Importância das técnicas de Biologia Molecular para diagnóstico e acompanhamento da Hepatite C
Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças
Instituto Adolfo Lutz
Curso de Especialização
Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Lia Lory Gama da Cunha
São Paulo 2019
Trabalho de conclusão de curso de especialização apresentado ao Instituto Adolfo Lutz- Unidade do Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP-Doutor Antônio Guilherme de Souza como requisito parcial para obtenção do titulo de Especialista em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública
Orientador: Profª Adriana Parise Compri Importância das técnicas de Biologia
molecular para diagnóstico e acompanhamento da Hepatite C
São Paulo (SP) 2019
RESUMO
O diagnóstico das hepatites virais é baseado na detecção de marcadores presentes no sangue, soro, plasma ou fluido oral da pessoa infectada, por meio de imunoensaios e/ou na detecção do ácido nucléico viral, empregando técnicas de biologia molecular. Os métodos moleculares vêm sendo muito utilizados no diagnóstico de diversas infecções e apresentam muitas vantagens devido à sua alta especificidade. Objetivos: Analisar a importância das técnicas de biologia molecular no diagnóstico e acompanhamento do paciente infectado pelo vírus da Hepatite C. Material e métodos: Para avaliar a importância das técnicas moleculares foram selecionadas amostras de pacientes diagnosticados com hepatite C crônica do genótipo 1, recebidas e estocadas no Laboratório de Hepatites virais do Centro de Virologia do IAL, no período de 2012 a 2014. Foi realizada a amplificação do material genético por PCR em tempo real e PCR convencional para posterior seqüenciamento do genoma do HCV. Resultados: No período de 2012 a 2014, foram escolhidas para o estudo, 996 amostras de pacientes com genótipo 1 da rotina do laboratório de Hepatites virais. Das amostras analisadas, 54,22% eram provenientes de pacientes do sexo masculino e 45,78% de pacientes do sexo feminino. A faixa etária predominante foi de 40 a 49 anos. Em relação à quantificação da carga viral do HCV, realizado por PCR em tempo real, observou-se média de Log de 5,86, com valor máximo de 7,62 e mínimo de 2,25. Do total de 996 amostras analisadas por PCR convencional, foi possível amplificar 919 amostras. Para as amostras positivas foi realizado o sequenciamento do genoma viral. Conclusão: É notável a importância das técnicas moleculares no manejo de pacientes infectados pelo HCV. O diagnóstico preciso e precoce permite um tratamento adequado, impactando diretamente na qualidade de vida do indivíduo. Além disso, é um instrumento de prevenção de agravos mais freqüentes relacionados à infecção, como cirrose hepática e carcinoma hepatocelular.
ABSTRACT
The diagnosis of viral hepatitis is based on the detection of markers in the blood, serum, plasma or oral fluid of the infected person by means of immunoassays and / or detection of viral nucleic acid using molecular biology techniques. Molecular methods have been widely used in the diagnosis of various infections and have many advantages because of their high specificity. Objectives: To analyze the importance of molecular biology techniques in the diagnosis and follow-up of patients infected with hepatitis C. Material and methods: To evaluate the importance of molecular techniques, samples were selected from patients diagnosed with chronic hepatitis C genotype 1, stocked in the Laboratory of Viral Hepatitis of the Center of Virology of the IAL, from the period of 2012 to 2014. The genetic material was amplified by real-time PCR and conventional PCR for subsequent sequencing of the HCV genome.
Results: Between 2012 and 2014, 996 samples of patients with genotype 1 from the
routine of the laboratory of viral hepatitis were chosen for the study. Of the samples analyzed, 54.22% were from male patients and 45.78% from female patients. The predominant age group was 40 to 49 years. Regarding the quantification of HCV viral load, performed by real-time PCR, we observed a Log mean of 5.86, with a maximum value of 7.62 and a minimum of 2.25. From the total of 996 samples analyzed by conventional PCR, it was possible to amplify 919 samples. For the positive samples, the viral genome was sequenced. Conclusion: The importance of molecular techniques in the management of patients infected with HCV is remarkable. Precise and accurate diagnosis allows an appropriate treatment, directly impacting the quality of life of the individual. In addition, it is an instrument for the prevention of more frequent diseases related to infection, such as cirrhosis of the liver and hepatocellular carcinoma.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo replicativo do HCV ... ...
9 Figura 2 – Esquema do genoma do HCV... 10 Figura 3 – Gráfico da estratégia da OMS para eliminação das Hepatites
virais até 2030... 12 Figura 4 – Representação do controle Low DNA Mass Ladder de acordo
com o volume de amostra e padrão utilizados... 21 Figura 5 – Corrida do fragmento de NS5B mais padrão de quantificação em gel
de eletroforese 2%... 24 Figura 6 – Representação do eletroferograma obtido da região NS5B do HCV... 25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Interpretações dos resultados de qPCR obtidos pelo
Equipamento m2000rt ... 19 Tabela 2 – Características dos pacientes incluídos no estudo ... 23
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT Alanina aminotransferase cDNA DNA complementar
CEPIAL Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz CHC carcinoma hepatocelular
CLIA imunoensaio de quimioluminescência DAA - droga de ação direta
ddNTPs didesoxinucleotídeos DNA Ácido desoxirribonucleico
ECL imunoensaio de eletro-quimioluminescência EDTA Ácido Etilenodiamino Tetracético
EIA imunoensaio enzimático GT genótipo
HCV vírus da Hepatite C
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IAL Instituto Adolfo Lutz
IFN Interferon
mRNA Rna mensageiro ng nanograma
nm nanômetro
OMS Organização Mundial da Saúde
ORF “open read frame” (fase de leitura aberta) PCR reação em cadeia pela polimerase
qPCR PCR em tempo real RNA ácido ribonucleico
RVS resposta virológica sustentada SUS Sistema Único de Saúde TAE Tris-Acetato-EDTA Taq Thermus aquaticus μL microlitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 8
1.1. Vírus Da Hepatite C (HCV)... 8
1.2. Historia Natural da doença... 10
1.2.1. Fase Aguda... 10 1.2.2. Fase Crônica... 10 1.3. Transmissão e Epidemiologia... 11 1.4. Diagnóstico... 13 1.4.1. Testes Sorológicos... 13 1.4.2. Testes Moleculares... 14 1.4.2.1. PCR... 14 1.4.2.2. Sequenciamento... 15 2. OBJETIVOS.... 16 3. REFERENCIAL TEÓRICO... 16 4. MATERIAL E MÉTODOS... 17 4.1. Amostras... 17 4.2. Aspectos Éticos... 17
4.3. PCR em tempo real quantitativo... 18
4.4. PCR convencional e sequenciamento do genoma do HCV... 19
4.4.1. Extração do RNA... 19
4.4.2. PCR... 19
4.4.3. Identificação do produto amplificado... 20
4.4.4. Seqüenciamento do genoma do HCV... 21
4.4.5. Edição das sequências... 22
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 22
6. CONCLUSÃO... 26
8
1. INTRODUÇÃO
A Hepatite é uma doença que causa inflamação hepática e que tem como agravos o quadro de cirrose (necrose hepática) e pode em casos mais graves evoluir para carcinoma hepatocelular (CHC). Esse processo inflamatório pode ocorrer por vários fatores, como medicamentos, alterações genéticas, disfunção metabólica, por ação de agentes tóxicos e exposição a agentes infecciosos1.
A hepatite viral é uma doença infecto contagiosa, causada por vírus com tropismo por células hepáticas (hepatócitos), a exemplo os vírus A, B, C, D e E, os quais apresentam mecanismos de infecção e agravos distintos2. A Hepatite C representa um sério problema em saúde pública devido ao número de indivíduos infectados, sendo que destes, 50 a 85% desenvolvem a forma crônica com aumento do risco de progredir para cirrose, CHC e óbito3.
1.1. Vírus da Hepatite C (HCV)
O HCV foi descrito na sua forma molecular pela primeira vez em 1989 por -Choo et al. 4. Anteriormente, em meados da década de 70, o vírus era classificado como vírus da hepatite não-A e não-B, relacionado principalmente a casos de hepatite crônica em pacientes transplantados e que receberam transfusão sanguínea.
É um vírus pequeno (com cerca de 50nm de diâmetro), envelopado, pertencente à família Flaviviridae e ao gênero Hepacivirus. Seu genoma viral é constituído por um vírus de RNA cadeia simples polaridade positiva que atua como RNA mensageiro (mRNA), com 9.600 nucleotídeos aproximadamente 5,6.
A entrada do vírus na célula hospedeira depende receptores de lipoproteínas, de co-receptores e proteínas de junção celular 1,7,8 (figura 1).
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Figura1: Ciclo replicativo do HCV.
Fonte: Adaptado de MORADPOUR; PENIN; RICE, 2007.
(a) entrada do vírus a célula por endocitose; b) exposição do genoma viral; c) tradução e processamento das proteínas virais mediada por IREs; d) Replicação: formação da fita de RNA polaridade negativa e formação, a partir deste, do RNA polaridade positiva; e) empacotamento e montagem da partícula viral e f) maturação liberação do vírion.
O genoma do vírus (figura 2) é composto por duas regiões terminais conservadas e não codificadoras (UTR) 5’ e 3’ e uma região de leitura aberta (ORF-
open reading frame) capaz de produzir uma poliproteína precursora com
aproximadamente 3.000 aminoácidos 5,6.
A poliproteína produzida pela ORF é clivada por proteases celulares e virais formando 10 proteínas 1,5,9. Essa poliproteína é separada em duas regiões, terço N-terminal (amina-N-terminal) que codifica as proteínas estruturais do virion (Core e as glicoproteínas do envelope E1 e E2), e terço C-terminal (carboxiterminal) que codifica as proteínas não estruturais (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) 1,9,10.
10
Figura 2: Esquema do genoma do HCV.
Fonte: Adaptado de RICE, 2011.
1.2. História natural da doença
A hepatite C pode apresentar-se nas formas aguda e crônica. Dos infectados por esse agravo, cerca de 70 a 80% evoluem para forma crônica (infecção por mais de 6 meses). A hepatite C crônica pode permanecer estável, e evoluir de maneira lenta; neste caso o individuo não apresenta lesões graves, ou rápida progressão para cirrose e até CHC. A evolução e progressão da doença dependem da resposta imunológica ao HCV. Em alguns casos pode apresentar-se na forma fulminante1.
1.2.1. Fase aguda
É caracterizada pelos 6 primeiros meses após o contato com o vírus, podendo variar de caso para caso. A característica clínica nesta fase inclui elevação excessiva dos níveis de alanina aminotransferase (ALT), com anticorpo anti-HCV positivo e/ou RNA de HCV detectável. As manifestações clínicas incluem quadros de icterícia, febre, dor de cabeça, mal-estar, anorexia, náuseas, vômitos, diarréia ou dor abdominal. Porém a maioria dos indivíduos infectados não apresenta a forma sintomática da infecção nesta fase 11.
1.2.2. Fase crônica
Caracterizada pela persistência da infecção (após 6 meses do contato com o vírus). A infecção crônica causa inflamações hepáticas como fibrose, possível
11
evolução para cirrose e CHC; e inflamações sistêmicas como problemas renais. Há estudos que associam a infecção por HCV com resistência a insulina e aterosclerose 12.
1.3. Transmissão e Epidemiologia
A principal via de transmissão é a parenteral, entretanto existem relatos de transmissão sexual e vertical 11. De acordo com a OMS, procedimentos de saúde inseguros e uso de drogas injetáveis foram as principais causas de novas infecções pelo HCV, representando a maioria das novas infecções em 2015. A prevalência global da infecção pelo HCV está estimada em 1%, com aproximadamente 71 milhões de indivíduos cronicamente infectados no mundo 13
A Hepatite viral causa cerca de 1,4 milhão de mortes ao ano por infecção aguda e câncer de fígado relacionado à hepatite e cirrose. Aproximadamente 48% dessas mortes são atribuídas ao HCV, o restante está associado aos vírus das hepatites B, A e E, respectivamente 14. Analisando o perfil epidemiológico dos casos de hepatite C nas Américas observa-se que os casos chegam a 7,2 milhões de infecções crônicas por esse vírus no ano de 2017 15.
De acordo com o Boletim Epidemiológico das Hepatites Virais de 2018 aproximadamente 63% dos testes reagentes para anti-HCV e HCV-RNA são da região Sudeste. Em 2017 foi observado que as maiores taxas de detecção foi na faixa etária entre 55 a 59, destes a maioria dos casos em indivíduos do sexo masculino. Na faixa etária até 34 anos a razão de detecção entre os sexos foi similar. A principal forma clínica de hepatite C notificada no Sinan foi à crônica com porcentagem acima de 60%, além disso, o percentual da forma fulminante foi de 0,2% sem grandes variações2.
Até o momento, o HCV possui 7 genótipos principais classificados de 1 a 7, incluindo 67 subtipos confirmados e 20 ainda em classificação com base na análise filogenética do genoma viral. O genótipo (GT) 1 corresponde a 46% de todas as infecções sendo o mais prevalente no mundo, seguido do GT3 com 30%. Os genótipos 2, 4 e 6 são responsáveis por 22,8% e GT5 menos de 1%. O GT2 é mais prevalente na Ásia e África Ocidental, GT3 mais comum no sul da Ásia, Austrália e alguns países da Europa, GT4 na Europa Central e Oriental África Subsaariana,
12
Norte da África e no Médio Oriente, GT5 na África Austral e GT6 no Sudeste da Ásia 16,17.
Em relação ao GT7, foi relatado um caso isolado no Canadá de um imigrante da África Central. Na América Latina tropical os genótipos circulantes mais prevalentes são o 1, 3 e 2 respectivamente17. Devido ao número de casos, agravos relacionados, dentre eles o carcinoma hepatocelular, o número de óbitos e gastos públicos com diagnóstico e tratamento das hepatites, essa doença foi reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um grave problema de saúde pública, o que levou a elaboração do documento “Global Health Sector Strategy on
Viral Hepatitis 2016–2021: Towards Ending Viral Hepatitis” (figura 3), que tem como
objetivo estabelecer estratégias para alcançar a meta de eliminação das hepatites até 2030, reduzindo os novos casos em 90% e em 65% os óbitos a ela relacionados 2,14.
Figura 3: Gráfico da estratégia da OMS para eliminação das Hepatites virais até 2030.
Fonte: adaptado de Global Health Sector Strategy on Viral Hepatitis, 2016–2021.
A estratégia baseia-se em três estruturas de organização: cobertura universal de saúde; o contínuo cuidado dos serviços de hepatite e a abordagem da saúde pública. Os objetivos desta estratégia vão além das metas de eliminação relacionadas diretamente a saúde, visa também, a redução da pobreza, redução da
13
fome, gerenciamento de água e saneamento básico e inclusão, minimizando a desigualdade e financiamento de capacitação de profissionais para implementação dessas medidas 14.
1.4. Diagnóstico
A abordagem laboratorial inicial e de rotina tem distintas finalidades como: triagem, confirmação do diagnóstico, estabelecer tratamento recomendado, avaliar resposta terapêutica e auxiliar na rastreabilidade do câncer18. Foi estabelecido que os exames de quantificação da carga viral do HCV devem ser realizados a cada seis meses no mínimo, dependendo do estado clinico do paciente, tratamento e gravidade da doença 18,19.
Com isso, pretende-se promover melhor rastreabilidade da infecção, resultando em maior número de pessoas infectadas com diagnóstico e tratamento, como estabelecido pela OMS.
1.4.1. Testes sorológicos
Os testes de primeira linha para o diagnóstico do HCV se baseiam na pesquisa de anticorpos (anti-HCV) específicos. Os testes estão disponíveis na forma de Testes Rápidos (TR) que são testes qualitativos do anticorpo Anti-HCV, por método imunocromatográfico, usando antígenos sintéticos e recombinantes imobilizados na membrana para identificação seletiva de Anti-HCV; os TRs tem baixo custo e são de fácil execução por não exigir punção venosa, podendo ser realizado em locais com recurso limitado 18,20. Além do TR, existem os Imunoensaios enzimáticos (EIAs), imunoensaios de quimioluminescência (CLIA) e imunoensaio de eletro-quimioluminescência (ECL). Os quais requerem estrutura laboratorial instalada e mão-de-obra especializada 20.
A detecção do anticorpo anti-HCV é especifica do vírus, porém indivíduos que já tiveram contato prévio com o vírus e apresentaram cura espontânea, também apresentam anti-HCV circulante, ou seja, a identificação do anticorpo não
14
caracteriza presença da infecção. Além disso, em indivíduos infectados ele pode aparecer de forma “tardia” devido à janela imunológica período em que não há resposta imune 21.
1.4.2. Testes Moleculares
A realização da pesquisa do RNA viral é mais sensível e específica, sendo possível detectar a presença do vírus (qualitativa) e carga viral (quantitativa), estes, porém apresentam alto custo, e maior complexidade 21.
Métodos moleculares vêm sendo muito utilizados no diagnóstico de diversas infecções e apresentam muitas vantagens devido à sua alta especificidade. O método de PCR em tempo real (qPCR) é utilizado como teste complementar ao diagnóstico para hepatite C. Com este método é possível detectar presença do vírus a partir da segunda semana de infecção. Além disso, também é utilizado para avaliar parâmetros do tratamento (indicação, monitoramento e RVS) 19.
O sequenciamento genético do HCV é importante para identificar os genótipos, subtipos e mutações, permitindo uma análise epidemiológica e avaliação de polimorfismos, inclusive àqueles relacionados à resistência às drogas.
A escolha do teste molecular deve levar em consideração a diversidade genética do vírus circulante na população. Esse conhecimento é fundamental para garantir a capacidade de detecção das diversas variantes que circulam no país19.
1.4.2.1. PCR
A técnica foi desenvolvida pelo bioquímico Kary Mullis em 1989, e consiste em amplificação de DNA de forma exponencial. É um dos principais testes moleculares utilizados hoje, principalmente para fragmentos curtos de DNA (abaixo de 10mil pares de base), permitindo a identificação do material genético de forma qualitativa e quantitativa. A amplificação pode ser feita com molde original tanto do DNA como do RNA, ou seja, no processo podemos ter a cópia do genoma completo (com introns e éxons) ou a cópia do cDNA formado a partir de mRNA. A execução
15
da técnica exige equipe treinada e requer cuidados para evitar a degradação e contaminação do material 22,23.
A técnica é bastante sensível e permite a identificação de um patógeno mesmo no estágio inicial da infecção. Isso é possível por meio do uso de iniciadores (primers), os quais são sequências curtas complementares ao genoma (DNA ou RNA) do agente infeccioso pesquisado. Além dos iniciadores a reação conta com ação de enzimas que auxiliam na extensão da nova fita e sais que otimizam a ação enzimática e estabilizam o meio favorecendo um ambiente ideal para a replicação in
vitro 23,24.
Desde o desenvolvimento da PCR, essa técnica teve avanços que levaram ao desenvolvimento de ensaios que permitem, além da identificação do DNA viral amplificado, a quantificação desse material genético, a exemplo, a qPCR. Essa técnica de amplificação permite quantificação em tempo real a cada ciclagem, isso só é possível por meio da captação da fluorescência de sondas marcadas. As sondas marcadas com fluorescência são fragmentos que apresentam as regiões (quencher e reporter) ligadas, e ao incorporar a fita de DNA, ocorre à quebra dessa ligação liberando fluorescência 24,25. Dessa forma, a técnica torna-se mais precisa e com maior reprodutibilidade, pois determina valores na fase exponencial da reação.
1.4.2.2. Sequenciamento
A técnica foi desenvolvida na década de 70 por Sanger e colaboradores, sendo utilizada para determinar a sequência de nucleotídeos de vários genomas. A reação é feita com didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluorescência, os quais funcionam como bloqueadores da enzima DNA-polimerase, pois não apresentam a hidroxila (OH) na sua extremidade 3’ 26. Para a reação, além dos ddNTPs, são necessários os mesmos compostos da PCR convencional. A reação é submetida a ciclos de alternadas temperaturas, que favorecem o funcionamento das enzimas envolvidas no processo. Ao final do processo é feita uma corrida eletroforética de fragmentos de DNA de vários tamanhos, marcados com fluorescência. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento identificará os produtos baseados nos diferentes comprimentos de onda 23,26,27.
16
Atualmente, a determinação da sequência por eletroforese é feita de forma automatizada. O equipamento apresenta pólo positivo e negativo, com um ou mais capilares preenchidos com fluido viscoso (polímero) onde ocorre uma eletroforese que transporta os fragmentos do DNA da reação de sequenciamento do pólo negativo para o positivo; neste “caminho” a amostra é interceptada por um laser que excita a fluorescência ligada a cada fragmento que é captada por uma câmera. O sequenciador é interfaceado a um computador para onde é transferida e organizada a informação colhida, gerando uma sequência na forma de arquivo fasta e um eletroferograma. Estes arquivos são, posteriormente, exportados para softwares que analisam a qualidade da reação. A partir dessa técnica, é possível identificar polimorfismos e genótipos 26,27.
2. OBJETIVOS
Avaliar a importância das técnicas de biologia molecular no diagnóstico e acompanhamento do paciente infectado pelo vírus da Hepatite C.
3. REFERENCIAL TEÓRICO
A hepatite C é uma doença infecto contagiosa causada pelo vírus C pertencente à família Flaviviridae, que apresenta tropismo por células hepáticas podendo causar doença aguda ou crônica, além de aumentar os riscos de cirrose e carcinoma hepatocelular. A principal via de transmissão é a parenteral, entretanto existem relatos de transmissão sexual e vertical. A prevalência global da infecção pelo HCV está estimada em 1%, com aproximadamente 71 milhões de indivíduos cronicamente infectados no mundo 13.
Analisando o perfil epidemiológico dos casos de hepatite C nas Américas observa-se que os casos chegam a 7,2 milhões de infecção crônica pelo vírus C15. Devido ao número de casos, agravos relacionados, dentre eles o carcinoma hepatocelular, o número de óbitos e gasto público com diagnóstico e tratamento das hepatites, a doença foi reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um grave problema de saúde pública, o que levou em 2016, a elaboração do documento “Global Health Sector Strategy on Viral Hepatitis 2016–2021: Towards
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Ending Viral Hepatitis”, que tem como objetivos estabelecer estratégias para
alcançar a meta de eliminação das hepatites até 2030, reduzindo os novos casos em 90% e em 65% os óbitos a ela relacionados14.
O diagnóstico das hepatites virais é baseado na detecção de marcadores presentes no sangue, soro, plasma ou fluido oral da pessoa infectada, por meio de imunoensaios e/ou na detecção do ácido nucléico viral, empregando técnicas de biologia molecular. Os métodos moleculares vêm sendo muito utilizados no diagnóstico de diversas infecções e apresentam muitas vantagens devido à sua alta especificidade. O método de PCR é utilizado como teste diagnóstico para hepatite C, preconizado pelo Ministério da Saúde, além de ser utilizado para monitorar o tratamento 19.
O sequenciamento genético do HCV é importante para identificar os genótipos e os subtipos do vírus, permitindo uma análise do perfil epidemiológico e avaliação de polimorfismos, inclusive aqueles relacionados à resistência às drogas.
Diante do exposto, torna-se evidente a grande importância da utilização das técnicas de biologia molecular para diagnóstico e acompanhamento da Hepatite C.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Amostras:
Para avaliar a importância das técnicas moleculares foram selecionadas amostras de pacientes recebidas pelo Laboratório de Hepatites virais do Centro de Virologia do Instituto Adolfo Lutz (IAL), no período de 2012 a 2014, para realização da genotipagem.
4.2. Aspectos Éticos:
Esse estudo faz parte do projeto intitulado “Caracterização de mutações de resistência primária para as drogas antivirais de ação direta (DAA) para o vírus da hepatite C”, o qual apresenta cadastro no conselho técnico cientifico (CTC) número
18
66G/2014 e aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz (CEPIAL) com o número 1.040.338.
4.3 PCR em Tempo Real Quantitativo
Para determinação da carga viral, foi utilizado o teste de PCR em tempo real, através do ensaio Abbott Real Time HCV®. Este ensaio consiste nos seguintes kits de reagentes: Abbott m sample preparation systemRNA®, Abbott Real Time HCV® kit reagente de amplificação, Abbott Real Time HCV® kit de calibradores, Abbott Real Time HCV® kit de controles.
O propósito da preparação foi extrair e concentrar o DNA alvo para torná-lo acessível à amplificação. Este processo foi realizado no equipamento m2000sp, um sistema automatizado de processamento de amostras.
Os reagentes do sistema rompem as partículas virais e expõem seu material genético, que é capturado e lavado para remoção de componentes não ligados da amostra.
Os ácidos nucléicos ligados foram eluídos e transferidos para uma placa de 96 orifícios profundos. O controle interno foi introduzido no procedimento de preparação das amostras e processado também junto aos calibradores e controles.
Após o equipamento m2000sp completar a extração, os reagentes de amplificação e o frasco da mistura principal foram carregados na área de trabalho conforme instruções do fabricante. Após o preparo, a placa foi lacrada e direcionada à área de amplificação, a qual foi inserida no equipamento m2000rt e iniciada a operação. Após o término do processamento os resultados foram impressos e realizada a manutenção dos equipamentos e descarte dos consumíveis.
A concentração de RNA do HCV em uma amostra ou controle é calculada a partir de uma curva de calibração armazenada. O instrumento Abbott m2000rt informa automaticamente os resultados, em UI/mL. A Tabela 1 apresenta os possíveis resultados e as interpretações do ensaio.
19
Tabela 1: Interpretações dos resultados da qPCR obtidos pelo equipamento m2000rt.
RESULTADO INTERPRETAÇÃO DESCRIÇÃO
Targed not detected Alvo não detectado RNA do HCV não detectado na amostra < 12 UI/mL Alvo detectado RNA detectado, porém abaixo do limite
linear de quantificação.
Entre 12 e 108 UI/mL Alvo detectado RNA detectado, dentro do limite linear de quantificação.
> 108 UI/mL Alvo detectado RNA detectado, porém acima do limite linear de quantificação.
4.4. PCR convencional e sequenciamento do genoma do HCV
As amostras positivas no ensaio quantitativo foram também submetidas à PCR convencional para posterior sequenciamento viral.
4.4.1. Extração do RNA
As amostras de plasma foram extraídas empregando-se o kit comercial
QIAamp Viral RNA Kit®, da Qiagen, utilizando-se soro ou plasma para esse procedimento. A técnica baseia-se na lise da amostra, liberando o material genético. Após lavagens consecutivas, isola-se o RNA viral purificado, o qual será eluído para posterior amplificação.
4.4.2. PCR
Para a realização do sequenciamento foi realizado PCR, utilizando as amostras extraídas, descritas acima.
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A amplificação foi realizada em três etapas: transcrição reversa (síntese do cDNA), primeira PCR e segunda PCR (Nested).
Para a transcrição reversa foi utilizado Random primers a 150ng/ µL (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) e Superscript III (200U/µL) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA).
Para a realização de primeira PCR foi utilizada a enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen®) e primers específicos para a região NS5B do genoma do HCV. Após a ciclagem, para aumentar a sensibilidade e eficiência, foi realizada a nested PCR utilizando a mesma enzima, gerando um fragmento de 400pb.
4.4.3. Identificação do produto amplificado
Após as etapas de PCR, o produto amplificado foi identificado por eletroforese em gel de agarose a 2% realizado em tampão Tris- Acetato (TAE 1,0x) com syber SAFE DNA gel stain (Invitrogen®).
Foi aplicado no gel, além das amostras, o padrão de quantificação (Low DNA
Mass Ladder - Invitrogen®, São Paulo, Brasil) por meio do qual é possível realizar a
quantificação do volume em nano grama (ng) de cDNA amplificado por comparação de intensidade de bandas, conforme mostra a figura 4. A visualização das bandas foi feita no transiluminador UVB (LTB-20X20 HE - Loccus do Brasil), e captura da imagem feita em sistema de captura digital de imagem L-PIX Touch, e para fins de registro uma copia de cada gel foi impressa na impressora térmica Sony Digital
21
Figura 4: Representação do controle Low DNA Mass Ladder de acordo com o volume de amostra e padrão utilizados.
Fonte: Adaptado de InvitrogenTM Life TechnologiesTM.
4.4.4. Sequenciamento do genoma do HCV
Após identificação e registro das bandas amplificadas, a concentração de DNA utilizada na reação foi definida de acordo com instruções do fabricante do kit de sequenciamento. A técnica utilizada é derivada da técnica de Sanger e colaboradores (1977), usando didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluorescência, conforme kit ABI PrismR BigDyeTM Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), no seqüenciador automático ABI (Applied Biosystems). .
A etapa de purificação foi realizada após a reação o Cycle Sequencing, a fim de remover os ddNTPs que não foram incorporados na fita de DNA, utilizando precipitação com Etanol / EDTA.
Para o sequenciamento, as amostras foram ressuspendidas com 10uL de formamida HIDI (Life Technologies). A placa foi então levada ao Sequenciador Automático ABI.
22
4.4.5. Edição das Sequências
As sequências foram editadas na ferramenta Sequencher® version 4.1.4 DNA sequence analysis software (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI USA). Neste software é realizado o alinhamento e edição da sequência. Após o alinhamento, é possível visualizar o eletroferograma e gerar a seqüência consensu. O arquivo
gerado no formato fasta é submetido ao site Geno2Pheno
(https://hcv.geno2pheno.org/) para caracterização de genótipos e identificação de mutações.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No período de 2012 a 2014, foram escolhidas para o estudo, 996 amostras de pacientes com genótipo 1 da rotina do laboratório de Hepatites virais. O genótipo 1 foi escolhido pois apresenta maior circulação em nosso meio, refletindo a distribuição dos genótipos do HCV no Brasil 28,29,30
.
Das amostras analisadas, 54,22% eram provenientes de pacientes do sexo masculino e 45,78% de pacientes do sexo feminino. A faixa etária predominante foi de 40 a 49 anos como mostrado na tabela 2.
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Tabela 2: Característica dos pacientes incluídos no estudo.
Característica N % Idade 1 a 9 anos 3 0,30 10 a 19 anos 5 0,50 20 a 29 anos 43 4,32 30 a 39 anos 184 18,47 40 a 49 anos 319 32,03 50 a 59 anos 241 24,20 60 a 69 anos 159 15,96 70 a 79 anos 38 3,82 > 80 anos 4 0,40 Sexo Masculino 540 54,22 Feminino 456 45,78
Observando os dados demográficos, notou-se que a infecção crônica do HCV foi mais prevalente em pacientes do sexo masculino e a faixa etária mais afetada estava entre 40-49 anos, seguida da faixa etária de 50 a 59. Os dados em relação à razão sexo e idade corroboram dados descritos no Boletim Epidemiológico 2.
Das amostras utilizadas no estudo, 388 foram provenientes de pacientes da região do ABCD, o que corresponde a 38,96% do total das amostras, a segunda região com o maior número de amostras, foi a região do Vale do Paraíba, com 362 amostras (36,35%). O laboratório de Hepatites do IAL é o coordenador da Rede de Diagnóstico Molecular das Hepatites Virais do Estado de São Paulo, atendendo as regiões do Vale do Paraíba, Vale do Ribeira, Região do ABCD, Região de Franco da Rocha, Unifesp e Santa Casa de SP.
Em relação à quantificação da carga viral do HCV, realizado por PCR em tempo real, observou-se média de Log de 5,86, com valor máximo de 7,62 e mínimo de 2,25. Essa metodologia constitui uma grande inovação tecnológica da PCR
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convencional, por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos mais precisos e rápidos23. Atualmente, a PCR em tempo real é utilizada como teste confirmatório para o diagnóstico da hepatite C. Além disso, é também indicada para monitorar o tratamento e avaliar a resposta virológica sustentada19. Dentre as vantagens da qPCR, em relação à PCR convencional, podemos citar maior sensibilidade, precisão, reprodutibilidade e acurácia, melhor controle de qualidade do processo e menor risco de contaminação 24.
Entretanto, a PCR convencional ainda é uma ferramenta de grande importância, já que oferece a possibilidade de trabalhar diferentes regiões do genoma, além de necessitar pouco volume de amostra para sua execução.
Do total de 996 (100%) amostras analisadas por PCR convencional, foi possível amplificar 919 (92,26%) amostras. A figura 5 demonstra a detecção especifica e eficiente do produto amplificado, sendo os fragmentos no tamanho aproximado de 400pb.
Figura 5: Corrida do fragmento de NS5B mais padrão de quantificação em gel de eletroforese 2%.
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Para as amostras positivas foi realizado o sequenciamento do genoma viral. A figura 6 ilustra o eletroferograma obtido, destacando a importância de se obter sequências de qualidade, uma vez que estas irão garantir resultados confiáveis.
Figura 6: Representação do eletroferograma obtido da região NS5B do HCV.
Com esta técnica é possível sequenciar fragmentos do genoma do HCV, sendo possível identificar genótipos e subtipos do vírus, identificar variações dentro do genótipo, além de avaliar polimorfismos importantes na avaliação de resistência aos medicamentos preconizados pelo Ministério da Saúde.
O sequenciamento confere aos pacientes a garantia do uso de uma terapia eficaz, além de diminuir os gastos com tratamentos sujeitos a falhas terapêuticas. Desta forma, é imprescindível que se pense na implantação desta técnica e otimização da mesma, com o objetivo de minimizar o custo na rotina diagnóstica do Sistema Único de Saúde.
Diante do exposto, a realização de técnicas moleculares para diagnóstico e acompanhamento da hepatite C, as quais são mais específicas e sensíveis, permite grande melhoria no monitoramento da infecção e tratamento da mesma, tendo
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respectivamente um maior número de diagnósticos e aumento das taxas de RVS
17,27. Por consequência, resulta em avanços que possibilitam o alcance da estratégia
criada pela OMS que visa eliminar as hepatites virais até 203017.
6. CONCLUSÃO
É notável a importância das técnicas moleculares no manejo de pacientes infectados pelo HCV. O diagnóstico preciso e precoce permite um tratamento adequado, impactando diretamente na qualidade de vida do indivíduo. Além disso, é um instrumento de prevenção de agravos mais freqüentes relacionados à infecção, como cirrose hepática e carcinoma hepatocelular.
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