Interface entre el laboratorio y el contexto clínico en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófi los

(1)

Interface entre el laboratorio y el contexto clínico en la

determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófi-los

Associate Professor

Rheumatology Division – UNIFESP

luis.andrade@unifesp.br

WHO/IUIS/AF

Autoantibody Standardizing Committee

Medical consultant in Immunology

Fleury Medicine & Health Laboratories

luis.andrade@grupofleury.com.br

Luís Eduardo Coelho Andrade

72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA

(2)

Conflitos de interesse

(3)

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos

•Anticorpos contra antígenos de:

• Grânulos azurófilos de neutrófilos

• Lisossomos de monócitos

•Marcador de vasculites associadas ao ANCA

(4)

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos – antígenos

Antígenos principais

Proteinase 3

Mieloperoxidase

Outros antígenos

Lactoferrina

Elastase

BPI – Bactericidal Permeability Increasing

Lisozima

Catepsina G

Azurocidina

(5)

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos – Positividade

Doenças

Especificidade

Frequência

GPA generalizada

PR3-ANCA

80-90%

GPA localizada

PR3-ANCA

30-40%

PAM

MPO-ANCA

60-74%

GEPA

MPO-ANCA

30-40%

Vasculite renal limitada

MPO-ANCA

75-80%

Doença do anticorpo anti-MBG

MPO-ANCA

10-40%

(6)

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos – Positividade

Padrão

Doenças

Frequência

a-ANCA ou p-ANCA

Hepatite autoimune tipo I

40-96%

RCU

50-85%

Doença de Crohn

10-20%

CEP

26-94%

Fibrose cística

Anti-BPI (77,3%)

(7)

(8)

Era pré-ANCA

• Heinz Klinger – 1931

• Síndrome consumptiva, artralgias, epistaxe, nariz em sela e otite média

• Autópsia – GN crescentes e inflamação granulomatosa de vias aéreas

• Freidrich Wegener – 1939

• Relatou 3 casos – envolvimento de vias aéreas, inflamação granulomatosa e

vasculite

• Godman & Churg – 1954

• Tríade – angiíte, inflamação e necrose do trato respiratório e GN necrosante

• Prosposta – Granulomatose de Wegener

(9)

Era pré-ANCA

• Davson et al – 1948

• Relato de casos de GN na PAN - Forma microscópica da

PAN

• 1ª descrição da PAM

• Jacob Churg & Lotte Strauss – 1951

• 13 pacientes com asma, eosinofilia, inflamação

granulomatosa

• Vasculite sistêmica necrosante e GN

Davson J, et al. QMJ 1948;17:175-202.

(10)

Era pré-ANCA

• Godman & Churg – 1954

• Revisão de 22 casos da literatura e 7 casos próprios

• Doenças com características semelhantes

• Granulomatose de Wegener

• Forma microscópica da periarterite nodosa

• Síndrome de Churg-Strauss

(11)

• 8 pacientes com GN necrosante

• Fator sérico que reage contra o citoplasma de neutrófilos na IFI

• Sorologia positiva para o vírus Ross River (arbovírus)

(12)

•1985 Fokko van der Woude

•IgG anti-citoplasma de neutrófilos pela IFI

•Positivo em 25 de 27 pacientes com granulomatose de Wegener ativa

•Positivo em 4 de 32 pacientes em remissão

(13)

Especificidade do ANCA

1988

P-ANCA +

ELISA para anti-MPO

C-ANCA sem reatividade

1990

Falk R & Jennette JC. N Engl J Med 1988;318:1651-7. Jenne D, et al. Nature 1990;346:520.

C-ANCA

Cromatografia + sequenciamento +

atividade enzimática

(14)

Masi et al. Arthritis Rheum 1990;33:1094-100. Leawitt et al. Arthritis Rheum 1990;33:1101-7.

(15)

Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:187-92.

(16)

(17)

Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos – Fenótipos

Weiner M & Segelmark M. Autoimmun Rev 2016;15:978-82.

Variáveis

PR3-ANCA

MPO-ANCA

Epidemiologia

Norte da Europa

América do Norte

Austrália

Sul da Europa

Ásia

Idade ao diagnóstico

45-55 anos

60-65 anos

Genética

HLA-DP, SERPINA1 e PRTN3

HLA-DQ

Patologia

Inflamação granulomatosa

Vasculite

Fibrose

Vasculite

Órgãos envolvidos

Vias aéreas superiores

Nódulos pulmonares

Múltiplos órgãos

Glomerulonefrite

Fibrose pulmonar

Prognóstico

Maior risco de recidivas

Maior risco de falha ao 1º

tratamento

(18)

ANCA – Técnicas baseadas em IFI

Sangue de doador

saudável

Separação de

neutrófilos

Fixação

Etanol

Formalina

Metanol

(19)

ANCA – Neutrófilos fixados no etanol

Positividade

≥ 1/40

Titulação

Padrão

C-ANCA

P-ANCA

A-ANCA

(20)

c-ANCA

p-ANCA

(21)

ANCA – Neutrófilos fixados no etanol

C-ANCA

Anti-PR3

P-ANCA

Anti-MPO

C-ANCA

atípico

Anti-BPI

P-ANCA atípico

Anti-elastase

Anti-lactoferrina

Anti-catepsina G

Anti-lisozima

Anti-azurocidina

(22)

(23)

ANCA – Neutrófilos fixados na formalina

Csernok E & Moosig F. Nat Rev Rheumatol 2014;10:494-501.

(24)

Solicitação de

ANCA

IFI com

neutrófilos

fixados no

etanol

ELISA

Anti-PR3

Anti-MPO

FAN

IFI com

neutrófilos

fixados na

formalina

(25)

Especificidade do ANCA – ensaios de fase sólida

• ELISA:

• Anti-PR3

• Anti-MPO

• IFI + ELISA (diagnóstico x acompanhar títulos):

• Maior especificidade

• IFI positivo isoladamente em 10%

• ELISA positivo isoladamente em 5%

(26)

Csernok E & Moosig F. Nat Rev Rheumatol 2014;10:494-501. Hellmich B, et al. Clin Exp Rheumatol 2007;25(1 Suppl 44):S1-5.

Métodos

Sensibilidade

IC de 95%

IFI

92,0%

(73,9-98,8%)

ELISA direto

60,0%

(38,7-78,8%)

ELISA de captura

72,0%

(50,6-87,9%)

ELISA de ancoragem

96,0%

(79,6-99,3%)

GPA (n=86)

Controle saudáveis (n=80)

Outras doenças (n=450)

Especificidade: 95,5-98,5%

(27)

Especificidade do ANCA – ELISA

Grupos

N

Diagnóstico histológico de

GPA (Wegener)

60 Artrite reumatoide

30 Controles saudáveis

30 Soro testado em 6 laboratórios

de referência

• Conclusão:

• ELISA de captura é mais reprodutível e tende a melhor desempenho

para detectar PR3-ANCA na GW

• Pode ser utilizado em conjunto com a histologia para diagnóstico de

GW

(28)

(29)

Variáveis

Positividade

(n=134)

ANCA +

100 (68,6%)

c-ANCA +

83 (61,9%)

p-ANCA +

17 (12,9%)

Variáveis

China

(N=411)

Brasil

(N=64)

p

ANCA positivo, n

(%)

410 (99,8)

43 (67,2)

< 0,0001

c-ANCA, n (%)

39 (9,7)

29 (69,0)

< 0,0001

p-ANCA, n (%)

363 (90,3)

12 (28,6)

a-ANCA, n (%)

0 1 (2,4)

ELISA realizado, n

(%)

410 (99,7)

31 (48,4)

--

ELISA negativo, n

(%)

1 (0,2)

9 (29,0)

< 0,0001

PR3-ANCA, n (%)

38 (9,3)

17 (54,8)

MPO-ANCA, n (%)

371 (90,5)

5 (16,1)

• Brasil: 64 pacientes

–Unifesp, USP e HFSP-RJ

–GPA (86,6%) e PAM (13,4%)

• China: 411 pacientes

– Renal Division, Department of

Medicine, Peking University

– PAM (69,1%), GPA (23,6%) e VRL

(7,3%)

(30)

ANCA no Brasil – experiência de Laboratório Fleury

• Exames de ANCA de jan/2015 a dez/2016 – 23 meses.

Variáveis

Resultados

Total de pedidos

8144

Positivos (≥ 1/20), n (%)

568 (7,0)

Positivos (≥ 1/40), n (%)

429 (5,3)

Inconclusivos, n (%)

315 (3,9)

Negativos, n (%)

7218 (88,6)

(31)

ANCA no Brasil – experiência de Laboratório Fleury

• Exames de ANCA de jan/2015 a dez/2016 – 23 meses.

Padrões

Resultados

p-ANCA atípico, n (%)

271 (47,7)

c-ANCA, n (%)

184 (32,4)

p-ANCA, n (%)

100 (17,6)

c-ANCA atípico, n (%)

13 (2,3)

Total

568 Padrões de ANCA

P-A NC A a típic o C-A NC A P-A NC A C-A NC A a típic o 0 100 200 300

n

d

e

p

a

c

ie

n

te

s

(32)

ANCA no Brasil – experiência de Laboratório Fleury

• Exames de ANCA de jan/2015 a dez/2016 – 23 meses.

Títulos de ANCA

1/20 1/40 1/80 _1/16 0 1/32 0 1/64 0 >1/6 40 1/12 80 0 50 100 150 n d e p a c ie n te s

anti-PR3 e C-ANCA

Positivo Negativo 0 50 100 150 n d e p a c ie n te s

Anti-MPO e P-ANCA

Positivo Negativo 0 20 40 60 80 n d e p a c ie n te s

32,6%

42,0%

(33)

(34)

Quimioiluminescência

Detecção de PR3-ANCA e MPO-ANCA

Imuno ensaios de linha ou ponto

Imuno ensaios enzimáticos fluorecentes

Ensaio de Cytobead

Ensaios de multiplex – Vasculitis kit

IFI automatizada

(35)

Grupos

N = 946

GPA

86 RCU

283 Doença de Crohn

208 Outras doenças

264 Controles

105 ELISA

(Quanta Lite)

Quimioiluminescência

(Quanta Flash)

IFI (Inova)

GPA

61,6%

75,6%

--

RCU

6,0%

31,1%

34,9%

DC

0,0%

1,9%

--

Métodos

Especificidade para RCU

IFI (P-ANCA atípico)

90,4%

PR3-ANCA

98,1%

(36)

Medipan Cytobead & EuroPlus ANCA Biochip Mosaic

Sowa M, et al. Plos One 2014;9:e107743

(37)

EuroPlus ANCA Biochip Mosaic – EuroPattern

Damoiseaux J, et al. J Immunol Methods 2009;348:67-73.

Vasculites associadas ao ANCA (n=249)

Outras doenças (n=85)

Controles saudáveis (n=27)

Variáveis

IFI + ELISA

EuroPlus

Sensibilidade

76,7%

77,1%

Especificidade

99,1%

98,1%

PR3-ANCA

MPO-ANCA

96,8%

99,2%

(38)

Medipan Cytobead – Aklides

Sowa M, et al. Plos One 2014;9:e107743

Doenças

N

Vasculites associadas ao ANCA

118 Artrite reumatoide

133 Doenças infecciosas

49 Doença inflamatória intestinal

77 Doenças hepáticas autoimunes

20 Colangite esclerosante primária

70 Controles saudáveis

125 Métodos

Cohen’s Kappa

C-ANCA

0,820

P-ANCA

0,876

PR3-ANCA

0,775

MPO-ANCA

0,720

(39)

Grupos

N

GPA

186 PAM

65 Outras doenças

924 Número

Métodos

1 QuantaLite – 1ª geração

2 Quimioiluminescência

3 3ª geração anti-PR3 e anti-MPO

(FEIA)

4 Multiplex Vasculitis kit

5 ELISA de captura

6 Orgentec – anti-PR3 (3ª) anti-MPO

(1ª)

7 Euroimmun – anti-PR3 (3ª) anti-MPO

(1ª)

(40)

(41)

FAN

ANCA

ANTI-MBG

COMPLEMENTO

ANTI-C1q

CRIOGLOBULINAS

GNRP

E

VASCULITES

(42)

Antimembrana basal glomerular

(porção NC colágeno IV)

(43)

(44)

• Na prática diária – IFI e ELISA (com variações);

Conclusões

• Importante instrumento para diagnóstico e avaliação de fenótipo

de vasculites associadas ao ANCA;

• Contexto apropriado;

• Futuro – Substituição da IFI por ensaios de fase sólida?

• Novas diretrizes.