Uma vez que a célula virgem se torna numa célula efectora, o contacto precisa de ser mais estável. Como isto acontece morfologicamente ainda não
é conhecido mas sabe-se que o contacto entre uma APC e uma célula efectora é mais estável, com uma velocidade de 1-2µm/min. Em ambos os casos, uma vez que o TCR e o complexo péptido-MHC correspondente tenham contactado e tenha havido transducção de sinal, o movimento torna-se muito mais rápido – os linfócitos T movem-se muito rapidamente à superfície da APC, a uma velocidade de aproximadamente 10 µm/min. A velocidade do movimento deve-se ao facto de que o resultado da activação é a proliferação – o linfócito T não se pode ligar completamente à APC devendo haver espaço para as células em proliferação. Uma vez que ocorreu a proliferação, linfócito T e ACP desassociam-se e ocorre a migração da célula T, quer para um órgão linfóide secundário, se tiver função memória, ou para o tecido alvo, se tiver uma função efectora.
Quais são os requisitos moleculares para este contacto entre a APC e o linfócito T? Quais são as moléculas que entram em jogo tornando possível esta interacção? Já foi mencionado: TCR, que reconhece o complexo péptido-MHC.
O TCR – T cell receptor – é um heterodímero expresso à superfície da maioria dos linfócitos T no sangue periférico. A forma mais
expressa deste heterodímero contem uma forma α e uma β. Ambas as cadeias estão divididas numa porção constante e numa porção variável. A domínio que se liga ao antigénio, as sequências que são importantes para o reconhecimento do péptido estão contidas na região V
de ambas as cadeias α e β. Já foi definida a estrutura cristalina de alguns destes complexos TCR/péptido-MHC. Como se pode ver na figura um péptido
(péptido HTLV-1, de um vírus) com uma molécula HLA-A (tipo de MHC) interage com este TCR específico. Este TCR que contem estas sequências V e J tem a capacidade para reconhecer de um modo muito específico este péptido e não outros. Como é que este reconhecimento específico se mantém? Existem regiões nos domínios Vα e Vβ, designadas CDR – complement determining region – que são particularmente importantes para o reconhecimento do péptido. É nestas sequências que se encontra a maior taxa de mutação no TCR. Portanto, o TCR estabelece um contacto com o complexo péptido-MHC. Este contacto resulta numa transducção de sinal no linfócito T. Mas esta sinalização não vai ocorrer se apenas o heterodímero TCRαβ estiver na superfície da células, aliás, este heterodímero não conseguirá apenas por si próprio atingir a superfície da célula. Na superfície dos linfócitos T, o
heterodímero TCRαβ está presente num complexo que contém CD3. O CD3 é um multímero, formado por diferentes cadeias: duas ε, duas ζ, uma δ e uma γ. É o CD3 que torna possível a transducção de sinal em consequência do reconhecimento do complexo péptido-MHC pelo TCR – o heterodímero TCRαβ não tem capacidade de sinalização, a sinalização ocorre pela estimulação do complexo CD3. No complexo CD3 existem diferentes cadeias, duas das quais são particularmente importantes: γ e ζ. A cadeia γ estabiliza o complexo TCRαβ para que este seja expresso à superfície do linfócito T (observação de células com uma mutação na cadeia γ do CD3 que impossibilitava a produção desta proteína revelou que estas células eram incapazes de expressar à sua superfície o TCRαβ – nesta célula, todos os restantes componentes do complexo TCRαβ CD3 eram degradados no seu interior; esta situação pode ser corrigida transfectando a célula com um plasmídeo que codifique uma cadeia γ funcional, possibilitando a expressão de um complexo TCRαβ-CD3 à superfície da célula). A cadeia ζ, uma vez que se junta ao complexo, inicia a transducção de sinal pois esta cadeia contém sequências designadas ITAMs – immunereceptor tyrosine based activation motives. Estas sequências são muito conservadas, sendo constituídas por 2 de resíduos de tirosina separados por 9-12 aminoácidos (Y – tirosina; L – leucina; V – valina; X – qualquer
aminoácido). Os ITAMs existem também nos outros componentes do complexo CD3. Adicionalmente, os ITAMs não existem apenas nas células T, mas também no BCR e no receptor das Ig.
Isto não é suficiente para haver transducção de sinal – é necessária uma molécula adaptadora que modifique estes resíduos de tirosina. A molécula adaptadora é recrutada graças a um correceptor. De facto, a interacção entre TCR e complexo péptido-MHC induz também a ligação de um correceptor CD4 ou CD8 na superfície do linfócito T. Os correceptores ligam-se à parte mais externa ma molécula do MHC, à cadeia principal. Uma vez que o correceptor foi recrutado para o complexo, o correceptor induz o recrutamento de uma cinase, a Lck. Esta molécula é um adaptador de sinal capaz de fosforilar os resíduos de tirosina presentes nas sequências ITAM. Os resíduos de tirosina fosforilados, especialmente aqueles da cadeia ζ, actuam como local de encaixa para o ZAP-70, outra cinase, que, por sua vez, fosforila as proteínas alvo.
O que é importante reter é que a fosforilação dos resíduos de tirosina é um dos primeiros eventos no processo de activação dos linfócitos T – é um dos primeiros eventos identificáveis que dão prova de que os linfócitos T foram activados.
1) Reconhecimento do complexo péptido-MHC pelo TCR
2) Recrutamento do correceptor CD4 ou CD8 3) CD4 ou CD8 liga-se à parte externa do MHC 4) O correceptor recruta a Lck
5) Lck fosforila os resíduos de tirosina nos ITAM da cadeia ζ
6) Os resíduos fosforilados são locais de ligação para ZAP-70, outra cinase, que está na base se uma cascata que, em última instância, vai regular a expressão génica para haver proliferação
Quão cedo é que ocorre este evento? É possível monitorizar o aparecimento de fosfotirosina usando um anticorpo contra tirosina fosforilada nas sequências ITAM e marcando o anticorpo com um fluorocromo verde, para seguir a coloração num conjugado APC-linfócito T ao longo do tempo, que indica, portanto, a presença de fosfotirosina. Na figura podemos observar que existe fosfotirosina logo após 2 minutos da conjugação, e dura cerca de 30 minutos. Se examinarmos o conjugado após
60 minutos, as células continuam associadas mas já não existe fosfotirosina – a presença desta dura cerca de 30 minutos Fazendo o mesmo tipo de observação com o TCR (marcação vermelha), verificamos que esta modifica-se em pararelo com o padrão da fosfotirosina. Primeiro, o TCR apresenta-se distribuído ao longo da interface entre APC e célula T, sendo que depois se concentra no mesmo local onde se encontrava a fosfotirosina. Portanto, a fosfotirosina e o TCR estão presentes e visíveis na mesma área, onde há contacto entre a APC e o linfócito T.
Quais são as consequências da fosforilação das proteínas intracelulares, qual é informação transmitida?
Até que ocorra transducção de sinal, o contacto entre APC e linfócito T é dinâmico, instável. A transducção de sinal pelo TCR devido ao reconhecimento do complexo péptido-MHC induz a mudança de conformação de moléculas de adesão, em particular, a integrina LFA-1, que passa de um estado de afinidade baixa para afinidade elevada. No estado de elevada afinidade, a LFA-1 liga-se fortemente à ICAM-1 na superfície da APC e estabiliza o contacto. Portanto, parte do objectivo
da transducção de sinal pelo TCR passa por mudar a conformação das moléculas de integrina para estabilizar o contacto entre APC e linfócito T.
Ocorrem outros eventos: o aumento do Ca2+ intracelular. Este é outro sinal de que a célula T foi activada. Podemos monitorizar este evento injectando as células T com um marcador fluorescente que muda de cor quando ocorre a activação. Na figura podem
ver-se dois linfócitos T que reconheceram o complexo péptido-MHC na mesma APC. Regista-ver-se um aumento no Ca2+ intracelular que dura cerca de uma hora. Após activação, os linfócitos T separam-se e o Ca2+ intracelular deixa de ser monitorizado. Enquanto o aparecimento da fosfotirosina é um dos primeiros eventos, durando cerca de 30 minutos, o aumento do Ca2+ intracelular ocorre mais tarde e dura mais de uma hora. A sinalização por Ca2+ intracelular depende do:
citoesqueleto de actina
reconhecimento do complexo péptido-MHC.
Se a célula for tratada com uma droga que destrua o citoesqueleto ou se se tratar o conjugado com um anticorpo contra o MHC-II que destrua a ligação ao TCR, verifica-se o desaparecimento do fluxo de Ca2+ intracelular.
Durante muito tempo, os imunologistas foram confrontados com um paradoxo: Havia uma situação em que linfócitos T virgens específicos para um antigénio são raros, os complexos péptido-MHC são raros, a interacção entre o TCR e os complexos péptido-MHC é fraca mas, apesar de todos estes factos, há estimulação dos linfócitos T e o sinal que esta estimulação induz é duradoura, dura mais de uma hora. Vejam-se os números na figura.
Então, como é que é possível conciliar estas observações? Uma das teóricas que explica como isto ocorre é a seguinte: O modelo propõe que um único complexo péptido-MHC numa APC pode activar diferentes TCR. Já foi demonstrado que um complexo péptido-MHC pode estimular algumas centenas de TCR numa hora. O mecanismo pode ser comparado a um cinto: O TCR à superfície de um linfócito T percorre a superfície da ACP de forma a contactar com os complexos péptido-MHC. Este sistema é eficiente porque há um fornecimento contínuo de novos TCR, e aqueles que não iniciaram um sinal na primeira vez têm uma nova
oportunidade de contactar com o complexo péptido-MHC. Este processo não é interminável, a transducção de sinal eventualmente pára porque os TCR que iniciaram um sinal são endocitados e destruídos. Este modelo chama-se “serial triggering model” e estabelece que durante a activação de linfócitos T específicos para um antigénio, um único complexo péptido-MHC na superfície de uma APC
pode iniciar a transducção de sinal em múltiplos TCR à superfície do linfócito T. O sistema é auto-limitado e auto-amplificado. Auto-auto-limitado porque os TCR que já iniciaram um sinal são endocitados e degradados no interior do linfócito T e auto-amplificado porque a célula fornece continuamente novos TCR para reconhecer o complexo péptido-MHC, reciclando os receptores que não iniciaram um sinal no primeiro contacto. Este modelo estabelece então como é que pode ocorrer activação dos linfócitos apesar de as condições necessárias para tal ocorrer serem raras.
Depois desta sinalização, as células permanecem em contacto, contacto este designado sinapse imune (SI). A sinapse imune e a sinapse neural têm algumas características em comum, apesar de serem diferentes. A SI têm a aparência de um “donut”. No início do contacto entre o linfócito T e a APC, o complexo TCR e o complexo péptido-MHC são encontrados nos extremos da área de contacto. Na área central estão distribuídas as moléculas de integrina. Desde que ocorra activação, há um movimento progressivo do complexo TCR/péptido-MHC para o interior da estrutura e as moléculas de integrina movem-se para o exterior. O resultado final é, de novo, uma estrutura em forma de “donut”, com um anel duplo, com uma interface em forma de “donut”. Esta estrutura contém o complexo TCR/péptido-MHC no centro e as moléculas de integrinas em torno de toda esta área. Esta estrutura é designada sinapse imune matura. A primeira representação da SI surgiu em 1998, sendo designada “Supramolecular activation cluster – SMAC”. A SMAC está dividida numa SMAC central – c-SMAC, onde se encontra o TCR, e uma SMAC periférica – p-SMAC onde se encontra a molécula de integrina LFA-1. Do lado da APC encontra-se o complexo péptido-MHC e a ICAM-1, opondo-se ao TCR e à LFA-1 do linfócito T. A SI demora cerca de uma hora para se formar. O rearranjo das moléculas dá-se como uma troca, passando o complexo TCR/péptido-MHC da periferia para o centro e o oposto para as integrinas.
Estas não são as únicas moléculas que participam na formação da sinapse imune, por exemplo, o CD2, que participa na sinalização pelos linfócitos T. Quando o linfócito T contacta com uma APC, na presença de antigénio, o CD2, durante a activação, localiza-se no c-SMAC. Outras moléculas localizam-se no p-SMAC da SI, como é o caso do CD45. De novo, na presença do antigénio, quando o linfócito T contacta com a APC, é possível representar a SI com fosfotirosina no c-SMAC e com CD45 na p-SMAC. O CD45 é uma molécula de grandes dimensões e actua como uma fosfatase, isto é, remove os grupos fosfato dos resíduos de tirosina, inibindo a c-SMAC.
Com a transducção de sinal pelo TCR, estes são endocitados e destruídos. Contudo, estão presentes na SI. Como?
A certo ponto da activação formam-se microdomínios onde se localizam os TCR, então estes microdomínios fundem-se para formar a sinapse – há uma sequência temporal dos eventos que o permite, não é um processo estático. A transducção de sinal ocorre antes da formação da SI
De que modo é que a SI é importante para a função dos linfócitos T efectores? Quando se fala da função dos linfócitos T efectores, refere-se à secreção de citoquinas pelos linfócitos T CD4+ ou libertação de grânulos citotóxicos pelos linfócitos T CD8+.
Se se analisar uma SI estabelecida num linfócito T helper, CD4+, que secreta IL-4, conjugado com dois tipos de APC – um que oferece uma elevada concentração de antigénio e outro que oferece uma baixa concentração de antigénio. Apesar de haver contacto do linfócito T com ambas as APC, as citoquinas são polarizadas e secretadas na direcção da APC que oferece o estímulo mais intenso. A polarização das citoquinas espelha a transducção de sinal, o aparecimento de fosfotirosina, indicando que as citoquinas são libertadas na direcção da SI maturada.
Em relação aos linfócitos T CD8+, citotóxicos, a sua função é libertar grânulos que foram poros nas células alvo provocando a sua lise. Contêm o chamado compartimento secretor onde estes grânulos são observados. Nestas células, a SI pode formar-se de um modo ligeiramente diferente do que foi descrito,
porque acomoda estes grânulos secretores no interior da c-SMAC. Portanto, nas células CD8+, a SI é formada por uma p-SMAC que contém o CD45 e uma c-p-SMAC dividida em dois domínios, um que é o compartimento secretor e o outro que é o domínio de transducção de sinal, a c-SMAC propriamente dita. Esta é designada sinapse secretora. O que é particular nas CTL é que, para atingir o seu objectivo não precisam de formar uma sinapse matura. É possível ver na imagem uma APC marcada em vermelho, carregada com duas doses diferentes de antigénio, a interagir com um linfócito T. O linfócito T está marcado com um anticorpo específico para CD2, estando localizado na c-SMAC quando há activação do linfócito. O que se pode ver é que a CTL polariza os seus grânulos, o compartimento secretor na direcção do alvo, da APC, mas esta polarização não é acompanhada por uma redistribuição do CD2 – o CD2 permanece distribuído na superfície do linfócito T, não se concentrando no interior do c-SMAC. Esta é designada sinapse lítica/secretora.
Portanto, o aspecto da SI depende do tipo de estímulo que o linfócito T recebe e do tipo de linfócito T.
Então, o que é a sinapse imune? Não existe uma definição para a SI, o que é possível fazer é descrever a morfologia e combinar esta informação com a função. Só é possível destacar aquilo que a SI não é:
Necessária para iniciar a sinalização pelo TCR (a SI forma-se posteriormente à sinalização pelo TCR – primeiro há o aparecimento de fosfotirosina, dois minutos após o contacto, durando cerca de 30 minutos, e depois o aumento do cálcio intracelular)
Necessária para manter a sinalização – os linfócitos T, mesmo depois de reconhecer uma população de APC, conseguem reconhecer uma nova população de APC com uma dose elevada de antigénio e manter o influxo de cálcio. É então uma estrutura dinâmica, podendo a transducção de sinal continuar com a formação de SI secundárias.
Uma estrutura estática – é uma estrutura diferente nas células CD4+ e CD8+.
Uma estrutura prototípica para uma dada célula – porque qualquer linfócito que interaja com uma APC pode constituir uma SI. Também os linfócitos T NK podem formar a SI
Então, se a SI não é essencial para iniciar a transducção de sinal nem para a função dos linfócitos T efectores, qual é a sua função?
Um estudo recente do passado ano sugere que a SI ajuda no processo de divisão assimétrica dos linfócitos T, no qual se originam células filhas com destinos diferentes a partir de um mesmo progenitor por distribuição desigual de moléculas durante a mitose. Propôs-se que a SI dirige a distribuição desigual de correceptores, integrinas e receptores de citoquinas na direcção do lado do linfócito T que contém a SI. Este é um processo que ocorre durante a proliferação das células T. Portanto, a outra parte da célula que está em proliferação não está ocupada por estas moléculas. O resultado é que um dos lados da
célula, aquele que contém a SI vai dar origem a um linfócito T efector, enquanto o outro vai originar uma célula memória. Assim, a SI assiste na divisão celular assimétrica e facilita a formação de células efectoras e células memória a partir de um único linfócito T durante o priming.i
Outra utilidade possível da SI é a da terminação do sinal, apesar de não ser necessária para o iniciar. Novas técnicas que permitem analisar em maior pormenor a superfície do linfócito T na interface com a APC durante a activação revelam que esta é de facto pontuada pelos TCR. Numa fase inicial da activação há formação de microagregados de complexos TCR/péptido-MHC, mas algum tempo depois, estes microagregados fundem-se numa estrutura que se assemelha à SI. Neste momento, a sinalização é fraca ou não está presente e o TCR está ubiquitinado. Pode-se questionar como é que se regista a formação de uma SI ao fim de 30 minutos e não de 60 – isto deve-se ao facto de
existirem diversas formas de analisar esta interacção e neste caso o linfócito T foi activado com complexos péptido-MHC sintéticos solúveis e não na presença de uma APC.
Podemos então dizer que a SI:
Está molecularmente definida;
Pode ter a função de favorecer a proximidade entre moléculas sinalizadoras e efectoras na interface entre os linfócitos T e as APC;
Pode ter a função de assistir na determinação do destino dos linfócitos T por terminação do sinal ou por favorecer o desenvolvimento de células com diferentes fenótipos.
i
Esta informação foi referida na aula como não estando presente no livro de texto, mas sendo um avanço recente no
