Tabela V. Derivados metilados de galactose obtidos das SG 1 e SG 2 nativas e dessulfatadas da alga verde C. isthmocladum
aas galactanas metiladas foram hidrolisadas e os produtos analisados como derivados alditóis acetato por GLC-MS empregando coluna capilar (25 m × 0.3 mm); bAs proporções de acetates metilados correspondem a integral de cada pico comparada com a soma das integrais; cTempo de retenção dos derivados alditol acetato.
Para uma análise estrutural mais detalhada das galactanas sulfatadas, foram empregadas técnicas de RMN mono e bi-dimensionais. As galactanas sulfatadas 1 e 2 e suas derivadas dessulfatadas produziram sinais semelhantes nos espectros de 1H, o que indica estruturas similares. Dessa forma, os espectros de 2D foram realizados exclusivamente com a galactana SG 2 nativa e dessulfatada. Os sinais de 1H entre 4.4 e 5.0 ppm contém uma mistura de sinais de H-1 dos anômeros beta da galactopiranose, bem como os sinais de H-4 do anel do açúcar. No entanto, estes sinais exibiram um deslocamento para direita de (~0,6ppm) em conseqüência da sulfatação (Figura 15).
Figura 15. Espectro de RMN 1H a 400 MHz das SG 1 (A) e SG 2 (B) nativas e das SG 1 (C) e SG2 (D) dessulfatadas. Cerca de 5 mg de cada amostra foi dissolvida em D2O e o espectro de RMN realizado a 50 oC. Os “chemicals shifts” são relativos ao ácido trimetilsililproprionico. Sulfated H4, indica sulfatação na posição 4; -H1, corresponde a região dos prótons anoméricos das unidades beta; 3-linked, unidade 3-O-ligada; 6-linked, unidade 6-O-ligada, Pyr-CH3, sinal de metil de grupos piruvato.
O espectro de 1H e, especialmente, o de 1H/13C DEPT-HSQC (figura 16) mostraram dois sinais anoméricos predominantes, denominados A e B, para a forma nativa e dessulfatada da SG 2. Pelos espectros 2D de COSY e TOCSY, foi possível traçar os sistema de spin destes dois sinais. Os sinais de 1H obtidos
Figura 16. Espectro de 1H/13C DEPT-HSQC da galactana nativa SG 2 (A) e dessufatada (B). Os sinais foram atribuídos com base nos experimentos de RMN 2D (COSY e TOCSY), e HSQC dos derivados depiruvatados e dessufatados. Os sinais em azul representam à fase negativa dos grupos CH2, e os pretos a fase positiva dos grupos CH e CH3. Os “chemicals shifts” são relativos ao ácido trimetilsililproprionico. Os sinais marcados por A referem-se para β-D-galactopiranosil 3-O-ligada e B para 6-O-ligada. Os sinais denominados de A3-Pyr, A4-Pyr e A5* representam 1H-“chemical shifts” do H3, H4, e H5 dos resíduos de 3,4-(1′carboxi)-etilideno-β-D-galactopiranose, respectivamente. Os sinais denominados de A3′, A, B4′, e A5′ correspondem ao H3 e H4 de β-D-galactopiranosil 4-sulfato 3-O-ligada; H4 da β-D-galactopiranosil 4-sulfato 6-O-ligada; e H5 da β-D-galactopiranosil 4-sulfato 3-O-ligada.
Figura 17. Região anomérica (5.1 a 4.5 ppm) dos espectros de COSY (A and C) e TOCSY (B e D) de SG2 dessufatada (A e B) e SG 2 nativa (C e D). Cerca de 5 mg de cada amostra foram dissolvidos em 0.5 mL de D2O sendo os espectros de RMN 2D adquiridos a 50°C, 400 MHz. Os sinais marcados por A são para β-D-galactopiranosil 3-O-ligada e B para 6-O-ligada. Sinais denominados de A3-Pyr, 4-Pyr e A5* representam 1H-“chemical shifts” do H3, H4, e H5 da 3,4-(1′carboxi)-etilideno-β-D-galactopiranose. A4′ e B4′ correspondem aos sinais de H4 da galactosil 4-sulfato 3-O-ligada, e 6-O-ligada, respectivamente
A sulfatação em C-6 está necessariamente associada ao sistema A, enquanto o sistema B apresenta glicosilação. O sistema A é predominantemente sulfatado em C-4, como indicado pelo sinal de baixo-campo (~0,65 ppm) de H-4, mas também existem sinais de menor intensidade de unidades não sulfatadas, como indicado pela analise de metilação. O sistema B é predominantemente sulfatado em C-4, como indicado pelo sinal de baixo campo de H-4, mas unidades não sulfatadas coexistem com tais unidades.
Tabela VI. “Chemical shifts” de 1H e 13C (ppm) para SG 2 nativa e dessulfatada da alga verde C. isthmocladum
a“Chemicals shifts” são relativos ao ácido trimetilsililproprionico (0 ppm) para 1H e metanol para 13C. Valores em negrito indicam posição de sulfato e em itálico indicam posições glicosiladas; bValores de (Bilan et al., 2007); c3-ligada -β-d-galactopiranose; d6-ligada -β-d-galactopiranose; ND, não determinado.
Curiosamente, além dos sinais de 1H e 13C do anel da galactose e de seus
carbonos e prótons anoméricos, as SG 1 e SG 2 nativas e dessulfatadas apresentaram um sinal intenso no espectro de 1H de ~1,7ppm (Figura 15), sinal que indica grupamento metil (CH3). Além disso, nas análises de metilação das
galactanas dessultadas havia alto grau de substituição em C3 e C4. Tais resultados sugerem a presença de um anel extra, ligado ao C3 e/ou C4 do anel da galactose. Então realizamos outros espectros na tentativa de verificar uma possível substituição com piruvato, fato já descrito na literatura, para algas do
gênero Codium (Bilan et al., 2007).
O espectro de HSQC revelou apenas um sinal em δH /δC 1.77/23.4 ppm que pode corresponder ao metil de um ácido pirúvico. O sinal de próton de baixo campo nesta região revela um piruvato típico envolvido num ketal cíclico incluindo O-3 e O-4 dos terminais não redutores das galactoses. Tais resultados indicam a presença de resíduos de galactose 3,4 ligados a um piruvato formando um anel [3,4-O-(1’carboxi)-etilideno] (Figura 18).
Figura 18. Espectros de 1H/13C HSQC (A) e HMBC (B) da região do metil do grupamento piruvato da SG2. Pyr:CH3, Pyr:O–C–O, e Pyr:COOH indicam sinais de CH3, O–C–O, e COOH da 3,4-O-(1′carboxi)-etilideno β-D-galactopiranosil respectivamente. Os singletes e dupletes do Pyr:CH3 nos espectros de HSQC e HMBC, são decorrentes de decoupling e
no-decoupling durante a aquisição dos espectros,
respectivamente.
Em síntese, tais resultados indicam que, cerca de 80% das unidades constituintes desta galactana são 3-β-D-Galp-1. A maioria destas unidades apresenta sulfatação em C4; no entanto, em menores quantidades, observa-se sulfatação em C6, como também unidades não sulfatadas. A SG 2 também possui unidades 6-ligadas de β-D-Galp-4(SO4), e, em menores quantidades, resíduos de galactopiranose não sulfatadas 6-ligadas.
Abaixo a Figura 19 ilustra as possíveis unidades monossacarídicas propostas para a galactanas sulfatadas 1 e 2, onde podemos observar uma unidade que corresponde ao principal constituinte (A) (3-β-D-Galp-4(SO4)-1 e três
outras que aparecem em menor proporção: (B) 3-β-D-Galp-4,6di(SO4)-1; (C)
6-β-D-Galp-4(SO4)-1; (D) 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno-β-D-Galp-1 dos terminais não
redutores.
Figura 19. Unidades monossacarídicas constituintes das SG 1 e SG 2. Estruturas propostas para os componentes encontrados na galactana sulfatada da alga verde C.
isthmocladum.
A preponderância da unidade (3-β-D-Galp-4(SO4)-1 em galactanas
sulfatadas em algas verdes nos leva a crer que esta estrutura foi preservada entre organismos que co-habitam o ambiente marinho, independente do Reino ao qual pertencem, como por exemplo: algas e ouriços (Bilan et al., 2007; Matsubara, 2004; Pomin and Mourao, 2008).
5.4 – Atividades Farmacológicas das SG 1 e SG 2
5.4.1 – Atividade anticoagulante - PT, aPTT, Heptest e TT - em plasma humano O tempo de protrombina (PT) é um teste de “screening” para a via extrínseca da coagulação – fatores VII, X, V, II e fibrinogênio – e para monitorar a
administração de anticoagulantes orais. Assim, PT evidencia defeitos ou efeitos de drogas na via extrínseca e na via comum.
O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é um teste de “screening” para a via intrínseca da cascata da coagulação – fatores XII, XI, IX, VIII, X, II e fibrinogênio – usando um substituto das plaquetas para ativação. Este teste também é usado para monitorar tratamento com heparina.
O tempo de trombina (TT) mede a quantidade de fibrinogênio presente na amostra. Esse tempo está aumentado quando os níveis de fibrinogênio são inferiores a 100 mg/dl, mas não é afetado por deficiência de nenhum outro fator. É prolongado por heparina e por outros inibidores.
O princípio do teste do Heptest mede a capacidade da heparina de potenciar a inativação de fator Xa exógeno pela Antitrombina. A velocidade de inibição do fator Xa é diretamente proporcional à concentração da heparina presente na amostra, evidenciada pelo aumento no tempo de coagulação.
A atividade anticoagulante das SGs foi inicialmente determinada utilizando os métodos de PT, aPTT, Heptest e TT, como descrito em Métodos. Heparina não fracionada porcina (162 U/mg) foi utilizada como controle positivo de atividade anticoagulante nos ensaios. A figura 20 mostra o efeito das SG 1 e 2 no tempo de coagulação do plasma nesses diferentes testes. O tempo normal de coagulação varia de acordo com o teste empregado, e corresponde ao tempo, em segundos, na ausência de drogas (concentração zero). Na mesma figura, podemos observar que nenhuma das SGs apresentou atividade anticoagulante, ou seja, não foram capazes de prolongar o tempo de coagulação normal. A figura também mostra que a heparina aumenta o tempo de coagulação para até 300s, e que a concentração de heparina necessária para atingir esses valores varia de acordo com o teste. Ainda, observa-se que a heparina não apresentou efeito sobre o PT, ou seja, não atua sobre a via extrínseca da coagulação.
Figura 20. Atividade anticoagulante das SG 1 e SG 2 em plasma humano. Plasma citratado foi suplementado com as SGs e heparina em diferentes concentrações (0-100 g/mL). O resultado mostra o tempo necessário para formação do coágulo em função da concentração das drogas. s, segundos.
5.4.2 – Efeito das galactanas na inibição de trombina e Xa em plasma humano As galactanas também foram avaliadas, em plasma, quanto a seu efeito sobre a atividade dos Fatores IIa e Xa sobre seus respectivos substratos. Assim, para tal, adiciona-se substratos cromogênicos ao plasma suplementado com as drogas (0-100 g/mL) e os produtos formados são quantificados a 504nm. Os resultados estão expressos em porcentagem de inibição. A quantidade de produtos cromogênicos formados é diretamente proporcional a absorbância neste comprimento de onda. Assim, a leitura de absorbância na ausência de drogas é considerada como zero por cento de inibição destas enzimas e uma diminuição desse valor significa inibição de suas respectivas atividades.
Figura 21. Atividades anti-IIa e anti-Xa das SG 1 e SG 2 em plasma humano.
Plasma citratado foi suplementado com as SGs e heparina em diferentes concentrações (0-100 g/mL). O resultado a porcentagem de inibição da atividade dos serino-proteases IIa e Xa.
Podemos observar na Figura 21 que as galactanas, nas concentrações utilizadas, não apresentaram efeito inibitório sobre a atividade das serino-proteases trombina e Xa. Por outro lado, a heparina, como descrito na literatura, inibiu a atividade destas proteases, já em baixas concentrações.
5.4.3 – Efeito das galactanas na inibição de trombina e Xa em sistema purificado na presença de antitrombina
Ainda na tentativa de verificar o efeito das SGs sobre as proteases trombina e Xa, realizamos um ensaio que no lugar de plasma emprega um sistema purificado, ou seja, as enzimas em presença de antitrombina. Assim, suplementamos a uma solução de antitrombina (5 U/mL) diferentes concentrações de SGs (0-1.000 g/mL) e para cada teste sua protease seguida de seu substrato cromogênico específico. Neste sistema podemos verificar o efeitos das SGs diretamente na serpina antitrombina e/ou nas proteases IIa e Xa, enquanto no teste que utiliza plasma humano, outros fatores além da trombina e Xa podem estar envolvidos com o possível efeito da droga. A Figura 22 mostra os resultados para este ensaio.
Figura 22. Atividades anti-IIa e anti-Xa das SG 1 e SG 2 em sistema purificado na presença da serpina antitrombina. Solução de antitrombina foi suplementada com as SGs em diferentes concentrações (0-1.000 g/mL). O resultado a porcentagem de inibição da atividade dos serino-proteases IIa e Xa.
As SGs mostraram efeitos distintos na inibição de trombina e Xa. Diferentemente dos ensaios realizados em plasma onde as SGs não mostraram efeito ou efeito negligente sobre a atividade destas proteases (Figura 21), elas mostraram efeitos, no mínimo curiosos no sistema purificado na presença de antitrombina exógena. Para o teste de Anti-IIa, em altas concentrações (100 g/mL e 1 mg/mL) ambas SGs inibiram a formação de substratos cromogênicos, o seja, inibiram a atividade da trombina para valores ao redor de 40%. Por outro lado, as SGs quando desafiadas no teste de Anti-Xa aumentaram a formação de substrato cromogênico, ou seja, gráfico de inibição com valores negativos. Estes resultados indicam que ocorre interação das SGs com antitrombina e/ou FIIa e FXa. Provavelmente, mudanças conformacionais das proteínas e/ou dos complexos formados gerados pela adição das SGs, no teste de Anti-IIa, diminuem a conversão do substrato cromogênico, enquanto para o teste Anti-Xa, as interações antitrombina/SGs e/ou Fator Xa/SGs, bem como complexos protéicos (antitrombina/FXa + SGs) aumentam a conversão do substrato cromogênico, promovendo a atividade catalítica do FXa.
5.4.4 – Atividades anticoagulantes das SGs - PT, aPTT, Heptest,TT e ACT - em sangue total humano e efeito na inibição de trombina e Xa em plasma recolhido.
Os dados mostram que as galactanas não apresentam efeito sobre o tempo de coagulação empregando-se plasma humano, e que, no entanto quando testadas em sistema purificado apresentam efeitos opostos sobre trombina e Xa em altas concentrações. Esses resultados nos levaram a investigar se as galactanas apresentariam efeito no tempo de coagulação de sangue humano total (WB, “Whole Blood”). Assim, diferentes concentrações de galactanas foram adicionadas ao WB e testadas nos diferentes ensaios (Tabela VII). Novamente, como já observado para plasma as SGs apresentam efeito somente sobre o aPTT e em altas concentrações. O efeito das SGs na inibição de trombina e fator Xa foi também realizado para WB. No entanto, diferentemente do ensaio em plasma onde a protease é adicionada ao plasma que foi suplementado com as SGs, para o WB o ensaio é realizado no plasma recolhido por centrifugação do WB que foi suplementado com diferentes concentrações das SGs. A esse plasma conveniou-se chamar plasma recolhido (RT, “Retrieved Plasma”). Da mesma forma que no ensaio em plasma humano, as SGs não apresentaram efeito sobre as atividades da trombina e Xa no RT. A Tabela VII sumariza os resultados obtidos.
Com o WB, também realizamos o teste de tempo de coagulação ativado (ACT). Após coleta, ao sangue é adicionado diferentes concentrações de SGs ou heparina em presença de celite para ativação da coagulação. O tempo de formação do coágulo é avaliado em equipamento específico (Hemochron). A Figura 23 mostra os resultados. Novamente, nenhuma das SGs apresentou efeito no tempo de coagulação ativado por celite.
Tabela VII. Atividades anticoagulantes das SG 1 e SG 2 e heparina em sangue total Concentração WB Tempo (segundos) RT Inibição (%)
Compostos (g/mL) aPTT Heptest TT Anti-IIa Anti-Xa
SG 1 0 30,1 17,9 12,5 0,0 0,0 25 61,1 18,9 16 0,0 0,0 50 70,4 19,1 17,3 1,5 0,0 SG 2 0 30,1 17,9 12,5 0,0 0,0 25 62,5 16,7 17 0,0 0,0 50 78,8 22,9 22,7 0,6 0,0 Heparina 0 30,1 17,9 12,5 0,0 0,0 2,5 160,7 63,0 83,7 24,0 45,7 5,0 200,4 90,3 151,8 39,5 57,2
WB, sangue total; RT, plasma recolhido
Figura 23. Atividade anticoagulante das SG 1 e SG 2 em sangue total (WB) pelo teste ACT. O sangue total citratado foi suplementado com diferentes concentrações (0-100 g/mL) de SGs e heparina 10 g/mL. O resultado mostra o tempo de formação do coágulo após recalcificação e ativação da coagulação em tubos contendo celite. s, segundos.
5.4.5 – Efeito conjunto das SGs e heparina nos testes de aPTT, Heptest e TT em plasma e na inibição de trombina e fator Xa em sistema purificado.
Os resultados obtidos nos levaram a investigar um potencial efeito sinérgico da ação da heparina e destes compostos nos testes de PT, aPTT, Heptest, em plasma, bem como no sangue total (WB).
Assim, soluções de SG 1 ou SG 2 e heparina foram preparadas em diferentes proporções: 100% de heparina e 0% de SG (1 ou 2); 75% de heparina e 25% de SG (1 ou 2); 50% de heparina e 50% de SG (1 ou 2); 25% de heparina e 75% de SG (1 ou 2); 0% de heparina e 100% de SG (1 ou 2). Em seguida, estas soluções foram adicionadas a plasma humano citratado para concentração final variando de 0-10 g/mL.
Como já mostrado, as SGs não apresentam atividade anticoagulante ou possuem atividade negligente em altas concentrações em plasma (Figura 20), portanto, em concentrações baixas das SGs (0-10 g/mL) nenhum efeito foi observado. Já a heparina nesta faixa de concentração apresenta potente atividade anticoagulante. Assim, à medida que a proporção de heparina na solução diminuísse (100-0%) esperava-se que a atividade anticoagulante da mistura seguisse essa tendência, uma vez que a atividade anticoagulante refletiria a ação da heparina.
A figura 24 mostra os resultados obtidos para as diferentes proporções entre SGs e heparina. Fica evidente que quando proporção entre SG e heparina é de 1:3, ocorre um sinergismo entre as SGs e heparina no ensaio da aPTT. Em maiores proporções de SGs na concentração de 10 g/mL da mistura observa-se uma diminuição do efeito da heparina ao redor de 50%, ou seja, as SGs em maior concentração inibem o efeito de heparina.
Figura 24. Atividades anticoagulantes de misturas de SGs e heparina em plasma humano. Plasma citratado foi suplementado com misturas SGs e heparina em diferentes proporções SGs/heparina e em diferentes concentrações finais no plasma (0-10 g/mL). O resultado mostra o tempo necessário para formação do coágulo em função da concentração das
A figura 24 também mostra o efeito das diferentes proporções de SGs e heparina no Heptest. Observa-se que quando proporção entre SG e heparina é de 1:3 ou de 1:2 ou 1:1 ocorre sinergismo entre as SGs e heparina no ensaio do Heptest. Esses resultados ficam claros quando a concentração da mistura é inferior ou igual 5 g/mL, pois em maiores concentrações começa saturação do sistema. Com relação ao teste de TT, observa-se que SGs em todas as proporções avaliadas levam à potencialização do efeito da heparina. Vale comentar que o efeito já é máximo para concentrações de heparina a partir de 5 g/mL.
Como mostrado na Figura 22 as SGs apresentam efeitos distintos na inibição de trombina e fator Xa em presença de Antitrombina, ou seja, em concentrações acima de 100 mg/mL ocorre cerca de 40% de inibição da trombina, enquanto para o fator Xa ocorre ativação ao redor de 30%. Assim, foram realizados experimentos onde inicialmente a solução de antitrombina foi previamente suplementada com 1 mg/mL de SG 1 ou SG 2, e a seguir foram realizadas curvas em presença de diferentes concentrações de heparina e a atividade de trombina e anti-Xa avaliada por hidrólise de substrato cromogênico específico para cada serino-protease. Os resultados mostram que as SGs presentes na solução de antitrombina potencializam o efeito da heparina em baixas concentrações (até 2,5 g/mL). Em concentrações superiores, ocorre saturação da curva de atividade inibitória desta protease (Figura 25). No entanto, a mesma resposta não pode ser observada para a atividade Anti-Xa. Como as SGs sozinhas ativaram a atividade do FXa neste sistema (Figura 22), esperávamos que o efeito anti-Xa da heparina fosse atenuado pelas SGs. No entanto, como pode ser visto na Figura 25, a presença das SGs não modificou o perfil de ação da heparina, sugerindo que a heparina e SGs atuem em diferentes sítios, ou que a heparina desloquem as SGs da interação com Fator Xa e antitrombina, ocorrendo então inibição da hidrólise do substrato pela enzima.
Os mesmos resultados foram obtidos para este ensaio, adicionando-se primeiro heparina a solução de AT, seguido das SGs (dados não mostrados).
Figura 25. Atividades Anti-IIa e Anti-Xa da heparina em sistema purificado na presença da antitrombina suplementada com SGs. A solução de antitrombina foi suplementada com SGs (1 mg/mL) e a seguir foram adicionadas diferentes concentrações de heparina (0-10 g/mL) e substrato cromogênico e as enzimas trombina e fator Xa. O resultado mostra a porcentagem de inibição da atividade dos serino-proteases IIa e Xa.
5.4.6 – Efeito das SGs nos ensaios de aPTT, Heptest e TT e na inibição de trombina e fator Xa em plasma heparinizado
O efeito das SGs no tempo de coagulação de plasma heparinizado medido pelos ensaios de aPTT, Heptest e TT está mostrado na Figura 26. O zero de concentração de SGs refere-se ao tempo de coagulação do plasma heparinizado (2,5 g/mL). Assim, valores acima implicam em potencialização do efeito observado para a heparina.
Para o aPTT observa-se aumento no tempo de coagulação em função da concentração de SGs. Os dados também mostram que as duas SGs apresentam efeitos semelhantes.
Para o Heptest, também se observa aumento do tempo de coagulação em função da concentração de SGs, no entanto, o efeito da SG 2 é nitidamente superior ao da SG 1, e saturado a partir de concentrações acima de 25 g/mL atingindo cerca de 300 segundos. Por outro lado, para SG 1 o tempo de coagulação atinge o máximo de 80 segundo somente com concentração de 100 g/mL.
Curiosamente, quando o ensaio no plasma heparinizado é feito em presença da serino-protease (trombina ou Fator Xa) e do respectivo substrato cromogênico não se observa efeito das SGs.
Figura 26. Atividades anticoagulantes de SGs e em plasma humano heparinizado.
Plasma citratado foi suplementado com heparina para concentração final de 2,5 g/mL e a seguir foi adicionada SGs em diferentes concentrações (0-100 g/mL). Os resultados de aPTT, Heptest e TT mostram o tempo necessário para formação do coágulo em função da concentração das drogas, enquanto Anti-IIa e Anti-Xa a porcentagem de inibição das drogas usadas.
5.4.7 – Efeito das SGs nos ensaios de aPTT, Heptest e TT sangue total heparinizado e no “retrieved plasma”.
O efeito das SGs no tempo de coagulação medido pelos ensaios de aPTT, Heptest e TT em sangue heparinizado e no plasma retirado (“retrieved plasma”, ver métodos) são mostrados na Figura 27.
Figura 27. Atividades anticoagulantes das SG 1 e SG 2 em sangue total
heparinizado e no “retrieved plasma”. Após coleta o sangue foi suplementado com heparina
(2,5Pg/mL) e a esta solução foram adicionados diferentes concentrações (0-100 Pg/mL) de SGs. Uma alíquota do sangue heparinizado foi centrifugada e o plasma recolhido (RT). Ambos WB (sangue total) e RT foram ensaiados empregando-se os diferentes testes de coagulação. s, segundos.
O efeito das SGs no tempo de coagulação de sangue total heparinizado medido pelos ensaios de aPTT, Heptest e TT está mostrado na Figura 27. O zero de concentração de SGs refere-se ao tempo de coagulação do sangue total heparinizado (2,5 g/mL). Assim, valores acima implicam em potencialização do efeito observado para a heparina. É interessante salientar que quando se compara este valor com o obtido com plasma heparinizado há um aumento significativo no tempo de coagulação para todos os ensaios. Observa-se que para ambas SGs o aumento do efeito da heparina medido pelo aPTT é equivalente e concentração dependente, e a partir de 6 g/mL das SGs ocorre saturação da curva em 300 segundos. Cabe ainda salientar que quando testadas individualmente no sangue total, as SGs não apresentaram efeito (Tabela VII).
Os resultados do Heptest foram semelhantes ao observado para plasma heparinizado, onde SG 2 apresenta maior atividade do que SG 1. Ainda, os resultados mostram que já nas concentrações de 3 g/mL ocorre um aumento de cerca de 3 e 4,5 vezes no tempo de coagulação, respectivamente para as SG 1 e SG 2. Por outro lado, para o TT observa-se que o efeito já está saturado na concentração de 3 g/mL para ambas SGs.
A Figura 27 também mostra os resultados do RT obtido a partir de sangue total heparinizado com 2,5 g/mL de heparina e em presença de diferentes concentrações de SGs. Assim, SGs e heparina estão presentes no sangue total. Curiosamente, observa-se que o RT obtido na ausência de SGs apresenta tempo de coagulação superior no ensaio do aPTT e do TT, ao observado quando se testa diferentes concentrações de heparina em plasma citratado (Figura 20). Ainda, não foi possível observar efeito das SGs no RT quando o teste empregado foi aPTT ou TT. Por outro lado, no Heptest observa-se que o tempo de coagulação aumenta em função da concentração de SGs no sistema. Novamente, o efeito da SG 2 é superior ao da SG1, e está saturado a partir de cerca de 10 g/mL.
5.4.8 – Efeito das SGs na inibição de trombina e Xa em RT (“retrieved plasma”) heparinizado.
Ainda na tentativa de investigar os efeitos das SGs, realizamos os ensaios Anti-IIa e Anti-Xa, com o plasma recolhido (RT) após centrifugação do sangue total heparinizado em presença de diferentes concentrações de SGs (0-100 g/mL). A figura 28 ilustra os resultados.
Figura 28. Atividades Anti-IIa e Anti-Xa de SGs em plasma recolhido (RT). Após coleta o sangue foi suplementado com heparina (2,5 g/mL) e diferentes concentrações de SGs (0-100 g/mL). O sangue foi centrifugado e o plasma recolhido (RT) e testado empregando-se substrato cromogênico e serino-proteases (trombina e Xa). Os resultados são expressos como porcentagem de inibição da atividade das serino-proteases IIa e Xa.
Curiosamente, as SGs que não apresentaram efeito quando ensaiadas em plasma heparinizado (Figura 26) mostram atividade no RT heparinizado. Assim, observa-se que ambas SGs diminuem o efeito de inibição da heparina sobre o Fator Xa mostrando curva dependente de concentração. As curvas são distintas para SG 1 e SG 2. Para SG 2 o efeito máximo (cerca de 25% de redução na inibição) já é alcançado com 25 g/mL, enquanto para SG 1 a diminuição na % de inibição ocorre até concentrações de 100 g/mL (cerca de 40 %). Por outro lado, somente SG 1 apresentou efeito sobre trombina, diminuindo o efeito da heparina em cerca de 50% na concentração de 100 g/mL. Não foram observados efeitos sobre trombina em todas as concentrações testadas de SG 2.
Logo, as posições destes grupamentos sulfato nas SG 1 e SG 2 estariam, provavelmente, influenciando de forma decisiva para a diferença na atividade anticoagulante apresentadas por elas.
Em trabalho realizado por Melo et al. (Melo et al., 2004) foram comparadas homogalactanas sulfatadas de invertebrados marinhos e da alga vermelha Botryocladia occidentalis. Foi mostrado que galactanas que possuem um terço dos resíduos de galactose 2,3-di-O-sulfatada apresentam atividade anticoagulante semelhante à da heparina não fracionada, no entanto outra galactana que possui sulfato na posição no carbono C-2 ou C-3 e não em ambas, apresenta baixa atividade anticoagulante. Em complemento a isso, foi mostrado em outro trabalho, que tanto a dupla sulfatação em C-2/C-3, ou em C-4/C-6 parecem ser necessárias para galactanas apresentarem atividade anticoagulante (Chaidedgumjorn et al., 2002).
5.4.9 – Efeito das SGs na agregação plaquetária
Em trabalho anterior (Farias, 2006) mostramos que as SGs não apresentam efeito per se na agregação plaquetária quando testados em baixas concentrações. No entanto, em altas concentrações (acima de 250 g/mL) SG 2 induziu ao redor de 70% de agregação. Esses resultados nos levaram a investigar se as SGs teriam efeito na agregação plaquetária em ensaios de competição com agonistas plaquetários conhecidos - ADP, Colágeno, Adrenalina.
Assim, diferentes concentrações de SGs foram adicionadas ao PRP, e a agregação plaquetária frente a diferentes agonistas medida após 7 minutos. Os dados mostram que nenhuma das SGs apresentou efeito sobre a ação dos agonistas utilizados (Figura 29).
Trabalhos estudando algas verdes do mesmo gênero, empregando frações de polissacarídeos sulfatados, alguns enriquecidos em galactanas (Ciancia et al., 2007) mostraram que esses compostos também não apresentam atividade quando testadas frente a agonistas como ADP. No entanto, algumas das frações quando em altas doses apresentavam ação pró-agregantes. Dados semelhantes
foram observados para galactanas sulfatadas da alga vermelha Botryocladia occidentalis (Farias et al., 2001).
Para outros tipos de polissacarídeos sulfatados isolados de algas, como fucoidanas, foi mostrado que esses compostos induzem agregação plaquetária irreversível de forma concentração dependente, e diretamente proporcional ao tamanho molecular (Durig et al., 1997).
Figura 29. Ação das SGs na agregação
plaquetária induzida por ADP, colágeno e adrenalina. O plasma rico em plaquetas (PRP) contendo diferentes concentrações das SGs como indicado, foi estimulado para agregação por ADP (3 M), colágeno (5 g/mL) e adrenalina (0,5 M) a 37 oC. A agregação foi medida após 7 minutos e está expressa como porcentagem de agregação.
5.4.10 – Atividade anti-hemostática e atividade antitrombótica das SGs
A atividade anti-hemostática das SGs foi testada em 2 modelos: sangramento por transecção caudal e sangramento por escarificação e uso tópico da heparina (efeito residual). Em ambos os modelos, as SGs não apresentaram efeito hemorrágico. Heparina testada nas mesmas condições produz intenso sangramento dose dependente (Tabela VIII).
A atividade de inibição na formação de trombos também foi avaliada para as SGs empregando-se 2 modelos distintos. No modelo de trombose da veia jugular induzido por pinçamentos sucessivos, observou-se que as SGs em diferentes concentrações quando injetadas por via endovenosa (veia caudal), não bloqueiam a formação de trombos, apresentando resultados semelhantes ao dos animais controle tratados com salina. No modelo de trombose de ligadura da veia cava, diferentes concentrações de SGs injetadas pela veia femural não promovem inibição na formação de trombos, apresentando resultados semelhantes ao dos animais controles não tratados com droga (Tabela VIII), contrastando com a heparina que apresenta potente ação antitrombótica (Tabela VIII).
Tabela VIII. Atividade anti-hemostática e antitrombótica das SGs. Compostos Concentração
(g/mL)
Efeito anti-hemostático Efeito antitrombótico Modelo 1a Modelo 2a Modelo 1b Modelo 2c
SG1 10 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 100 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 1000 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 SG2 10 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 100 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 1000 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12 Heparina 250 >15 >15 8 – 10 zero Salina - 6 – 8 1 – 2 3 – 4 10 – 12
a tempo de sangramento em minutos; b número de pinçamentos necessários para formar o trombo; c peso do trombo
5.5 – Interação das SGs com Antitrombina, Fator IIa e FXa
As proteínas da coagulação - AT, Xa, IIa - possuem diversos resíduos de triptofano distribuídos pela suas cadeias, estando alguns deles localizados perto de aglomerados de resíduos básicos possivelmente envolvidos na ligação de carboidratos sulfatados. Assim, a emissão de fluorescência deste resíduo pode ser usada para estudar mudanças locais na conformação protéica induzida pela interação com carboidratos sulfatados (Church et al., 1989; Sun and Chang, 1989; Tanyi et al., 1995).
A adição das galactanas resultou numa atenuação, dose dependente, da fluorescência do triptofano em todas as proteínas em estudo de uma maneira similar ao que ocorreu após a adição de heparina. Tal observação sugere que tais compostos interagem de maneira similar com as proteínas da coagulação (Figuras 30 a 32).
Figura 30. Efeito das SGs na fluorescência de triptofano da Antitrombina. O painel da esquerda mostra os gráficos da intensidade de variação de fluorescência (excitação = 285 nm; emissão = 350 nm; fenda de 5 nm) da Antitrombina (30 ng/mL) e o painel da direita representa o
Figura 31. Efeito das SGs na fluorescência de triptofano da Trombina. O painel da esquerda mostra os gráficos da intensidade de variação de fluorescência (excitação = 285 nm; emissão = 350 nm; fenda de 5 nm) da Antitrombina (30 ng/mL) e o painel da direita representa o ajuste da equação não-linear F= (Fmax X [SG])/(Kd + [SG]).
Apesar da interação similar, é interessante ressaltar que diferentemente da heparina, ambas galactanas não possuem atividade anticoagulante em plasma quando testadas nos diferentes ensaios, indicando que só a interação não é suficiente para o efeito farmacológico.
Apesar das limitações para a determinação de Kd entre proteínas e carboidratos sulfatados complexos em conseqüência da heterogeneidade de massa molecular, bem como presença de possíveis sítios de interação de alta e baixa afinidade, os Kds foram determinados utilizando a equação F = (Fmax x
[galactana])/(Kd + [galactana]), tomando como base a massa molecular média das galactanas sulfatadas. As curvas hipérbólicas obtidas foram ajustadas de acordo com a equação não-linear, onde F= a variação de fluorescência emitida induzida pelo polissacarídeo sulfatado ligado à proteína, Fmax é o máximo de variação de
fluorescência em concentração infinita de polissacarídeo sulfatado e Kd é a constante de dissociação aparente do complexo proteína-polissacarídeo sulfatado.
SG 1 e SG 2 apresentaram Kd de 10-9 M, semelhantes aos valores descritos para heparina (da ordem de 48 nM) (Watton et al., 1993). Os dados mostram que as SGs mesmo possuindo alta afinidade pelos fatores da coagulação com forte interação com trombina, fator Xa e antitrombina em sistemas isolados, apresentam atividade anticoagulante negligente quando comparados à heparina.
Figura 32. Efeito das SGs na fluorescência de triptofano do Fator Xa. O painel da esquerda mostra os gráficos da intensidade de variação de fluorescência (excitação = 285 nm; emissão = 350 nm; fenda de 5 nm) da Antitrombina (30 ng/mL) e o painel da direita representa o ajuste da equação não-linear F= (Fmax X [SG])/(Kd + [SG]).
5.6 – Ensaios de biologia celular
5.6.1– Efeito das SGs sobre a viabilidade e proliferação celular
Para investigar o efeito das SGs sobre a viabilidade e proliferação celular em cultura de células utilizamos diferentes linhagens celulares que vem sendo estudadas em nosso laboratório: células endoteliais (EC) de aorta de coelho; fibroblastos humanos; Caco-2, tumor de cólon-retal humano; HCT 116, carcinoma coloretal humano; PC-3, adenocarcinoma de próstata humano derivado de metástase óssea; e DU 145, carcinoma de próstata humano. Cada tipo celular foi mantido em cultura como descrito em Métodos.
Assim, foi realizado o ensaio de viabilidade celular utilizando a técnica de MTT (ver métodos). As linhagens celulares foram expostas a diferentes concentrações (0-100 g/mL) das SGs e foram investigadas quanto à viabilidade celular (MTT) e proliferação celular (BrdU) (ver Métodos). Os resultados para o ensaio de viabilidade celular podem ser visualizados na Figura 33.
Os dados da figura 33 mostram que as SGs alteram a viabilidade celular somente das células de carcinoma de próstata humano (Du-145). Os resultados também mostram que a curva dose x efeito, não apresenta dependência de concentração para as doses empregadas. O efeito sobre Du-145 com a menor dose testada das SGs já leva a uma diminuição da viabilidade celular em cerca de 35%. Resultados semelhantes foram também observados quando heparina na concentração de 100 g/mL foi testada nas mesmas condições nessas células.
Figura 33. Efeito das SGs na viabilidade de diferentes tipos celulares normais e tumorais. EC, células endoteliais; fibroblasto, fibroblasto humano derivado de ; Caco-2, linhagem celular derivada de cólon-retal humano; HCT 116, linhagem celular derivada de carcinoma colo retal humano; PC-3, linhagem celular derivada de metástase óssea de adenocarcinoma de próstata humano; e DU 145, linhagem celular derivada de carcinoma de próstata humano. Zero no eixo x representa os resultados obtidos com células tratadas com BSS na ausência dos diferentes polissacarídeos sulfatados. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P <0.05.
A Figura 34 ilustra os resultados obtidos quanto ao potencial efeito das SGs na proliferação dos diferentes tipos celulares. As células foram privadas de soro e assim mantidas na fase G0 do ciclo celular. A seguir, foram estimuladas com soro
Figura 34. Efeito das SGs na proliferação avaliado de diferentes tipos celulares avaliado pela incorporação de BrdU. Cerca de 5.000 células foram mantidas em meio específico para cada célula na presença de 0,2 % de SFB por 24 - 48 horas a 37 °C em atmosfera de CO2 (2,5%). A seguir foi adicionado ao meio de cultura: BrdU (10 M), BrdU (10M) contendo SFB 10% ou BrdU (10M) contendo SFB 10% e diferentes concentrações das SGs ou heparina por 18 horas. A incorporação de BrdU no DNA foi quantificada por quimiluminescência em leitora de ELISA conforme descrito em Métodos. rlu/s: unidade de luz relativa por segundo; EC, células endoteliais; fibroblasto, ; Caco-2, linhagem celular derivada de cólon-retal humano; HCT 116, linhagem celular derivada de carcinoma colo retal humano; PC-3, linhagem celular derivada de metástase óssea de adenocarcinoma de próstata humano; e DU 145, linhagem celular derivada de carcinoma de próstata humano. Zero no eixo x representa os resultados obtidos com células tratada com BSS e na ausência dos diferentes polissacarídeos sulfatados. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P
Os resultados mostram que entre os tipos celulares avaliados, as SGs alteram a proliferação para alguns tipos celulares, em concentrações específicas e o efeito varia de acordo com o tipo celular. Assim, a proliferação celular de fibroblastos foi estimulada em cerca de 2 vezes pela SG 2 e a curva dose x efeito já mostra efeito máximo na menor concentração do composto investigada. Heparina produziu efeito semelhante na concentração de 100 g/mL. Ainda, é importante ressaltar que nenhum efeito foi observado quando SG 1 foi ensaiada nas mesmas concentrações e condições. Células endoteliais também foram estimuladas a proliferar em presença de SG 2, porém somente em concentrações acima de 50 g/mL. Por outro lado, SG 1 inibiu a proliferação de HCT-116, linhagem celular derivada de carcinoma colo retal humano, e aparentemente já na concentração de 12,5 g/mL observa-se uma diminuição na proliferação ao redor de 40%. SG 2 e heparina não tiveram efeito nesta linhagem. Para os demais tipos celulares estudados (Caco 2, PC3 e DU-145) foi observado que ambas as SGs inibem a proliferação com curvas de concentração dose x efeito específica para cada SG. Observa-se que SG2 apresenta maior ação inibitória em função do efeito observado em menores concentrações.
São poucos os dados da literatura sobre a ação de polissacarídeos sulfatados na viabilidade e proliferação de células normais e tumorais. Recentemente, foi mostrado que fucoidanas de algas marrons induzem apoptose em células de câncer de cólon (Kim et al.). Fucanas sulfatadas da alga marrom Ascophyllum nodosum denominadas ascofilanas não apresentam efeito citotóxico em diferentes tipos celulares investigados. Curiosamente, esses compostos aumentam a proliferação de alguns tipos celulares, enquanto outros fucoidanas inibem a proliferação (Jiang et al., 2010). Heterofucanas sulfatadas de Spatoglossum schröederi apresentaram citoxicidade e inibição da proliferação quando testadas frente a diferentes linhagens tumorais. A proliferação celular de linhagem de fibroblastos também foi inibida por esses compostos (Almeida-Lima et al., 2010). No entanto, esses compostos quando avaliados frente a células endoteliais e epiteliais não promoveram efeito na proliferação e na vialibilidade
constituídos principalmente por ácidos urônicos e glucose presentes na alga verde Ulva lactuca alteram a proliferação celular de células epiteliais normais e de tumor de cólon (Caco-2) (Kaeffer et al., 1999). Em algas vermelhas foi mostrado que carragenanas são citotóxicas para linfócitos humanos e alguns tipos promoveram a proliferação celular (Sugawara and Ishizaka, 1982).
Assim, dependendo do tipo celular e da estrutura do polissacarídeo sulfatado e das concentrações empregadas, observa-se que esses compostos complexos podem apresentar atividades distintas na proliferação celular, bem como, na capacidade citotóxica.
5.6.2 – Efeito das SGs na síntese de glicosaminoglicanos sulfatados pelas células endoteliais
A presença de heparam sulfato na superfície de células endoteliais em cultura foi primeiramente observada por (Buonassisi, 1973). Posteriormente, verificou-se que, o heparam sulfato da célula endotelial apresentava um efeito inibitório na coagulação sangüínea (Buonassisi and Colburn, 1983).
Em nosso laboratório foi descrito pela primeira vez o efeito de heparina sobre células endoteliais. Heparina induz aumento na síntese de heparam sulfato. O efeito é específico para heparam sulfato, não alterando a síntese de outros glicosaminoglicanos e de glicoproteínas sulfatadas e é específico para célula endotelial (Nader et al., 1989; Nader et al., 1991). Outros autores observaram o mesmo fenômeno paras células endoteliais da aorta bovina (Lowe-Krentz et al., 2001) e células endoteliais do cordão umbilical humano (Pinhal et al., 2001)
Resultados do nosso grupo também demonstram que polissacarídeos sulfatados de algas (fucanas) estimulam a síntese e liberação de heparam sulfato, em células endoteliais (Leite et al., 1998). Esse heparam sulfato especifico de células endoteliais é rico em unidades contendo ácido idurônico 2-O-sulfato e apresenta ação antitrombótica (Nader et al., 1987; Nader et al., 2004b; Pinhal et al., 1995; Pinhal et al., 1994). Assim, o efeito das SGs nesse sistema foi investigado. Células endoteliais, confluentes, foram expostas ou não (controle) a diferentes concentrações de SGs (0-100 g/mL) e heparina (100 g/mL) em
presença de [35S]-sulfato. As células foram mantidas a 37 oC sob atmosfera de 2,5% de CO2, e após 24 horas os GAGs sulfatados foram extraídos e analisados.
A incorporação de [35S]-sulfato nos GAGs sintetizados pelas células na presença ou ausência dos polissacarídeos presentes na fração celular e secretados para o meio extracelular, corrigida por microgramas de proteína celular, está representado na Figura 35.
Figura 35. Efeito das SGs na síntese de glicosaminoglicanos sulfatados em células endoteliais. Esse experimento foi realizado utilizando-se células endoteliais de aorta de coelho confluentes, que foram incubadas por 22h em meio F-12 sem SFB, contendo [35S]-sulfato de sódio (150Ci/mL) em presença ou ausência de diferentes concentrações das SGs (0 - 100g/mL) e de heparina (100g/mL). Os GAGs sintetizados foram identificados e quantificados como descrito em métodos. Os resultados são expressos como cpm (contas por minuto) por g de proteína celular e representam a média de 4 determinações ± desvio padrão. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P <0.05; HS, heparam sulfato; CS, condroitim sulfato.
Nota-se que SGs induzem um aumento significativo na síntese do heparam sulfato secretado para o meio extracelular. Este efeito é dose dependente e já pode ser observado na menor concentração testada (cerca de 3 x em relação ao controle). Embora ambas SGs estimulem a síntese do heparam sulfato, pode-se observar que o efeito de SG 2 é menores concentrações é maior do que SG 1. Como observado para heparina, o efeito é específico para o heparam sulfato. Não se observa variação na síntese do condroitim sulfato. Ainda, SGs apresentam efeito maior do que heparina testada nas mesmas concentrações. É importante
glicosaminoglicanos presentes na fração celular (p>0,05). Assim, a exposição das células endoteliais a diferentes concentrações das SGs levou a um estímulo específico na síntese de heparam e na sua secreção.
Como já mencionado, o heparam sulfato de células endoteliais apresentam ação antitrombótica (Buonassisi and Colburn, 1983; Rocha et al., 2005c) e as células quando expostas às SGs aumentaram significativamente a síntese desse composto. No entanto, não observamos efeito das SGs na inibição da trombose em modelo animal. Esse resultado aparentemente contraditório poderia ser explicado com o modelo descrito por Rocha e col. (Rocha et al., 2005c) que verificou que uma galactofucana sulfatada da alga marrom S. schröederi, também não apresentou atividade anticoagulante ou antitrombótica quando comparado com a heparina. No entanto, os autores observaram que o aparecimento de atividade antitrombótica dessa galactofucana sulfatada era dependente do tempo de exposição à droga, sendo máximo após 6 horas. A galactofucana sulfatada também induziu a síntese do heparam sulfato por células endoteliais, e foi demonstrado que o efeito antitrombótico do meio era dependente da secreção do heparam sulfato. Assim, foi proposto que a heparina atua como antitrombótico tanto via seu efeito anticoagulante quanto pela indução da síntese do heparam sulfato endotelial. Esses dois efeitos não são fáceis de distinguir. Contudo, os resultados obtidos com a galactofucana sulfatada, que não possui atividade anticoagulante e que apresenta potente ação antitrombótica e induz a síntese do heparam sulfato endotelial, permitem enfatizar que esse mecanismo tenha papel relevante na prevenção da trombose. Com relação às galactanas sulfatadas aqui descritas são necessários novos experimentos de inibição de trombose como os realizados para a galactofucana sulfatada para corroborar a potencial ação antitrombótica.
5.6.3 – Efeito das SGs sobre adesão e migração de células endoteliais
O efeito das SGs sobre a adesão de células endoteliais (EC) foi também investigado. Assim, as placas de cultura foram recobertas com laminina ou fibronectina e as células foram em seguida plaqueadas (ver Métodos). Diferentes
concentrações de SGs (0-100 g/mL) e heparina (100 g/mL) foram adicionadas ao meio de cultura e o efeito dos compostos sobre a adesão de células endoteliais foi avaliado.
Figura 36. Efeito das SGs na adesão de ECs em superfície de fibronectina ou laminina. Cerca de 50.000 células endotelias foram mantidas a 37 ºC por 2h na presença das proteínas de matriz (10 g/ml). Após esse tempo, as células aderidas foram fixadas, coradas e analisadas em leitora de ELISA a 540nm conforme descrito em Métodos. O experimento foi realizado em quadruplicata. CTR, células controle na ausência dos polissacarídeos sulfatados; BSA, albumina sérica bovina. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P <0.05.
Nota-se que ambas as SGs, nas concentrações utilizadas, não tiveram efeito na adesão de ECs sobre o “coat” de fribronectina quando comparadas ao controle (ausência de drogas). Por outro lado, heparina na concentração de 100 g/mL inibiu em cerca de 40% a adesão das ECs neste substrato (Figura 36).
As SGs, quando avaliadas na adesão das ECs sobre um “coat” de laminina, inibiram em cerca de 40% a adesão, em todas as concentrações utilizadas, indicando provável saturação já na concentração de 12,5 g/mL. Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparamos as SGs nas diferentes concentrações (p >0,05), indicando que o efeito das SGs não se mostrou dose dependente para as concentrações empregadas (Figura 36). O mesmo efeito de inibição da adesão foi também observado para a heparina (100 g/mL).
Assim, o efeito anti-adesão diferenciado das SGs nas ECs é dependente do “coat” de proteína utilizado, ou seja, a interação das SGs pode ou não influenciar a adesão dessa linhagem celular, dependendo do substrato em que se encontram.
As SGs também foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a migração de ECs utilizando técnica de “scratch” (ver Métodos). Após confluência foi feita um arranhão utilizando-se com ponteira (1000L), estabelecendo-se um espaço livre entre as células. A seguir, foi retirado o meio de cultura e adicionado novo meio contendo SGs (0 - 100 g/mL) ou heparina (100 g/mL) e as células foram mantidas a 37 oC por 12 horas. As células foram observadas e fotografadas em intervalos de 4 horas. A área entre as duas populações de células foi determinada nos diferentes tempos e comparada com o tempo zero (Figura 37)
Figura 37. Efeito das SGs na migração de células endoteliais em função da concentração e do tempo. A documentação da migração das células endoteliais foi realizada em intervalos de 4 horas, com o auxílio de uma câmera acoplada ao microscópio de fase invertida, com a objetiva no aumento de 10x. As imagens foram analisadas utilizando o software AxioVision da Zeiss. A área entre as duas populações de células, medida em pixels, foi utilizada para quantificar o experimento e a área medida no tempo zero para cada poço, utilizada como controle (100 % de abertura). Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P <0.05.
Os resultados mostram que as SGs a partir de 8 horas retardam a migração das células endoteliais. Não são observadas diferenças entre as concentrações
SG 2 0 20 40 60 80 100 12.5 25 50 100 4h 12.5 2 5 50 100 8h 12.5 25 50 100 12h Controle Heparina SG2
*
*
Concentração (g/mL) Á rea A b er ta (% )avaliadas. O efeito persiste pelo menos até 12 horas. Resultados semelhantes foram também observados para heparina.
5.6.4 – Efeito das SGs sobre a formação de estruturas tipo capilar por células endoteliais em Matrigel.
É conhecido que células endoteliais quando crescidas em Matrigel desenvolvem estruturas tipo capilar. Os resultados da inibição da migração de EC nos levaram a investigar se as SGs poderiam inibir a formação dessas estruturas. A figura 38 ilustra esses resultados. Fica evidente que as SGs inibem a formação de vasos. Novamente, SG 2 mostra maior atividade, inibindo em cerca de 50% já na concentração de 12,5 g/mL. Os resultados nos permitem concluir que as SGs apresentam potente efeito anti-angiogênico, o que somado à ausência de efeito hemorrágico in vivo coloca essa galactanas sulfatadas como potenciais agentes para uso na inibição da neovascularização. A heparina também apresentou efeito, no entanto frente à sua atividade hemorrágica, seu uso fica limitado. A Tabela IX mostra os dados quantitativos obtidos.
Figura 38. Efeito das SGs na formação de
estruturas tipo capilar por células endoteliais em Matrigel. (A) controle, na ausência de drogas; (B) heparina (100 g/mL); (C), (E), (G) e (I) representam as células em presença de SG 1 nas concentrações de 12.5, 25, 50 e 100g/mL; (D), (F), (H) e (J) representam as células em presença de SG 2 nas concentrações de 12.5, 25, 50 e 100g/mL. (x100)
Tabela IX. Efeito das SGs na formação de estruturas tipo capilar
Compostos Concentração (g/mL) No de vasos formados após 24 horas
SG1 12,5 107 ± 11 25 103 ± 15 50 67 ± 11 100 6 ± 5 SG2 12,5 49 ± 37 25 31 ± 27 50 8 ± 8 100 7 ± 5 Heparina 100 10 ± 3 Controle - 109 ± 50
Cada tratamento foi realizado em triplicata. Os dados foram estatisticamente avaliados pelo método teste de múltipla comparação de Dunnett. * representa P <0.05.
Inibidores de angiogênese estão sendo colocados como novas drogas candidatas para a terapia do câncer e de doenças degenerativas. Nas etapas finais da angiogênese, as células endoteliais se organizam numa rede 2-D quando plaqueadas sobre Matrigel, que corresponde à membrana basal reconstituída. Ficou evidente que as SGs inibem a formação de túbulos tipo capilares. Resultados semelhantes foram mostrados pelo nosso grupo quando nesse sistema se emprega um heparinóide purificado do cefalotórax do crustáceo Litopenaeus vannamei (Dreyfuss et al., 2010). Fucoidans purificados de diferentes algas marrons contendo quantidades substanciais de ramificações lineares de 2-O--D-glucuronopiranosil branches (1 → 3) ligadas a cadeia principal de poli--L-fucopiranose exibem potente efeito inibitório na tubulogênese in vitro empregando-se células endoteliais de cordão umbilical humano (Cumashi et al., 2007).
Os dados até o momento são indicativos que esses compostos inibem angiogênese via interação com fatores de crescimento, em especial VEGF, FGF e TGF-. Os nossos resultados das diferenças estruturais entre SG 1 e SG 2
explic com S 5.6.5 endot desen eletro carac Figur amostr corrida subme que h provav Membr foram confirm cada g sulfato (10Pg) comp SGs b na m
car sua mai SG 1. – Processo A título de teliais, foi r nvolver um oforético d terização d ra 39. Com
ras foram sub a eletroforétic etidas a ensai á uma redu velmente cons rana de nitro reveladas so mando que a glicosaminog (HS); 1, hep ); 6, SG 2 bio Observa-s aradas com biotiniladas igração (F ior atividade o de biotinil e investigar realizado a m “probe” p das galact do processo portamento bmetidas à el ca, as amost os de “blottin ução da mig seqüência de ocelulose apó mente as ba biotina está r licano sulfata parina; 2, SG otinilada (10 P se que há u m a migraç s apresenta igura 39A) e na inibiçã ação das S r a interaçã biotinilaçã para estud tanas biot o de biotinil o eletroforé etroforese em tras foram tr ng”. ( A) Gel d gração dos e uma maior in ós ensaio de ndas corresp realmente con ado, condroi 1 nativa; 3, S Pg); 7, SG 1, uma reduçã ção das S am maior in ). Estes re ão de forma SG 1 e SG 2 ão das gala
o das SG os de inte tiniladas fo ação (Figu tico das SG m gel de agar ransferidas p de agarose, c GAGs bioti nteração com “blotting” e pondentes ao njugada aos tim sulfato ( SG 2 nativa; 4 biotinilada (3 ão na migra Gs nativas nteração co sultados já ação de va 2 actanas sul 1 e SG 2, eração celu oi analisa ra 39). G 1 e SG 2 rose, tampão ara uma me corado com a nilados. Ess m a diamina p revelada com s polissacaríd compostos. M (CS), dermat 4, heparina bi 0Pg); 8, SG ação das S s. Os resul om a diam á são desc sos quando lfatadas co com a fina ular. O com ado com nativa e bi PDA 0,05M embrana de azul de toluidi se retardo d presente no ta m DAB. Nota deos sulfatad M, mistura co tam sulfato iotinilada; 5, S 2 biotinilada ( SGs biotinila ltados suge ina, levand critos para o comparad om as célul alidade de mportamen objetivo d otiniladas. pH 9,0. Após nitrocelulose, ina. Observa-da migração ampão PDA. ( a-se que em dos biotinilado ontendo 5 Pg (DS), hepara SG 1 biotinila (30 Pg). adas, quand erem que do à reduçã heparinas da as se nto de As s a , e -se é (B) B, os, de am ada do as ão e
da biotina às SG 1 e SG 2 foi confirmada após transferência dos compostos para membrana de nitrocelulose, por incubação com estreptavidina conjugada com peroxidase e revelação com DAB, como descrito em Métodos (Figura 39B).
5.6.6 – Detecção citoquímica das SGs em células endoteliais
Dados anteriores de nosso laboratório mostram que a heparina se liga à matriz extracelular de células endoteliais e promove a síntese de proteoglicanos de heparam sulfato nestas células (Trindade et al., 2008b). Esses dados foram claramente demonstrados empregando-se diferentes abordagens que envolviam microscopia confocal, microscopia eletrônica e citometria de fluxo. Ficou evidente que células endoteliais em suspensão, ou seja, na ausência de matriz extracelular, não ligam heparina. Logo, sem matriz extracelular não há ligação da heparina e seu conseqüente efeito sobre estas células.
No presente trabalho foi mostrado que as SGs também estimulam a liberação de heparam sulfato pelas EC, e o efeito foi significativamente maior do que o descrito para heparina. Assim, utilizando as SGs biotiniladas, decidiu-se investigar, pela técnica de microscopia confocal, se as galactanas sulfatadas apresentavam o mesmo perfil de localização descrito para heparina.
Assim, células endoteliais foram cultivadas sobre lamínulas, em placas “multiwell”, e após três dias foram desafiadas com as SGs biotiniladas (10 g/mL) e posteriormente reveladas com estreptavidina conjugada com Texas Red. As lâminas foram montadas e analisadas em microscópio confocal (para detalhes ver Métodos).
Curiosamente, ambas SGs foram detectadas na superfície das células endoteliais (Figura 40).
