QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGNINA PEROXIDASE ATRAVÉS DA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SOLIDO DO RESÍDUO DE BATATA
(Solanum tuberosum L.)
Tamires Carvalho dos Santos1, Alexsandra Nascimento Ferreira2, Clissiane Soares
Viana Pacheco2, Thiago José Onório Rocha2 e Marcelo Franco3
1. Graduanda em Engenharia Ambiental 2. Graduando em Licenciatura em Química.
3. Prof. D.Sc. do Departamento de Estudos Básicos e Instrumentais (marcelofranco@pq.cnpq.br)
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia Praça Primavera, 40, Campus de Itapetinga, BA, Brasil.
Data de recebimento: 02/05/2011 - Data de aprovação: 31/05/2011
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi analisar e quantificar a atividade cinética da enzima lignina peroxidase produzida através da fermentação em estado sólido. Utilizou-se a espécie fúngica Aspergillus Niger como inoculante e o resíduo proveniente do beneficiamento da batata (Solanum tuberosum L.) como matéria prima, em diferentes concentrações de água. O resíduo agroindustrial depois de gerado, necessita de destino adequado, pois, além de criar potenciais problemas ambientais, representam perdas de matérias-primas e energia, exigindo investimentos significativos em tratamentos para controlar a poluição. Foram avaliadas as condições ótimas de tempo (24, 72, e 120 horas) e umidade especifica (40%, 50% e 60%), onde foi quantificado o potencial da atividade cinética para as enzimas estudadas. A fermentação foi realizada a 30oC em estufa bacteriológica. Os
resultados encontrados indicam a melhor atividade para lignina peroxidase 2,96x1013
UI/L em 72 horas de fermentação e melhor concentração em 50% de umidade. PALAVRAS-CHAVE: biotransformação, fungos filamentosos, sustentabilidade ambiental.
ABSTRACT
The aim of this study was to analyze and quantify the kinetics of enzyme activity Lignin Peroxidase produced by Solid State Fermentation, used the fungus
Aspergillus niger as inoculant and residue from the processing of potato (Solanum tuberosum L.) as raw material, at different water concentrations. The agro-industrial
residue after generated, requires suitable target, because in addition to creating potential environmental problems, represents a significant loss of raw materials and energy, requiring significant investments in treatments to control pollution. We evaluated the optimal conditions of time (24, 72, and 120 hours) and specific humidity (40%, 50% and 60%), where it was quantified the potential of kinetic activity for the enzymes studied. The fermentation was conducted at 30oC in a bacteriological
incubator. The results showed the best activity for Lignin Peroxidase 2,96x1013 UI/ L
KEYWORDS: biotransformation, filamentous fungi, environmental sustainability.
INTRODUÇÃO
A degradação microbiana de lignina exerce um papel essencial na ciclagem do carbono e a função dos microorganismos, que são em sua maioria os fungos, é fundamental para as biotecnologias emergentes tal como a polpagem biomecânica, o branqueamento enzimático de polpas e a degradação de poluentes orgânicos (BAJPAI et al., 2004; RAMOS et al., 2004; WHITELEY e LEE, 2006; MARDONES et
al., 2006).
A biodegradação da lignina a CO2 e H2O depende de um efetivo processo de
despolimerização dessa macromolécula que origina compostos de baixa massa molar susceptíveis ao metabolismo intracelular dos fungos. Grande parte da abordagem experimental realizada até hoje, visa elucidar os mecanismos de biodegradação da lignina, tomando como base, que o polímero é constituído de ligações etéreas aril-aquil e que poucos grupos fenólicos estão disponíveis (FUJIAN, 2001).
Os fungos constituem um dos grupos de microrganismos mais importantes na atividade de decomposição da matéria orgânica em função de sua capacidade especializada de degradação. Esta atividade ocorre, sobretudo, através de sua fase vegetativa ou miceliana. Nas fases vegetativa e reprodutiva, a formação de biomassa depende da produção de enzimas extracelulares, que são fundamentais na degradação dos componentes dos substratos, principalmente lignocelulose (VELÁZQUEZ-CEDEÑO et. al., 2002).
O uso de enzimas é considerado na atualidade, um dos maiores setores da indústria biotecnológica. A exploração vem sendo feita da forma bruta, a partir de origem animal e vegetal, ou pelo aproveitamento da expressão enzimática decorren-te do crescimento microbiano sobre dedecorren-terminados substratos (COLEN, 2006).
O objetivo deste trabalho é caracterizar a produção da enzima, lignina peroxidase, responsável pela degradação da lignina no resíduo de batata (Solanum
tuberosum L.) através da Fermentação em Estado Sólido com o uso do fungo
filamentoso Aspergillus niger como inóculo.
MATERIAIS E MÉTODOS
Escolha da Espécie Fúngica
O microrganismo estudado foi o fungo filamentoso Aspergillus niger proveniente do Laboratório de Reaproveitamento de Resíduos Agroindustriais - LABRA da UESB campus de Itapetinga. O resíduo foi cedido por uma agroindústria de beneficiamento localizada na região sudoeste da Bahia, seco em estufa de secagem e esterilização SOLAB a 70 oC por 24 horas, e triturado em moinho tipo
Obtenção da Solução de Esporos
A cultura esporulada (em PDA HIMEDIA acidificado) foi suspensa em solução de Tween 80 VETEC a 0,01% sendo nesta efetuada a contagem do número de esporos em suspensão, utilizando câmara de Neubauer dupla espelhada e microscópio binocular BIOVAL L1000, assim como descrita por (RAIMBAULT & ALAZARD, 1980).
Fermentação em Estado Sólido
As fermentações foram realizadas em erlenmeyers contendo 10 g de resíduo, adicionando uma suspensão contendo a quantidade de 108 esporos por
grama de substrato, foram adicionados volumes de água estéril até os seguintes valores de umidade representados por 50%, 60% e 70% de umidade. A umidade inicial do resíduo depois de seco foi 6,67%. Os cultivos foram conduzidos a 35°C em estufa bacteriológica refrigerada modelo (SL 101 SOLAB) segundo Santos et al. 2010.
Extração dos compostos enzimáticos
Após o processo fermentativo, foi feita a extração mecânica do extrato enzimático com solução tampão de citrato de sódio VETEC com o pH 4,8 a 50 mM, o extrato enzimático proveniente da fermentação foi recolhido e centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos em centrifuga (CETRIBIO modelo 80-2B).
Determinação da atividade de lignina perochidase (LiP)
A atividade da lignina peroxidase foi realizada segundo o protocolo de ARCHIBALD (1992). Foram utilizados dois tubos de ensaio de 10 x 100 mm, um para amostra não fervida e outro para amostra fervida. Foi adicionado em cada tubo 0,6 mL da amostra a ser analisada, 0,2 mL do tampão citrato-fosfato, 0,1 mL de H2O2. Um tubo foi fervido por 10 minutos (controle) e depois retirado e resfriado. O
tempo inicial (zero) foi determinado como a medição da absorbância no momento em que se adiciona 0,1 mL de siringadalzine. Depois foi feita outra medição no tempo final após 10 minutos. De cada tubo foram retirados alíquotas de 1,0 mL de cada tubo contendo as amostras fervidas e não fervidas foram medidas contra espectro zero a 460 nanômetros (ε = 29400 L. M-1. cm-1).
A atividade cinética de produção das enzimas foram calculadas seguindo a formula abaixo “International Unit” (UI, Unidade Internacional) (AGUIAR FILHO, 2008):
Onde:
∆Abs = absorbância (Abs final – Abs inicial) ε = coeficiente de absorção molar
R = quantidade de solução da amostra t = tempo de reação em minutos
UI/L = Unidade Internacional, onde significa μmol min-1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A umidade é um dos fatores que mais interferem na produção das enzimas quando se utiliza fermentação em estado sólido. A adição de água produz aumento de volume no substrato o que facilita sua utilização pelos microrganismos (EL-BATAL & KAREM, 2001). Entretanto, quando esta quantidade é excessiva ocorre diminuição na transferência de O2 e da produção da enzima pelo sistema. Por outro
lado, um baixo nível de umidade reduz a difusão dos nutrientes no substrato sólido, diminuindo a hidratação e aumentando a tensão da água no substrato (BOTELLA et al., 2005)
As atividades cinéticas das enzimas estudadas estão abaixo estão e expressas nas Figura 1, onde os valores máximos obtidos em ambas as enzimas foram mais expressivos na umidade representada por 50% e a 72 horas de fermentação. A máxima atividade enzimática de lignina peroxidase foi 2,96x1013
(UI/L). 0 5E+12 1E+13 1,5E+13 2E+13 2,5E+13 3E+13 3,5E+13 24 72 120
Tempo de fermentação em horas
A ti vi d ad e en zi m at ic a (U /L ) 40% 50% 60%
Figura 1: Atividade de lignina peroxidase em função do tempo de fermentação As LiPs são heme-proteínas que apresentam potencial de oxidação suficientemente elevado para abstrair elétrons de estruturas aromáticas não fenólicas, dando origem a radicais cátions.
As peroxidases catalisam reações envolvendo a transferência de hidrogênio de moléculas orgânicas para peróxidos formando água. A sua ação enzimática provem da redução cíclica do átomo de ferro no grupo hematina, na presença de H2O2, a enzima se combina com a molécula de H2O2, formando um complexo que
pode oxidar uma variedade de doadores de elétrons formando água no final. Por causa da baixa especificidade do complexo enzimático peroxidase-H2O2, este pode
promover a oxidação de uma grande variedade de poluentes orgânicos (DELLAMATRICE, 2005).
A umidade é um fator crítico para o crescimento de fungos em substrato sólido. Como a quantidade de água é sempre limitada, o controle do nível de umidade é essencial para aperfeiçoar o processo em estado sólido. O teor de umidade adequada para o substrato deve permitir a formação de um filme de água na superfície, para facilitar a dissolução e a transferência de nutrientes e oxigênio. Entretanto, os espaços entre as partículas devem permanecer livres para permitir a difusão de oxigênio e a dissipação de calor (GERVAIS & MOLIN, 2003; SANCHEZ, 2009). O que pode-se notar que a umidade de 50% foi a ideal para a obtenção das enzimas aqui estudadas, a otimização realizada foi necessária para o ajuste de produção da enzima.
Nas demais umidades estudadas, 40% e 60%, ouve a diminuição da atuação fungica e pode estar relacionado com a inibição do fungo, marcado pela extrapolação do nível de água ideal para o desenvolvimento da linhagem selecionada no caso de 60% de umidade, ou a baixa atividade de agua necessaria paa que o fungo consiga se desenvolver encontrada em 40% de umidade, estas duas condições podem estar influenciando no metabolismo responsável pela produção da enzima.
O fungo sintetizou a enzima sem a necessidade de qualquer indutor ou suprimento além do resíduo de cacau e água em diferentes concentrações.
CONCLUSÃO
Os resultados indicam que a estirpe de Aspergilus niger é bastante promissora, no que se diz respeito à obtenção de Lignina Peroxidase. Em ambas as enzimas estudas a umidade ótima para a melhor concentração cinética foi 50%, em relação ao tempo o que se pode observar é que em 72 horas foi ideal para o estimulo da estipe aqui estudada obtenção ótima das espécies enzimáticas investigadas.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas de ITI (Iniciação Tecnológica Industrial) concedidas e ao Banco do Nordeste (BNB) pelo apoio financeiro concedido.
REFERÊNCIAS
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