DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS
EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ANA CAROLINA GONZALES MORAES
FRANCA
2012
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS
EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ANA CAROLINA GONZALES MORAES
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti.
FRANCA
2012
Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
Moraes, Ana Carolina Gonzales
M818d Desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação de egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia líquida de alta eficiência / Ana Carolina Gonzales Moraes ; orientador: Patrícia Mendonça Pauletti. – 2012
76 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Ciências
1. Styrax camporum. 2. Controle de qualidade. 3. Validação. 4. CLAE-DAD. 5. Nor-neolignanas. I. Universidade de Franca. II. Título.
Dedico
Aos meus pais, Moacyr e Regina, por
todo amor e dedicação. Por me ensinarem
os verdadeiros valores da vida. Aos meus
irmãos, Leonardo e Ana Luísa, e ao meu
namorado, Ubirajara, por estarem
presentes na minha vida, dando apoio e me
incentivando. À minha avó por todas as
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela vida, esperança, por todas oportunidades incríveis e conforto nos momentos difíceis.
Aos meus pais, pelo amor e compreensão. A vocês toda a minha gratidão, vocês são um exemplo para mim.
Aos meus irmãos, pelo carinho, incentivo e companheirismo.
Ao Ubirajara, amor da minha vida, pela sua paciência, respeito e compreensão. Sem você nada disso seria possível.
A toda minha família, inclusive, Ângela, Bira, Carol, minha avó Zélia, por estarem do meu lado, dando-me apoio e força e por me acolherem sempre.
À Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti, que com sua imensa sabedoria, colaborou para meu crescimento profissional, por toda sua dedicação, confiança e amizade. Estou imensamente grata.
A todos os companheiros de laboratório que contribuíram para a execução deste trabalho. Em especial, pelos grandes amigos, Murilo, Thaís, Carol, Camila, Karen e Eveline.
Aos professores do grupo de pesquisa da Universidade de Franca por colaborarem para o meu crescimento profissional durante as disciplinas cursadas.
À CAPES pelo suporte financeiro.
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para execução deste trabalho.
“
Começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos radiantes,
com a graça de um adulto – e não com a tristeza de uma criança. E aprende a construir
todas as suas estradas no hoje, pois o terreno do amanhã é incerto demais para os
planos”
William Shakespeare
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLO... I LISTA DE FIGURAS ... III LISTA DE TABELAS ... IV LISTA DE FLUXOGRAMA ... V RESUMO ... VI ABSTRACT ...VII
1 INTRODUÇÃO ... 2
1.1 USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS ... 2
1.2 CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS ... 4
1.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ... 6 1.4 FAMÍLIA STYRACACEAE ... 10 1.5 LIGNÓIDES ... 12 2 OBJETIVOS ... 17 3 PARTE EXPERIMENTAL ... 19 3.1 EQUIPAMENTOS ... 19 3.2 MATERIAIS ... 19 3.3 MATERIAL VEGETAL ... 20
3.4 OBTENÇÃO DOS PADRÕES ... 20
3.5 PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA ... 22
3.5.1 Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol ... 22
3.5.2 Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum ... 23
3.5.3 Preparo das amostras ... 23
3.6 CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) ... 23
3.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ... 24
3.7.1 Curva analítica por padronização externa ... 24
3.7.4 Recuperação ... 25
3.7.5 Precisão (inter e intra-dia) ... 26
3.7.6 Exatidão ... 26
3.7.7 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) ... 26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
4.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE Styrax ...29
4.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL E HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax ... 34
4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ... 38 4.3.1 Seletividade e Especificidade ... 38 4.3.2 Linearidade ... 39 4.3.3 Precisão ... 40 4.3.4 Exatidão ... 40 4.3.5 Recuperação ... 41
4.3.6 Limite de Detecção (LOD) ... 41
4.3.7 Limite de Quantificação (LOQ) ... 42
4.4 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA QUANTIFICAR O EGONOL E HOMOEGONOL EM S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii ... 42
5 CONCLUSÕES ... 45
6 REFERÊNCIAS ... 47
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila
ANVISA Agência de Vigilância Sanitária C18 Sílica Octadecilsilano
CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CLAE (HPLC) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CV Coeficiente de variação
DAD Detector de arranjo de diodos DPR Desvio padrão relativo EEJ Estação ecológica do Jataí EM (MS) Espectrometria de massas
GPNUF Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais da UNIFRAN IC Inclinação da curva de calibração
ICH International Conference on Harmonization INMETRO Instituto Nacional de Metrologia
LC Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida) LOD Limite de detecção
LOQ Limite de quantificação
MeOH Metanol
MS Ministério da Saúde
OMS Organização Mundial de Saúde
p. Página
PVDF Fluoreto de polivinilideno
r Coeficiente de correlação
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
Rf Fator de retenção
RMN 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
SUS Sistema Único de Saúde
tR Tempo de Retenção
USP United States Pharmacopeia
UV-Vis Ultravioleta-Visível
Vinj Volume de injeção
λ Comprimento de onda
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Styrax camporum Pohl. 10
Figura 2 – Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana, neolignana, nor-lignana e nor-neolignana.
13
Figura 3 – Lignanas isoladas de Styrax. 14
Figura 4 – Estruturas químicas de egonol (1) e homoegonol (2). 29 Figura 5 – Espectro de RMN 1Hde 1 (CDCl3, 200 MHz). 32
Figura 6 – Espectro de RMN 1Hde 2 (CDCl3, 200 MHz). 33
Figura 7 – Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, Vinj= 20 μL, [ ] = 1,0
mg/mL.
36
Figura 8 – Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 50 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 30 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, Vinj= 20 μL, [ ] = 1,0
mg/mL.
36
Figura 9 – Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do caule de S. camporum; (b) extrato das folhas de S.
camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d)
extrato das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições cromatográficas: metanol-água-ácido acético (73:26.9:0.1, v/v/v) e detecção em 311 nm.
37
Figura 10 – Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 1. 39 Figura 11 – Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 2. 40 Figura 12 – Espectro de UV-Vis dos padrões (a) egonol (1) e (b)
homoegonol (2).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Dados de RMN 1H (200 MHz) das substâncias 1 e 2 e comparação com a literatura (CDCl3, 200 MHz).
31
Tabela 2 – Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol (2).
39
Tabela 3 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intra e inter-dia para o egonol (1) e homoegonol (2).
41
Tabela 4 – Recuperação para o egonol (1) e homoegonol (2). 41 Tabela 5 – Quantidade (μg/mL) de egonol (1) e homoegonol (2)
em espécies de Styrax.
LISTA DE FLUXOGRAMA
RESUMO
MORAES, Ana Carolina Gonzales. Desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação de egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia líquida de alta eficiência. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca.
A crescente utilização das plantas para fins terapêuticos têm-se destacado em todo o mundo nas últimas décadas. Em vários países, essa forma de terapia constitui o único recurso disponível para o tratamento primário da saúde. Portanto, há necessidade de se desenvolver e comprovar a qualidade das análises químicas desses produtos. Devido à ampla utilização na medicina popular de Styrax camporum em tratamentos de transtornos gastroduodenais, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar uma metodologia analítica para a detecção e a quantificação dos marcadores químicos da espécie S. camporum por CLAE-DAD, visando o controle de qualidade dessa espécie vegetal e de outras desse gênero. A cromatografia líquida de alta eficiência, no modo reverso de eluição, foi utilizada para obtenção de um cromatograma fringerprinting representativo do extrato padrão de S.
camporum e para o desenvolvimento de uma condição isocrática para quantificar as
nor-neolignanas presentes em espécies de Styrax. Os padrões egonol e homoegonol foram isolados de S. pohlii e usados no preparo das soluções padrão e controle de qualidade, as quais foram utilizadas para atender os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e recuperação. Tendo em vista a comprovação da aplicabilidade do método desenvolvido, dois extratos brutos etanólicos de espécies Styrax, previamente preparados, S. pohliin e S. ferrugineus e o extrato das folhas secas de S. camporum foram utilizados para quantificar os padrões egonol (1) e homoegonol (2). A resposta do detector de UV a 311 nm foi linear de 0,36 - 42,00 µg/mL para 1 e 2 e as equações da reta encontradas foram y = 123.000 x – 2.743 e y = 93.490 x – 10.630 (r = 0.9999 e 0,9998, CV < 2 %), respectivamente. O método desenvolvido mostrou-se seletivo, específico, linear, preciso e exato para os dois marcadores propostos, sendo, portanto, passível de utilização no controle de qualidade de S. camporum e também de outras espécies deste gênero.
Palavras-chave: Controle de qualidade, validação, CLAE-DAD, Styrax camporum, Styracaceae, nor-neolignanas.
ABSTRACT
MORAES, Ana Carolina Gonzales. Development and validation of an analytical method for the quantification of egonol and homegonol in extracts of Styrax (Styracaceae) by high performance liquid chromatography. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca.
The increasing use of plants for therapeutic purposes has been highlighted in worldwide in last decades. In several countries, this kind of therapy is the only available resource for primary care treatment. Thus, there is a requirement to develop and demonstrate the quality of chemical analysis of these products. Due to extensive use in folk medicine of
Styrax camporum in the treatment of gastrointestinal disorders, the objectives of this study
were to develop and validate an analytical methodology for detection and quantification of chemical markers of the species S. camporum by HPLC-PAD, aiming to control quality of this species and others from this genus. The high performance liquid chromatography reverse elution mode was used to obtain a fingerprinting chromatogram representative of the standard extract of S. camporum and to development an isocratic condition to quantify the nor-neolignans present in species of Styrax. The standards egonol and homoegonol were isolated from S. pohlii and used to meet the parameters: linearity, selectivity, precision and accuracy, limit of quantification (LOQ) and detection (LOD) and recovery. In order to prove the applicability of the developed method, two crude ethanolic extracts of Styrax species, previously prepared, S. pohlii and S. ferrugineus, and the extract form the leaves of S.
camporum were used to quantify the standards egonol (1) and homoegonol (2). The response
of the UV detector at 311 nm were linear from 0.36 to 42.00 μg/mL for 1 and 2. The regression equations found were y = 123,000 x – 2,743 and y = 93,490 x – 10,630 (r = 0.9999 and 0.9998, CV < 2%), respectively. The method developed proved to be selective, specific, linear, precise and accurate for both markers proposed, therefore, that can be used to control quality of S. camporum and also in other species of this genus.
Keywords: Quality control, validation, HPLC-PAD, Styrax camporum, Styracaceae, nor-neolignans.
1 INTRODUÇÃO
1.1 USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS
Pela observação e experimentação das plantas, os povos primitivos propagaram, de geração em geração, as propriedades terapêuticas de determinadas plantas, que se tornaram parte da cultura popular (Calixto, 2000; Turolla e Nascimento, 2006). Essas informações populares contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais e podem orientar pesquisas na área de produtos naturais, já que muitas espécies são usadas empiricamente, sem respaldo científico quanto à eficácia e segurança (Foglio et al., 2006).
As plantas medicinais constituem uma alternativa medicamentosa bem aceita e acessível devido às vantagens em relação aos medicamentos obtidos por síntese química, como menores efeitos adversos comparadas com os fármacos sintéticos, preferência dos consumidores por tratamentos de origem natural e, principalmente, pelo custo mais baixo comparado com os medicamentos sintéticos (Cañigueral et al., 2003; Melo et al., 2007).
A fitoterapia tem ressurgido como opção terapêutica e sua crescente utilização têm-se destacado em todo o mundo. Nos países em desenvolvimento, essa forma de terapia se constitui, muitas vezes, no único recurso disponível para o atendimento primário à saúde (Melo et al., 2007).
A OMS (Organização Mundial de Saúde) vem, desde 1978, valorizando o uso da medicina tradicional em países em desenvolvimento. A OMS tem estimulado os países a identificar e explorar os aspectos da medicina tradicional que fornecem remédios ou práticas seguras e eficazes para a obtenção da saúde, os quais devem ser recomendados nos programas voltados para cuidados primários de saúde (Tomazzoni et al., 2006).O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta, sendo estimada entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial. Dados estatísticos indicam que existam 55 mil espécies de plantas (Barreiro e Bolzani, 2009). O uso de parte dessa biodiversidade com fins terapêuticos é uma prática antiga e, atualmente,
encontra-se em expansão. Dentro desse contexto, o Ministério da Saúde (MS) aprovou a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS), portaria nº 971 de 03/05/2006, com o intuito de valorizar a utilização de plantas medicinais no SUS. Entre as diretrizes dessa política, tem-se a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais e da Relação Nacional de Fitoterápicos, incentivo à pesquisa e desenvolvimento de plantas medicinais e fitoterápicos, priorizando a biodiversidade do país, e também, a garantia do monitoramento da qualidade dos fitoterápicos pelo Sistema Nacional de Vigilância Sanitária (Ministério da Saúde, Portaria nº 971, 2006).
As pesquisas na área de produtos naturais contribuem também para o desenvolvimento de novos fármacos, sendo que, muitos dos medicamentos alopáticos, foram originalmente sintetizados para mimetizar ou otimizar a ação de seu precursor natural. O grande impacto recente de fármacos derivados de plantas foi, provavelmente, na área dos quimioterápicos com a introdução de vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), podofilotoxina e os análogos etoposídeo (VP-16-213; Vepeside®) e teniposídeo (VM-26; Vumon®), camptotecina e taxol (plaxitaxel; Taxol®) (Montanari e Bolzani, 2001). Cerca de 60 % dos medicamentos em ensaios clínicos, para diferentes tipos de câncer, são produtos naturais ou contém farmacóforos derivados de produtos naturais (Cragg et al., 1997; Cragg e Newman, 2000).
No mercado mundial de medicamentos, estimado em cerca de 300 bilhões de dólares, aproximadamente 40 % destes são originados, direta ou indiretamente, de fontes naturais (sendo 75 % de origem vegetal e 25 % de origem animal e de micro-organismos). Estima-se que o mercado brasileiro de fitoterápicos movimente cerca de 22 bilhões de dólares por ano (Zuanazzi e Mayorga, 2010).
Tendo em vista a crescente difusão e utilização das plantas medicinais, poucos estudos foram feitos a fim de se comprovar a garantia da eficácia, segurança e qualidade para a maioria desses produtos, dificultando a comercialização de fitoterápicos e a possibilidade de exportação destes (Pinto et al., 2002; Barnes, 2003).
A falta de qualidade de um produto fitoterápico ou droga vegetal pode interferir na eficácia e segurança do produto. Portanto, é indispensável o desenvolvimento de métodos analíticos eficazes para o controle da qualidade destes produtos e também das análises químicas, pois, dados analíticos não confiáveis podem levar a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irrecuperáveis (Ribani et al., 2004).
1.2 CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS
As plantas possuem centenas de constituintes químicos e alguns deles estão presentes em baixas concentrações. Normalmente, tem mais de um composto ativo e, muitas vezes, o princípio ativo é desconhecido. Apesar dos procedimentos analíticos modernos, raramente, é possível uma investigação fitoquímica de sucesso, pelo isolamento e caracterização de todos os metabólitos secundários presentes no extrato vegetal (Calixto, 2000). Nesse contexto, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS) é uma técnica de grande valia no processo de identificação de substâncias conhecidas, pois permite comparar a amostra analisada com os principais bancos de dados de substâncias orgânicas (Bugni et al., 2008; Rodrigues et al., 2006).
O acúmulo das substâncias presentes nas plantas é consideravelmente dependente de vários fatores que dificultam o controle de qualidade dos fitoterápicos. Fatores como o uso de plantas frescas, temperatura, luz, exposição à água, disponibilidade de nutrientes, variações sazonais, período da colheita, secagem, embalagem, armazenamento, transporte, parte da planta coletada, método de extração e preparação, etc., podem afetar significativamente a qualidade e, conseqüentemente, o efeito terapêutico. Todos esses fatores explicam a composição química variável da planta (Calixto, 2000; Li et al., 2008; Liang et al., 2004). Dessa forma, a normalização e o controle de qualidade de matérias-primas e preparações fitoterápicas devem ser permanentemente realizados.
Os avanços que ocorreram nos processos de purificação e isolamento permitiram estabelecer estratégias apropriadas para a análise da qualidade e padronização das plantas medicinais, a fim de manter quanto possível à homogeneidade do extrato vegetal (Calixto, 2000).
O emprego de técnicas cromatográficas hifenadas que possibilitam a separação, identificação e o isolamento de substâncias de um extrato vegetal mostra-se necessário, tanto para a determinação da composição química do princípio ativo e/ou de uma substância tóxica de uma planta, como também para a determinação de uma substância, ou grupo de substâncias, que sirva como marcadora daquela espécie, para controle qualitativo e
quantitativo, propiciando a padronização do material vegetal e produtos relacionados (Souza-Moreira, 2010; Calixto, 2000).
Dentre as técnicas mais importantes, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode ser utilizada para a padronização e controle de qualidade da matéria-prima e fitoterápicos (Calixto, 2000). A CLAE é o método freqüentemente utilizado devido a sua versatilidade, facilidade de execução, alta resolução na separação, não é limitado pela volatilidade ou estabilidade do composto analisado, pode-se trabalhar em escala analítica e preparativa, é um método eficiente, rápido e reprodutível (Liang et al., 2004; McMaster, 2007).
A CLAE combinada ao detector de arranjo de diodos (DAD) é uma técnica útil, pois pode fornecer numerosas informações sobre os metabólitos, antes mesmo do seu isolamento, permite otimizar a condição cromatográfica, diminuindo o tempo de análise, possui uma boa capacidade de separação cromatográfica, fornece o espectro de Ultravioleta-Visível (UV-Vis) (Espada et al., 2008; Liang et al., 2004).
Essa técnica é amplamente utilizada na análise de produtos naturais que apresentem grupos cromóforos que propiciam a absorção de luz na região do UV-Vis. Este detector realiza uma varredura que se estende de 200-800 nm e permite a obtenção de espectros de UV-Vis das bandas cromatográficas. O baixo preço deste equipamento em relação aos outros detectores foi a principal causa para seu sucesso, contudo, a necessidade de maiores informações sobre as estruturas moleculares de cada substância na amostra analisada levou ao desenvolvimento de técnicas hifenadas mais modernas, como o acoplamento da CLAE com o espectrômetro de massa e com a ressonância magnética nuclear (Pinto et al., 2002; Rodrigues et al., 2006).
Desse modo, a CLAE pode ser usada para análise quali e quantitativa de extratos de origem vegetal, pois sua alta resolução permite a separação de misturas complexas de substâncias, oferece uma caracterização completa da planta ou do produto analisado e permitir a distinção entre espécies vegetais próximas. Auxilia ainda na detecção de adulterantes e na identificação de drogas vegetais baseada no Fingerprint químico (impressão digital) da amostra analisada pela comparação com padrões e/ou marcadores (Liang et al., 2004; Liang et al., 2010; Souza-Moreira, 2010).
A técnica de Fingerprint químico é amplamente utilizada no controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos. A “impressão digital” química gerada nesses
experimentos fornece uma medida da semelhança e da abundância de componentes específicos entre as amostras, além de definir rapidamente a composição química do extrato vegetal e gerar pontuações de similaridade (Liang et al., 2004).
Os extratos, nessa técnica, são analisados normalmente por CLAE acoplada a diferentes detectores que geram perfis químicos únicos, que são usados para comparar a qualidade e composição da amostra em relação a extratos padrões. Os dados são processados com o auxílio de algoritmos que permitem a comparação precisa e reprodutível de amostras analisadas em ocasiões diferentes. Então, é possível detectar a presença de marcadores químicos dentro de uma amostra e estes são, então, selecionados para a quantificação. (Sahoo
et al., 2010; Li et al., 2008).
1.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO
A validação analítica é um método dinâmico e imprescindível para demonstrar, através de evidências experimentais, que o método atende às exigências das aplicações analíticas, assegurando atingir os padrões adequados de exatidão, precisão e confiabilidade (Silva et al., 2006; Alencar et al., 2004). Deve ser demonstrado que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em laboratório de produtos farmacêuticos (Randau et al., 2005).
Para tanto, alguns parâmetros devem ser analisados: especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequado à análise, demonstrando confiabilidade do método. Esses procedimentos estão descritos em vários guias de agências reguladoras (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003; ICH,1996; USP, 2005). Entretanto, nenhum desses guias especifica as regulamentações para fitoterápicos e matérias-primas vegetais. Desta forma, os parâmetros de qualidade estão fundamentados naqueles recomendados para medicamentos.
I. Especificidade / Seletividade: capacidade de detectar, de forma inequívoca, a presença de uma substância na presença de componentes, tais como impurezas, produtos de
degradação e componentes da matriz, que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse (USP,1999; Vessman et al., 2001; ANVISA, 2003).
Diversos métodos podem ser empregados no estudo da seletividade. Através da comparação da matriz isenta da substância de interesse e a matriz adicionada com esta substância, sendo que, nenhum interferente deve sofrer eluição juntamente com a substância de interesse. Por meio de detectores modernos (DAD, arranjo de diodos) pode-se correlacionar a área de pico da substância de interesse com a pureza do mesmo. E também, pelo método de adição de padrão, a partir do qual se constrói uma curva analítica com adição da substância de interesse na amostra e compara-se com a curva analítica sem a presença da matriz, caso elas sejam paralelas, pode-se dizer que o método é seletivo (Ribani et al., 2004).
II. Linearidade: refere-se à capacidade da metodologia analítica gerar resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de uma faixa de confiança para qual o método é satisfatório (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003).
A fórmula matemática que relaciona a resposta do detector (y) e a concentração do analito (x) na amostra é a equação da reta:
y = ax + b Onde:
y: resposta medida (absorbância, altura ou área do pico) x: concentração do analito
a: inclinação da reta (coeficiente angular)
b: intersecção da curva no eixo y (coeficiente linear)
Para estimar a qualidade da curva analítica obtida utiliza-se o coeficiente de correlação r. Quanto mais próximo de 1 for esse parâmetro, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. O critério mínimo aceitável pela ANVISA deve ser igual a 0,99 e o INMETRO recomenda um valor acima de 0,90 (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003).
III. Precisão: avalia a proximidade dos resultados obtidos entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra semelhantes ou padrões, em condições definidas, sendo usualmente expressa como desvio padrão (S) ou desvio padrão relativo (DPR), também conhecido como coeficiente de variação (CV %).
Desvio padrão: S =
Coeficiente de variação: CV % =
Onde:
: média aritmética de um pequeno número de determinações : valor individual de uma medição
: número de medições : desvio padrão
A precisão pode ser medida em três níveis (ANVISA, 2003; ICH, 1996):
a) Repetibilidade: concordância dos resultados dentro de um pequeno espaço de tempo com as mesmas condições de operação (analista, equipamento, reagentes). Recomenda-se a análise de no mínimo nove determinações com três concentrações, baixa, média e alta ou seis determinações a 100% da concentração do teste.
b) Reprodutibilidade: variação inter-laboratorial dos resultados obtidos. Exigida em casos de inclusão da padronização de procedimentos analíticos nos compêndios e farmacopéias.
c) Precisão intermediária: concordância dos resultados obtidos no mesmo laboratório, porém com alguma variação, podendo ser diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores. Segue as mesmas recomendações para o cálculo de repetitividade descrita acima.
IV. Exatidão: demonstra o grau de proximidade entre os resultados experimentais e um valor de referência aceito como verdadeiro, obedecendo a intervalos de segurança. São necessárias nove análises com três concentrações diferentes (baixa, média e alta) (ANVISA, 2003; ICH, 1996). Geralmente, os métodos utilizados para avaliar a exatidão são: uso de materiais de referência, participação em comparações inter-laboratoriais e execução de ensaios de recuperação (INMETRO, 2003; Thompson et al., 2002). A expressão matemática utilizada é a seguinte:
Exatidão =
V. Recuperação: utilizada para avaliar a quantidade de determinado analito recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra. Este parâmetro permite avaliar a perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas volumétricas imprecisas ou interferentes na amostra. Através da comparação da resposta de uma amostra enriquecida com a não enriquecida, é possível determinar o percentual recuperado pelo processo. São desejáveis valores próximos de 100 %, porém se aceita uma variação de até 15 % sendo mais importante o enriquecimento ser preciso, exato e reprodutível (ANVISA, 2003; Chasin et al.,1998; Causon, 1997; Brito et al., 2003). Para cálculo da porcentagem faz-se uso da seguinte fórmula:
% Recuperação =
VI. Limite de Detecção (LOD): refere-se à menor quantidade da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas, segundo a seguinte fórmula (ANVISA, 2003; Ribani et al., 2004).
VII. Limite de Quantificação (LOQ): é definido como a menor concentração do analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com valores aceitáveis de precisão e exatidão (Cassiano et al., 2009). O LOQ pode ser calculado por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por processos estatísticos.
LOQ =
1.4 FAMÍLIA STYRACACEAE
As Styracaceae são plantas arbustivas ou arbóreas, as quais possuem 160 espécies agrupadas em 11 gêneros (Dickison, 1993; Fritsch et al., 2001). O gênero Styrax L. possui 130 espécies, que compreende cerca de 80 % do total de espécies da família Styracaceae, as quais estão distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais, como no Sudeste da Ásia, Oeste da Malásia e Américas (Hutchinson, 1973; Nakajima e Monteiro, 1986; Dickison, 1993). No Brasil, são encontradas cerca de 25 espécies desse gênero, sendo que quatro estão presentes nos cerrados brasileiros: Styrax camporum Pohl., S. ferrugineus Nees et Mart., S. pohlii A. DC. e S. martii Seub. (Nakajima e Monteiro, 1986; Saraiva et al., 1988).
Figura 1. Styrax camporum Pohl. Fonte: Lorenzi, 1982.
Styrax distingue-se dos outros gêneros de Styracaceae, devido à produção de
material resinoso, vulgarmente chamado como resina de benjoim, normalmente secretada quando se fere a casca da árvore. Essa resina tem sido utilizada em várias partes do mundo em produtos de perfumaria, cosméticos e na medicina popular como expectorante (Costa, 1996), pois possui atividade fungicida, bacteriostática e é utilizada nas preparações inalatórias para bronquite, asma, e outras doenças respiratórias (Steiner e Leifer, 1949; Hjorth, 1961). Por outro lado, a alergia à tintura de benjoim tem sido reportada, embora não seja de forte sensibilização (Scardamaglia et al., 2003).
As plantas desse gênero acumulam diversas classes de compostos como saponinas, triterpenos, lignanas e neolignanas (Pauletti et al., 2006). Estas substâncias apresentam diversas atividades biológicas, as saponinas, por exemplo, possuem atividade fungistática (Zehavi et al., 1986; Segal et al., 1966) e antiinflamatória (Min et al., 2004a). Dentre os efeitos farmacológicos dos triterpenos, destacam-se a atividade no sistema complemento, sendo um indicativo de atividade na terapia de doenças inflamatórias (Min et
al., 2004a), citotóxica (Kim et al., 2004), efeitos inibitórios contra a matriz metaloproteinase
(MPP)-1 (Moon et al., 2005; Kim et al., 2004) e antiinflamatória (Yun et al., 2007).
Em especial as lignanas e neolignanas têm atraído a atenção de pesquisadores devido às diversas atividades biológicas apresentadas (Simões, 2004), dentre elas, destacam-se destacam-se as atividades antibacteriana e antifúngica (Pauletti et al., 2000), antioxidante (Min et al., 2004b), antihipertensiva (Kakie et al., 1994) e antiinflamatória (Min et al., 2004a).
A espécie Styrax camporum Pohl (Figura 1, p. 10), conhecida como "estoraque do campo", "cuia de brejo" e "benjoeiro'', amplamente utilizada em doenças gastroduodenais na medicina popular, teve seu potencial antiulcerativo e toxicidade avaliados. A administração oral a ratos, durante 30 dias, do extrato seco dos seus galhos (70 % etanol), diminuiu o tamanho da úlcera induzida por ácido acético e o volume da secreção ácida e aumentou o número de fibras colágenas. Esses estudos confirmaram a sua eficácia no combate de úlceras estomacais (Bacchi e Sertie, 1994; Bacchi et al., 1995).
Outras espécies de Styrax, como S. pohlii e S. ferrugineus também são empregadas na medicina popular no tratamento de febres (Lorenzi, 1982; Rodrigues e Carvalho, 2008). Na indústria de perfumes e cosméticos, a resina balsâmica conhecida como benjoim, é a matéria-prima principal para a obtenção do ácido benzóico. Na medicina
tradicional é utilizado como adjuvante para inalação das vias respiratórias devido às suas propriedades expectorantes e é comercializada no Brasil (Pauletti et al., 2002).
1.5 LIGNÓIDES
O termo lignóide é uma designação genérica, que caracteriza um grupo de metabólitos secundários, cujo esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo fenilpropânico (C6-C3)n (Figura 2, p. 13), sendo n restrito a poucas unidades (Ward, 1999). Dentre os
lignóides, destacam-se as lignanas e neolignanas.
As lignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento oxidativo, de álcoois cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos, cujo carbono γ ou 8 (C3) da cadeia lateral encontra-se oxidado (Ward, 1999). Assim, as lignanas são biossintetizadas através da dimerização, por acoplamento oxidativo, de unidades fenilpropanoídicas (C6C3), através da ligação do C8-C8’ formando uma variedade de
subclasses estruturalmente bem distintas (Figura 2, p. 13).
Já as neolignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento oxidativo de alil e/ou propenil fenóis e, ao contrário das lignanas, são isentas de oxidação no carbono γ ou 8 (Figura 3, p. 14) (Gottlieb, 1978).
Quando há perda de um ou mais átomos de carbono na estrutura química de uma lignana ou neolignana, é representado pelo prefixo nor (Moss, G.P., 2000).
4 5 6 1 2 3 7 8 9 3 2 1 6 5 4 7 8 9 9' 8' 7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' Fenilpropanóide Lignana Neolignana 9 8 7 1 2 3 4 5 6 3' 2' 1' 7' 8' 9' 6' 5' 4' 1 2 3 4 5 7 8 9 9' 8' 7' 6' 1' 2' 3' 4' 5' N or-lignana 5 6 1 7 8 9 4 3 2 7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' N or-neolignana
Figura 2. Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana , neolignana, nor-lignana e
nor-neolignana.
Os lignóides são amplamente distribuídas no reino vegetal e podem ser encontradas nas raízes, hastes, cascas, frutas e sementes de muitas espécies de plantas (Macrae e Towers, 1984; Gottlieb e Yoshida, 1989), possuindo diferentes níveis de oxidação, modo de substituição e estrutura química.
No gênero Styrax, a classe de lignóides mais encontrados são as nor-neolignanas benzofurânicas: egonol (1), homoegonol (2) (Figura 3, p. 14) e seus derivados. Em 1915, foi isolado pela primeira vez o egonol a partir de sementes de S. japonicum (Okada, 1915) e Kawai e Sugiyama identificaram sua estrutura como sendo 5-(3´´-hidroxipropil)-2-(3´,4´-metilenodioxifenil)-7-metoxibenzofurano (Kawai e Sugiyama, 1939). Foram identificadas outras substâncias como: o homoegonol, isolado de S. officinalis (Segal et al., 1967), desmetoxi egonol (1a) de S. obassia (Takanashi et al., 1974), glicosídeos benzofurânicos (1d-1e; 2a) de S. officinalis (Anil, 1980), e ésteres benzofurânicos (1b-1c) de
R1 O O O R2 R3 R1 CH2OH CH2OH O H2CO CH2O- Gentiobiosil CH2OH- Gentiotriosil CH2O-Glucose O H2CO R2 OCH3 H OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 R3 H H H H H H H (1) Egonol
(1a) Desmetoxi egonol
(1b) Egonol 2-metilbutanoato
(1c) Desmetoxi egonol 2-metilbutanoato
(1d) Egonol-β-gentiobiosídeo (1e) Egonol-β-gentiotriosídeo (1f) Egonol-β-glicosídeo O OCH3 OCH3 R3 R2 R1 H Gentiobiosil Glucosil R2 H H H R3 OCH3 OCH3 OCH3 (2) Homoegol (2a) Homoegonol-β-gentiobiosídeo (2b) Homoegonol-β-glicosídeo R1O
Figura 3. Lignanas isoladas de Styrax.
O egonol, homoegonol e seus derivados juntamente com o egonol-β-glicosídeo (1f) e o homoegonol-β-glicosídeo (2b) apresentaram atividade antibacteriana e antifúngica contra Staphylococcus aureus e Candida albicans (Pauletti et al., 2000). A citotoxicidade do egonol e homoegonol foi avaliada frente a três linhagens celulares Hep-2, HeLa, e C6, sendo que apresentaram atividade moderada (Teles et al., 2005). Adicionalmente, o egonol inibiu a
atividade hemolítica do sistema complemento, este tipo de inibição é benéfico na terapia das doenças inflamatórias (Min et al., 2004a). Assim, devido a ampla ocorrência das nor-neolignanas benzofurânicas em espécies de Styrax estas podem ser consideradas os marcadores quimiossistemáticos do gênero (Pauletti et al, 2006).
A necessidade de determinação e conhecimento dos principais constituintes químicos (padrões ou marcadores), bem como a padronização desses constituintes (responsáveis ou não pela atividade terapêutica) para se assegurar a qualidade, a repetibilidade e minimizar os efeitos adversos promovidos por extratos de plantas medicinais e fitoterápicos torna-se fundamental o desenvolvimento de métodos analíticos confiáveis (Hosttettman e Marston, 2002).
Deste modo, devido à ampla utilização, na medicina popular, de espécies de
Styrax faz-se necessário desenvolver e validar uma metodologia analítica para detecção e
quantificação de egonol (1) e homoegonol (2), os principais compostos encontrados nas espécies de Styrax, S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii.
2 OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e validação de um método analítico para o controle de qualidade de extratos vegetais de espécies de Styrax, principalmente, S. camporum. Para esse propósito, os objetivos específicos foram:
• Extração e isolamento dos marcadores químicos, egonol e homoegonol, do extrato etanólico de S. pohlii;
• Avaliação do perfil químico do extrato padrão de S. camporum por CLAE-DAD;
• Identificação dos marcadores químicos por DAD;
• Otimização da condição cromatográfica para detecção e quantificação dos compostos;
• Preparo dos padrões para obtenção da curva analítica por padronização externa e por adição de padrão;
• Validação da metodologia analítica desenvolvida de tal forma que sejam satisfeitos os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e Recuperação.
• Análise e quantificação dos extratos obtidos, caules e folhas de S. camporum, partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii.
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 EQUIPAMENTOS
• Evaporador rotativo (Büchi, Switzerland )
• Speed Vac (Thermo Electron Corporation, Waltham, EUA);
• Banho ultrassônico (Unique, modelo USC-1400, Indaiatuba, Brasil); • Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear de 1
H (Bruker, modelo Ac-200, Billerica, EUA) - IQ-USP - São Carlos;
• Sistema Direct-Q-UV (Millipore, Billerica, USA);
• Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência de sistema binário (LC-6AD), equipado com um injetor manual Rheodyne com alça de amostragem de 20 µL, desgaseificador DGU-20A5, e acoplado a um detetor PDA série SPDM-20A, com aquisição de dados através de um microcomputador, com software LCsolution (Shimadzu, São Paulo, Brasil);
• Lâmpada UV (Spectroline, modelo ENF-240C, USA)
• Balança analítica (UMark, 250A Bel Engineering, São Paulo, Brasil)
3.2 MATERIAIS
• Solventes grau P.A. (Synth, São Paulo, Brasil);
• Clorofórmio deuterado (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA); • Metanol grau HPLC (J.T. Baker);
• Filtro de membrana de Nylon 66, 0,45 µm x 47 mm (Supelco); • Filtro de membrana de PVDF, 0,45 µm x 13 mm (Supelco);
Sílica GF254 (Sigma-Aldrich) e G (Sigma-Aldrich);
• Coluna ODS, 5 μm, 250 mm x 4,60 mm (Shimadzu Shim-pack) equipada com pré-coluna do mesmo material;
• Solução de vanilina preparada da seguinte forma: pesou-se 0,3 g de vanilina dissolveu-se em 30 mL de uma solução de água (450 mL), ácido sulfúrico (400 mL) e metanol (450 mL).
3.3 MATERIAL VEGETAL
As partes aéreas das espécies S. pohlii A. DC., S. camporum Pohl e S.
ferrugineus Ness et Mart. foram coletadas na Estação Ecológica do Jataí (EEJ), no município
de Luis Antônio (21°33’ a 21°37’ sul e 47°45’ a 47°57’ oeste, em outubro de 2008 e abril de 2009, respectivamente). As exsicatas (SPFR12168, SPFR12170, SPFR12169, respectivamente) foram identificadas pela Profa. Valéria Maria Melleiro Gimenez e pelo Prof. Milton Groppo e depositadas no Herbário do Departamento de Biologia, Laboratório de Sistemática Vegetal, da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil (SPFR).
3.4 OBTENÇÃO DOS PADRÕES
Para reisolamento dos padrões egonol (1) e homoegonol (2) utilizou-se a espécie S. pohlii. Assim, após o processo de secagem (40° C) e trituração em moinho de facas, 2,4 kg das partes aéreas foram submetidas à extração ambiente, por maceração com etanol durante, aproximadamente, três dias, com três repetições. Em seguida, o extrato obtido foi filtrado em papel de filtro e o solvente foi removido sob pressão reduzida, o que resultou em 87 g de extrato bruto.
submetido à partição líquido-líquido com n-hexano. Após evaporação do solvente, através de evaporador rotativo, a partição rendeu 2,8 g. Desta fração n-hexânica, 1,39 g foi submetido a cromatografia em coluna com 28,1 g de sílica gel 70-230 Mesh-ASTM (60 Å, Sigma-Aldrich) em coluna de 1,5 cm de diâmetro e 47 cm de altura. A fase móvel n-hexano-AcOEt foi utilizada em ordem crescente de polaridade: n-hexano (300 mL), n-hexano:AcOEt (9:1, 300 mL; 8:2, 400 mL; 7:3, 300 mL; 6:4, 200 mL; 5:5, 100 mL; 3:7, 200 mL; v/v) AcOEt (100 mL) e MeOH (100 mL). Deste procedimento, foram obtidas 111 subfrações, de 20 mL cada, que após análise por CCDC [n-hexano-AcOEt, 8:2 e 7:3 (v/v)] foram agrupadas em 31 subfrações (Fluxograma 1, p. 21).
Nas subfrações 69-80 e 92-100 identificou-se a presença de duas substâncias diferentes sendo, assim, purificadas por CCDP com fase móvel DCM-MeOH (98:2, v/v), sendo que, da subfração 69-80, originou-se a substância 2 (m= 22 mg) que foi analisada por CLAE-UV e apresentou tR de 25,60 min, sendo identificada por RMN 1H. Na subfração
92-100 foi identificada a presença de 1 (m= 27 mg) que ao ser analisada por CLAE-UV, gerou uma banda cromatográfica com tR de 22,02 min. Essa substância foi identificada por
Fluxograma 1. Fracionamento da fração hexânica de S. pohlii.
3.5 PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA
3.5.1 Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol
Preparou-se uma solução dos padrões 1 e 2 (5,0 mg/mL cada) em metanol (1 mL). A partir desta solução, uma solução estoque (84 μg/mL) foi preparada em metanol-água (95:5, v/v) em balão volumétrico.
A partir dessa solução, sete soluções padrão nas concentrações de 0,36, 1,47, 5,25, 10,50, 21,00, 33,60 e 42,00 μg/mL foram obtidas.
Para o preparo das soluções controle de qualidade foram feitas soluções nas concentrações de 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL a partir da solução estoque.
CCDP(DCM:MeOH) CCDC (n-hexano:AcOEt) CC (n-hexano:AcOEt) Fração n-hexano m=1,39g 111 Subfrações Agrupamento em 31 Subfrações Subfr. 69-80 Subfr. 92-100 Subfr. 1 m = 27 mg 1 Subfr. 1 m = 22 mg 2
3.5.2 Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum
Pesou-se exatamente 1 g de pó seco dos caules de S. camporum e extraiu-se com 10 mL de diclorometano através de banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução foi filtrada em papel de filtro e concentrada em Speed Vac. Em seguida, o material foi ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v).
3.5.3 Preparo das amostras
O pó das folhas secas de S. camporum (1 g) foi extraído em 10 mL de diclorometano com o banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução foi filtrada em papel de filtro e concentrada usando Speed Vac. O material foi ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v). Os extratos brutos etanólicos das partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii (4,0 mg/mL de cada), anteriormente produzidos pelo nosso grupo de pesquisa, foram preparados em 1,0 mL de metanol-água (95:5, v/v).
3.6 CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA
EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD)
Estudos preliminares foram feitos utilizando um gradiente exploratório contendo metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 5 % a 100 % de metanol em 50 minutos, 100 % de metanol durante 10 min. O tempo de análise total foi de 78 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial e 15 min de equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um fluxo de 1,0 mL/min.
Na tentativa de melhorar as condições de análise, o seguinte gradiente foi empregado: metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 50 % a 100 % de metanol em 30 min,
equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um fluxo de 1,0 mL/min.
A fase móvel usada no desenvolvimento e validação do método para quantificação de 1 e 2 foi composta de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v/v) e fluxo de 1,0 mL / min. Os espectros de UV foram registrados entre 200-400 nm e a detecção feita em 311 nm.
3.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
A validação do método analítico foi realizada de acordo com os requisitos do Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos publicados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, RE 899, 2003).
3.7.1 Curva analítica por padronização externa
Para a construção da curva de calibração por padrão externo utilizou-se sete concentrações diferentes de cada padrão, obtidas através de diluições da solução estoque (84 μg/mL) em metanol-água (95:5, v/v).
As soluções contendo 0,36, 1,47, 5,25, 10,5, 21,0, 33,6 e 42,0 μg/mL de 1 e 2, foram injetadas em triplicata para obter a curva de calibração e, assim, determinar a linearidade do método. A curva de calibração foi obtida plotando a área do pico versus a concentração em μg/mL do composto, com a ajuda do programa GraphPad Prism. A linearidade foi obtida a partir do valor do coeficiente de correlação (r).
33,6, 42,0, 50,4 e 67,2 μg/mL de 1 e 2 foram transferidas para tubo Falcon com o auxílio de uma micropipeta, concentradas utilizando um concentrador Speed Vac. Em seguida, foi adicionada uma quantidade constante de 50 µL do extrato padrão dos caules de S. camporum e 250 µL de metanol-água (95:5, v/v). As soluções foram injetadas em triplicata. A curva de calibração por adição de padrão foi construída pelo programa GraphPad Prism. A linearidade foi obtida através do valor do coeficiente de correlação (r).
3.7.3 Seletividade
Para avaliar a seletividade do método, o detector de arranjo de fotodiodo (DAD) foi usado para identificar o egonol e o homoegonol e verificar a pureza desses padrões nos extratos a partir das áreas dos picos correspondentes. Os tempos de retenção dos padrões 1 e 2 foram empregados para a identificação dos mesmos no cromatograma obtido para os extratos.
3.7.4 Recuperação
A eficiência da extração do egonol e homoegonol foi determinada a partir das três soluções de controle de qualidade, 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL que foram adicionadas a amostras de 1 g de pó seco dos caules de S. camporum, extraídas com 10 mL de DCM em banho ultrassônico por 10 min. O solvente foi evaporado em Speed Vac e o material ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v), para então serem analisadas em quintuplicata. O percentual de recuperação foi determinado comparando-se as áreas das bandas cromatográficas das amostras que foram tratadas com os resultados obtidos a partir da análise das amostras que não foram tratadas.
3.7.5 Precisão (inter e intra-dia)
A precisão do método foi determinada avaliando-se em quintuplicata as três soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL), em três dias não consecutivos. A precisão e repetibilidade foram confirmadas pelo valor do desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV %) dos ensaios intra e interdias.
O DPR foi calculado pelo desvio padrão (s) sobre o valor médio medido multiplicado por 100 sendo admitidos valores de CV % menores ou iguais a 5 % (ANVISA, 2003).
Coeficiente de variação: CV % =
3.7.6 Exatidão
A exatidão do método foi verificada a partir da análise em quintuplicata das soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL). A exatidão foi expressa pela relação entre o valor médio das concentrações encontradas e o valor da concentração teórica multiplicado por 100. Para a exatidão foram aceitos valores menores ou iguais a 20 % (ANVISA, 2003).
Exatidão =
determinados de acordo com a curva de calibração, como LOD = 3 x (s/IC) e LOQ = 10 x (s/IC), onde s é o desvio padrão do branco e IC é a inclinação da curva de calibração.
Resultados e
Discussão
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE Styrax
Os compostos egonol (1) e homoegonol (2) (Figura 4, p. 29) foram eleitos como marcadores químicos dos extratos de Styrax, pois, até o momento da realização deste trabalho não havia relatos na literatura sobre qual substância, em particular, poderia estar relacionada à propriedade antiulcerativa atribuída à espécie S. camporum (Moraes et al., 2011). Assim, devido à ampla ocorrência das nor-neolignanas benzofurânicas em espécies de
Styrax estas foram escolhidas como padrão externo no desenvolvimento e validação de um
método cromatográfico para análise de extratos de Styrax.
Com base nos Rf das cromatoplacas, nos tempos de retenção (tR1 12,07 min e
tR2 20,92 min) dos cromatogramas preliminares obtidos por CLAE-DAD, nos espectros de
UV-Vis e em comparação com padrões disponíveis no nosso laboratório, constatou-se que o egonol e homoegonol, compostos de média polaridade, eram acessíveis em maior quantidade e facilidade no extrato bruto etanólico de S. pohlii. Assim, este extrato foi submetido a processo de partição líquido-líquido e a fração hexânica rica nesses compostos foi purificada por coluna cromatográfica seguida de uma CCDP.
Os compostos isolados foram identificados por análise de RMN 1H e suas estruturas foram confirmadas por comparação com dados espectrais disponíveis na literatura (Schreiber e Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000).
O O O OCH3 HO 1 2 2 3 5 8 9 1" 2'' O OCH3 OCH3 OCH3 HO 2 3 5 8 9 1" 2' 3' 6 7 4 1 3'' 4'' 5'' 6'' 2' 3' 4 6 7 1 2'' 3'' 4'' 5'' 6''
na região correspondente a hidrogênio de anel aromático. O sinal em δ 7,39 foi atribuído ao H-6′ (dd, J = 8,1 e 1,7, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto e meta respectivamente com o H-5′ (δ 6,86, d, J = 8,1, 1H) e o H-2′ (δ 7,32, d, J = 1,7, 1H), revelando um anel aromático trissubstituído. Os sinais dos hidrogênios H-4 (δ 6,96, d, J = 1,4, 1H) e H-6 (δ 6,63, d, J = 1,4, 1H) indicaram a presença de um acoplamento meta e a presença de um anel aromático tetrassubstituído. Os sinais em δ
2,77 (t, J = 7,6, 2H), δ 1,95 (m, 2H) e δ 3,70 (t, J = 6,2, 2H) indicaram a presença de uma cadeia alifática.
Os singletos em δ 6,78 (H-3) e em δ 6,00 (s, 2H) e δ 4,03 (s, 3H) indicaram a presença de anel benzofurânico, um grupamento metilenodioxi e uma metoxila ligados a anel aromático, respectivamente. Esses dados confirmaram a presença de uma nor-neolignana tipo benzofurânica comumente encontrada em espécies de Styrax, o egonol (1).
O espectro de RMN 1H de 2 (Figura 6, p. 33, Tabela 1, p. 31), apresentou sinais semelhantes aos da substância 1. Sendo que o sinal em δ 7,45 foi atribuído ao H-6′ (dd, J= 8,5 e 2,0, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram o mesmo tipo de acoplamentos, isto é, em posição orto e meta com o H-5′ (δ 6,93, d, J= 8,5, 1H) e o H-2′ (δ 7,37, d, J=2,0, 1H) revelando um anel aromático trisubstituído. Adicionalmente, os sinais dos hidrogênios H-4 (δ 6,98,d, J= 1,5, 1H) e H-6 (δ 6,65, d, J=1,5, 1H) e os valores das constantes de acoplamento evidenciaram acoplamento em meta e indicaram a presença de outro anel aromático tetrasubstituído. O singleto em δ 6,83 (1H), foi atribuído ao hidrogênio do anel benzofurano. Os sinais em δ 3,71 (t, J=6,4, 2H), δ 2,79 (t, J=7,6, 2H) e δ 1,96 (m, 2H) indicaram uma cadeia alifática. Os singletos integrados para 3H em δ 4,03, δ 3,98 e δ 3,93 confirmaram a presença de três metoxilas. Esses dados quando analisados em conjunto com os valores disponíveis na literatura (Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000; Schreiber e Stevenson, 1976) permitiram identificar a estrutura do homoegonol, uma nor-neolignana de ampla ocorrência em espécies de Styrax.
(CDCl3, 200 MHz). H 1 δ, m, J (Hz) 1* δ, m, J (Hz) 2 δ, m, J (Hz) 2** δ, m, J (Hz) 3 6,78 s 6,76 s 6,83 s 6,75s 4 6,96 d (1,4) 6,91 d (2,0) 6,98 d (1,5) 6,90 d (2,0) 6 6,63 d (1,4) 6,57 d (2,0) 6,65 d (1,5) 6,60 d (2,0) 2´ 7,32 d (1,7) 7,29 d (2,0) 7,37 d (2,0) 7,29 d (2,0) 5´ 6,86 d (8,1) 6,83 d (2,0) 6,93 d (8,5) 6,80 d (8,0) 6´ 7,39 dd (8,1 e 1,7) 7,39 dd (2,0; 8,0) 7,45 dd (8,5 e 2,0) 7,35 dd (2,0; 8,0) 1´´ 2,77 t (7,6) 2,82 t (8,0) 2,79 t (7,6) 2,79 t (8,0) 2´´ 1,95 m 2,02 m 1,96 m 1,97 m 3´´ 3,70 t (6,2) 3,78 t (7,8) 3,71 t (6,4) 3,78 t (7,8) 7-OCH3 4,03 s 4,01 s 4,03 s 3,99 s OCH2O 6,00 s 5,94 s - - 3´-OCH3 - - 3,98 s 3,97 s 4´-OCH3 - - 3,93 s 3,85 s *
Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000
SpinWorks 2.5: PADRAO P/ PROTON 0.1% ET. BENZ. EM CDCL3 TMS 21/10/01 PPM 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0 0. 993 0. 785 0. 822 0. 939 0. 793 0. 873 1. 819 2. 999 2. 072 2. 069 1. 829 7. 4216 7. 4130 7. 3808 7. 3722 7. 3228 7. 3144 7. 2589 6. 9719 6. 9686 6. 9650 6. 8845 6. 8432 6. 7857 6. 6334 6. 6265 6. 0011 4. 0304 3. 7386 3. 7066 3. 6747 2. 8131 2. 7771 2. 7369 1. 9799 1. 9483 1. 9405 1. 9360 1. 9038 0. 0000 Figura 5. Espectro de RMN 1Hde 1 (CDCl3, 200 MHz). 00 6.90 6.80 6.70 6.60 6. 9719 6. 9686 6. 9650 6. 8845 6. 8432 6. 7857 6. 6334 6. 6265 7.40 7.30 7.2 7. 4216 7. 4130 7. 3808 7. 3722 7. 3228 7. 3144 7. 2589
PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -0.0 0. 998 0. 936 0. 974 1. 027 0. 960 0. 976 3. 319 3. 240 2. 927 2. 141 2. 161 2. 044 7. 4807 7. 4705 7. 4387 7. 4290 7. 3723 7. 3624 7. 2632 6. 9880 6. 9834 6. 9810 6. 9473 6. 9051 6. 8383 6. 6434 6. 6363 4. 0410 3. 9891 3. 9314 3. 7515 3. 7196 3. 6879 3. 6672 2. 8267 2. 7907 2. 7504 1. 9929 1. 9613 1. 9533 1. 9490 1. 9167 1. 2546 0. 0014 Figura 6. Espectro de RMN 1Hde 2 (CDCl3, 200 MHz). PM 7.44 7.40 7.36 7.32 7.28 7.24 7.20 7.16 7.12 7.08 7.04 7.00 6.96 6.92 6.88 6.84 6.80 6.76 6.72 6.68 6.64 0. 998 0. 936 0. 974 1. 027 0. 960 0. 976 7. 4807 7. 4705 7. 4387 7. 4290 7. 3723 7. 3624 7. 2632 6. 9880 6. 9834 6. 9810 6. 9473 6. 9051 6. 8383 6. 6434 6. 6363
4.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL E HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax
A exigência cada vez maior da qualidade nos produtos de origem vegetal requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes que garantam a segurança na identificação e quantificação de diferentes substâncias presentes na matriz. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido muito utilizada para a padronização e o controle de qualidade de materiais vegetais (matéria-prima) e produtos fitoterápicos em processos acabados (He, 2000).
As impressões digitais químicas (fringerprinting) obtidos por técnicas cromatográficas, especialmente pelas hifenadas, são recomendadas para o controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos, uma vez que podem representar adequadamente a integridade do produto e, portanto, a autenticidade das plantas medicinais (Giri et al., 2010; Gong et al., 2003). Através da hifenação é possível combinar uma técnica de separação com outra técnica de determinação estrutural e identificação de compostos, permitindo uma análise completa da amostra.
De acordo com Snyder e Dolan (1996), para desenvolvimento de um método cromatográfico empregando CLAE no modo reverso, é indicado iniciar utilizando uma eluição gradiente exploratória, a qual tem por objetivo determinar se uma condição gradiente ou isocrática é a mais apropriada para a análise de uma amostra em estudo. Nessa eluição, emprega-se uma mistura de H2O (solvente A) e um solvente orgânico (solvente B - MeOH ou
ACN) como constituintes da fase móvel, sendo que ocorre a variação da concentração de % B em um tempo definido (1 hora), sob condições de vazão determinadas e constantes (2,0 mL/min).
O modo isocrático é preferível quando se tem valores baixos de tR e uma boa
resolução dos picos. Assim, a eluição gradiente exploratória indicará qual a porcentagem do solvente B a ser empregado na análise para se obter os valores de tR desejados (Snyder e
No caso do modo gradiente, a escolha se dará com base nos valores elevados de tR e na grande diversidade química ou ainda se não for possível uma boa separação
cromatográfica. A eluição exploratória permite avaliar qual a melhor percentual do solvente B a ser empregada (concentração inicial e final), reduzindo assim, a faixa de gradiente empregado e o tempo de análise (Snyder e Dolan, 1996).
A fim de se avaliar o perfil químico do extrato vegetal padrão dos caules de S.
camporum e identificar a fase móvel mais eficiente para separação dos compostos da
amostra, foi realizada uma análise em gradiente exploratório por CLAE-DAD.
As condições de análise propotas por Snyder e Dolan (1996) foram adaptadas neste estudo, como a redução da vazão visando avaliar a melhor interação dos compostos da amostra com a fase estacionária.
Utilizou-se uma coluna C18 , inicialmente eluída com gradiente MeOH-H2O
(0,1% de ácido acético) (Figura 7, p. 36) de 5 % a 100 % de MeOH em 50 min, e 100 % MeOH durante 10 min, sendo o total da análise 78 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial, e 15 min para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. O perfil cromatográfico inicial do extrato padrão de S. camporum mostrou vários picos menores e dois picos mais intensos em 311 nm relativos aos compostos 1 e 2. Foi possível notar nesse cromatograma a presença de poucas bandas cromatográficas no início da análise.
Assim, com intuito de melhorar esses dados o gradiente anterior foi modificado para MeOH-H2O (0,1 % de ácido acético) (Figura 8, p. 36) de 50 % a 100 % de MeOH em 30
min, e 100 % MeOH durante 5 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial, e 15 min para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. Nesta nova condição as bandas cromatográficas relativas aos compostos 1 e 2 eluidas em tR menores, o que é importante em
termos de análise, pois, nesta condição tem-se um tempo de corrida menor.
Com base também nas eluições com gradiente foi possível confirmar que ambos os padrões possuíam média polaridade, e que seria possível quantificar os padrões egonol e homoegonol na matriz de forma mais rápida e eficiente, através da otimização das condições cromatográficas no modo de eluição isocrático. Assim, algumas condições isocráticas empregando MeOH-H2O e ácido acético foram testadas. A resolução adequada e
pureza dos extratos, avaliada pelo detector DAD, foram obtidas com a fase móvel composta de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v /v) (Figura 9, p. 37).
0 10 20 30 40 50 min 0 25 50 75 100 125mAU
Figura 7. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, Vinj= 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min 0 50 100 150 200 250 mAU
Figura 8. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S.
camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 50 % a 100 % de MeOH
(solvente B) em 30 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, Vinj= 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL.
1 2
1 2
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 50 100 mAU 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 50 100 150 mAU 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 50 100 mAU 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 50 100 150 200 mAU
Figura 9. Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do caule de S. camporum; (b) extrato das folhas de S. camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d) extrato das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições cromatográficas: metanol-água-ácido acético (73:26.9:0.1, v/v/v) e detecção em 311 nm. 1 2 1 2 1 2 1 2 (a) (b) (c) (d)
4.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO
Os parâmetros de “performance” avaliados foram: seletividade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão, recuperação, limite de detecção e limite de quantificação, seguindo como referência os limites aceitáveis propostos pelo Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos (ANVISA, 2003).
4.3.1 Seletividade e Especificidade
A curva de calibração (Figura 10, p. 39) pelo método de adição de padrão foi realizada para avaliar a interferência da matriz. Esta curva de calibração foi estabelecida pela análise na faixa de 10,5 a 67,2 μg/mL para 1 e 2. As equaçes de regressão encontradas foram y = 138.900 x + 234.200 e y = 103200 x - 316.100, com um coeficiente de correlação (r) de 0,9986 e 0,9994, respectivamente, e com CV < 2 % para a análise em triplicata. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa nos resultados obtidos pela curva de adição de padrão e os obtidos pela curva de calibração externa.
O software LCsolution do CLAE-DAD indicou também que os picos referentes aos compostos 1 e 2 eram exclusivamente destes e que não havia coeluição de nenhum outro componente da matriz vegetal. Desse modo, com base na curva de calibração por adição de padrão e pelos dados gerados pelo DAD (Tabela 2, p. 39), concluiu-se que o método desenvolvido apresenta seletividade e especificidade adequadas para os padrões em cada um dos extratos analisados, com boa resolução.
A pureza dos padrões isolados, 1 e 2, foi determinada pelas áreas dos picos detectados por CLAE-DAD como sendo 100% e 98,7%, respectivamente (Tabela 2, p. 39).
Tabela 2. Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol (2). Pureza do padrão Similaridade
1 100 %
98,7 %
0.999
2 0.998
4.3.2 Linearidade
O método de padronização foi com padrão externo, sendo que a resposta do detector DAD a 311 nm apresentou-se linear nas concentrações de 0,36 a 0,42 μg/mL para 1 e 2. As equações de regressão encontradas foram y = 123.000 x - 2.743 e y = 93.490 x - 10.630, com um coeficiente de correlação (r) de 0,9999 e 0,9998, respectivamente, e com um CV de < 2 % para a análise em triplicata (Figura 11, p. 40).
Padrão 1 - Egonol 0 20 40 60 80 0 5.0×106 1.0×107 1.5×107 Linearidade Adição de Padrão concentração [µg/mL] Ár e a
Padrão 2 - Homoegonol 0 20 40 60 80 0 2.0×106 4.0×106 6.0×106 8.0×106 Linearidade Adição de Padrão concentração [µg/mL] Ár e a
Figura 11. Curva de calibração padrão externo x linearidade padrão 2.
4.3.3 Precisão
A precisão desenvolvida no método foi a de repetibilidade através da análise em quintuplicata de três soluções padrão com concentração baixa (10,5 μg/mL), média (33,6 μg/mL) e outra alta (67,2 μg/mL) em relação às concentrações da curva de calibração, em três dias não consecutivos. Os resultados para as replicatas das amostras apresentou CV % de 0,26 a 0,57 para o padrão 1 e de 0,27 a 0,73 para o padrão 2. As análises apresentaram dentro dos limites de aceitação estabelecidos para o método, não excedendo 5 % (Tabela 3, p. 41).
4.3.4 Exatidão
A exatidão do método também foi avaliada através da análise em quintuplicata das concentrações baixa, média e alta. Os valores estão de acordo com os critérios de aceitação estabelecidos para o método, contemplando valores de 99,3 a 104,0 para o padrão 1 e de 105,9 a 110,0 para o padrão 2, ou seja, com variabilidade menores ou igual a 20 % (Tabela 3, p. 41).
