PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967
(Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e
relações de parentesco intracolonial.
Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia.
RIBEIRÃO PRETO - SP 2015
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967
(Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e
relações de parentesco intracolonial.
Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia.
Orientador Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento
RIBEIRÃO PRETO - SP 2015
SILVA, ALINE CANDIDA RIBEIRO ANDRADE
Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967 (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e relações de parentesco intracolonial. Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva, - 2015.
205f.:il.
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Pós Graduação em Entomologia, 2015.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento.
1. Euglossa melanotricha. 2. Regulação reprodutiva. 3. Sinais químicos. 4. Relação parental. 5. Evolução do comportamento social.
À Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto e ao Programa de Pós Graduação em Entomologia, pela oportunidade concedida.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento da pesquisa.
Ao Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento, pelo apoio, paciência, incentivo e confiança depositada.
Ao Prof. Dr. Marco Antonio Del Lama, pelo exemplo de seriedade e dedicação à pesquisa científica.
Ao meu querido filho Davi, pela compreensão e amor incondicional. À Juliana e Geni, pelo tempo e carinho dedicados a Davi.
Aos meus pais e irmãos (Pedro, Maria, Dedé, Márcio, Marcelo e Pedro Filho) pela compreensão, confiança, e principalmente, pelo exemplo de amor e cumplicidade.
Aos especialistas de Laboratório Dr. Sidnei Mateus, Izabel Turatti e Isabel Cristina pelo auxílio técnico à realização do trabalho.
Às secretárias do Programa de pós-graduação em Entomologia, Renata e Vera, pela atenção, competência e presteza de sempre.
Ao colaborador e amigo Elder Miranda, pela amizade e pelo exemplo de competência e honestidade.
Ao Dr. Sidnei Mateus (Dneis), pela amizade, incentivo, pelo exemplo de honestidade, cafezinhos e discussões.
Aos colegas do Laboratório de Ecologia e Comportamento de Insetos Sociais, Glaúcia (Mami), Yarinha (Flor), Claudinha e Salsas, pela amizade, agradável convivência e pela troca de experiência durante o desenvolvimento do trabalho.
Ao Dr. Túlio Nunes, pela amizade, apoio, incentivo, e acima de tudo pelo exemplo de seriedade e competência.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Genética e Evolução de Hymenoptera na Universidade Federal de São Carlos, Tony, Dani Luna, Jamile, Camila, Teka, Pedro, Mariana e Vitor, pelo apoio, amizade, agradável convivência e pelo carinho com que me acolheram. Aos amigos irmãos Dani Carol, Márcia Xavier, Nathy, Rafa, Fabrício, Raone, Ju Cordeiro, Ju Duarte, Nanda e Marília, pela compreensão, confiança, parceria e pela amizade verdadeira.
“Remember to look up at the stars and not down at your feet.
Try to make sense of what you see and wonder about what makes the universe exist.
Be curious. And however difficult life may seem, there is always something you can do and succeed at. It matters that you don’t just give up”
As sociedades animais exibem variações notáveis em suas estratégias reprodutivas. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que mantém o monopólio reprodutivo, ou podem ser formados por indivíduos que compartilham de forma igualitária a reprodução. No topo dessa variação, os indivíduos podem maximizar seu fitness pela reprodução direta ou indiretamente através da ajuda a parentes. A estrutura social pode ser mantida pela discriminação parental através do tratamento diferencial a coespecíficos. Em insetos sociais, o reconhecimento de parentes envolve pistas de odor, sendo a sinalização química fundamental para resolução dos conflitos. Rainhas indicam seus status através de sinais químicos e a resposta das operárias a esses sinais incluem a supressão da atividade ovariana. Em espécies de insetos primitivamente sociais, as dominantes podem indicar seu status e inibir a reprodução das subordinadas somente através do comportamento agressivo ou podem ser dóceis e ainda assim manter o monopólio reprodutivo, sugerindo que a sinalização química pode agir sinergicamente com as interações de dominância. Neste trabalho foram investigados quais mecanismos estão envolvidos na regulação social de Euglossa melanotricha, uma abelha primitivamente social. Para investigar esses mecanismos, foram feitas análises das interações comportamentais, testes experimentais, análises da composição química cuticular das fêmeas e do parentesco entre as fêmeas e sua prole em 42 famílias de Euglossa melanotricha. Os resultados mostraram que fêmeas dominantes mantêm o monopólio reprodutivo por coerção e oofagia dos ovos. Embora as diferenças entre os perfis químico cuticulares das dominantes e subordinadas indiquem que a sinalização química pode estar envolvida na comunicação da dominância reprodutiva. Contudo, essa variável não foi fator dependente da fertilidade associada a condição de acasalamento e atividade ovariana. Os resultados da análise genética indicaram sistema de acasalamento único para a espécie, e o parentesco entre as fêmeas apontou três distintos grupos: famílias de irmãs, mãe-filha e famílias de fêmeas não aparentadas. A assimetria reprodutiva variou de acordo com o parentesco, agressão e oofagia dos ovos. A participação das subordinadas na produção total foi menor nas famílias aparentadas (imãs e mãe-filha) do que nas famílias não aparentadas. Contudo, a produção dessas fêmeas foi desviada para machos nas famílias aparentadas. Tais resultados suportam as predições dos modelos de concessão, sendo a partilha da reprodução resultado do incentivo da dominante a permanência da subordinada em troca da sua cooperação. Este estudo fornece evidências a rara situação de correlação positiva entre assimetria reprodutiva e parentesco previsto pelos modelos de concessão, e indicam uma hierarquia social mantida por ‘contrato social’ com relação ao esforço reprodutivo em Euglossa melanotrica. Os dados também indicam que a organização de sociedades pequenas como em Euglossa pode ser modulada por traços complexos assim como em sociedades de insetos com socialidade avançada.
Palavras-Chave: Euglossa melanotricha, regulação reprodutiva, sinais químicos, relação
Animal societies exhibit remarkable variation in their breeding strategies. Groups may contain one or a few individuals that maintain a monopoly over reproductive output, or be formed by individuals that have an equal share in the reproductive process. Ultimately, an individual may maximize its fitness by either reproducing itself or contributing to the success of its close relatives. Social structure may be maintained by the discrimination of relatives through the differential treatment of conspecifics. In social insects, relatives may be recognized by their odor, with chemical signaling being fundamentally important for the resolution of conflicts. Queens indicate their social status through chemical signals and the response of workers to these signals may include the suppression of ovarian activity. In primitively social insects, dominant individuals may communicate their status and inhibit reproduction in subordinates by aggressive behavior alone, although they may also be docile, but still maintain their reproductive monopoly, indicating that chemical signaling may act synergistically with dominance behavior. The present study investigated the mechanisms determining social regulation of Euglossa melanotricha, a primitively social bee. This investigation was based on the analysis of behavioral interactions, experimental tests, the analysis of the chemical composition of the cuticle of the females, and the relatedness between the females and their offspring in 42 Euglossa melanotricha families. The results indicated that the dominant females maintain a reproductive monopoly through coercion and oophagy, although the differences in the chemical profiles of the cuticle of the dominant and subordinate females suggests that chemical signaling may also be involved in the communication of reproductive dominance. However, this factor was not dependent of the fertility associated with the mating condition and ovarian activity. The results of the genetic analysis indicated o unique mating system for the species, with the relatedness among females indicating three distinct types of group: families of sisters, mother-daughters, and families of unrelated females. Reproductive asymmetry varied according to relatedness, aggression, and oophagy. The participation of the subordinates in total production was lower in the related females (sisters and mother-daughters) than in the unrelated families. However, the production of the subordinates in the related families was biased towards males. These findings support the predictions of concession models, in which sharing of reproduction results from the incentives of the dominant females and the tolerance of the subordinate in exchange for cooperation. This study provides evidence of a rare positive correlation between reproductive asymmetry and relatedness, as predicted by concession models, and indicates the existence of a social hierarchy maintained by a “social contract” in relation to reproductive effort in Euglossa
melanotrica. The data also indicate that the organization of small societies, such as those
found in Euglossa, may be modulated by complex traits, as in advanced insect societies.
Key words: Euglossa melanotricha, reproductive regulation, chemical signals, relatedness,
Figura 1. A - Município de Campo Formoso, com a localização da área de estudo. B – Localização dos ninhos na área urbana. Imagens feitas através do Software Google Earth 2011. C- Interior da sala onde os ninhos estão instalados...32 Figura 2. A. Entrada do ninho de Euglossa melanotricha na parede de blocos. B e C. Retirada do ninho. D. Transferência para caixa de observação. E. Visualização das caixas na bancada. F. Microcâmera posicionada sobre o vidro. G. Equipamento utilizado para captura, registro e análise das imagens. H. Marcação de uma fêmea...34 Figura 3. Representação esquemática das interações agressivas ou de dominância nos ninhos de
Euglossa melanotricha: (A) Mordiscar, (B) Empurrar e (C) Perseguir com sobrevôos de ameaça.
Fêmea dominante e Fêmea subordinada...36 Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa
melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico
das antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada ...37 Figura 5. Esquema de um dos ninhos de Euglossa melanotricha. No círculo pontilhado, as células estão identificadas pela ordem de oviposição e substituição do ovo. OS – Ovos substituídos e ON – Ovo não substituído...37 Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos ninhos de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas...39 Figura 7. Média do tamanho corporal (Média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes invasoras, subordinadas invasoras e dominantes residentes em ninhos de Euglossa melanotricha ...48 Figura 8. Atividade ovariana em fêmeas de Euglossa melanotricha: (A) Fêmea dominante, (B) subordinada e (C) invasora que assumiu a dominância reprodutiva ...48 Figura 9. Comparação das proporções (%; média ± desvio padrão) de n-alcanos, alcenos e alcanos ramificados entre dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha ...55 Figura 10. Cromatogramas dos perfis cuticulares de fêmeas de Euglossa melanotricha. Uma fêmea de cada grupo foi escolhida aleatoriamente. Os principais componentes encontrados nesta amostra foram: (a) Tricosano; (b) (Z) 5-Pentacoseno; (c) n-Pentacosano; (d) 5-Metilpentacosano (e) n-Hexacosano; (f) (Z) 9- Heptacoseno; (g) n- Heptacosano; (h) 13-, 11-, 9- Metilheptacosano; (i) 9- Nonacoseno; (j) n-Nonacosano; (k) Hentriacontano...57 Figura 11. Resultado da analise canônica mostrando as posições relativas dos grupos de fêmeas por status social (fêmeas dominantes, n = 30; subordinadas, n = 30; fundadoras, n=12) em
Euglossa melanotricha. Elipses correspondem a 95% do intervalo de confiança ...58
Figura 12. Comparação das proporções (% relativa, média ± desvio padrão) dos compostos C23 = n-tricosano, ZC25 = 5-pentacoseno, C25 = n-pentacosano, MeC25 = 5-metilpentacosano, C26 = n-hexacosano, ZC27 = 9-heptacoseno, C27 = n-heptacosano, MeC27= 13-, 11-, Metilheptacosano, 9-Nonacoseno, n-nonacosano e n-hentriacontano entre fêmeas dominantes (n=30) e subordinadas (n=30) de colônias de Euglossa melanotricha. *p < 0,05 e ns = não significativo foram determinados pelo teste t para amostras independentes por grupo...58
Figure 14. Análise discriminante do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes invasoras (n = 5), dominantes residentes (n = 30) e subordinadas (n = 30) em 10 ninhos de
Euglossa melanotricha...62
Figura 15. Genealogia de himenópteros sociais com uma rainha fecundada por um macho (sistema monogínico/monoândrico). Os números ilustram o parentesco de uma operária com sua irmã (r = 0,75), seu irmão (r = 0,25), seu próprio filho (r = 0,5), e do seu filho com outra operária (r = 0, 375). Os indivíduos estão representados por meio de símbolos indicando o sexo (Hamilton 1972, Bourke & Franks 1995, Heinze et al 2004)...90 Figura 16. Filogenia dos gêneros de Hymenoptera eussocial (formigas, abelhas e vespas) sugerida a partir da análise da frequência de acasalamento. Os clados que exibem alta poliandria (> 2 acasalamentos) têm ramos sólidos vermelhos, enquanto os clados com baixa ou poliandria facultativa (>1, mas < 2 acasalamentos) têm ramos pontilhados vermelhos; ao passo que, os clados que exibem monoandria têm ramos sólidos pretos (Hughes et al 2008)...93 Figura 17. Correlação entre a proporção de machos produzidos pelas fêmeas subordinadas e o parentesco (r) entre as fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30) ...116 Figura 18. Esquema ilustrado da estrutura sócio-genética de Euglossa melanotricha, incluindo a média do parentesco entre os pares de fêmeas em cada família por grupo parental (irmãs, mãe e filha e fêmeas não relacionadas), a distribuição da reprodução a proporção sexual da prole dessas fêmeas ...116 Figura 19. a) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e o parentesco (r) das fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30). b) Correlação entre a assimetria reprodutiva (B) e a frequência de policiamento dos ovos feito pelas fêmeas dominantes. c) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e a frequência de interações agressivas realizadas pelas fêmeas dominantes. Cada símbolo representa uma família ...118
Tabela 1. Experimentos de remoção e reintrodução das dominantes em sucessivos e diferentes processos de reutilização de ninhos, com o número de repetições, de fêmeas, e o tempo de permanência das dominantes fora do ninho ...40 Tabela 2. Número de atos agressivos e ovos policiados (comidos) durante os processos de reutilização de ninhos, incluindo o status social das fêmeas e seus respectivos tamanhos corporais (distância intertegular) e desenvolvimento ovariano (comprimento dos oócitos basais)...47 Tabela 3. Reutilizações de ninhos por pares de fêmeas, incluindo o número de posturas, o número de ovos comidos pelas dominantes, e as interferências não agressivas (AN) e agressivas (A) observadas durante as atividades de construção das células (CC), aprovisonamento (AP), oviposição (OV), operculação (OP), reabertura da célula (RC) e outras atividades como limpeza das células, selamento de arestas e da entrada do ninho ...49 Tabela 4. Resultados dos experimentos de remoção: efeito da presença das fêmeas dominantes de
Euglossa melanotricha com as interações que ocorreram após sua reintrodução nos ninhos (em 30
reutilizações de 10 ninhos)...51 Tabela 5. Composição química em porcentagem média (± desvio padrão) dos hidrocarbonetos cuticulares de Euglossa melanotricha. Lista completa com todos os compostos determinados pela análise em CG-MS (Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas). Estão em negrito somente os 11 picos selecionados pela análise estatística...53 Tabela 6. Porcentagens médias (± desvio padrão) dos 11 picos selecionados pela análise discriminante entre fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha ...56 Tabela 7. Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares dos grupos de fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha ...57 Tabela 8. Proporção relativa de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes (residentes e invasoras) e subordinadas de Euglossa melanotricha. Letras em negrito representam os 11 picos selecionados pela análise estatística...60 Tabela 9. Análise discriminante dos compostos químicos cuticulares encontrados nos grupos de fêmeas dominante invasora, dominante residente e subordinada de Euglossa melanotricha ...61 Tabela 10. Associação prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva ...95 Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações e reativações de ninhos de
Euglossa melanotricha...102
Tabela 12. Microssatélites utilizados, sequências e temperaturas de hidridação (TH) dos primers e suas referências. F: forward; R: reverse...104 Tabela 13. Diversidade alélica para as famílias de Euglossa melanotricha, com o número de machos e fêmeas genotipados por loco ...110 Tabela 14. Parentesco entre as fêmeas de Euglossa melanotricha nas relações entre mãe e filhas e entre irmãs completas nas famílias de fundações (n = 12; NF1-NF12) ...111
Tabela 16. Número total da prole e a proporção de machos produzidos por cada fêmea reprodutiva nas famílias de Euglossa melanotricha, agrupadas de acordo com o parentesco ...115 Tabela 17. Número de oviposições feitas pelas subordinadas e a frequência de ovos comidos pelas dominantes em cada família de Euglossa melanotricha agrupadas de acordo com o parentesco...119 Tabela 18. Associação observada e prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva...128
CAPÍTULO 1: Introdução Geral... 13
1.1 Objetivos... 19
1.2 Referências Bibliográficas... 20
CAPÍTULO II: Regulação reprodutiva em Euglossa melanotricha: Contexto social, fertilidade e sinalização química ... 25
2.1 Introdução... 26
2.2 Materiais e Métodos ... 30
2.2.1 Espécie estudada... 30
2.2.2 Local de estudo... 31
2.2.3 Ninhos e protocolo de observações ... 33
2.2.4 Experimentos... 38
2.2.5 Condições fisiológicas das fêmeas e razão sexual da prole... 41
2.2.6 Medidas morfométricas das fêmeas ... 41
2.2.7 Extração de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas ... 42
2.2.8 Análises químicas: comparação entre os perfis cuticulares das fêmeas... 43
2.2.9 Análises estatísticas ... 44
2.3 Resultados... 46
2.3.1 Interações de dominância em Euglossa melanotricha ... 46
2.3.2 Experimento 1: Efeito da remoção e reintrodução das fêmeas dominantes ... 50
2.3.3 Experimento 2: Efeito da remoção das fêmeas subordinadas ... 50
2.3.4 Discriminação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas por status social.... 52
2.3.5 Comparação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares e a sinalização de dominância.... 59
2.4 Discussão... 63
2.4.1 Regulação social e a dominância reprodutiva em Euglossa melanotricha ... 63
2.4.2 Efeito da remoção das fêmeas dominantes e subordinadas sobre o comportamento, reconhecimento e produtividade nos ninhos ... 65
2.4.3 Análise do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas de acordo com o status social ocupado nos ninhos de Euglossa melanotricha ... 67
2.4.4 Implicações para a evolução da eussocialidade... 76
3.1 Introdução... 89
3.1.1 Assimetria reprodutiva e a resolução dos conflitos sobre a reprodução... 91
3.1.2 Análises do parentesco genético por locos microssatélites ... 95
3.2 Objetivos... 99
3.3 Materiais e Métodos ... 100
3.3.1 Coleta de material... 100
3.3.2 Coleta de dados... 101
3.3.3 Extração do DNA e análise por microssatélite... 101
3.3.4 Análise dos dados microssatélites ... 105
3.3.5 Estimativa da frequência de acasalamento ... 106
3.3.6 Análise do parentesco (r)... 107
3.3.7 Razão sexual... 107
3.3.8 Medida da assimetria reprodutiva... 107
3.3.9 Análise das variáveis preditas pelos modelos de assimetria reprodutiva ... 108
3.3.10 Análise estatística ... 108
3.4 Resultados... 108
3.4.1 Análise dos dados de microssatélites ... 108
3.4.2 Frequência de acasalamento ... 109
3.4.3 Proporção sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas nas famílias de Euglossa melanotricha ... 111
3.4.4 Assimetria reprodutiva ... 114
3.4.5 Análise combinada: ... 114
3.4.5.1 Assimetria reprodutiva versus parentesco, policiamento do ovo e agressão... 114
3.4.5.2. Parentesco versus produtividade total ... 117
3.5 Discussão... 120
3.5.1 Análise de microssatélites ... 120
3.5.2 Frequência de acasalamento nas famílias de Euglossa melanotricha ... 120
3.5.3 Razão sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas de Euglossa melanotricha... 121
3.5.4 Parasitismo e a razão sexual da prole ... 123
3.5.5 Assimetria reprodutiva e o parentesco das fêmeas adultas em Euglossa melanotricha... 123
3.6 Referências Bibliográficas... 129
CAPÍTULO 1:
s investigações sobre o comportamento social em Hymenoptera têm tradicionalmente enfocado associações entre duas ou mais fêmeas compartilhando o mesmo ninho, especialmente, quando interações cooperativas no cuidado com a prole são manifestadas (Wilson 1971). A razão para este enfoque é óbvia, pois as associações mais complexas encontradas nos himenópteros sociais são compostas por um grande número de fêmeas completamente ou parcialmente estéreis (operárias) especializadas no cuidado da prole e manutenção do ninho, e uma única ou poucas fêmeas férteis (rainhas), especializadas na produção de ovos.
O modelo da seleção parental proposto por Hamilton (1964) forneceu um grande avanço conceitual para a compreensão da evolução da socialidade, e se mantém como maior paradigma teórico em relação à compreensão da evolução social em insetos.
Uma das predições do modelo afirma que em ninhos com apenas uma rainha que tenha acasalado apenas uma vez (monoginia/monoandria), as operárias podem alocar seus esforços entre dois tipos reprodutivos: fêmeas ou irmãs completas com as quais terão 75% de genes compartilhados, e machos ou irmãos com os quais terão 25% dos genes em comum. Essa assimetria na produção de fêmeas e machos, numa razão de 3:1 ao invés do investimento igualitário de 1:1, como previsto pela teoria da alocação sexual em populações panmíticas (Fisher 1930), pode gerar conflitos de interesse no momento da determinação do sexo da prole (Trivers & Hare 1976). Em outras palavras, a estrutura social pode ser mantida pela discriminação parental através do tratamento diferencial a coespecíficos como função da sua relação genética (revisado por Gadagkar 1985).
Estudos têm testado as premissas do modelo, e demonstrado correlação positiva entre parentesco e o ganho genético individual seja ele pela reprodução direta ou indiretamente através da ajuda a parentes (Alexander et al 1991, Keller & Nonacs 1993, West-Eberhard 2003, Seppä et al 2012). Contudo, apesar das idéias de Hamilton terem sido largamente
A
aplicadas principalmente na compreensão da estrutura social dos himenópteros (Hamilton 1964a,b), se atos altruístas são dirigidos diretamente a “parentes” que tenham sido reconhecidos como tal, ainda é um assunto controverso (Sherman et al 1997). Há, portanto, considerável interesse na investigação das pistas que podem estar envolvidas no reconhecimento parental (Fletcher & Michener 1987), incluindo seres humanos (Weisfeld et al 2003).
Em insetos sociais, o reconhecimento de parentes envolve pistas de odor, sendo a sinalização química fundamental para resolução dos conflitos reprodutivos. Os sinais químicos podem compor uma assinatura individual que contribui para o reconhecimento de companheiras de ninho (Nunes et al 2008, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Emery & Tsutsui 2013). Além de desempenharem um importante papel na sinalização do status social ou reprodutivo, fertilidade, e alocação de tarefas (Nunes et al 2009, 2010, 2014, Smith et al 2009, van Zweden 2010, Evison et al 2012).
Estudos sobre os mecanismos envolvidos na resolução de conflitos foram realizados em insetos sociais (revisado em Ratnieks et al 2006), mas pouco se sabe sobre a evolução e manutenção desses mecanismos em insetos primitivamente sociais, além do papel que a seleção parental assume em tais sociedades. Hipóteses concorrentes são baseadas em conceitos como manipulação parental e interações mutualísticas entre indivíduos não aparentados (Wilson 1971).
Os mecanismos de regulação social são de particular interesse em táxons de insetos com níveis rudimentares de socialidade, em que conflitos reprodutivos são passíveis de ocorrer devido ao sistema haplodiploide e à totipotência reprodutiva fisiológica das fêmeas (Ratnieks et al 2006, Zanette et al 2012). Uma importante questão sobre essas interações é como as variações nas estratégias individuais podem contribuir para manter o sistema social estável.
Em algumas espécies de insetos primitivamente sociais, a divisão de trabalho reprodutivo é mantida de forma ativa por rainhas ou “pacemakers” centrais. O comportamento agressivo ou de domínio pode resultar na intimidação ou supressão da atividade reprodutiva das operárias ou subordinadas (West-Eberhard 1969, 1977, Reeve 1991). A natureza altamente direcional das interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode ter uma base olfativa (revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977) sugeriu que a regulação reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização química, e isso tem sido demonstrado em testes experimentais realizados com vespas do gênero Polistes e Ropalidia e em formigas Ponerinae (Downing & Jeanne 1985, Premnath et al 1996, Hannonen et al 2002).
No topo desta variação em estratégias reprodutivas, as relações entre os indivíduos dentro dos grupos sociais podem variar. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que assumem a dominância reprodutiva (alta assimetria), ou podem ser formados por indivíduos que compartilham de forma igualitária a reprodução (baixa assimetria) (Emlen & Wrege 1992).
Nas últimas décadas, os mecanismos de regulação social pela assimetria reprodutiva ou “reproductive skew” têm sido amplamente discutidos. Essa percepção levou a formulação de modelos teóricos que prevêem como a assimetria reprodutiva pode ser afetada por fatores genéticos, ecológicos e comportamentais (Reeve & Ratnieks 1993, Reeve & Keller 1995, Reeve 1998, Reeve et al 1998, Johnstone 2000, Reeve & Keller 2001, Bolton et al 2006, Reeve & Shen 2006, Lucas et al 2011, Seppä et al 2012, Reeve & Shen 2013).
A teoria de Vehrencamp (1983) da assimetria reprodutiva, adaptada aos insetos sociais por Reeve & Ratnieks (1993), prevê que uma fêmea dominante tem controle total sobre a partilha da reprodução. No entanto, a dominante pode conferir uma 'concessão' reprodutiva para outra fêmea, a fim de incentivá-la a permanecer no grupo. A concessão está relacionada
as relações parentais entre as fêmeas reprodutivas, de modo que, quanto maior o parentesco, menor o incentivo para reprodução direta, e as operárias ou subordinadas alocariam mais esforço no cuidado da prole da rainha ou dominante; do contrário, quanto menor o parentesco, maior o incentivo, e, portanto, maiores as chances das operárias participarem da produção da colônia (Reeve 1991). Esse contrato social conhecido como modelo de concessão foi proposto com base nas associações de fêmeas do gênero Polistes (Reeve & Ratnieks 1993), uma vespa primitivamente social.
Outro modelo conhecido como cabo-de-guerra ou ‘tug-of-war’ tem sido aplicado para explicar a assimetria reprodutiva em abelhas, formigas e vespas (Field et al 1998, Hogendoorn & Velthuis 1999, Reeve et al 2000, Hannonen et al 2002, Seppä et al 2012, Sumner et al 2002, Paxton et al 2002, Field & Cant 2009, Shen et al 2011). O modelo prevê que fêmeas dominantes e subordinadas têm controle limitado sobre a reprodução e devem alocar mais esforços para aumentar as suas próprias cotas e contribuir para produção total do grupo. A principal previsão do modelo é que a assimetria reprodutiva está negativamente correlacionada com o parentesco (Reeve et al 1998).
Dentro da família Apidae, as abelhas euglossine (Tribo Euglossini) formam o grupo mais basal, monofilético e distinto dos Apinae corbiculados (Apini + Meliponini + Bombini) por serem as únicas que não formam grandes ninhos e diferenciação morfofisiológica entre castas (Roig-Alsina & Michener 1993). As abelhas euglossine possuem atualmente cinco gêneros e mais de 200 espécies, sendo Euglossa, Eulaema e Eufriesea constituídos por espécies coletoras de pólen, e Aglae e Exaerete constituídos por espécies cleptoparasitas (Nemésio & Ramussen 2011).
O gênero Euglossa inclui 129 espécies amplamente distribuídas, encontradas desde o norte do México até o Paraguai, norte da Argentina e Jamaica (Michener 2000, Nemésio & Ramussen 2011). As abelhas desse gênero apresentam pequeno ou médio porte (8-19 mm),
possuem poucos pelos, tegumento metálico brilhante e coloração que varia do verde ao azul, violeta e cobreado (Michener 2000).
Estas abelhas exibem comportamento de nidificação que varia do solitário (Kimsey 1987, Michener 2000, Cameron 2004), comunal (Garófalo et al 1998, Soucy et al 2003, Otero et al 2008) ao primitivamente social, além das espécies com multifêmeas nos ninhos que exibem divisão de tarefas, divisão reprodutiva e sobreposição de gerações (Cocom Pech et al 2008, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012). Em espécies com multifêmeas nos ninhos, os estudos têm mostrado monopólio reprodutivo por uma única fêmea que inclui interações agressivas e oofagia de ovos (Garófalo 1985, Ramirez-Arriaga et al 1996, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012).
Dada a diversidade de sistemas sociais das abelhas euglossine que varia do solitário ao primitivamente social com multi-fêmeas nos ninhos, entender como os conflitos de interesse surgem e como evoluem em populações desse táxon são de particular interesse para compreensão dos mecanismos envolvidos na evolução da socialidade em Hymenoptera.
Além desses aspectos, estudos prévios têm especulado que o comportamento solitário das abelhas euglossine seria uma reversão evolutiva, com algumas espécies de Euglossa retendo alguns traços eussociais (Cameron 2004, Cardinal et al 2010), enquanto outros estudos sugerem que a eussocialidade foi herdada de um ancestral comum a todos os corbiculados (Zucchi et al 1969, Chavarría & Carpenter 1994, Noll 2002, Canevazzi & Noll 2014). Portanto, o estudo da biologia comportamental das abelhas euglossine pode iluminar as interpretações da evolução da socialidade em abelhas corbiculadas.
Até o momento, são poucos os estudos empíricos sobre os mecanismos da regulação social em espécies com nível rudimentar de socialidade (Paxton et al 2002, Langer et al 2004) e são ausentes estudos com abelhas euglossine. Os estudos atualmente disponíveis com
dados empíricos e análise do parentesco das famílias desse táxon são necessários para se evitar avaliações incorretas dos traços comportamentais, e, como consequência, a interpretações equivocadas sobre a evolução da eussocialidade neste grupo.
1.1 Objetivos
O principal objetivo dessa tese foi investigar os conflitos reprodutivos e as resoluções destes através da análise das relações sócio-etológicas mediadas por sinalização química e parentesco genético intracolonial em um grupo que apresenta nível rudimentar de socialidade. Nosso modelo de estudo foi a espécie Euglossa melanotricha, por diferentes motivos. O primeiro foi a possibilidade de estudar uma população encontrada em área urbana, com registro de ocorrência de ninhos há mais de 10 anos. O segundo motivo diz respeito à importância ecológica da espécie. Eg. melanotricha é abundante em áreas de Cerrado e Caatinga (Nemésio & Faria Jr. 2004, Andrade-Silva et al 2012). O último se refere a questões práticas como facilidade na transferência dos ninhos e manipulação.
De acordo com o objetivo principal da tese as questões norteadoras do trabalho foram: a. Quais os conflitos reprodutivos em Euglossa melanotricha? b. Fêmeas subordinadas
participam da produção dos ninhos?
b. A sinalização química representa uma das formas de resolução dos conflitos sobre a reprodução?
c. Qual o parentesco genético intracolonial? d. conflitos sobre a reprodução mediados pelas interações de dominância são influenciados pelo parentesco entre as fêmeas? e. Conflitos sobre a partilha na reprodução e na produção de machos têm relação com o parentesco?
Este estudo foi dividido em etapas que consistiram em sessões de observação, sessões experimentais (manipulação), e análise química e genética. Inicialmente foram feitos registros do comportamento das fêmeas nos ninhos para identificação do status social ocupado por cada uma delas, e registro das interações comportamentais. Em seguida, foram feitas as sessões experimentais com manipulação das fêmeas adultas e, finalmente, foram feitas as análises da composição do perfil químico cuticular das fêmeas, e do parentesco genético das fêmeas adultas e da sua prole pela análise de microssatélites.
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CAPÍTULO
II:
Regulação reprodutiva em Euglossa
melanotricha: Contexto social, fertilidade e
sinalização química
(Manuscrito submetido a Animal Behavior em Jan/2015: ANBEH-D-15-00021-Anexo XLIV).2.1 Introdução
Em insetos sociais, a comunicação do status social fornece um mecanismo pelo qual membros de um grupo podem avaliar o status reprodutivo de um indivíduo reduzindo assim o conflito (Smith et al 2009). A estrutura social é então protegida por sistemas de reconhecimento eficientes com base em sinais químicos (revisado por D'Ettorre & Lenoir 2010).
De fato, insetos sociais vivem em um mundo de odores; mais de 100 glândulas exócrinas que emitem sinais químicos reguladores da organização social e da reprodução na colônia já foram caracterizadas no grupo (Billen 2004). Os sinais químicos ou feromônios podem compor uma assinatura individual que contribui para o reconhecimento de companheiras de ninho (revisado por Blomquist & Bagnères 2010, van Zweden & D’Ettorre 2010), além de desempenharem um importante papel na sinalização do status social, fertilidade, e alocação de tarefas (Nunes et al 2009, 2014, Smith et al 2009, Evison et al 2012).
Sinais químicos são divididos em compostos voláteis, secretados pelas glândulas exócrinas, e hidrocarbonetos, ou feromônios de contato, encontrados na cutícula (Howard 1993). A função primária dos hidrocarbonetos é proteger os insetos da perda de água e formarem uma barreira contra micro-organismos (Jackson & Blomquist 1976, Lockey 1988, Gibbs 2002). São compostos hidrofóbicos de cadeia longa que podem ter origem endógena, ou serem adquiridos a partir do meio externo (Wigglesworth 1964, Carlin 1983, revisado por Lorenzi et al 1996, Leonhardt et al 2013).
Os compostos de origem endógena são sintetizados pelos oenócitos, localizados perto da epiderme ou dispersos no interior do corpo. Oenócitos são frequentemente associados com corpos de gordura, uma importante fonte de ácidos graxos, que podem servir como
precursores para a biossíntese de hidrocarbonetos (ver Diehl 1975, Howard & Blomquist 2005, Juarez & Fernandez 2007). Eles ainda podem ser produzidos por glândulas tegumentares da classe III, glândulas produtoras de feromônios de comunicação (Guerino 1999).
Os hidrocarbonetos são transportados entre os diferentes tecidos da epicutícula, gordura corporal e ovários, associados à principal lipoproteína hemolinfática, a lipoforina (Lp) (Chino et al 1985). Esta proteína está envolvida no transporte seletivo de feromônios sexuais sobre a superfície cuticular (Schal et al 2001).
Na cutícula das abelhas, formigas e vespas usualmente são encontrados hidrocarbonetos com 20 a 40 átomos de carbono (Akino 2006). Além dos compostos lineares, são descritos compostos ramificados com um a três radicais metil ou etil (Howard 1993). São encontrados também, compostos insaturados com uma ou duas ligações duplas (Howard & Blomquist 2005, Akino 2006, revisado por Blomquist & Bagnères 2010). Nestes grupos de insetos, hidrocarbonetos cuticulares constituem a principal fonte de sinais de comunicação (revisado por Blomquist & Bagnères 2010, D'Ettorre & Lenoir 2010, Smith et al 2012).
Em espécies de insetos sociais, as rainhas sinalizam sua presença através de feromônios e a resposta das operárias a esses sinais incluem o início da trofalaxia, a inibição da produção de novas rainhas e, em algumas espécies, a supressão da atividade ovariana (Dietemann et al 2005, Lommelen et al 2006, Nunes et al 2014). O potencial reprodutivo da rainha transmitido pelo seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares pode estar estreitamente associado com a ativação dos ovários ou somente ao seu status social definido a partir da formação de hierarquias reprodutivas estáveis (revisado por Monnin 2006, Dapporto et al 2010, van Zweden 2010, Teseo et al 2013).
A sinalização química é particularmente interessante quando a regulação envolve grupos de fêmeas que são potencialmente capazes de reproduzir. Entre os himenópteros
sociais, as formigas têm sido o melhor grupo estudado. Neste grupo, foram descritas diferenças nos perfis de hidrocarbonetos cuticulares correlacionados à regulação reprodutiva em 21 espécies representadas por 16 gêneros (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).
A importância da sinalização química na competição entre fêmeas com a mesma condição reprodutiva é corroborada por vários estudos que mostram que as mudanças importantes na composição do perfil de hidrocarbonetos cuticulares acompanham as modificações fisiológicas quando envolvem as fases de pós-acasalamento ou ainda após o estabelecimento da hierarquia de dominância (Kocher et al 2010,Foitzik et al 2011).
Em algumas espécies de abelhas, formigas e vespas, interações de dominância são mais intensas depois que as colônias se tornam órfãs ou quando a hierarquia de dominância reprodutiva é estabelecida pela primeira vez (Monnin & Peeters 1999, revisado por Ratnieks et al 2006). As agressões tendem a diminuir logo que um ou poucos indivíduos assumem a dominância reprodutiva (Monnin & Peeters 1999, Cuvillier-Hot et al 2004). Esta redução parece coincidir com o desenvolvimento de um perfil de hidrocarbonetos cuticulares específico em indivíduos que assumem a dominância (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).
Esse comportamento foi amplamente estudado em formigas, e neste grupo não ocorre divisão reprodutiva em colônias órfãs somente por meio da regulação física ou de dominância, sem que ocorra sinalização química (Blomquist & Bagnères 2010). A maioria das descrições foi feita em estudos com espécies primitivamente sociais, proporcionando a base para a identificação de uma rainha saudável e reprodutiva (Martin & Drijfhout 2009, revisado por Blomquist & Bagnères 2010).
De acordo com a hipótese da "sinalização honesta", os odores emitidos por fêmeas reprodutivas sinalizam de forma confiável tanto seu status de acasalamento como sua fertilidade, e a resposta dos outros membros do grupo deve ser proporcional ao potencial reprodutivo da rainha (Hannonen et al 2002, Evison et al 2012).
Rainhas da espécie de formiga Camponotus floridanus, marcam seus ovos com os mesmos compostos presentes na sua cutícula. Esses ovos são distribuídos pelas operárias ao longo do ninho indicando dessa forma a presença de uma rainha fértil dentro da colônia o que resulta em ausência de oviposição das operárias (Endler 2004, 2006).
Efeitos comportamentais e fisiológicos do feromônio da rainha sobre a reprodução das operárias têm sido demonstrados em algumas espécies de formigas, abelhas e vespas (Slessor et al 2005, Holman et al 2010, Nunes et al 2014, van Zweden et al 2014, van Oystaeyen et al 2014) e em espécies de cupins (Matsuuraa et al 2010). Na formiga Lasius niger, por exemplo, o composto 3-metilhentriacontano foi o principal componente da cutícula de rainhas (Lenoir et al 2009). Operárias expostas a esse composto apresentaram uma grande resposta elétrica nas antenas, medido por um eletroantenógrafo, além de apresentarem uma diminuição da agressão a objetos expostos ao composto. Testes com o sintético do composto resultaram em inibição do desenvolvimento ovariano nas operárias, comprovando ser o feromônio de esterilidade proveniente de compostos cuticulares (Holman et al 2010).
Em insetos primitivamente sociais, o estudo dos perfis individuais de hidrocarbonetos cuticulares é particularmente interessante, pois a complexidade social envolve interações entre fêmeas sem distinção morfológica entre rainhas e operárias, em que todas as fêmeas são potencialmente capazes de reproduzir e produzir machos e fêmeas (Peeters 1993). Neste grupo de insetos, interações agressivas resultam no estabelecimento de relações hierárquicas (Röseler & van Honk 1990, Augusto & Garófalo 2010). Contudo, a natureza altamente direcional das interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode ter uma base olfativa (revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977) sugeriu que a regulação reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização química, e isso tem sido demonstrado em testes experimentais feitos com vespas do gênero Polistes e Ropalidia e em formigas do gênero Formica (Downing & Jeanne 1985, Premnath et al 1996, Hannonen et al 2002, Blomquist & Bagnéres 2010).
Apesar da existência de uma extensa base de dados para as abelhas das tribos Bombini (Ayasse et al 1999), Apini (Wossler & Crewe 1999) e Meliponini (Nunes et al 2014), não há evidência disponível sobre a possibilidade de regulação social química em abelhas euglossine. Neste estudo, foram investigados os mecanismos que regulam a estrutura social em famílias de Euglossa melanotricha com ênfase na sinalização química. Para a investigação dos mecanismos, foi testado como a dominância reprodutiva é estabelecida e mantida nessas famílias. Uma das previsões do estudo é que a regulação reprodutiva envolve sinais químicos além do controle físico ou de dominância. Contudo, as agressões direcionadas a indivíduos subordinados afetam o comportamento desses indivíduos, mas não inibe seu desenvolvimento ovariano. Adicionalmente, foram avaliados a partir de uma série de experimentos de remoção e reintrodução e dos registros das invasões nos ninhos, se o status de indivíduos dominantes (residentes ou invasores) foi refletido pelo seu perfil químico cuticular.
2.2 Materiais e Métodos
2.2.1 Espécie estudada
Euglossa melanotricha é uma abelha de tamanho médio (comprimento do corpo 13
mm), tegumento metálico brilhante e de cor azul, comumente encontrada em áreas com vegetação aberta no Brasil e na Bolívia (Nemésio 2009). No Brasil, a espécie encontra-se distribuída nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste (Moure et al 2007, Nemésio 2009), sendo uma das mais abundantes em áreas de Cerrado e Caatinga (Andrade-Silva et al 2012).
A fundação dos ninhos é solitária e as fêmeas das sucessivas gerações podem reutilizar os ninhos, resultando em ninhos com multi-fêmeas. Ninhos reutilizados são ocupados por 2-5
fêmeas. Todas as fêmeas podem potencialmente acasalar e colocar ovos, embora somente uma delas apresente comportamento de dominância (Andrade-Silva & Nascimento 2012). Um processo de reutilização de ninho (R) é iniciado quando pelo menos duas fêmeas da mesma ou de diferentes gerações reutilizam os ninhos ou quando novas associações são formadas por fêmeas não aparentadas. A duração do processo de reutilização de ninhos (do início do forrageamento, coleta de resina até à postura final das fêmeas) varia de 18 a 79 dias (46,4 ± 14,9 dias, n = 30 famílias). Após a fase de reutilização, as fêmeas interrompem as atividades de nidificação e permanecem nos ninhos a maior parte do tempo. Este período de inatividade dura de 15-63 dias (34,11 ± 11,7 dias) (Andrade & Silva 2012).
Neste estudo, as fêmeas foram removidas durante o período de inatividade como forma de controlar o número de fêmeas em cada processo de reutilização do ninho. As observações, manipulações e testes experimentais foram então reiniciados após a associação entre fêmeas fundadoras e sua prole, entre recém emergidas ou entre fêmeas residentes e invasoras.
2.2.2 Local de estudo
O estudo foi realizado em área residencial, situada na cidade de Campo Formoso (10º30’00’’S e 40º19’00’’W), Chapada Diamantina, Bahia, Brasil (Fig. 1). O tipo climático da região é tropical subúmido seco com precipitação variando de 302 a 1935 mm anuais, e maior ocorrência de chuvas de março a agosto. A temperatura anual varia de 19 ºC a 28 ºC (PERH 2010).
Figura 1. A - Município de Campo Formoso, com a localização da área de estudo. B – Localização dos ninhos na área urbana. Imagens feitas através do Software Google Earth 2011. C- Interior da sala onde os ninhos estão instalados.
C A
2.2.3 Ninhos e protocolo de observações
Quatorze ninhos com multifêmeas de E. melanotricha foram acondicionados em caixas de madeira (12 x 10 x 8 cm) cobertas com tampa de vidro. Os ninhos foram mantidos sobre uma bancada e estiveram conectados ao meio externo através de um tubo plástico, de modo que as abelhas podiam sair livremente para forragear (Fig. 2A, B, C, D e E). O protocolo de transferência foi o mesmo adotado por Andrade-Silva e Nascimento (2012).
As observações comportamentais foram feitas continuamente através de uma combinação de imagens de vídeo capturadas usando mini-câmeras (Citrox 5001 de cor digital de dia/noite) e imagens focais com melhor resolução foram feitas com câmera digital - modelo Sony HDR-CX580V. As câmaras foram posicionadas a cerca de 20 cm sobre a tampa de vidro da caixa de madeira (Figura 2F e G).
As câmeras foram conectadas a um Microcomputador (Dell Vostro 260), onde as imagens foram processadas e editadas (USB Camera Viewer 1.25) (Figura 2G). As análises dos vídeos foram feitas diariamente e cópias foram armazenadas em DVD e HD externo. Para facilitar a análise foram criadas sessões de 3 horas para leitura e registro dos dados, sem intervalo, entre 6-9 h, 9-12 h, 12-15 h, 15-18 h, 18-21 h, 21-24 h, 24-3h, 3-6h. Duas análises foram feitas por sessão, a primeira utilizando o método de todas as ocorrências para montagem do repertório comportamental, e a segunda, o método ‘indivíduo focal’, como forma de identificar a condição reprodutiva de cada fêmea (Altmann 1974). Ambos os métodos seguiram o mesmo esquema: três vezes por semana durante os meses de Janeiro/2013 a Abril/2013.
Como a fundação de ninhos em Euglossa melanotrica é solitária, todas as análises comportamentais se referem às interações entre as fêmeas que ocorreram a partir do primeiro processo de reutilização dos ninhos. A identificação das fêmeas foi feita com base em
características comportamentais. Ao emergirem, as fêmeas receberam uma marca com a identificação do ninho, e, depois de registradas as interações, elas receberam uma segunda marca indicando seu status ou condição reprodutiva. As marcações foram feitas no tórax das fêmeas com pontos de caneta permanente colorida não-tóxica, sem cheiro e de secagem rápida (Fig 2H).
Figura 2. A. Entrada do ninho de Euglossa melanotricha na parede de blocos. B e C. Retirada do ninho. D. Transferência para caixa de observação. E. Visualização das caixas na bancada. F. Microcâmera posicionada sobre o vidro. G. Equipamento utilizado para captura, registro e análise das imagens. H. Marcação de uma fêmea.
Durante o estudo, foram observadas 12 invasões nos ninhos por fêmeas ‘alienígenas’. Assim, os diferentes grupos de fêmeas – dominante vs subordinadas, dominantes residentes vs invasoras - foram analisados separadamente.
As observações foram focadas nos seguintes comportamentos:
(1) Dominância: dez pares de fêmeas com estrutura reprodutiva estável (ou seja, fêmeas que permaneceram como dominante e subordinada por várias semanas) foram filmadas por 24 h continuamente (240 dias; 5760 horas; LD 3:3 h). As observações foram focadas nas interações de dominância, incluindo comportamentos como mordiscar (a
dominante ataca outra fêmea mordiscando a extremidade abdominal; Figura 3a), empurrar (a dominante ataca outra fêmea dando cabeçadas no abdômen; Figura 3b), ameaçar com sobrevôos (a dominante persegue a outra fêmea sem contato físico com sobrevôos de ameaça; Figura 3c) e canibalismo dos ovos das subordinadas.
Foram então calculadas as taxas das interações de dominância para cada abelha, após correção para a proporção de tempo gasto por abelhas em seus ninhos, no dia em questão. Os resultados foram analisados utilizando o teste exato de Wilcoxon.
(2) Não-dominância ou não agressivo: envolveu os componentes ativos de interações não-dominantes ou não agressivas entre os pares de fêmeas, como antenação e aproximação (A dominante se aproxima e acompanha outra fêmea tocando as antenas durante as atividades realizadas nos ninhos; Figura 4d e 4e). Como no caso do comportamento de domínio, calculamos as taxas de interações de não-dominância de cada abelha, após correção para a proporção de tempo gasto por essa abelha no seu ninho, no dia em questão.
(3) Comportamento de subordinação: As fêmeas subordinadas não demonstram comportamento de defesa ou reação e se escondem embaixo do conjunto de células, recuam ou saem dos ninhos para evitar o confronto.
(3) Outras atividades: a proporção de tempo que uma abelha esteve envolvida em atividades fora ou dentro do ninho durante o período de monitoramento. Tais atividades foram classificadas como:
a) Forrageamento: somente as fêmeas subordinadas saem do ninho para coleta de resina e alimento larval;
b) Repouso: a fêmea permanece a maior parte do tempo dentro dos ninhos, sem realizar atividades de forrageamento; a fêmea anda no ninho ou, muito raramente, no substrato, sem realizar qualquer atividade aparente, que não seja para se deslocar de um ponto para outro;
c) Auto limpeza: a abelha se limpa passando as pernas pelo corpo, antenas, uma contra as outras e lambendo as pernas anteriores. Não há sincronia entre as regiões a serem limpas. Nas regiões sensoriais a auto limpeza é entendida como uma forma de manter desobstruídas as áreas receptoras. No corpo, além da limpeza, pode ocorrer a manutenção de ferômonios e hidrocarbonetos cuticulares;
d) Postura de ovos: as subordinadas constroem um anel circular em torno da célula (colar da célula) após a última deposição de alimento larval. Essas fêmeas então fazem a postura imediatamente após a construção do colar, enquanto as fêmeas dominantes aguardam as subordinadas opercularem as células para substituem os ovos dessas fêmeas pelos seus.
A B
C
Figura 3. Representação esquemática das interações agressivas ou de dominância nos ninhos de
Euglossa melanotricha: (A) Mordiscar, (B) Empurrar e (C) Perseguir com sobrevôos de ameaça.
Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa
melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico das
antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada.
Nos processos de reutilização de ninhos, foram quantificados o número de posturas das subordinadas e o número de ovos substituídos pelas dominantes. Para auxiliar na determinação da maternidade do ovo, cada ninho foi esquematizado com registro da ordem e posição das células que tiveram os ovos substituídos (Figura 5). Os eventos são facilmente observáveis, a oviposição envolve uma subordinada ou uma dominante inserindo o abdômen dentro da célula (média de duração: subordinadas 120,80 ± 23,48 segundos, n = 76; e dominantes 88,09 ± 16,70 segundos, n = 70) (Mann-Whitney, Z = 8,86 p <0.0001, n = 76), e o canibalismo do ovo envolve a prolongada inserção da cabeça dentro da célula (duração média: 158,35 ± 45,65 segundos, n = 70), seguido por rotação ou movimentos ascendentes e descendentes, que indicam que o ovo está sendo consumido.
Figura 5. Esquema de um dos ninhos de Euglossa melanotricha. No círculo pontilhado, as células identificadas pela ordem de oviposição e substituição do ovo. OS – Ovos substituídos e ON – Ovo não substituído. E D 1 cm 1 OS 2 OS 3 OS 4 OS OS5 6 OS 7 ON 8 OS 9 OS 10 OS
2.2.4 Experimentos
1. Remoção e reintrodução das fêmeas dominantes
As sessões experimentais foram conduzidas em cinco repetições para cada intervalo de tempo (n = 30 reutilizações em 10 ninhos, Tabela 1) entre os meses de maio/2013 a outubro/2013. Cada repetição foi feita durante um novo processo de reutilização de um ninho, logo após a emergência ou associação das fêmeas (Tabela 1). O número de fêmeas associadas em cada reutilização de ninho variou entre dois e cinco. Contudo, apenas um par de fêmeas foi monitorado em cada repetição. As fêmeas que emergiram após a identificação do par residente foram removidas do experimento (uma a três fêmeas por repetição).
Por ninho, em cada processo de reutilização, as sessões experimentais foram realizadas em três dias, entre 6 h e 18 h. No primeiro dia, foram observados os ninhos como descrito no protocolo de observações, sem qualquer tipo de manipulação. Foram designadas como dominantes, as fêmeas que apresentaram comportamento agressivo, passaram a maior parte do tempo no ninho, comeram e substituíram os ovos postos por outras fêmeas pelos seus. Por outro lado, as fêmeas subordinadas foram aquelas que realizaram atividades externas, tiveram seus ovos comidos e sofreram as intervenções agonísticas.
Em cada ninho, uma dominante foi removida no segundo dia de manhã, entre 0500 h e 0600 h. As dominantes removidas foram mantidas em gaiolas individuais feitas com ‘bobs’ plásticos para cabelo, tamanho 3 (2,8 x 6,3 cm) (Figura 6). Cada gaiola foi coberta com tule e suas extremidades fechadas com papelão. Um microtubo do tipo Eppenforf (2 ml) foi pendurado dentro de cada gaiola com solução de mel a 40% para alimentação das fêmeas (Figura 6). As dominantes foram mantidas nas gaiolas em intervalos que variaram de 12 a 72 horas (Tabela 1).
Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos ninhos de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas.
Os testes experimentais consistiram na manipulação de 30 fêmeas para análise do (1) efeito da remoção das fêmeas dominantes sobre a atividade reprodutiva das subordinadas e análise do (2) efeito da remoção com posterior reintrodução sobre a capacidade das dominantes em reconhecerem células com ovos das subordinadas.
2. Remoção das fêmeas subordinadas
Seguindo os mesmos procedimentos utilizados para remoção das dominantes (Tabela 1), foram conduzidas as sessões experimentais nas quais as subordinadas foram removidas de 10 ninhos (durante 30 processos de reutilização), com 5 repetições para cada intervalo de tempo (Tabela 1). Como descrito anteriormente para os experimentos de remoção das dominantes, as sessões experimentais foram iniciadas com pares de fêmeas adultas em processo de reutilização de um ninho. Os experimentos foram realizados entre novembro/2013 e abril/2014. Após verificar a ordem hierárquica dos pares, as subordinadas foram removidas permanentemente em cada uma das repetições para avaliar o efeito da presença das subordinadas na produtividade das dominantes. Para avaliar o efeito da ausência
