CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
São Luís, MA 2011
DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA
DE CEPAS DE Escherichia coli
ISOLADAS DE
ÁGUA DE CONSUMO HUMANO NO ESTADO
DO MARANHÃO
MÁRCIA ARAÚJO VAN DER BOOR
DETECÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE CEPASDE Escherichia coli ISOLADAS DE ÁGUA DE CONSUMO HUMANO NO ESTADO DO MARANHÃO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientadora: Prof.a Dr.a Patrícia de Maria Silva Figueirêdo
Co-orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto
SÃO LUÍS, MA 2011
B724d BOOR, Márcia Araújo van der
Detecção de fatores de virulência de cepas de Escherichia coli isoladas de água de consumo humano no estado do Maranhão. / Márcia Araújo van der Boor – São Luís: UNICEUMA, 2011.
109p :il.
Dissertação (Mestrado) – Mestrado em Biologia Parasitária. Centro Universitário do Maranhão, 2011.
1. Escherichia coli 2. Virulência. 3. Água I. Drª Patrícia de Maria Silva Figueirêdo II. Título.
Márcia Araújo van der Boor
Detecção de fatores de virulência de cepas de Escherichia coli isoladas de água de consumo humano no estado do Maranhão.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / 2011, considerou a candidata ( ) APROVADA ( ) REPROVADA 1) Examinador _________________________________________ 2) Examinador _________________________________________ 3) Examinador _________________________________________ 4) Presidente (Orientador) _________________________________
SUMÁRIO DEDICATÓRIA ... v AGRADECIMENTOS... vi EPÍGRAFE ... viii RESUMO ... ix ABSTRACT ... x LISTA DE FIGURAS... xi
LISTA DE TABELAS ... xii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS... xiii
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. A PROBLEMATICA DAS DOENÇAS DE VEICULAÇÃO HÍDRICA ... 1
1.1.1. A água como fonte de infecções ... 2
1.1.2. Bactérias indicadoras fecais ... 3
1.1.3. Escherichia coli e a contaminação de água ... 4
1.2. Escherichia coli... 5
1.3. Escherichia coli DIARREIOGÊNICA... 7
1.3.1. Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) ... 7
1.3.2. Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC) ... 9
1.3.3. Escherichia coli Enteroinvasora (EIEC)... 12
1.3.4. Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC/STEC) ... 14
1.3.5. Escherichia coli Enteroagregativa (EAEC) ... 15
1.3.6. Escherichia coli Difusamente Aderente (DAEC) ... 17
2. OBJETIVOS ... 19
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19
3. METODOLOGIA ... 20
3.1. ÁREA DE ESTUDO ... 20
3.2. COLETA DE AMOSTRAS E ISOLAMENTO DE E. coli. ... 20
3.3. DETECÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA (HEMOLISINA, LIPASE, PROTEINASE, ELASTASE , FOSFOLIPASE, GELATINASE)... 21
3.3.1. Hemólise ... 21
3.3.2. Lipase... 22
3.3.3. Proteinase ... 22
3.3.5. Fosfolipase ... 22
3.3.6. Gelatinase... 22
3.3.7. Produção de Biofilme ... 22
3.3.8. Produção de Fímbria Curli... 23
3.3.9. Adesão a células Hep-2... 24
4. RESULTADOS ... 25
4.1. ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS ... 25
4.2. DETECÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA (HEMOLISINA, LIPASE, PROTEINASE, ELASTASE , FOSFOLIPASE, GELATINASE)... 27
4.2.1. Hemólise ... 27
4.2.2. Detecção de atividade enzimática (Lipase, Proteinase, Fosfolipase, Gelatinase, Elastase)... 28
4.2.3. Produção de Biofilme ... 30
4.2.4. Produção de Fímbria Curli... 32
4.2.5. Adesão a células HEp-2 ... 32
5. DISCUSSÃO ... 33
6. CONCLUSÕES ... 41
REFERÊNCIAS ... 42
APÊNDICE I - ARTIGO SUBMETIDO AO: JOURNAL OF WATER AND HEALTH... 51
ANEXO A - ACEITE - V SIMPÓSIO DE MICROBIOLOGIA ... 87
ANEXO B - ACEITE - XIV WORLD WATER CONGRESS... 88
ANEXO C - NORMAS PARA O ARTIGO: JOURNAL OF WATER AND HEALTH ... 89
ANEXO D - COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO... 92
ANEXO E - MAPA MUNDIAL: MORTES ATRIBUIDAS A ÁGUA, SANEAMENTO E HIGIENE (DIARRÉIA) EM CRIANÇAS ABAIXO DE 5 ANOS, 2004... 93
ANEXO F - TAXA DE MORTALIDADE POR DOENÇA DIARRÉICA AGUDA, POR REGIÃO, BRASIL 2000-2007... 94
DEDICATÓRIA
Ao meu amado marido Randolph Alexander van der Boor, pelo companheirismo, amizade, incentivo, paciência. Características essas compartilhados durante toda a nossa convivência e que se mostraram especialmente presentes nessa etapa de tantos desafios na minha vida, com certeza sem seu apoio eu não conseguiria.
Aos nossos grandes tesouros, Victória Catharina e Reinhar Arthur, nossos filhos, que nos momentos difíceis através de sorrisos, abraços e beijos trouxeram refrigério para minha alma e paz para meu coração.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida, pela proteção e cuidado, por todas as oportunidades e bençãos derramadas sobre mim.
Agradeço também a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que a realização desse trabalho fosse possível:
Aos meus pais, João Martins Araújo e Maria das Graças Silva Araújo, pela criação, ensinamentos, incentivo e pela oportunidade que me proporcionaram para que realizasse meus estudos.
Ao meu marido Randolph Alexander van der Boor, meu grande ajudador e responsável por essa conquista, que me apoiou e me confortou em todos os momentos nessa jornada.
Aos meus filhos amados Victória Catharina Araújo van der Boor e Reinhart Arthur Araújo van der Boor, que por muitas vezes foram privados da minha companhia, a eles o meu agradecimento pois eles são a força que me move a continuar lutando para conquistar os meu sonhos.
A minha querida turma de Mestrado: Adriana de Mendonça Marques, Alícia Valéria dos Santos Zaranza, Antônio Inácio Pereira dos Nascimento, Ione Cristina de Paiva Pereira, Kênia Regina Oliveira Maia, Roxana de Carvalho Veras, Suzane Katy Oliveira, Viviane Menezes de Menezes pela amizade, companheirismo, sorrisos e apoio. À todos, deixo o registro da minha mais profunda admiração pelos profissionais competentes e dedicados que são; que por muitas vezes, mesmo sufocados com todos as responsabilidades (profissionais e familiares), problemas de saúde, perda de entes queridos, ao peso de muitas lágrimas, stress e dor, ainda assim, conseguiram superar todas as suas limitações com garra e determinação, e se dedicar a este Programa de Mestrado.
Ao querido Raimundo Rodrigues dos Santos Filho, Farmacêutico responsável pelo Laboratório de Controle de Qualidade de Água da FUNASA, pelo suporte e compreensão nos momentos em que precisei me ausentar em virtude deste Mestrado.
A FUNASA, pelo fornecimento das amostras de água usadas neste estudo.
Aos colegas de laboratório Adriana Marques, Alícia Zaranza Monique do Carmo, Francyele de Moraes, Diogo Lima Ribeiro e todos os demais pela amizade, companheirismo e colaboração nos experimentos
A professora Cristina Andrande, pelos ensinamentos, sugestões e por participar das minhas bancas de qualificação e Defesa Pública.
A minha orientadora Patrícia Figueiredo, pela oportunidade e confiança que me foi depositada para que realizasse esse trabalho.
A todos os professores do Programa de Mestrado em Biologia Parasitária, por compartilharem seus conhecimentos.
Aos funcionários da Secretaria da Pós-graduação, por sempre serem tão gentis, prestativos e acolhedores.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Maranhão (FAPEMA) (AEXT-00567/10) pelo suporte financeiro.
Aos Professores Cristina de Andrade Monteiro, Maria Rosa Quaresma Bomfim, Ilka Márcia Ribeiro de Souza Serra, Sílvio Gomes Monteiro (Suplente), pelo aceite em participar da Banca examinadora.
A todos, o meu sincero
EPÍGRAFE
'For since the creation of the world God's invisible qualities (His eternal and unlimited power and divine nature) have been clearly seen, being understood from what has been made, so that
men are without excuse.' (Romans 1:20, NIV)
RESUMO
Título: Detecção de fatores de virulência de cepas de Escherichia coli isoladas de água de consumo humano no estado do Maranhão.
E. coli é considerada o principal indicador da qualidade da água e de contaminação fecal. Estima-se que 88% das doenças diarreicas do mundo são causadas pelo consumo de água contaminada. O objetivo deste trabalho foi, avaliar o índice de contaminação por E. coli em água de consumo humano fornecida a população em municípios do estado do maranhão, bem como detectar os fatores de virulência presentes nas cepas. A detecção de Coliformes Totais e E. coli foi realizada pelo método do Substrato Cromogênico. Das cepas isoladas realizou-se detecção de atividade enzimática: produção de hemolisina em ágar sangue de carneiro, cavalo e humano à 5%, além de lipase, proteinase, elastase, fosfolipase, gelatinase e teste de adesão a celulas Hep-2. Das 1.192 amostras de água, 331 (27,8%) estavam contaminadas com Coliformes Totais e 115 (9,65%) por Escherichia coli. A produção de biofilme observada em microplacas foi de 77% e em ágar Vermelho Congo foi de 50%. Evidenciou-se produção de fímbria curli em 74% das cepas. Quanto a produção de enzimas, foi evidenciada a produção de hemolisina em 70% das cepas em sangue de carneiro e a produção de 73% de lipase, 70% de proteinase, 29% de elastase e 0% de gelatinase e fosfolipase nas cepas. Apenas 7,0% dos isolados aderiram a células Hep-2. Esses resultados sugerem que essas cepas tem potencial de causar doenças devido à combinação de fatores de virulência; como a produção de biofilme e fímbria curli que auxiliam na adesão da bactéria ao hospedeiro e enzimas extracelulares que causam danos teciduais e celulares. A presença de E. coli em água para consumo humano é um risco para a saúde da população. As autoridades devem redobrar a sua atenção a fim de que a população receba água de qualidade isenta de patógenos, como preconiza a legislação.
ABSTRACT
Title: Detection of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from drinking water in the state of Maranhão, Brazil.
Escherichia coli is considered the principal indicator for water quality and faecal contamination. An estimated 88% of all human diarrheic diseases in the world are caused by consumption of contaminated water. The objective of this research was to evaluate the E. coli contamination level and detect the virulence factors of E. coli found in drinking water in the supplies of municipalities in the interior of the state of Maranhão. The detection of total coliform and E. coli were performed using the Chromogenic Subtract method. Enzymatic activity tests such as: hemolysin in agar sheep, horse and human blood 5% and lipase, protease, elastase, phospholipase, gelatinase, biofilm, curli fimbriae, and adherence to HEp-2 cells, were performed. Of the 1.192 water samples, 331 (28%) were contaminated with Total Coliforms and 115 (9,7%) with E. coli. Biofilm production in plate assay was observed in 50% of the strains and in microtitre well surfaces in 77%. The production of curli fimbriae was observed in 74% of the strains. As for the production of enzymes, we observed the production of hemolysin in 70% of the E. coli strains in sheep blood and we observed 73% lipase, 70% protease, 29% elastase, and no (0%) phospholipase and gelatinase production in the isolated strains. Adherence to HEp-2 cells was found in 7,0% of the strains. The results suggest that the combination of virulence factors detected in these isolated strains can potentially cause diseases; factors such as biofilm and curli fimbriae production, which help in the adhesion of the bacteria to the host and extra-cellular enzymes that can cause tissue and cell damage. The presence of E. coli in drinking water is a public health risk and the authorities should ensure that the general population receives good quality water, that does not contain pathogens, as also stipulated by law.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Locais de coleta das amostras de água em municípios do estado do Maranhão. .... 20
Figura 2: Atividade hemolítica das cepas de E. coli nos diferentes tipos de sangue testados 27 Figura 3: Placa de Hemólise em Sangue de Carneiro... 28
Figura 4: Produção de Enzimas Extracelulares ... 28
Figura 5: Placa de Mueller-Hinton mostrando halos de Lipólise... 29
Figura 6: Placa de Mueller-Hinton mostrando halos de hidrólise de Elastase... 29
Figura 7: Produção de Biofilme em microplaca... 31
Figura 8: Produção de Biofilme in AVC... 31
Figura 9: Colônias produtoras de fímbria curli em meio LB ... 32
Figura 10: Aderência agregativa das cepas de E.coli às células HEp-2 e a lâmina... 32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Contaminação das amostras de água coletadas nas municípios... 26 Tabela 2: Formação de Biofilme em Microplaca e Ágar Vermelho Congo (AVC)... 30
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AAF = Fímbria de Aderência Agregativa (do inglês: Aggregative Adhesion Fimbriae)
ADD = Acute Diarrheic Diseases
AIDS = síndrome de imunodeficiência adquirida (do inglês: Acquired Immunological Deficiency Syndrome)
AMC = Ágar MacConkey
APHA = American Public Health Association AVC = Ágar Vermelho Congo
BHI = infusão de cérebro e coração (do inglês: Brain-Heart Infusion) CAEMA = Companhia de Água e Esgoto do Maranhão
CT = toxina da cólera (do inglês: Cholera Toxin) DAEC = Escherichia coli difusamente aderente D.O.c. = Densidade óptica do controle
D.O.i. = Densidade óptica do isolado
DNA = ácido desoxirribonucleico (do inglês: Desoxyribonucleic Acid) EAF = plasmídio de fator de aderência da Escherichia coli enteropatogênica EAEC = Escherichia coli enteroagregativa
EAST = Enterotoxina termoestável de Escherichia coli enteroagregativa ECD = Escherichia coli diarreiogênica
E. coli = Escherichia coli
EIEC = Escherichia coli enteroinvasora EHEC = Escherichia coli enterohemorrágica EPEC = Escherichia coli enteropatogênica ESP = Espectofotometria
ESBL = beta-lactamase de espectro estendido
ESTEC = E. coli produtora de toxina Shiga(Stx)
ETEC = Escherichia coli enterotoxigênica
ExPEC = Escherichia coli Patogênica Extra-intestinal (do inglês: Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli)
FAPEMA = Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado do Maranhão FUNASA = Fundação Nacional de Saúde
HIV = agente causador da AIDS (inglês: Human Immunodeficiency Virus) HUS = Síndrome Urêmica Hemolítica (do inglês: Hemolytic-uremic Syndrome)
IBGE = Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística LEE = locus de destruição do enterócito
LB = meio Luria Bertani LT = toxina termolábil
MEM = Meio Mínimo Essencial de Eagle Modificado OMS = Oraganização Mundial de Saude (inglês: WHO) pAA = plasmídio de aderência agregativa
PBS = Tampão fosfato salina
PCR = Reação em cadeia da Polimerase RTX = Toxina de estrutura repetida
SAAES = Serviço de Abastecimento Autônomo de Água e Esgoto S. Enterica = Salmonella Enterica
SFB = soro fetal bovino ST = toxina termoestável
STEC = Escherichia coli produtora de toxina Shiga (do inglês: Shiga Toxin- producing Escherichi coli)
TBE = Tris borato Etilenodiamina-tetra ácido acético
UPEC = Escherichia coli Uropatogênica (do inglês: Uropathogenic Escherichia coli) WHO = World Health Organization (português: OMS)
1. INTRODUÇÃO
1.1. A PROBLEMATICA DAS DOENÇAS DE VEICULAÇÃO HÍDRICA
Água é essencial à vida. O acesso a água segura e livre de microorganismos patogênicos deve ser fornecido a todos. Quando a população tem acesso a água potável de qualidade, uma grande melhora no nível de saúde da população é observado (WHO, 2011). Todos os esforços para que a água fornecida a população seja segura precisa ser feito (ISHI et al., 2008; CABRAL, 2010).
Em países em desenvolvimento muitas pessoas sofrem com a falta de água potável. Nesses países a transmissão de doenças de veiculação hídrica é muito comum (ASHBOLT, 2004). Segundo a Organização Mundial de Saude (OMS) (WHO, 2011), 2,5 bilhões de pessoas não tem acesso à melhorias sanitárias, e mais de 1,5 milhões de crianças morrem a cada ano vítimas de doenças diarréicas. Ainda segundo a OMS, a mortalidade devido doenças relacionadas a água ultrapassa 5 milhões de pessoas por ano. Entre essas, mais de 50% são de infecções microbianas. No Brasil de acordo com os dados da Monitoração de Doenças Diarréicas Agudas (DDA) do Ministério da Saúde, de 2000 a 2010, foram notificados 29.491.078 casos de DDA, com 53.543 óbitos. No ano de 2010, o Nordeste contabilizou 1.561 mortes, 165 destas no Estado do Maranhão (MS/SVS/DASIS, 2010).
De modo geral, o maior risco microbiano está associado com ingestão de água contaminada com fezes humanas ou de animais, no preparo de alimentos ou no banho. Entre os fatores de contaminação dos sistemas de abastecimento de água podemos citar: contaminação fecal de águas superficiais ou subterrâneas (em países em desenvolvimento são reservatórios de microorganismos, devido principalmente a descargas do esgoto sem tratamento em água doce e água costeira), falta de tratamento ou tratamento ineficaz, falha na distribuição, defeitos nas tubulações de água (LEVINE et al., 1987; NATARO e KAPER, 1998; TSEN et al., 1998; FORD, 1999; QUADRI et al., 2005; ISHI et al., 2008; CABRAL, 2010).
Doenças diarréicas agudas são um sério problema de saúde pública em países em desenvolvimento. As pessoas afetadas por doenças diarréicas são aquelas com poucos recursos financeiros e pouco acesso à instalações sanitárias. Crianças abaixo de cinco anos, principalmente em países da África, Ásia e América do Sul são os mais atingidos por doenças microbianas de veiculação hídrica. Essas doenças também afetam países desenvolvidos (ASHBOLT, 2004; HASAN et al., 2010). Nos Estados Unidos por exemplo, estima-se que 560.000 pessoas sofram de severas doenças de veiculação hídrica, e 7,1 milhões de pessoas
sofram de infecções leves a moderadas, resultando em aproximadamente 12.000 mortes ao ano (CABRAL, 2010).
Dentre os agentes causadores de diarréia através de veiculação hídrica podemos citar: Vibrio Cholerae, Shigella spp, Campylombacter jejuni, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum e Escherichia coli. Estima-se que Escherichia coli seja o segundo microorganismo de maior incidência em água de consumo humano nos Estados Unidos. (FORD, 1999).
Em todo o mundo Escherichia coli é um importante agente de doenças diarréicas (FORD, 1999), tem sido relacionada a epidemias de diarréia através do consumo de água contaminada (SWERDLOW et al., 1992; OLSEN, 2002; HRUDEY et al., 2003; COOPER, 2010). Os patótipos mais comumente associados a ingestão de água contaminada são EAEC, ETEC e EHEC, que são transmitidos pela rota oral - fecal (HUANG et al., 2006).
Apesar da grande relevância de Escherichia coli como agente causativo de doenças diarréicas de veiculação hídrica e seu grande impacto na saúde pública; os fatores de virulência associados a cepas de E. coli de água de consumo humano tem sido pouco estudados.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o índice de contaminação por E. coli em água de consumo humano fornecida a população em municípios do estado do Maranhão bem como analisar se esses isolados possuem a habilidade de produzir fatores de virulência. Os fatores de virulência estudados nesse trabalho foram: produção de enzimas extracelulares (hemolisina, lipase, proteinase, elastase, fosfolipase, gelatinase), identificação de fímbria curli, produção de biofilme e adesão em células Hep-2.
1.1.1. A água como fonte de infecções
A primeira prova documental que o fornecimento público de água poderia ser fonte de infecções, veio de estudos epidemiológicos sobre cólera realizado pelo Dr. John Snow em 1850. Snow estudou uma epidemia de cólera associada com o fornecimento de água pública em Broad Street, Londres (apud ASHBOLT, 2004).
Em 1885, Percy and Grace Frankland iniciaram a primeira análise bacteriológica de rotina em Londres, usando um meio de gelatina sólida de Robert Koch, para contar bactéria. Em 1891, Percy e Grace Frankland criaram o conceito que organismos característicos em água de esgoto, deviam ser identificados a fim de fornecer evidência de poluição (apud CABRAL, 2010).
Em 1892, Schardinger propôs que, uma vez que Bacterium coli, era componente comum da flora fecal, sua presença em água podia ser um indicadora de presença de
contaminação fecal e portanto de presença de patógenos entéricos (apud DAWSON et al., 2000). Pouco depois da descrição de Bacterium coli, outra bactéria foi isolada de fezes e água: Klebsiella em 1882 e Enterobacter in 1890 (apud ISHI et al., 2008; apud CABRAL, 2010).
Em 1893, o método de Wurtz de enumerar Bacterium coli, estava sendo usado por sanitaristas bacteriologistas. Os Coliformes já eram nessa época considerado um grupo heterogêneo de organismos, muitos dos quais não eram de origem fecal. A origem da importante observação que Bacterium coli é prioritariamente de origem fecal enquanto outros Coliformes não são, pode ser atribuído a Winslow e Walker in 1907 (apud CABRAL, 2010).
1.1.2. Bactérias indicadoras fecais
1.1.2.1. Coliformes Totais
São bactérias do grupo Coliforme, bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presença de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0ºC ± 0,5ºC entre 24 h e 48 h, e que podem apresentar atividade da enzima ß-galactosidase. A maioria das bactérias do grupo Coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo (BRASIL, 2004).
1.1.3.2 Coliformes Termotolerantes
É um subgrupo das bactérias do grupo Coliforme que fermentam a lactose a 44,5ºC ± 0,2ºC em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal.
1.1.2.2. Escherichia Coli
É uma bactéria do grupo Coliforme que fermenta a lactose e manitol, com produção de ácido e gás a 44,5ºC ± 0,2ºC em 24 h, produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, não hidroliza a uréia e apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase, sendo considerada o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos (BRASIL, 2004).
1.1.2.3. Métodos de detecção de Coliformes Totais e Fecais
Os testes tradicionais utilizados para detecção de Coliformes Totais e Fecais são a técnica dos tubos múltiplos e da membrana filtrante.
O teste dos Tubos Múltiplos é usado para amostras de água que variam de médio a altamente contaminada e membrana filtrante para amostras de água que variam de pouco a muito pouco contaminada. Membrana Filtrante é um método altamente sensível .Porém, ambos os métodos são de realização demorada e não detectam bactérias viáveis mas não cultiváveis. Essas limitações levaram a busca de métodos mais rápidos e se possível menos susceptível a falsos negativos (CABRAL, 2010).
A problemática foi solucionada com a detecção de atividade enzimática de β-D-galactosidase (a 37°C). É um bom indicador de Coliformes Totais em águas ambientais, já que a maioria das bactérias possuem essa enzima, como: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella Raoultella , Hafnia, Serratia e Yersinia. A maioria das cepas de Proteus, Salmonella e Edwardsiella não possuem essa enzima. (CABRAL, 2010)
A detecção de atividade de β-D-glucuronidase (a 44,5°C) é, geralmente um bom indicador para Coliformes Fecais em águas ambientais poluídas e é muito específico para E. coli. É encontrada na maiorias das cepas de E. coli e em algumas cepas de Salmonella e Shigella. (CABRAL, 2010)
1.1.3. Escherichia coli e a contaminação de água
Águas superficiais de países em desenvolvimento são reservatórios de microorganismos, e a transmissão destes pode ocorrer usando a água para banho, ou no preparo de alimentos ou ingestão (LEVINE et al., 1987; NATARO e KAPER, 1998; TSEN et al., 1998; QUADRI et al., 2005). No caso dos animais, a contaminação do ambiente parece ter um papel importante (TSEN et al., 1998; KUHNERT et al., 2000).
Em países desenvolvidos doenças causadas por E. coli ,transmitidas pelo consumo de água, estão mais relacionadas com fontes privadas do que com o fornecimento público. Num incidente registrado, a identificação de E. coli O157:H7 numa fonte privada de água em Canadá foi ligado a um caso de diarréia sanguinolenta numa criança de 16 meses, onde a água era a via mais provável de infecção (DAWSON et al., 2000).
Nos humanos, E. coli é excretada pelas fezes e entra no sistema de tratamento de água; normalmente é eliminada por cloração ou tratamento similar. Entretanto, quando o sistema de tratamento é ineficiente ou a água é proveniente de escoamento de solo contaminado com fezes de animais, a bactéria se dissemina no ambiente e fornece uma rota em potencial de
contaminação. Pesquisas tem mostrado que E. coli pode penetrar no solo ou em sistemas de tratamento de água e persistir por muitos anos envolvidas em matrizes de biofilme. De fato, E. coli O157 tem sido isolada de lama e outros sedimentos, assim como leitos de rio, lagos e mares. A bactéria tem demonstrado sobreviver em água gelada por mais de doze semanas (COOPER, 2010).
Pesquisas epidemiológicas demonstram que reservatórios ambientais de cepas de E. coli podem permitir a reintrodução do patógeno em populações susceptíveis e por muitas vezes causarem epidemias (COOPER, 2010; OLSEN et al., 2002). O uso de adubo de fezes de animais contaminados pode levar ao influxo da bactéria no solo. A agricultura e o fluxo natural da água transfere a bactéria para o interior do solo, podendo assim penetrar em aquíferos, que é usado como fonte de água de consumo humano, expondo assim a população a contaminação. Um exemplo dessa rota de contaminação, foi uma epidemia ocorrida em Ontário, Canadá no ano de 2000, onde 2.300 pessoas adoeceram como resultado da contaminação de um poço com fezes de gado contendo E. coli O157 e outros microorganismos patogênicos. Foram relatados sintomas de gastroenterite, 65 pessoas foram hospitalizadas, 27 apresentaram Sídrome Urêmica Hemolítica e 7 morreram (HRUDEY et al., 2003; COOPER, 2010). Outra grave epidemia, causada pela contaminação de água de consumo humano (não clorada) por E. coli 0157, aconteceu em Cabool, Estados Unidos em 1989. Provavelmente o sistema de abastecimento de água foi contaminado com esgoto durante reparos em dois tubos principais de água e pela troca de um tubo de 48 metros que era abastecido por uma fonte subterranea não clorada. Nesta epidemia ocorreram 243 casos de gastroenterite, incluindo 86 casos de diarréia sanguinolenta, 2 casos de Síndrome Urêmica Hemolítica e 4 mortes (SWERDLOW et al., 1992).
Em 2006, uma epidemia de E. Coli O 157:H7, durante agosto e setembro foi relatada nos Estados Unidos e Canadá. A fonte da contaminação foi espinafre, que provavelmente foi irrigado com água contaminada na California. Este incidente causou 199 infecções, 39 casos de Síndrome Urêmica Hemolítica e três mortes (ISHI et al., 2008).
1.2. Escherichia coli
Escherichia coli faz parte da família Enterobacteriaceae, é pertencente ao gênero Escherichia, composta por bacilos gram negativos, móveis, não esporulado, anaeróbios facultativos, fermentadores de glicose. Desenvolve-se bem em meios de cultura utilizados na rotina laboratorial como MacConkey e Teague (HUNTER, 2003). É integrante da microbiota do trato-intestinal do homem (e outros vertebrados) (HARRINGTON et al., 2006),
colonizando-o horas após o nascimento. Tem um papel importante no organismo, controlando a multiplicação de bactérias patogênicas e sintetizando uma considerável quantidade de vitaminas. Indivíduos saudáveis podem ter mais de 1 bilhão de células de E. coli no intestino (que é seu primeiro habitat) e a metade disso na parte externa do corpo (seu segundo habitat).
Contudo, apesar de fazerem parte da microbiota intestinal, existem cepas de E. coli, que são capazes de provocar uma grande variedade de doenças, sendo chamadas de 'patogênicas', elas podem causar infecções intestinais e extra-intestinais (TOUCHON et al., 2009).
As E. coli que causam infecções intestinais são chamadas E. coli diarreiogênicas (ECD) e as que causam infecções extra-intestinais como: infecção do trato urinário, meningite, septicemia, pneumonia são conhecidas como ExPEC (VALENTINI et al., 1992; BRUNEAU et al., 2004; KAPER et al., 2004; HAMELIN et al., 2007).
Essas cepas ocupam hoje o segundo lugar entre os principais agentes causadores de doenças de origem alimentar (OLSEN et al., 2000). Devido o grande espectro de doenças causadas por E. coli, ela é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo inteiro. A cada ano E. coli causa mais de dois milhões de mortes devido a diarréia infantil e infecções extra-intestinais (principalmente septicemia provocada por infecção urinaria ascendente). São responsáveis também por 150 milhões de casos de cistite não complicada (KOSEK et al., 2003). Estudos sugerem que as cepas patogênicas de E. coli seriam derivadas de cepas comensais de E. coli que teriam adquirido DNA de virulência cromossômicos ou extra- cromossômicos que codificam enterotoxinas, adesinas ou fatores de invasão (WEINTRABE, 2007). O genoma de E. coli tem uma plasticidade que o permite ganhar ou perder genes de virulência frequentemente, pelo fato de que vários destes estarem localizados em elementos móveis como plasmídios, fagos e transposons. Esses genes geralmente estão localizados em grandes blocos denominadas 'ilhas de patogenicidade' (KUHNERT et al., 2000).
A primeira descrição da Escherichia coli foi em 1855 pelo cientista Theodor von Escherich. O cientista identificou uma bactéria em grande densidade em fezes humanas e a relacionou com diarréia infantil; a chamou de Bacterium coli commune, o nome atual de Escherichia coli foi oficializado em 1958, em honra ao seu descobridor (apud PUPO et al., 1997; apud KUHNERT et al., 2000).
A Escherichia coli é amplamente distribuída no ambiente, podendo contaminar alimentos de origem animal, frutas, verduras e seus derivados. Pode contaminar também corpos de água superficial e subterrânea(KUHNERT et al., 2000).
1.3. Escherichia coli DIARREIOGÊNICA
A diarréia infecciosa é uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade infantis nos países em desenvolvimento (principalmente em crianças pertencentes a famílias de baixo nível sócio-econômico) e é um dos indicadores utilizados na avaliação do nível de saúde de uma população (HANSON et al., 1993; NATARO e KAPER, 1998; KOSEK et al., 2003).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, ela é a segunda causa de morte entre crianças abaixo de cinco anos. Estima-se que 1,5 milhões de crianças morram a cada ano, a maioria delas em países em desenvolvimento, devido principalmente à falta de água tratada, saneamento básico e higiene (WHO, 2011)
Inicialmente a classificação de E. coli era feita através de análise sorológica. Kauffman em 1944, propôs um esquema de classificação baseado nos antígenos de superfície somático(O), flagelar(H) e capsular(K). Esses marcadores sorológicos são insuficientes para identificar uma cepa de E. coli como diarreiogênica, pois não correlaciona na maioria das vezes, com a presença de fatores de virulência (CLARKE et al., 2002; TOMA et al., 2003).
Atualmente as cepas E. coli causadoras de diarréia e disenteria são classificadas em seis categorias de acordo com a presença de fatores de virulência como: produção de toxina, capacidade de adesão e invasão, etc. (NATARO e KAPER, 1998). Sendo divididas em seis patótipos: Escherichia coli Enteropatogênica Clássica (EPEC), que pode ser dividida em EPEC típica (presença de gene eae e plasmídio EAF) e EPEC atípica (presença apenas do gene eae), E. coli Enterotoxigênica (ETEC), E. coli Enteroinvasora (EIEC), E. coli Enterohemorrágica (EHEC), E. coli Enteroagregativa (EAEC), E. coli que adere difusamente a células epiteliais (DAEC) (TRABULSI et al., 2002; NAVARRO-GARCIA et al., 2010).
1.3.1. Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC)
Escherichia coli enteropatogênica é um patógeno extracelular. Resumidamente a característica principal de sua patogenicidade se dá através de sua ligação a superfície da célula hospedeira e que através de um sistema conhecido como sistema de secreção do tipo III, que injeta diretamente na célula subjacente fatores de virulência (VALLANCE et al., 2000). Durante a infecção, EPEC causa um efeito conhecido como “attaching and effacing”(A/E) na histopatologia dos enterócitos intestinais. As lesões A/E são caracterizadas pela destruição das microvilosidades e mudanças no citoesqueleto, como o acúmulo de actina polimerizada, diretamente abaixo da célula aderida (ROSENSHINE et al., 1996; VALLANCE et al., 2000; NAVARRO-GARCIA et al., 2010).
O termo Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) foi introduzido por Neter et al. em 1955 (apud CLARKE et al., 2002) para descrever cepas de E. coli associadas com diarréia infantil e durante muitos anos foi identificado na rotina laboratorial pelo sorogrupo O (CLARKE et al., 2002; TRABULSI et al., 2002).
1.3.1.1. Classificação:
As cepas de EPEC pertencem a um número reduzido de sorogrupos, sendo eles: O14, O55, O86, O111, O119, O125, O126, O127, O128 e O142) (KUHNERT et al., 2000; KAPER et al., 2004). e com relativa freqüência está associada a casos de diarréia aguda (SCALETSKY et al., 1984; KUHNERT et al., 2000).
1.3.1.2. Epidemiologia:
EPEC é uma importante causadora de diarréia em países em desenvolvimento. Crianças abaixo de 2 anos são as mais afetadas (ROSENSHINE et al., 1996; PUPO et al., 1997; KUHNERT et al., 2000; ASHBOLT, 2004). Apresentando sintomas graves como diarréia aquosa, vômito e febre (KUHNERT et al., 2000; VALLANCE et al., 2000; CLARKE et al., 2002). Provavelmente a diarréia causada por EPEC resulta de múltiplos mecanismos, incluindo secreção de íons, inflamação intestinal e aumento da sua permeabilidade, perda da superfície de absorção devido à lesão A/E (KAPER et al., 2004).
Estima-se que EPEC seja responsável por 117 milhões de episódios de diarréia por ano em países em desenvolvimento (excluindo a China) (CLARKE et al., 2002). Entre o grupo de 0-6 meses, cepas de EPEC são o grupo bacteriano mais isolado em diarréia bacteriana (NATARO e KAPER, 1998; CLARKE et al., 2002). São responsáveis por mais de 30% dos casos de diarréia em crianças no Brasil (GOMES et al., 1991).
1.3.1.3. Mecanismo de Ação:
EPEC e outras cepas de E. coli patogênicas, ao contrário de cepas comensais de E. coli que são encontradas no intestino, contém em seu genoma ilhas de patogenicidade. Todos os genes necessários para a formação das lesões A/E e pedestais estão localizados em uma ilha de patogenicidade de 35-kbp denominada “Locus of Enterocyte Effacement” (LEE) (PUPO et al., 1997; NATARO e KAPER, 1998; VALLANCE et al., 2000).
1.3.1.4. Estágios da infecção por EPEC
As interações da EPEc e as células hospedeiras incluem passos distintos que foram classificados em um processo de três estágios:
1) Aderência da bactéria no epitélio intestinal do hospedeiro.
2) Produção de proteínas bacterianas denominadas Esps: EspA, EspB e EspD. 3) Aderência íntima do eritrócito e formação do pedestal.
(ROSENSHINE et al., 1996; VALLANCE et al., 2000).
1.3.1.5. Grupos de EPEC
As cepas EPEC são divididas em dois grupos: EPEC típicas (presença de gene eae e plasmídio EAF) e EPEC atípicas (presença somente do gene eae) (TRABULSI et al., 1996).
As EPEC típicas, ou simplesmente EPEC, são bastante homogêneas em suas propriedades de virulência, pois expressam basicamente os fatores de virulência codificados pela região LEE e pelo plasmídio EAF. Um fato interessante sobre EPEC típica é que aparentemente seu único reservatório são os humanos, portanto indica que o mal manuseio de excretas humanas e má qualidade de água são o maior problema relacionado a sua transmissão. Quanto a EPEC atípica, ambos humanos e animais podem ser reservatórios (ASHBOLT, 2004).
Por outro lado, as EPEC atípicas não são portadoras do plasmídio EAF, mas possuem o gene eae e demais fatores de virulência codificados na região LEE. As EPEC típicas e atípicas também diferem no padrão de adesão em células. As EPEC típicas apresentam somente o padrão de adesão localizada, enquanto que as atípicas apresentam o padrão de Adesão “Localizada Like” (LAL), podendo também apresentar Adesão Difusa (AD) e Adesão Agregativa (AA) (TRABULSI et al., 2002).
1.3.2. Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC)
Escherichia coli enterotoxigênica são importantes causadoras de diarréia em crianças abaixo de 5 anos em países em desenvolvimento e entre adultos de países industrializados que viajam para países em desenvolvimento (diarréia do viajante) (VARGAS et al., 1998; CORRÊA et al., 2006; DORSEY et al., 2006; LOTHIGIUS et al., 2008; FLORES et al., 2008; SHAH et al., 2009). Adultos imunologicamente não previamente infectados são mais susceptíveis. Estudos tem mostrado que 20% a 60% desses viajantes tiveram diarréia e que 20% a 40% dos casos são causados por ETEC (REIS et al., 1980; PUPO et al., 1997; NATARO e KAPER, 1998; KUHNERT et al., 2000; RODAS et al., 2011).
ETEC são cepas de E. coli que produzem pelo menos uma toxina do grupo de toxinas denominado enterotoxinas. São elas a toxina termo-lábil (LT) e a toxina termo-estável (ST). Podem expressar somente LT, somente ST ou ambas, podem produzir também um ou vários Fatores de Colonização (FCs) (PUPO et al., 1997; TSEN et al., 1998; NATARO e KAPER, 1998; VARGAS et al., 1998; DORSEY et al., 2006; FLORES et al., 2008; RODAS et al., 2011).
A primeira descrição de ETEC em humanos foi relatada por Dupont e colaboradores que perceberam que certas cepas de E. coli isoladas de fezes de crianças com diarréia, levavam a secreção de fluídos em alças intestinais de coelhos infectados (apud NATARO e KAPER, 1998).
Estão distribuídas numa grande variedade de sorogrupos, que abrangem pelo menos 78 grupos O e 34 H. Os sorogrupos O mais comuns são O6, O8, O15, O20, O25, O27, O49, O63, O78, O128, O148, O153, O159, O167 e O169, sendo os grupos O e H mais fortemente associados O8:H9, O78:H12 e O25:H42 (NATARO et al., 2006). Wolf (1997) após uma grande pesquisa em banco de dados de diversos países do mundo, relatou que em ETEC o antígeno com a maior variedade foi o antígeno O. Em 954 isolados incluídos no estudo 78 diferentes sorogrupos foram identificados. O grupo O mais comum encontrado nesse estudo foram: O6, O78, O8, O128 e O153; eles foram responsáveis por mais da metade das cepas de ETEC (WOLF, 1997).
1.3.2.1. Epidemiologia
Nos últimos anos, estudos tem mostrado que ETEC é o enteropatógeno mais freqüentemente isolado de casos de diarréia em crianças com menos de 5 anos de idade em países em desenvolvimento, estima-se 380.000 óbitos a cada ano (LASARO et al., 2006; WHO, 2011; RODAS et al., 2011). No Egito foi relatado que ETEC é a causa mais comum de diarréia em crianças na escola, sendo responsável por mais de 70% dos casos. A incidência foi maior no sexo masculino do que no sexo feminino. Um estudo minucioso em Bangladesh com crianças de 0 a 5 anos mostrou que 90% dos casos de ETEC relatados no hospital foram de crianças de 0 a 2 anos de idade .A susceptibilidade de bebês e crianças pequenas também tem sido observada em outros contextos; como baixo nível de saúde pública e higiene (QUADRI et al., 2005).
Vários estudos tem demonstrado que diarréia por ETEC e infecções assintomáticas são mais comuns nos períodos quentes do ano. Essa sazonalidade pode ser devido a fatores climáticos e ambientais. Como a temperatura atmosférica aumenta após os meses de inverno,
há um aumento do crescimento da bactéria no ambiente e isso continua nos meses de verão. E com a chegada das chuvas no período chuvoso, há um aumento de contaminação na superfície das águas com material fecal (QUADRI et al., 2005).
A contaminação de água e alimentos é principal via de contaminação humana por ETEC (LASARO et al., 2006; LOTHIGIUS et al., 2008). Em qualquer situação em que água de consumo humano e higiene sanitária são inadequadas, ETEC é normalmente o maior causador de doenças diarréicas (KUHNERT et al., 2000).
1.3.2.2. Mecanismo de ação
Após a ingestão, de água ou alimentos contaminados, a ETEC coloniza o intestino e se adere a mucosa. Normalmente não causam inflamação local perceptível ou mudança histológica. Porém causam um grande desequilíbrio no transporte de água e eletrólitos para dentro dos enterócitos levando aos sintomas típicos de ETEC (KUHNERT et al., 2000; FLORES et al., 2008).
ETEC causa diarréia aquosa do tipo secretória que varia de branda, auto-limitada, a severa. A doença se inicia com diarréia aquosa, com ausência de sangue, muco ou pus. Em alguns poucos pacientes febre e vômito podem estar presentes. A diarréia dura em torno de 3 a 4 dias e é na maioria dos casos auto-limitada, se a hidratação for mantida os pacientes sobrevivem sem nenhuma sequela (NATARO e KAPER, 1998).
Entre os principais fatores de virulência da ETEC podemos citar a produção de toxinas, a termo-lábil (LT) e a termo-estável (ST) (DORSEY et al., 2006). LT-I e ST-I podem ser isoladas de humanos e suínos. A LT-II tem sido raramente isolada, apenas no Brasil e na Tailândia (TSEN et al., 1998).
1.3.2.3. Toxina Termo-lábil
As Toxinas Termo-lábeis (LT) são toxinas oligoméricas intimamente relacionadas em estrutura e função com a toxina da cólera (CT) produzida pelo Vibrio cholerae. Essas duas toxinas apresentam 80% de identidade nas suas seqüências de aminoácidos e possuem o mecanismo de ação (NATARO e KAPER 1998; QUADRI et al., 2005; FLORES et al., 2008).
LT também afeta a síntese de prostaglandinas e leucotrienos que estimulam o transporte de eletrólitos e podem contribuir para o desequilíbrio de íons. Além disso, LT também tem efeitos sobre o sistema nervoso entérico, que controla a motilidade intestinal e a secreção de íons, e estimula a produção de citocinas pelas células intestinais (NATARO e KAPER, 1998).
1.3.2.4. Toxinas termo-estáveis (ST)
ST é um pepitideo de baixo peso molecular, constituído de 18 a 19 aminoácidos, seis dos quais são cisteínas, que formam três pontes dissulfeto intramoleculares. Existem duas variantes, STp e STh, assim denominadas por terem sido descobertos em porcos e humanos, respectivamente, e tem mecanismos de ação idênticos.
A proporção relativa de produção de LT, ST e LT/ST pela ETEC parece variar de região geográfica em pacientes com diarréia por ETEC e em pacientes assintomáticos. Os genes de ambas as classes são encontrados predominantemente em plasmídeos, e alguns em transposons (NATARO e KAPER,1998; QUADRI et al., 2005).
1.3.3. Escherichia coli Enteroinvasora (EIEC)
No final da década de 50 e início da década de 60, começou-se a observar que algumas cepas de E. coli isoladas de pacientes com quadro de disenteria eram capazes de causar ceratoconjuntivite em cobaias. Essas cepas de E. coli foram classificadas então com vários nomes, entre eles: Shigella, Shigella manolovi, S. so¢a, S. 13, S. meta-dysenteriae, etc. Nos últimos anos, decidiu-se designar todos EIEC, E coli Enteroinvasora e hoje esse nome é universalmente aceito (BANDO et al.,1998).
As cepas de EIEC recebem esse nome devido a sua habilidade em invadir células HeLa in vivo, infectar a mucosa intestinal humana e invadir células M, macrófagos e células epiteliais. É mundialmente aceito que EIEC é uma bactéria muito similar, ou até mesmo idêntica, a Shigella, em relação aos seus mecanismos de virulência. Algumas cepas de EIEC tem o mesmo antígeno O que Shigella, porém tem uma atividade metabólica maior (BANDO et al., 1998).
As disenterias causadas por EIEC e Shigella são um grande problema de saúde pública em diferentes regiões do mundo, especialmente em países em desenvolvimento (BANDO et al., 1998).
1.3.3.1. Sorotipos
As cepas de E. coli que correspondem a EIEC são encontradas em doze sorogrupos, O28ac:NM; O29:NM; O112ac:NM; O124:NM; O124:- H30; O136:NM; O143:NM; O144:NM; O152:NM; O159:NM; O164:NM; O167:NM (BANDO et al., 1998; AMHAZ et al., 2006).
1.3.3.2. Patogênese
Shigella e EIEC possuem um grande plasmídio denominado pInv, responsável pela capacidade invasora, que codifica o sistema de secreção do tipo III que confere a bactéria a capacidade de invadir células eucarióticas. È um sistema responsável pela secreção de muitas proteínas que são responsáveis pela patogenicidade da EIEC.
As proteínas Ipa (IpaA até IpaD) são proteínas secretadas que são responsáveis pelo fenótipo invasor (NATARO e KAPER, 1998).
A patogênese tanto de Shigella quanto de EIEC compreende: a penetração do epitélio, lise do vacuolo endocítico, multiplicação intracelular, movimentação através do citoplasma, e extensão até as células epiteliais adjacentes. Quando a infecção é muito severa essa sequência de eventos desencadeia uma reação inflamatória que produz ulceração (NATARO e KAPER, 1998). Infecções por EIEc são caracterizadas por um período de diarréia que precede fezes diarréicas contendo sangue e muco, porém na maioria dos pacientes apenas diarréia aquosa ocorre (NATARO e KAPER, 1998).
1.3.3.3. Epidemiologia
Estudos epidemiológicos sobre EIEC tem mostrado que sua ocorrência na maioria das vezes está associada a epidemias. Em casos raros EIEC pode ser identificada como Shigella spp ou cepa não patogênica de E. coli. A maioria das epidemias relatadas tem relação com alimentos e água contaminada, porém a transmissão de pessoa a pessoa também é possível (NATARO e KAPER, 1998).
A incidência de EIEC em países desenvolvidos, não é alta, mas esporadicamente epidemias de alimento contaminado acontecem. Um caso no Texas com 370 pessoas contaminas foi associado a um restaurante (NATARO e KAPER, 1998).
O papel de cepas de EIEC em doenças diarréicas não tem sido muito investigado. Entretanto, já foi mostrado em alguns estudos, que dependendo da população que está sendo estudada, é uma bactéria que pode ser isolada com uma frequência relativamente alta. Estudos conduzido em São Paulo, Brasil, envolvendo crianças com mais de 2 anos de idade e apresentando quadro de diarréia aguda, mostrou que EIEC foi isolada de 57% das crianças que vivem em famílias de classe média e de 20% de crianças que vivem em favelas. Em Bangkok foi descrito uma freqüência similar (MARTINEZ et al., 1999).
1.3.3.4. Aspectos Clínicos
As apresentações clínicas de EIEC podem ser relatadas em epidemias, endemias e estudos com voluntários. Na maior parte dos casos a infecção causada por EIEC se apresenta com diarréia aquosa, que pode ser muito difícil de se diferenciar da diarréia secretória causada por ETEC. Uma pequena minoria dos pacientes podem desenvolver um quadro mais severo com: sangue, muco, leucócito, tenesmo e febre. Infecções assintomáticas causadas por EIEC são incomuns (NATARO e KAPER, 1998).
1.3.4. Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC/STEC)
EHEC é definida pela habilidade de produzir a toxina vero, que é citotóxica para células da linhagens VERO. A primeira epidemia de contaminação alimentar causada por EHEC foi relatada em 1982 nos Estados Unidos. Nessa epidemia, Riley et al. (apud TAKEDA, 2011) isolaram a cepa de E. coli O157:H7. Os sintomas associados com esse microorganismo eram muito severos, como: dor abdominal e diarréia sanguinolenta, e a doença foi denominada colite hemorrágica. O’Brien e colaboradores (apud TAKEDA, 2011) descobriram que a VT e a atividade citotóxica, produzida pela E. coli O157:H7 descoberta por Riley, era neutralizada por uma antitoxina produzida por Shigella dysenteriae tipo 1. Essa descoberta foi muito importante, pelo fato das duas toxinas serem produzidas por espécies diferentes de bactérias e serem imunologicamente semelhantes. Por esse motivo que é EHEC é chamada de E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) (TAKEDA, 2011).
EHEC são cepas de E. coli que causam colite hemorrágica e Síndrome Urêmica Hemolítica (HUS). HUS ocorre principalmente em crianças com a tríade microangiopatia, anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal aguda.
EHEC contém um subgrupo de sorotipos chamada E. coli produtora de toxina Shiga(Stx) (ESTEC), nas quais a presença de Stx é sine qua non para virulência. A família Stx contém dois tipos, o Stx1 e Stx2. (RAMAMURTHY, 2008)
Stx1 (Stx1 e Stx1c) é antigenicamente similar a enterotoxina Shiga produzida por Shigella dysenteriae tipo 1. Stx2 é heterogênea (Stx2c, Stx2d, Stx2e e Stx2f) e imunologicamente diferente de Stx1. Ambas as Stxs têm uma estrutura A-B: a subunidade A tem atividade de N-glicosidase e a subunidade B se liga a membrana glicolipídica, globotriaosilceramida(Gb3). Stx é uma potente citotoxina que inibe a síntese de proteínas em células eucarióticas. Stx é também conhecida como verotoxina (VT) (RAMAMURTHY, 2008). Segundo dados epidemiológicos, Stx2 parece ser mais importante para o desenvolvimento de HUS. ( RAMAMURTHY, 2008)
1.3.4.1. Patogenicidade
A dose infectante de STEC é muito baixa e sua patogenicidade é bastante complexa. Após a ingestão de água ou alimentos contaminados, STEC coloniza os enterócitos do intestino delgado com características de conectar e destruir (“attaching and effacing”) via os componentes do sistema de secreção do tipo III(SSIII), que é codificada na ilha de patogenicidade no locus de apagamento do enterócito. (RAMAMURTHY, 2008).
A destruição ("effacement") dos enterócitos é marcado por mudanças citológicas, como a destruição das microvilosidades e aderência íntima da bactéria com a membrana celular, causando o acúmulo de actina polimerizada abaixo da bactéria aderida. (RAMAMURTHY, 2008).
1.3.4.2. Epidemiologia
Vários estudos epidemiológicos realizados ao redor do mundo sugerem que ruminantes em geral, e bovinos em particular, são reservatórios zoonóticos de STEC. A fonte principal de infecção por STEC em animais de fazenda, em geral são a água de beber, a alimentação e o ambiente do animal. (RAMAMURTHY, 2008)
1.3.5. Escherichia coli Enteroagregativa (EAEC)
Dentre as categorias diarreiogênicas de E. coli, EAEC, Escherichia coli enteroagregativa é a mais recentemente identificada e descrita (HUANG et al., 2006). Ela foi identificada no Chile em uma criança com diarréia persistente (HARRINGTON et al., 2006).
EAEC é um patógeno emergente em diarréia pediátrica (KAUR et al., 2010), mas seus mecanismos de patogenicidade não estão completamente entendidos (BOUZARI et al., 2001; MONTEIRO-NETO et al., 2003).
Desde que foi descrita pela primeira vez em 1987, Escherichia coli Enteroagregativa, tem sido reconhecida como um agente crescente de diarréia em países em desenvolvimento e mais recentemente em países desenvolvidos (GOMES et al., 1998; STEINER et al., 2000; ADACHI et al., 2001; BOUZARI et al., 2001; SARANTUYA et al., 2004; HUANG et al., 2006). Tem sido relacionada com diarréia persistente em pacientes com HIV/AIDS e com diarréia dos viajantes. Diversas epidemias já foram descritos (NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998; STEINER et al., 2000; ADACHI et al., 2001; HARRINGTON 2005; KAUR et al., 2010).
Em 1979, Cravioto et al. relataram que a maioria das E. coli enteropatogênica aderiam a cultura de células Hep-2 e que portanto esse padrão de adesão poderia ser utilizado para
diferenciar EPEC. Anos depois foi demonstrado que muitos sorogrupos de E. coli não EPEC eram capazes de aderir também a células HEp-2, porém com um padrão de aderência claramente diferente. Enquanto o padrão de aderência de EPEC é localizada, o padrão de não EPEC era difuso. As cepas com padrão de aderência difuso foram posteriormente subdivido em duas subcategorias: agregativa (caracterizada pela autoaglutinação proeminente entre as bactérias na superfície celular) e verdadeiramente difuso (onde as bactérias ficam dispersas sobre a superfície celular). Apenas a agregativa foi associada com diarréia no Chile (NATARO e KAPER, 1998; NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998).
As EAEC são definidas como estirpes de E. coli que não secretam toxina LT nem ST, e que aderem às células HEp-2 através do padrão autoagregativo, no qual as bactérias aderem uma à outra adquirindo uma configuração em tijolos empilhados (stacked-brick) (NATARO e KAPER, 1998; STEINER et al., 2000). É provável que essa definição englobe tanto estirpes patogênicas quanto não-patogênicas (ELIAS et al., 2002), entretanto pelo menos um subgrupo de EAEC é comprovadamente patogênico para humanos (NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998).
A grande maioria de cepas de EAEC alberga um plasmídio de virulência de 60 a 65 MDa (pAA). O plasmídio pAA codifica a Fímbria de Aderência Agregativa (AAF) I e II , que é uma fímbria de 2 nm a 3 nm de diâmetro), é responsável pela aderência em células Hep-2 e por hemaglutinação de eritrócitos humanos em cepas de EAEC 17-2, codifica também a toxina termotolerante enteroagregativa enterotoxina (EAST-1) (NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998; BOUZARI et al., 2001; HARRINGTON et al., 2006).
1.3.5.1. Patogênese
A patogênese de EAEC é muito complexa devido as cepas serem muito heterogêneas (KAUR et al., 2010).
A patogênese de EAEC pode ser dividida em três estágios:
1) aderência a mucosa intestinal e a camada de muco, essa aderência inicial é provavelmente mediada por fímbria AAF;
2) aumento da produção de muco, levando ao depósito de biofilme de muco;
3) inclui a elaboração de toxinas ou inflamação, que resulta em danos a mucosa e secreção intestinal.
(NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998; HARRINGTON et al., 2006; KAUR et al., 2010).
Hospedeiros malnutridos podem ser incapazes de recuperar a mucosa intestinal danificada e consequentemente desenvolver um quadro de diarréia persistente. (NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998; KAUR et al.,2010).
1.3.5.2. Aspectos Clínicos
Os sintomas clássicos são: diarréia aquosa, secretória e mucóide, com um quadro de febre baixa e pouco ou nenhum vômito (HARRINGTON et al., 2006; KAUR et al., 2010). Menos comumente fezes sanguinolentas (NATARO, STEINER e GUERRANT, 1998).
1.3.6. Escherichia coli Difusamente Aderente (DAEC)
Esta é uma categoria de E. coli reconhecida como diarreiogênica caracterizada pelo seu padrão de aderência difusa em células in vitro (NATARO e KAPER, 1998).
1.3.6.1. Patogênese:
O mecanismo de patogênese de DEAC ainda é pouco conhecido. Bilge e colaboradores (apud NATARO e KAPER, 1998) descreveram a clonagem e caracterização de uma fímbria de superfície, o gene codificador dessa fímbria pode estar tanto no cromossomo da bactéria quanto em plasmídio. Os genes fimbriais apresentam semelhanças com o grupo de adesinas bacterianas Dr (NATARO e KAPER, 1998).
Yamamoto et al., Cookson e Nataro (apud NATARO e KAPER, 1998) demonstraram que DEAC são capazes de produzir projeções em forma de dedo na superfície de células Caco-2 ou HEp-2 infectadas. Essas projeções aparentemente envolvem a célula de tal maneira que ela ficaria protegida contra a ação da gentamicina (NATARO e KAPER, 1998).
1.3.6.2. Epidemiologia
Muitos estudos tem relacionado DAEC com agente de diarréia, enquanto outros estudos isolam DAEC na mesma freqüência de pacientes com diarréia e de pacientes assintomáticos. Isso pode ser explicado através da susceptibilidade dependente da idade. Pois quando a população estudada é estratificada em idade percebe-se que a prevalência de diarréia é maior em crianças. Em estudo realizado no Chile, Levine et al. (1993) demonstraram que DAEC é associada com crianças de 1 ano a 5 anos (NATARO e KAPER, 1998).
Jallat e colaboradores (apud NATARO e KAPER, 1998) relataram um alto índice de pacientes hospitalizados com diarréia na França, entre os quais não se encontrou nenhum
outro enteropatógeno além de DAEC, sugerindo assim que este pode ser um importante agente de diarréia em países desenvolvidos (NATARO e KAPER, 1998).
2. OBJETIVOS
Detecção de fatores de virulência de Escherichia coli isoladas de água de consumo em municípios do Maranhão.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o nível de contaminação por Coliformes Totais e Fecais de água de consumo humano no interior do Maranhão
Obter cepas de E. coli provenientes de água de consumo.
Detectar atividade Enzimática (hemolisina, lipase, proteinase, elastase, fosfolipase, gelatinase) das cepas de E. coli.
Verificar a produção de biofilme (Microplaca e Ágar Vermelho Congo em placa de Vermelho Congo)
Detectar a produção de Fímbria Curli
3. METODOLOGIA
3.1. ÁREA DE ESTUDO
Este estudo foi conduzido em várias cidades do interior do estado do Maranhão. O Maranhão está localizado na região Nordeste, sendo limítrofes ao leste com o estado do Piauí, Sudoeste com o estado do Tocantins e estado do Pará ao oeste. Segundo dados do IBGE, censo 2010, é o estado brasileiro com menor Índice de Desenvolvimento Humano da federação; tem uma população de 6.424.340 habitantes, apenas 29% dos municípios contam com serviço de fornecimento de água, e apenas 11% dos domicílios particulares tem água canalizada ou alguma forma de abastecimento de água.
3.2. COLETA DE AMOSTRAS E ISOLAMENTO DE E. coli.
Foram coletadas pela Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), entre fevereiro de 2010 e setembro de 2011, 1.192 amostras de água para consumo humano em 55 municípios para realização de teste bacteriológico (Figura 1).
Figura 1: Locais de coleta das amostras de água em municípios do estado do Maranhão. Os pontos maiores representam os municípios com os índices microbiológicos dentro das normas da Portaria 518/2004.
As amostras foram provenientes de Sistemas de Abastecimento Público, administrados por SAAES (Serviço de Abastecimento Autônomo de Água e Esgoto), CAEMA (Companhia de Água e Esgoto do Maranhão) ou por Prefeituras. Foram coletadas amostras de poços tubulares, pontas de rede, torneiras de escolas e hospitais.
Foram coletados 100 ml de água cada ponto, de acordo com Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (CLESCERI et al., 2004) and e pela Portaria do Ministério da Saúde n.º518/2004 em sacos de coleta estéril contendo tiossulfato de sódio para inativar o cloro, foram resfriadas para transporte e analizadas num intervalo máximo de 24 horas (BRASIL, 2004).
A detecção de Coliformes Totais e E. coli foi realizada pelo método do Substrato Cromogênico, seguindo as especificações do fabricante, aprovado pelo 'Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater' (LENORE et al., 2005) e pela Portaria do Ministério da Saúde n.º. 518 (BRASIL, 2004).
Para a obtenção das cepas de E. coli, as amostras de água que apresentavam-se amarelas e fluorescentes (ONPG-positivo, MUG-positivo) foram selecionadas e coletadas com auxílio de alça de platina em anel. Em seguida as amostras foram semeadas em ágar MacConkey (MC) (Biobrás, MG-BR). De cada placa de MacConkey foram escolhidas aleatoriamente duas colônias fermentadoras de lactose e uma não fermentadora, e então, identificadas bioquimicamente através dos meios EPM (TOLEDO et al., 1982a), MILi (TOLEDO et al.,
1982b) e Citrato de Simmons (Biobrás, MG-BR). As cepas foram estocadas em caldo infuso
de coração e cérebro (BHI) (Difco, Detroit, MC) com 20% de glicerina a -20°C até sua utilização.
3.3. DETECÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA (HEMOLISINA, LIPASE,
PROTEINASE, ELASTASE , FOSFOLIPASE, GELATINASE)
3.3.1. Hemólise
As amostras de E. coli foram cultivadas em 3 ml de caldo BHI durante 24h, a 37°C. Após esse período, as amostras foram semeadas por picada em placas de ágar com 5% de sangue desfibrinado de carneiro, e hemácias não desfibrinadas de sangue de cavalo e humano. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e 48 horas quando então foi observado os halos de hemólise total produzidos pela alfa hemolisina (Hly) (ANDREU et al., 1997).
3.3.2. Lipase
Para a detecção de lipase as amostras foram semeadas em placa de Ágar Mueller-Hinton com adição de azeite à 2%. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e 48 horas e foram observados os halos de atividade lipolítica ao redor das colônias (EDBERG et al., 1996).
3.3.3. Proteinase
Para detecção de proteinase as amostras foram semeadas em placa de Ágar Mueller-Hinton com adição de Àgar Milk a 10%. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e 48 horas em seguida foram observados os halos de atividade proteolítica ao redor das colônias. (EDBERG et al., 1996).
3.3.4. Elastase
As cepas foram semeadas em BHI incubadas a 37°C durante 24 h e posteriormente foram inoculadas pontualmente em placas de Petri com o meio de cultura contendo 1% de elastina (INLAB) e 2% de ágar bacteriológico (HIMEDIA), diluídos em tampão Tris-HCl (hidroximetil) aminometano 0,03M pH8,0 e incubadas por 48 h a 37°C. A atividade de elastase foi determinada pela observação de zonas claras ao redor do local de inoculação (MORIHARA, 1964).
3.3.5. Fosfolipase
O método para análise da produção de fosfolipase foi através do crescimento bacteriano em Mueller-Hinton acrescido de 3% de egg yolk, incubando-se a cultura a 37°C por 48 horas. A produção de fosfolipase foi verificada pela presença do halo de precipitação (EDBERG et al., 1996).
3.3.6. Gelatinase
Para detecção de gelatinase as amostras foram semeadas em placa de Ágar Mueller-Hinton com adição de gelatina a 2%. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e 48 horas e foram observados os halos claros ao redor das colônias (EDBERG et al., 1996).
3.3.7. Produção de Biofilme
Para detecção da capacidade dos isolados de produzir biofilme em meio sólido foi utilizado Ágar Vermelho Congo (AVC). O meio de cultura foi preparado a partir dos
seguintes compostos: Brain Heart Infusion Broth (BHI) (Oxoid) 37 g/l, Sacarose (Difco) 50 g/l, Ágar Base (Difco) 15 g/l e Ágar Vermelho Congo (AVC) 0,8 g/l. Onde, o Ágar Vermelho Congo (AVC) foi autoclavado separadamente, em solução aquosa hiperconcentrada, e adicionado aos demais constituintes do meio. Em seguida o meio foi plaqueado e foi realizada a semeadura. As placas foram incubadas em estufa microbiológica por 24 horas a 48 horas a 37ºC. Após 24 /48 horas foi verificado o crescimento de colônias e a produção de biofilme. As amostras que apresentaram colônias de coloração negra ou enegrecida, considerou-se como produtoras de biofilme, e as que apresentaram colônias de coloração vermelha, considerou-se como não produtoras de biofilme. (FREEMAN et al, 1989).
A aderência bacteriana em teste espectrofotométrico foi verificada seguindo a metodologia de Stepanovic et al. (2004), onde foi realizado através dos cultivos em Brain Heart Infusion Broth (BHI), 24 horas após inoculação a 37ºC. Os mesmos foram padronizados por espectrofotometria, deixando-se todos com densidade óptica (DO) igual a 0,7. Cada amostra, já padronizada, foi adicionada em placa de cultura de tecido com 96 cavidades com fundo em “U”, em duplicata, junto com controles, no volume de 200 ml por cavidade. Depois de preenchida, a placa foi incubada à 37ºC por 24 horas em estufa microbiológica. Passado o tempo de incubação, a placa foi lavada por três vezes com tampão PBS, e deixada secar em temperatura ambiente. À placa seca, adicionou-se 200 µL/cavidade de Cristal Violeta, e deixou incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, cada cavidade foi lavada por três vezes com água destilada e deixada secar em temperatura ambiente. A placa corada com Cristal Violeta foi submetida à espectrofotometria com filtro de 540 nm para aferir as respectivas absorbâncias (Ab) de cada cavidade. Baseando-se nas densidades ópticas (D.O.i) produzidas pelos isolados, e baseando-se no controle negativo (D.O.c) os isolados foram classificados nas seguintes categorias, com algumas modificações:
Não produtor: D.O.i < D.O.c
Produtor fraco: D.O.c < D.O.i <_ (2x D.O.c)
Produtor moderado: (2x D.O.c) < D.O.i <_ (4x D.O.c) Produtor forte: (4xD.O.c) < D.O.i
3.3.8. Produção de Fímbria Curli
Para identificação da fímbria Curli as amostras foram inoculadas no meio Luria Bertani (LB), com pH 8, durante 24 horas a 37ºC. Após este período a cultura foi semeada em placas de LB (sem sal) contendo 0,004% de Vermelho Congo e 0,002% de Azul Brilhante. As placas
foram incubadas por 24 horas a 48 horas em temperatura ambiente. Colônias vermelhas ou rosas foram indicativas de bactérias produtoras de Fímbria Curli (DA RE et al., 2006)
3.3.9. Adesão a células Hep-2
As células HEp-2 (Carcinoma de laringe humana) foram descongeladas em banho de água a 37ºC e transferidas para uma garrafa de cultura de células contendo Meio Mínimo Essencial de Eagle Modificado (MEM/Cultilab), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB/Cultilab) e 1% de solução de antibióticos contendo penicilina (1000 U/mL; Sigma) e estreptomicina (250 µg/mL; Sigma). As garrafas de cultura foram incubados em atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC por 48 horas até a formação da monocamada celular. Após este período o meio foi descartado sendo adicionado à cultura celular uma solução de AVT (Associação Tripsina Versene/Cultilab) para descolamento da monocamada. As células foram ressuspendidas no meio MEM acrescido de 10% de SFB e 1 % de antibióticos, para um número estimado de 2,5 x 105 células /mL. A suspensão de células foi distribuída em microplacas de 96 cavidades, em volume de 100 µL por cavidade. As microplacas foram incubadas a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas. Após a formação da
monocamada semiconfluente, o meio foi descartado e a microplaca foi lavada três vezes com PBS estéril 0,15M pH 7,4 e em cada câmara foi adicionado 1mL de MEM acrescido de 2% de SFB (Soro Fetal Bovino), com e sem 1% de D-manose. Em seguida, foram adicionados 40µL de cada amostra bacteriana por câmara. A microplaca foi incubada por 3 horas a 37ºC e, após este período lavada 3 vezes com 1 mL de PBS 0,15M pH 7,4 por câmara para retirada das bactérias não aderidas. As lâmínulas foram fixadas com metanol por 10 minutos e coradas com May-Grünhald (5 minutos) e Giemsa (20 minutos) e observadas em microscópio óptico em objetiva de imersão. Para definir o tipo de adesão foram utilizados os critérios descritos por Cravioto et al. (1979).
