Analise dos polimorfismos p53, PROGINS, Reβ, CYP1A1, GSTM1 e GSTT1 em endometriose
A.B Frare1,2, I.R Costa2,3, S.R. Souza1,2, R.C.P.C Silva1,2, B.M Bordin1,2,3 and K.K.V.O. Moura1,2,3
1
Especialização em Reprodução Humana, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, GO, Brasil
2
Núcleo de Pesquisa Replicon, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, GO, Brasil
3
Departamento de Biomedicina, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia, GO, Brasil E-mail: arianeufg@yahoo.com.br Katia Karina Verolli de Oliveira Moura, Doutorado em Ciências (Fisiologia Humana), Universidade de São Paulo
Resumo
A endometriose é definida pelo aparecimento de focos de tecido endometrial com características glandulares e/ou estromais idênticos aos da cavidade uterina em outras localizações, que não o endométrio. A incidência desta patologia tem aumentado ao longo do tempo daí a importância de se encontrar genes que estejam relacionados ao seu desenvolvimento. O objetivo deste trabalho foi analisar os genótipos encontrados em dois grupos, um com pacientes portadoras de endometriose e outro de mulheres sem clinica realcionada a endometriose, quanto aos polimorfismos p53, GSTM1, GSTT1, Reβ, PROGINS e CYP1A1. No grupo de mulheres com endometrioses foram encontrados 6 genótipos mais frequentes, sendo que os polimorfismo mais detectados foram o códon 72 do gene p53 com a variável Pro/Arg, o PROGINS do gene do receptor de progesterona teve maior presença do genótipo A1/1, a variante Reβ do receptor de estrógeno AG, os polimorfismos GSTM1 e GSTT1 tiveram distribuição idênticas, em relação a CYP1A1 o genótipo W1/W1 foi o mais detectado.No grupo de mulheres sem queixa relacionada a endometrioses foram encontrados 4 genótipos mais frequentes, verificou-se que os polimorfismo no códon 72 do gene p53 com a variável Pro/Arg teve maior freqüência, assim como o polimorfismo PROGINS do gene do receptor de progesterona com o genótipo A1/1, a variante Reβ do receptor de estrógeno GG, ausência dos polimorfismo
GSTM1 em todos os genótipos mais freqüentes, e a maior frequência do GSTT1 nulo, com relação ao polimorfismo CYP1A1 o genótipo W1/W1 foi detectado em todos os genótipos mais frequentes.
Palavras - chave: Endometriose, p53, GSTs, PROGINS, Reß, CYP1A1
Introdução
A endometriose é uma enfermidade inflamatória crônica dolorosa, que representa um dos transtornos ginecológicos benignos mais comuns. É uma patologia heterogênea que se desenvolve em mulheres na idade reprodutiva e regride espontaneamente após a menopausa (Renner et al, 2006; Lima et al, 2006; Johnson et al, 2004). Na literatura, a incidência de endometriose nas mulheres com infertilidade varia de 6% a 58% (HASSON,1976; WHEELER, 1989), ao passo que 30 a 50% das mulheres com endometriose são inférteis (FEDELLE E COLS, 1992; THOMAS, 1995).
Nas últimas décadas ocorreu um aumento significativo no número de pacientes inférteis com endometriose. Essa constatação pode representar apenas o aumento na prevalência desta enfermidade na população feminina ou, simplesmente, a melhora da investigação diagnóstica do casal infértil, sobretudo com o desenvolvimento da videolaparoscopia como instrumento diagnóstico fundamental desta patologia. (ABRÃO, 2002).
A endometriose é uma doença poligênica/multifatorial que frequentemente resulta em vários problemas ginecológicos incluindo dispareunia, dismenorréia, dor pélvica e infertilidade (Nakata et al, 2004). A associação entre a doença e os polimorfismos genéticos tem sido reconhecida há muito tempo. Recentemente, os avanços tecnológicos na biologia molecular têm abastecido o interesse nos polimorfismos moleculares e sua influência na suscetibilidade e apresentação clínica das doenças (Tempfer et al, 2009; Ribeiro Júnior, 2009). A endometriose tem sido relacionada os polimorfismo p53, GSTM1, GSTT1, Reβ, PROGINS e CYP1A1 e com o grau de severidade da doença. (NAKATA, 2004; CARVALHO, 2004; HSIEH, 2006).
Alterações genômicas podem representar eventos importantes no desenvolvimento da endometriose. O p53 é um gene supressor de tumor, responsável pelo controle da regulação do crescimento celular e regulação do ciclo celular, onde ele está envolvido na proliferação celular, bem como na progressão de vários tipos de tumores. Duas variantes descritas no códon 72 do gene p53 resultam da substituição de um único nucleotídeo,
resultando na presença de prolina (p53pro) ou arginina (p53arg) no produto da proteína. A mutação do p53 foi encontrada na endometriose. Anomalias e aberrações cromossômicas relacionadas à p53, podem estar associada com a transformação maligna da endometriose ováriana. Contudo alguns pesquisadores não detectaram alteração na expressão da p53 na patologia da endometriose (Ribeiro et al, 2009).
A endometriose é uma doença dependente do estrogênio. Vários dos processos fundamentais envolvidos na função normal do endométrio, como a proliferação e vascularização são regulados pelo estrógeno. A ação do estrógeno é mediada por duas variantes do receptor de estrógeno denominado Reα e Reβ (Critchley et al, 2006). Estrógeno é conhecido como o fator mais importante que estimula o desenvolvimento da endometriose. A distribuição do estrogênio nos implantes de endometriose foi visto classicamente ser apenas através do sangue que circula de forma endócrina (Bulun et al, 1999).
Inúmeras investigações atuais têm enfoque nos efeitos do receptor de progesterona no endométrio. O receptor de progesterona B (PR-B) prevalece nas células epiteliais endometriais e o receptor de progesterona A (PR-A) no estroma. A progesterona também reverte o crescimento estimulado pelos estrógenos, especificamente nas células do estroma e diminui a quantidade de receptores de estrógeno (Yánez e González, 2008). O alelo selvagem do gene PR é denominado A1 e o alelo polimórfico PROGINS, denominado A2. Mulheres com o alelo A2 apresentam aumento do risco de desenvolverem patologias nos tecidos onde a exposição à progesterona tem efeito de proteção, como no ovário e no endométrio (Giacomazzi, 2008).
A maquinaria de metabolização xenobiótica possui dois tipos de enzimas: as de metabolismo oxidativo mediado, ou de fase I, e as enzimas conjugadas, ou de fase II. Muitos compostos são convertidos a metabólitos altamente reativos pelas enzimas oxidativas de fase I, principalmente enzimas da superfamília do citocromo P450 (CYPs). Em contraposição, as reações da fase II envolvem a conjugação com um substrato endógeno, por meio das glutationa S-transferase (GSTs), UDP glucoronil transferase e N-acetil transferase (NATs), que agem como enzimas inativadoras dos produtos da fase I, tornando os metabólitos hidrofílicos e passíveis de excreção (Nakata et al, 2004; Rossit, 2000).
Os genes CYP1A1 e CYP1B1 da fase I codificam enzimas envolvidas na desintoxicação do metabolismo do estrogênio. Estudos em populações austríaco, indianos,
chineses, japoneses e taiwaneses não encontraram associação entre os polimorfismos conhecidos do gene CYP1A1 e a suscetibilidade à endometriose. (Guo, 2006). Em relação às enzimas CYPs, uma das mais extensivamente estudadas é a CYP1A1. Um polimorfismo de restrição MspI (CYP1A1m1) na região 3’ não codificante do gene, resultante da transição de uma timina para citosina (T→C), parece promover aumento da sua expressão (Nakata et al, 2004).
Muitos dos substratos GST são xenobióticos e diferentes classes de enzimas são específicas para diferentes substratos. Os estudos publicados visando à identificação de suscetibilidade genética à endometriose e os polimorfismos do gene glutationa S-transferase GSTM1 e GSTT1 são os mais estudados e parecem ser importantes na desintoxicação dos produtos do estresse oxidativo (Guo, 2005; Hadfield et al, 2001).
Este estudo visa analisar os genótipos encontraro em dois grupos, um com pacientes portadoras de endometriose e outro de mulheres sem clinica realcionada a endometriose, quanto aos polimorfismos p53, GSTM1, GSTT1, Reβ, PROGINS e CYP1A1.
Material e Métodos
Foram coletadas 73 amostras de sangue periférico, sendo 49 de mulheres com endometrios corfimada por laparoscopia e 24 de mulheres sem clínica de endometrise. Todas pacientes responderam um questionário com dados pessoais e hábitos sociais.
A extração do DNA genômico foi obtido por meio do kit Wizard® (Genomic DNA Purification Kit), seguindo as recomendações do fornecedor. A integridade do DNA foi certificada por meio de eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio (0,5mg/mL) e visualizado no Sistema de Vídeo Documentação VDS (Amersham Biosciencs, USA).
Análise Molecular
As amostras de DNA foram submetidas à amplificação por PCR, visando à detecção dos polimorfismos p53, GSTM1, GSTT1, Reβ, PROGINS e CYP1A1 (tabela I), em volume de 25µL. Todas as análises foram realizadas em duplicatas.
Tabela I – Sequência dos primers dos p53, GSTM1, GSTT1, Reβ, PROGINS e CYP1A1
Primer Sequência (5’ – 3’) Tamanho do produto
(Fw) A PROGINS
(Rev)
AAA GTA TTT TCT TGC TAA ATG TC P53-Pro (Fw) GCC AGA GGC TGC TCC CCC P53-Pro (Rev) GCC AGA GGC TGC TCC CCC 177 pb P53-Arg (Fw) TCC CCC TTG CCG TCC CAA P53-Arg (Rev) CTG GTG CAG GGG CCA CGC 141 pb GSTM1 (Fw) GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC GSTM1 (Rev) GTTGGGCTAAATATACGGTGG 4215 pb GSTT1 (Fw) TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC GSTT1 (Rev) TCACCGGATCATGGCCAGCA 480 pb
RsaI Fw ACT TGC CAT TCT GTC TCT ACA 409 pb
RsaIRev Controle
CAC AGG ACC CTG AAT CCT 409 pb (controle)
RsaI RevA AGC TCT CCA AGA GCC GT 127 pb (variante A)
RsaI RevG AGC TCT CCA AGA GCC GC 127 pb (variante G)
CYP1A1 (Fw) TAGGAGTCTTGTCTCATGGCCT3’ 340 pb CYP1A1 (Rev) CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT 140 pb
Fonte: Carvalho et al., 2004; Fonte: Ribeiro Júnior, 2009; Fonte: Aschim et al., 2005
Resultados
TabelaII: Genótipos encontrados nas pacientes com endometriose (E=endometriose)
E1 Pro/arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1
E2 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1
E3 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1
E5 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E6 Pro/arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/m1 E7 Pro/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E8 Pro/arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/W1 E9 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/m1 E10 Pro/Pro/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/m1 E11 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E12 Arg/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/m1 E13 Arg/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E14 Arg/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E15 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E16 Arg/Arg/A1/2/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E17 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E18 Pro/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E19 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E20 Pro/Arg/A1/2/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E21 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/W1 E22 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E23 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/m1 E24 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E25 Arg/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT/W1/m1 E26 Pro/Arg/A2/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/w1 E27 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/m1 E28 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/W1 E29 Pro/Prol/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E30 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/W1 E31 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/W1 E32 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/m1 E33 Arg/Arg/A1/2/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E34 Pro/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E35 Pro/Arg/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E36 Pro/Arg/A1/2/GG/GSTM1/GSTT1/W1/m1
E37 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E38 Pro/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E39 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E40 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E41 Prol/Arg/A1/2/AG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E42 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 E43 Pro/Arg/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/m1 E44 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 E45 Pro/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/m1 E46 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 E47 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/m1 E48 Pro/Pro/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1nulo/W1/m1 E49 Arg/Arg/A1/1/AG/GSTM1nulo/GSTT1nuloW1/m1
No grupo de mulheres com endometrioses foram encontrados 6 genótipos mais freqüentes, que estão em destaque na tabela II. Sendo que destes 6 genótipos verificou-se que os polimorfismo no códon 72 do gene p53 com a variável Pro/Arg tiveram maior presença em 4/6 genótipos mais frequentes e Arg/Arg em 2/6. O polimorfismo PROGINS do gene do receptor de progesterona teve maior presença do genótipo A1/1 em 4/6 genótipos mais freqüentes, A1/2 foi encontrado em 2/6. A variante Reβ do receptor de estrógeno AG foi encontrado em 5/6 genótipos mais freqüentes sendo o GG encontrado em apenas 1/6. Os polimorfismos GSTM1 e GSTT1 tiveram distribuição idênticas nos genótipos mais frequentes, sendo detectado a presença desses polimorfismos em 3/6 genótipos mais frequentes e GSTM1nulo/GSTT1nulo em 3/6. Em relação a CYP1A1 o genótipo W1/W1 foi detectado em 5/6 genótipos mais freqüentes e o W1/w1 em apenas 1/6.
Tabela III: Genótipos encontrados no grupo controle (C=controle)
C1 Arg/Arg/A1/1/GG/GTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1
C2 Arg/Pro/A1/1/AG/GTM1nulo/GSTT1/W1/W1
C3 Arg/Pro/A1/2/GG/GSTM1/GSTT1nulo/W1w1
C4 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1
C6 Arg/Pro/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTM1/W1/w1 C7 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 C8 Arg/Pro/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C9 Arg/Arg/A1/2/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 C10 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C11 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1W1 C12 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C13 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C14 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C15 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C16 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1W1/W1 C17 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 C18 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 C19 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1/GSTT1/W1/W1 C20 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1/W1/W1 C21 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1W1 C22 Arg/Pro/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1 C23 Arg/Arg/A1/1/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1W1 C24 Arg/Arg/A1/2/GG/GSTM1nulo/GSTT1nulo/W1/W1
No grupo de mulheres sem queixa relacionada a endometrioses foram encontrados 4 genótipos mais freqüentes, que estão em destaque na tabela III. Sendo que destes 4 genótipos verificou-se que os polimorfismo no códon 72 do gene p53 com a variável Pro/Arg teve esteve presente em 2/4 genótipos mais frequentes e Arg/Arg em 2/4. O polimorfismo PROGINS do gene do receptor de progesterona teve presença apenas do genótipo A1/1 entre os genótipos mais freqüentes 4/4. A variante Reβ do receptor de estrógeno GG foi encontrado em todos os genótipos mais freqüentes 4/4. Verificou-se que GSTM1 nulo foi detectado em todos os genótipos mais frequentes. O polimorfismo GSTT1 foi detectado em apenas 1/4 dos genótipos mais frequentes e GSTT1 nulo em 3/4. Com relação ao polimorfismo CYP1A1 o genótipo W1/W1 foi detectado em todos os genótipos mais freqüentes, não sendo encontrado W1/w1.
Discussão
Encontrar variantes genéticas que contribuem para doenças complexas, como a endometriose, diabetes ou doenças cardíacas é muito mais difícil porque a contribuição de genes individuais é pequeno, muitos genes contribuem para o risco de um indivíduo de desenvolver a doença e o risco da doença é muitas vezes modificado pelo ambiente. No entanto, doenças comuns, de saúde pública apresentam uma carga de doenças mendelianas maior, e há grandes esforços internacional para definir a contribuição genética para estas doenças. Apesar dessas limitações, o mapeamento do gene continua a ser uma abordagem importante para entender os caminhos envolvidos na etiologia de doenças complexas, incluindo endometriose. ( Montgomery et al., 2008)
Um problema particular na interpretação dos resultados de estudos de associação genética em endometriose está ligado ao fato de que, esta não é uma característica monogênica, mas uma característica complexa. Portanto, vários fatores genéticos podem vir a ter um efeito com um nível adicional de variação em relação a tamanhos de efeito individual. Especialmente efeitos de tamanhos pequeno podem ser facilmente perdidos em estudos individuais com tamanhos de amostra pequena. Problemas metodológicos comuns em estudos de associação genética incluem o tamanho reduzido da amostra, comparações múltiplas, diferentes origens étnicas dos sujeitos do estudo, variando definições doença e critérios de inclusão / exclusão e de viés. (C.B. Tempfer,1,5 M. Simoni,2 B. Destenaves,3 and B.C.J.M. Fauser. Functional genetic polymorphisms and female reproductive disorders: Part II—endometriosis. Hum Reprod Update. 2009 Jan–Feb; 15(1): 97–118.)
Montgomery et al, 2008 fizeram uma revisão na literatura para encontrar o genes que estão sendo relacionados com a endometriose na literatura, e entre os genes citados estão os envolvidos nas vias de desintoxicação, vias de esteróides sexuais e vias sinalização de citocinas, moléculas de adesão e enzimas do ciclo celular. Foram citados os genes GSTM1, GSTT1 e PROGINS, analisados em nosso estudo, contudo não encontraram relação desses genes com a endometriose .
Tempfer et al, 2009 também fizeram uma revisão na literatura abordando a influência de polimorfismos genéticos na endometriose. Contudo não foi encontrado nenhuma evidência consistente que ligue endometriose com polimorfismos específicos de genes que codificam mediadores inflamatórios e proteínas envolvidas no metabolismo dos esteróides sexuais, a função vascular e a remodelação dos tecidos. Todos os genes analisados no presente estudo foram citados nessa revisão, sendo que não foi mostrado
unanimidade com relação a influência destes genes na endometriose merecendo assim, mais estudos.
Conclusão
Apesar dos vários estudos feitos ao longo dos anos, a etiologia e patogenia da endometriose ainda não são claras ( Minici et al; 2008), daí a importância de se buscar genes relacionados com esta patologia, para auxiliar no diagnóstico e tratamento.
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