UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
REBECCA LAÍS SILVA RODRIGUES
PREVALÊNCIA DO VÍRUS ZIKA NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE NO PERÍODO DE 2014 A 2015
Natal – RN Novembro – 2019
PREVALÊNCIA DO VÍRUS ZIKA NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE NO PERÍODO DE 2014 A 2015
Por
Rebecca Laís Silva Rodrigues
Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes
Natal –RN Novembro –2019
Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia “Prevalência do Vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte no período de 2014 a 2015”
elaborada por Rebecca Laís Silva Rodrigues
e aprovada por todos os membros da Banca Examinadora foi aceita pelo curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 19 de novembro de 2019
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________ Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes (Orientador) Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
___________________________________________________ Profª. Drª. Monique Gabriela das Chagas Faustino Alves
Departamento de Bioquímica – UFRN
___________________________________________________ Profª. Drª. Fabiana Lima Bezerra
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer primeiramente a Deus, pelo meu ingresso no Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, a melhor do Norte/Nordeste, mesmo diante de um ano tão turbulento. Agradeço à minha mãe, por sempre estar ao meu lado, acalmando-me nos momentos difíceis; por suas orientações e conselhos que levarei por toda a minha vida.
Agradeço também ao meu namorado, pela paciência e compreensão diante da minha comprometida rotina acadêmica. Agradeço ao meu orientador professor Veríssimo, pelos seus ensinamentos valiosos, por me conduzir na elaboração dos trabalhos de iniciação científica e de monografia.
Agradeço às minhas amigas de curso, pelas horas de estudos, monitorias, seminários, provas, e por me auxiliarem nesse caminho da biomedicina.
Por fim, agradeço aos meus familiares, que sempre estiveram torcendo e desejando o melhor à minha trajetória de vida.
RESUMO
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, e está intimamente relacionado aos vírus da febre amarela, dengue, vírus do Nilo Ocidental e vírus da encefalite japonesa. Foi isolado pela primeira vez em Uganda, no continente africano, em abril de 1947 na Floresta Zika. Além da transmissão vetorial pela picada das fêmeas do mosquito do gênero Aedes infectadas, o ZIKV também pode ser transmitido pelo contato sexual, por transfusões de sangue e verticalmente da mãe para o filho, durante a gestação. Quando sintomática, as manifestações clínicas ocorrem, em média, de 3 a 7 dias após a inoculação do vírus pelo mosquito, e inclui febre, dor de cabeça, artralgia, mialgia, conjuntivite, vômito, fadiga e exantema maculopapular. O objetivo do presente estudo foi pesquisar a presença do vírus Zika em amostras de sangue total e de soro, obtidas de pacientes com suspeita clínica de infecção por esse patógeno. Foram analisadas 353 amostras de soro e sangue total, provenientes de diversos municípios do Estado do Rio Grande do Norte, coletadas no período de 2014 e 2015. As amostras foram processadas para a extração do RNA total, para a síntese de cDNA e para a transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), usando iniciadores específicos para uma região do genoma viral. A taxa de prevalência global da infecção no período estudado foi de 17,6%, sendo 10,4% no ano de 2014 e 21,0% em 2015. A distribuição dos casos confirmados da doença, de acordo com o gênero, mostrou que as taxas de prevalência foram praticamente as mesmas para homens e mulheres, com valores de 17,3% e 17,7%, respectivamente. Foram diagnosticados casos da infecção pelo vírus Zika em todas as faixas etárias, mas a maioria dos pacientes infectados estavam na faixa etária de até 50 anos, observando-se uma redução do número de casos após os 51 anos de idade. Os resultados mostram um pico de incidência da infecção pelo vírus zika no ano 2015, atingido igualmente homens e mulheres, especialmente aqueles na faixa etária de zero a 50 anos.
ABSTRACT
Zika virus (ZIKV) is an arbovirus belonging to the Flaviviridae family and genus Flavivirus, and is closely related to yellow fever, dengue, West Nile virus and Japanese encephalitis virus. It was first isolated in Uganda on the African continent in April 1947 in the Zika Forest. In addition to vector transmission by the bite of infected Aedes mosquitoes, or ZIKV can also be transmitted by sexual contact, blood transfusions and vertically from mother to child during pregnancy. When symptomatic, clinical manifestations occur on average 3 to 7 days after mosquito virus inoculation and include fever, headache, arthralgia, myalgia, conjunctivitis, vomiting, fatigue, and maculopapular rash. The aim of the present study was evaluate the presence of Zika virus in whole blood samples or serum of patients with suspected clinical infection with this pathogen. A total of 353 serum or whole blood samples from various cities of the state of Rio Grande do Norte collected from 2014 to 2015 were analyzed. The samples were processed for total RNA extraction, cDNA synthesis and reverse transcription followed by real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) using primers required for a region of the viral genome. The overall prevalence rate of infection in the study period was 17.6%, 10.4% in 2014 and 21.0% in 2015. The distribution of confirmed cases of disease according to gender showed that rates prevalence were practically the same for men and women with values of 17.3% and 17.7%, respectively. Cases of Zika virus infection were diagnosed in all age groups, but most of the infected patients were aged up to 50 years with a reduction in the number of cases after 51 years of age. The results show a peak of incidence of virus infection in 2015, reaching similar men and women, especially in the 0-50 age group.
LISTA DE ABREVIATURAS
GBS Síndrome de Guillain-Barré
IFN Interferon IL Interleucina
PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico
RNA Ácido Ribonucleico
RE Retículo Endoplasmático
RT-qPCR Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real
SC Células de Sertoli
SCs Células de Schwann
SE Semana Epidemiológica
SNP Sistema Nervoso Periférico
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distribuição dos casos positivos de infecção pelo vírus zika e taxas de prevalência da infecção em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte, com suspeita da doença ...26 Tabela 2: Distribuição dos casos positivos pelo ZIKV e taxas de prevalência da infecção em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte, de acordo com o gênero ...27 Tabela 3: Distribuição por faixa etária dos casos positivos para ZIKV em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte ...27 Tabela 4: Número de casos prováveis e incidência de Zika, por região e Unidade
da Federação do Brasil, 2018 e 2019
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação genômica e estrutural do vírus Zika
...12
Figura 2: Ciclo de replicação do ZIKV ...14
Figura 3. Trajetória do Vírus Zika até chegar ao Brasil ...15
Figura 4: Patogênese do ZIKV ...17
Figura 5: Casos notificados de vírus Zika, Rio Grande do Norte, 2015 e 2016 ...29
Figura 6: Casos prováveis de febre pelo vírus Zika, Brasil, 2016 ...30
Figura 7. Classificação dos casos prováveis de Zika, Rio Grande do Norte, 2018 e 2019 ...31
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ...viii
LISTA DE TABELAS ...ix
LISTA DE FIGURAS ...x
1 INTRODUÇÃO ...12
1.1 Aspectos Gerais do vírus Zika ...12
1.2 Histórico e Epidemiologia da infecção pelo vírus Zika ...15
1.3 Interação vírus x hospedeiro humano ...17
1.4 Manifestações clínicas ...20
1.5 Resposta imunológica contra o vírus Zika ...20
1.6 Profilaxia e Tratamento ...21 2 OBJETIVOS ...23 2.1 Objetivo geral ...23 2.2 Objetivos específicos ...23 3 MATERIAL E MÉTODOS ...24 3.1 Amostras ...24
3.2 Extração do RNA viral ...24
3.3 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecção do Vírus Zika ...25
4 RESULTADOS ...26
5 DISCUSSÃO ...28
6 CONCLUSÃO ...35
12 1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais do vírus Zika
O ZIKV pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, e está intimamente relacionado ao vírus da febre amarela, vírus da dengue (DENV), vírus do Nilo Ocidental (WNV) e vírus da encefalite japonesa (GOULD e SALOMÃO, 2008). Como todos os flavivírus, o ZIKV possui genoma composto por uma fita simples de RNA, com polaridade positiva1, contendo cerca de
11.000 nucleotídeos de comprimento e uma única fase aberta de leitura, flanqueada pelas regiões 5’ e 3’ não traduzidas (URT’s), codificando uma única poliproteína (FAYE et al., 2013), que posteriormente é clivada em proteínas estruturais denominadas de capsídeo (C), pré-membrana (prM), que depois de processada torna-se M e a glicoproteína do envelope (E), juntamente com as proteínas não-estruturais conhecidas como NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (Figura 1) (BARONTI et al., 2014).
Figura 1. Representação genômica e estrutural do vírus Zika
(Fonte: adaptado de FREIRE et al., 2014)
1 Polaridade positiva é quando o RNA genômico serve como mRNA e tem a capacidade de sintetizar proteínas.
13 As três proteínas estruturais são necessárias para a montagem de novas partículas virais infecciosas, enquanto as proteínas não estruturais atuam na replicação do genoma. A proteína C do capsídeo envolve o genoma para formar o nucleocapsídeo, que por sua vez é envolvido pelo envelope viral, formado a partir da membrana do retículo endoplasmático da célula hospedeira, na qual foram inseridas a proteína prM e a glicoproteína E, para formar os vírions imaturos. A glicoproteína E é a estrutura de ligação do vírus aos receptores da célula, num processo denominado adsorção, promovendo-se, em seguida, a fusão entre o envelope viral e a membrana da vesícula, formada a partir de membrana plasmática com a liberação dos vírus no interior da célula (DAI et al., 2016; STETTLER et al., 2016; WANG et al., 2016; ZHANG et al., 2017). As sete proteínas não estruturais (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) estão envolvidas em uma variedade de funções que vão da replicação de RNA viral, morfogênese das partículas virais, indução de rearranjos de membrana e desenvolvimento de partículas virais para a modulação da resposta imunológica do hospedeiro (MARTÍN-ACEBES e SAIZ, 2012).
Quando as partículas virais se ligam aos receptores de entrada presentes na membrana plasmática da célula ativam proteínas intracelulares do tipo clatrinas, as quais se ligam à parte interna da membrana, promovendo uma invaginação que se rompe, formando uma vesícula endossômica, contendo as partículas virais no seu interior. À medida que essas vesículas se aproximam do núcleo, o ambiente vai se tornando mais ácido, atingindo o pH ideal para as alterações conformacionais da glicoproteína E, o que possibilita a exposição do seu domínio de fusão, o qual promove a fusão entre o envelope viral e a membrana do endossomo, liberando os nucleocapsídeos virais no citosol (HEINZ e STIASNY, 2017; SMIT et al., 2011). Em seguida, ocorre quebra do capsídeo e o RNA genômico é traduzido na poliproteína nos ribossomos da membrana do retículo endoplasmático (RE). Após o processamento, as proteínas não estruturais permitem a síntese de uma fita completa de RNA de polaridade negativa, que serve como molde para a síntese de novas cópias do genoma viral (LINDENBACH, THIEL e RICE, 2007).
Ao mesmo tempo em que ocorre a replicação do RNA viral na luz do RE, as proteínas prM e E são direcionadas para a membrana da organela, onde são
14 inseridas. Enquanto isso, múltiplas cópias da proteína C se reúnem para montar os capsídeos, envolvendo as cópias do RNA genômico recém-sintetizadas para formar os nucleocapsídeos, os quais brotam da membrana do retículo endoplasmático, na qual estão inseridas as proteínas prM e E, para formar o envelope viral. As partículas virais que brotam da membrana do RE estão ainda imaturas e apresentam a superfície espiculada, onde as proteínas E e prM se arranjam em 60 heterotrímeros (REY, STIASNY e HEINZ, 2017). Os vírions imaturos e ainda não infeciosos são transportados através do Golgi, onde ocorre a clivagem da proteína percursora prM, em sua forma definitiva M, pela ação de proteases semelhantes à furina. A proteína E recebe a glicosilação nos resíduos de aminoácido Asn67 e Asn153, para assegurar o seu dobramento adequado. Após esses eventos, os vírions tornam-se maduros e são liberados da célula por exocitose (Figura 2) (MOSSENTA et al., 2017; PIERSON e GRAHAM, 2016).
Figura 2. Ciclo de replicação do ZIKV
15 1.2 Histórico e Epidemiologia da infecção pelo vírus Zika
O ZIK foi isolado pela primeira vez a partir de uma fêmea de macaco Rhesus febril, que havia sido utilizada como sentinela para o vírus da febre amarela, na Floresta Zika, localizada próxima de Entebbe, na Uganda, no continente africano, em abril de 1947(DICK et al., 1952; KARABATSOS, 1985). Embora não tenha havido o isolamento do vírus, evidência pela detecção de anticorpos neutralizantes indica que o vírus circula entre humanos no continente asiático desde o início dos anos 50 (SMITHBURN, KERR e GATNE, 1954). Antes restrito aos continentes africano e asiático onde haviam pequenos surtos da infecção, o ZIKV surgiu nas Ilhas Yap, no Oceano Pacífico, em 2007 (HAYES, 2009). Depois, no arquipélago da Polinésia Francesa, em 2013 (KUCHARSKI et al., 2016); na Ilha de Páscoa, Chile, em 2014 (TOGNARELLI et al., 2016) e, em seguida, no Nordeste do Brasil, em 2015 (ZANLUCA et al., 2015), espalhando-se rapidamente para outras regiões do país (CALVET, SANTOS e SEQUEIRA, 2016) e para as Américas, atingindo 48 países e territórios da região (IKEJEZIE et al., 2017) (Figura 3).
Figura 3. Trajetória do Vírus Zika até chegar ao Brasil
(Fonte: adaptado de Mapas continentes, 2010)
16 Os estudos filogenéticos permitiram identificar duas linhagens africanas, uma da África Oriental e outra da África Ocidental e uma linhagem Asiática (ENFISSI et al., 2016). Em 2007, foi efetuado pela primeira vez o sequenciamento completo do genoma da cepa do vírus zika denomina Kedougou, isolada no Senegal (KUNO e CHANG, 2007). Estudos genéticos sugerem que a atual estirpe pandêmica pertence à linhagem Asiática, que teria sofrido mutações que levaram à sua adaptação recente ao homem (ABUSHOUK, NEGIDA e AHMED, 2016).
A transmissão do vírus ocorre predominantemente através da picada de mosquitos do gênero Aedes (LANCIOTTI et al., 2008), especificamente pelas fêmeas do mosquito do gênero Aedes infectadas, especialmente Aedes aegypti e em menor escala pelo Aedes albopictus (THAM et al., 2018). O vírus foi isolado em outros fluidos corpóreos, como sêmen e saliva (ATKINSON et al., 2016; MUSSO et al., 2015). A transmissão por via sexual é descrita em um número crescente de casos, incluindo casos de transmissão homem – mulher, homem – homem e mulher – homem (HILLS et al., 2016; DAVIDSON et al., 2016). Além disso, a possibilidade de transmissão sanguínea da doença já foi demonstrada (BARJAS-CASTRO et al., 2016; LANTERI et al., 2016), como também a transmissão vertical da mãe para o filho, durante a gestação (SHARMA e LAL, 2017).
Em 2016, 48 países e territórios das Américas haviam relatado mais de 532.000 casos suspeitos de infecção pelo vírus Zika, incluindo 175.063 casos confirmados. Além disso, 22 países e territórios relataram 2.439 casos de síndrome congênita associada ao Zika. Cinco países relataram casos de transmissão sexual desse vírus (IKEJEZIE et al., 2017; “PAHO WHO | Regional Zika Epidemiological Update (Americas) August 25, 2017”, [s.d.] ).
No Brasil, em 2016, foram registrados 216.207 casos prováveis de febre pelo vírus Zika, sendo confirmados laboratorialmente oito óbitos causados por esse patógeno nos Estados do Rio de Janeiro, Espírito Santo, Maranhão e Paraíba. Até outubro de 2017, foram registrados 15.586 casos prováveis de febre pelo vírus Zika no país, com taxa de incidência de 7,6 casos/100 mil hab., e destes, 6.679 (42,9%) foram confirmados (BRASIL, 2017). Atualmente, não existem terapias ou vacinas específicas aprovadas para uso em seres humanos,
17 para combater ou prevenir a infecção por ZIKV, embora vários compostos farmacológicos promissores e vacinas estejam atualmente em desenvolvimento (DURBIN e WILDER-SMITH, 2017; MCARTHUR, 2017).
1.3. Interação vírus x hospedeiro humano
A picada do inseto vetor infectado inocula os vírus na pele, os quais se replicam em fibroblastos da pele e são capturados pelas células dendríticas e levados para os linfonodos mais próximos, onde infectam monócitos e macrófagos que entram na corrente sanguínea e disseminam os vírus para vários órgãos (Figura 4). Os sinais e sintomas associados ao ZIKV ocorrem, em média, de 3 a 7 dias após a inoculação do vírus pelo mosquito e inclui um início abrupto de febre acompanhado de dor de cabeça, artralgia, mialgia, conjuntivite, vômito, fadiga e erupção maculopapular (HEANG et al., 2012).
Figura 4. Patogênese do ZIKV. O curso típico da infecção pelo ZIKV é ilustrado (fundo verde) com potenciais efeitos graves que requerem mais investigação indicado (fundo azul). DENV, vírus da dengue; ADE, aprimoramento dependente de anticorpos.
18 A microcefalia causada pelo vírus Zika, ainda no período de gestação, decorre da infecção materna do feto, em que o vírus rompe a barreira placentária, causando a malformação do cérebro (SOCIEDADE BRASILEIRA DE INFECTOLOGIA, 2015). A microcefalia é considerada uma anomalia do crânio desde o nascimento, que afeta o desenvolvimento normal do cérebro. Os bebês nascem com perímetros cefálicos iguais ou inferiores a 32 cm (BRASIL, 2015). Os estudos realizados em 2015, pela Associação Brasileira de Saúde Coletiva (ABRASCO), comprovaram que os fetos infectados pelo vírus Zika podem desenvolver a microcefalia (SOUZA, 2016). Vários casos de infecção intra-uterina presumida por ZIKV resultaram em calcificações cerebrais grosseiras em diferentes regiões cerebrais do recém-nascido (MELO et al., 2016).
A detecção do ZIKV em esperma e sêmen humano durante meses após a viremia ter desaparecido (ATKINSON et al., 2016; PAZ-BAILEY et al., 2018) sugere fortemente que os testículos e a próstata são órgãos em humanos adultos imunoprivilegiados, onde o ZIKV pode estabelecer persistência. Isso indica que as mulheres grávidas de áreas onde o ZIKV é endêmico e, mesmo em áreas onde o ZIKV não é endêmico, têm risco de adquirir ZIKV a partir de parceiros infectados. Para estabelecer uma infecção persistente nos testículos, o ZIKV deve se evadir da imunidade periférica e manter a replicação de baixo nível sem causar morte celular e inflamação severas (SIEMANN et al., 2017; ROBINSON et al., 2018). Os mecanismos pelos quais o ZIKV infecta essas células e estabelece a persistência testicular permanecem indefinidos.
O ambiente imune dos testículos é inerentemente imunossupressor e rigidamente regulado por uma rede de comunicação entre células residentes do espaço intersticial e túbulos seminíferos, através da produção de hormônios, citocinas e quimiocinas (CHEN, DENG e HAN, 2016). As células de Sertoli (SC) dos túbulos seminíferos são células grandes do tipo colunar que, além de formar a barreira hematotóxica e apoiar a espermatogênese (KAUR, THOMPSON e DUFOUR, 2014), também induzem resposta imune inata a patógenos, incluindo vírus, produzindo citocinas e interferons (IFNs) STRANGE et al., 2018; WU et al., 2016). Os resultados mostraram que SC humanas são altamente suscetíveis à infecção prolongada pelo ZIKV, sem apresentar efeito citopático, apesar da
19 indução de resposta antiviral, incluindo a produção de IFN tipo I (SIEMANN et al., 2017; KUMAR et al., 2018; STRANGE et al., 2018). O receptor Axl, que desempenha um papel fundamental na manutenção do meio imunossupressor no testículo, leva a supor que a expressão constitutiva do Axl aumenta a entrada do ZIKV e suprime a resposta antiviral em SC humana, para promover infecção robusta e persistente (STRANGE et al., 2019).
A primeira associação da infecção por ZIKV com a síndrome de Guillain-Barré (GBS) foi um estudo retrospectivo do surto da Polinésia Francesa, quando houve um aumento de 20 vezes na incidência de GBS e todos os 42 pacientes hospitalizados com GBS tiveram anticorpo anti-ZIKV (CAO-LORMEAU et al., 2016). Em 2016, a Organização Mundial da Saúde reconheceu oficialmente o ZIKV como causa de GBS e microcefalia (KRAUER et al., 2017). GBS, uma doença do nervo periférico potencialmente fatal, é caracterizada por um rápido início de fraqueza muscular bilateral, progredindo para paralisia, que pode ser acompanhada por sintomas sensoriais. A SGB geralmente ocorre uma a três semanas após uma doença infecciosa postulada para desencadear uma resposta imune específica para patógeno, que reage de forma cruzada com os antígenos do sistema nervoso periférico (SNP) (WILLISON, JACOBS e VAN DOORN, 2016).
As células de Schwann (SCs) se desenvolvem a partir de células da crista neural. São células gliais mielinizantes do SNP e desempenham um papel central na função do nervo periférico, manutenção e reparação. Em resposta à lesão do nervo, as SCs podem se diferenciar em uma célula proliferativa capaz de secretar mediadores inflamatórios que aumentam a remoção de mielina mediada por macrófagos (ARMATI; MATHEY, 2013) e podem iniciar e regular respostas imunes locais (HÖRSTE et al., 2008; YDENS et al., 2013). A evidência de que o ZIKV desencadeia o tipo de GBS AIDP (Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Aguda), que tem como alvo as SCs, sugeriu a possibilidade do ZIKV induzir a GBS, ao danificar as SCs diretamente através da infecção ou por meio da resposta imune a antígenos celulares em vez de virais (PARRA et al., 2016; MUÑOZ, BARRERAS e PARDO, 2016). O(s) mecanismo(s) do GBS induzido pelo ZIKV ainda não é compreendido (DHIMAN, ABRAHAM e GRIFFIN, 2019).
20 1.4 Manifestações clínicas
Muitos casos da infecção pelo ZIKV são assintomáticos e na maioria dos pacientes infectados que apresentam sintomas, estes configuram uma doença branda e autolimitada, com duração próxima de uma semana. Na febre por ZIKV, os principais sintomas são: febre, cefaleia e exantema maculopapular pruriginoso (MUSSO et al., 2015). A infecção por vírus Zika foi considerada historicamente como tendo um curso benigno até o surto em larga escala ocorrido na Polinésia Francesa (2013-2014) em que, pela primeira vez, constatou-se a ocorrência de complicações neurológicas graves associadas à infecção, como a síndrome de Guillain-Barré (SGB) (CAO-LORMEAU et al., 2016). Em novembro de 2015, o Ministério da Saúde do Brasil confirmou a relação entre a infecção pelo vírus Zika e a ocorrência de microcefalia. A presença do vírus foi identificada por pesquisadores do Instituto Evandro Chagas (IEC) em amostras de sangue e tecidos de um recém-nascido do Ceará que apresentava microcefalia e outras malformações congênitas (BRASIL, 2016).
1.5. Resposta imunológica contra o vírus Zika
As respostas de células T representam um aspecto crucial da resposta imune adaptativa à infecção. No contexto de infecções virais, macrófagos e células dendríticas se infectam e reconhecem os vírus por meio dos receptores da imunidade inata e são ativadas, produzindo interferons do tipo I (IFN-I) que ativam células matadoras naturais (NK), as quais, por sua vez, produzem interferon gama (IFN-γ), Interleucina 12 (IL-12) e outras citocinas que ativam células TCD4+ (ou células T auxiliares), que se diferenciam e suportam a resposta imune adaptativa, através da produção de citocinas efetoras, tais como: interferon gama (IFN-γ), Interleucina 12 (IL-12) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). As citocinas produzidas pelas células TCD4+ ativam as células TCD8+ (ou células T citotóxicas), as quais desempenham papéis importantes no controle e eliminação de patógenos (LUCKHEERAM et al., 2012; SMITH et al., 2004), reconhecendo e matando diretamente as células infectadas, além de produzir citocinas efetoras, o que as torna críticas para o controle de infecções virais (VALBON, CONDOTTA e RICHER, 2016). Além disso, ambos os pools de células T são capazes de gerar populações de memória de vida longa, a fim de
21 responder rapidamente à reinfecção e fornecer maior proteção (VALBON, CONDOTTA e RICHER, 2016).
As pesquisas demonstraram que em camundongos imunocompetentes o ZIKV estabelece uma infecção autolimitada com perda de peso leve e transitória como o único sintoma discernível de infecção (PARDY et al., 2017; HUANG et al., 2017). No entanto, a infecção induz uma resposta robusta das células TCD4+ Th1, a qual apresenta expressão do fator de transcrição T-bet e produção de citocinas efetoras IFN-γ, TNF-α e interleucina-2 (IL-2) (PARDY et al., 2017). Além disso, as células TCD8+ regulam positivamente a expressão de IFN-γ e TNF-α, produzem a molécula citolítica granzima B e apresentam um fenótipo altamente ativado após infecção por ZIKV (PARDY et al., 2017; HUANG et al., 2017). Não foi observada nenhuma ativação de células TCD4+ ou TCD8+ quando os camundongos foram imunizados com vírus inativados por UV (Radiação Ultravioleta), indicando que a infecção ativa com replicação do ZIKV vivo é necessária para a geração de imunidade mediada por células TCD4+ e TCD8+ (PARDY et al., 2017). No entanto, essa proteção foi perdida em camundongos deficientes em células T, demonstrando um papel fundamental desses linfócitos no controle da infecção pelo ZIKV (NAZERAI et al., 2018).
1.6 Profilaxia e Tratamento
Atualmente não existe nenhuma vacina disponível para prevenir a infecção pelo ZIKV. O domínio EDIII da proteína E é um candidato potencial à vacina. A glicoproteína E é responsável pela adsorção, endocitose e fusão do envelope do vírus com a membrana do endossomo. Contém um domínio transmembrana e um ectodomínio (também denominado E80), que pode ser dividido em domínio I (EDI), domínio II (EDII) e domínio III (EDIII) (DAI et al., 2016 ; KOSTYUCHENKO et al., 2016 ; ZHAO et al., 2016 ). Estudos recentes mostram que o EDIII apresenta epítopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais neutralizantes do ZIKV (ROBBIANI et al., 2017 ; SAPPARAPU, FERNANDEZ e KOSE, 2016 ; STETTLER et al., 2016 ; WANG et al., 2016 ; ZHAO et al., 2016). Além disso, estudos mostram que a proteína ZIKV EDIII pode ser produzida de forma robusta em leveduras e induz imunidade protetora contra a infecção pelo ZIKV in vitro, sem induzir anticorpos reativos
22 cruzados os quais poderiam aumentar o risco de infecção por dengue. O EDIII produzido em levedura é seguro e efetivo candidato à vacina ZIKV, digno de desenvolvimento adicional (ZHANG et al., 2019).
As estatinas são inibidores reversíveis da 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) redutase (HMGCR), uma enzima envolvida na biossíntese do colesterol (MOGHADASIAN, 1999). Elas são clinicamente aprovadas e usadas para reduzir os níveis de colesterol, para prevenir doenças cardiovasculares primárias e secundárias. Mas um estudo recente mostrou a possibilidade de utilizar as estatinas como drogas anti-ZIKV. Os resultados deste estudo mostraram que o uso de estatinas reduz a produção de partículas infecciosas de ZIKV em células Vero2. Especificamente, o tratamento de células Vero
infectadas com ZIKV com estatinas lipofílicas (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina e sinvastatina) capazes de atravessar membranas, durante toda a duração da infecção resulta em produção diminuída de partículas de ZIKV infecciosas no sobrenadante da cultura ao longo do tempo. Além disso, o ensaio de imunofluorescência revelou que o tratamento com estatinas reduziu a capacidade do ZIKV em infectar células, resultando em menores proporções de células infectadas e menores focos de infecção. As partículas do ZIKV também pareciam ter uma localização mais limitada e estavam mais confinadas à região perinuclear em células tratadas com estatina, em comparação com células Vero infectadas com ZIKV não tratadas (ESPAÑO et al., 2019).
23 2 OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
Pesquisar a presença do vírus Zika em amostras de sangue total ou de soro obtidas no período de 2014 a 2015 de pacientes do Rio Grande do Norte, com suspeita clínica de infecção por esse patógeno.
2.2. Objetivos específicos:
Estimar a taxa de prevalência da infecção pelo ZIKV em pacientes com suspeita clínica de infecção por esse patógeno.
Realizar a distribuição das taxas de prevalência de acordo com o gênero e faixa-etária dos pacientes.
24 3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras
Foram analisadas 353 amostras de soro ou sangue total provenientes de pacientes com sinais e sintomas compatíveis com infecção por Zika atendidos nos diversos Centros de Saúde e Hospitais da Rede pública e privada de vários municípios do Estado do Rio Grande do Norte. Amostras de sangue total ou de soro foram coletadas até no máximo cinco dias após o início dos sintomas, o que corresponde ao período de viremia da doença. Essas amostras foram enviadas para o Laboratório Central do Rio Grande do Norte (LACEN-RN), instituição colaboradora deste projeto. Uma alíquota de cada amostra foi encaminhada ao Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC), do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde foram processadas e analisadas por métodos moleculares. Todas as amostras vieram acompanhadas de ficha de identificação e dados de coleta em relação ao início dos sintomas da doença.
3.2 Extração do RNA viral
As amostras obtidas acima foram submetidas ao processo de extração do RNA total utilizando kit comercial, QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia,
EUA), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. A extração foi
realizada da seguinte forma: foram pipetados 560 µL de tampão AVL (tampão de lise) preparado com RNA (carrier/transportador), em tubos de microcentrífuga com capacidade de 1,5 mL, aos quais foram adicionados 140 µL das amostras sangue total (PBMC + Trizol) ou soro, em seguida homogeneizados por pulso-vortex (Vortex Model QL-901, Biomixer) por 15 segundos. Após isso, foram incubados à temperatura ambiente por 10 min, seguindo-se de breve centrifugação (6000 x g/ 15 seg) e adição de mais 560µL de etanol (96-100%). Novamente o produto foi homogeneizado por meio de pulso vórtex 15 seg, seguindo-se de breve centrifugação (6000 x g/ 15 seg). Do total, 630µL do produto obtido foram passados para uma coluna QIAamp Mini (Kit QIAGEN); centrifugados a 6000 x g/1min (esse passo foi repetido); foram adicionados
25 500µL de tampão (Buffer AW1) à coluna, e centrifugado a 6000 x g/1min. O tubo coletor foi descartado e substituído por novo tubo coletor de microcentrífuga com capacidade de 1,5 mL e acoplado à coluna, adicionados mais 500µL de tampão (Buffer AW2) centrifugado a 20 000 x g/3min. Novamente o tubo coletor foi descartado e a coluna acoplada a um microtubo de polipropileno com capacidade de 1,5mL (Sigma). Por fim, foram adicionados 60µL tampão (Buffer
AVE). A amostra foi incubada por 1 min à temperatura ambiente e então
centrifugada a 6000 x g/1min, à coluna descartada. Dado todo o procedimento e as amostras extraídas, foram acondicionadas em freezer -80°C até o momento de serem utilizadas para obtenção do cDNA.
3.3 Reação de RT-qPCRpara detecção do Vírus Zika
Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), para detecção da sequência específica do ZIKV: foi realizada conforme descrita por Faye et al. (2013). Foi utilizado o equipamento 7500 Fast da Applied Biosystems (Thermo Scientific). Foram empregados dois iniciadores consensuais forward e reverse (Zika_qRT_F e Zika_qRT_R) a 200 nM, complementares às sequências dos genes que codificam a proteína NS5, que é a mais conservada do gênero Flavivirus e a sonda (Zika_qRT_P), a 125 nM, complementar aos nucleotídeos conservados existentes nas cepas de ZIKV da Malásia, África e Micronésia. A mistura de reagentes para a reação da RT-qPCR foi realizada para cada amostra estudada da seguinte forma: em uma placa de 96 poços (AppliedBiosystems®), foram adicionados 2,5 μL do TaqMan FAST 1-Step Master Mix (2x) (AppliedBiosystems, Foster City, Usa), 0,2 μL do primer Zika_qRT_F (Invitrogen, USA), 0,2μL do primer Zika_qRT_R (Invitrogen, USA), 0,2 μL da sonda Zika_qRT_P (AppliedBiosystems®) e 1,9 μL de água livre de nucleases (Promega, Madison, USA). Após a preparação desses 5 µL de mistura para a reação, foram alíquotados 5 µL do RNA previamente extraído. A Placa de 96 poços foi levada ao equipamento ABI Prism 7500 Fast (AppliedBiosystems®) e a reação ocorreu de acordo com os seguintes parâmetros de termociclagem: 1 ciclo para ativação enzimática da transcriptase reversa (50ºC por 5 minutos), 1 ciclo para a inativação enzimática e desnaturação inicial (95ºC por 20 segundos), 40 ciclos de desnaturação (95ºC por 15 segundos), anelamento (60ºC por 1 minuto), extensão (60ºC por 1 minuto)
26 e um período de extensão final (60ºC por 1 minuto). Em todas as reações foram utilizados cDNA obtidos de uma amostra positiva para vírus Zika, utilizada como controle positivo e de cDNA obtido de indivíduos comprovadamente negativo para o ZIKV, como controle negativo.
4 RESULTADOS
Neste estudo, são apresentados resultados referentes ao monitoramento do ZIKV no Estado do Rio Grande do Norte em amostras coletadas no período de 2014 a 2015. Foram analisadas amostras de sangue total e de soro de 353 pacientes (de ambos os sexos e de diferentes faixas etárias) com suspeita clínica de infecção pelo ZIKV. Desse total, 62 amostras foram positivas para a presença da sequência específica do genoma do vírus, revelando uma taxa de prevalência global da infecção de 17,6%, sendo 10,4% no ano de 2014 e 21,0% em 2015 (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição dos casos positivos de infecção pelo vírus zika e taxas de prevalência da infecção em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte com suspeita da doença.
Número de casos estudados
Ano Negativos Positivos % Total
2014 103 12 10,4 115
2015 188 50 21,0 238
Total 291 62 17,6 353
Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA)
A distribuição dos pacientes incluídos neste estudo de acordo com o gênero revelou que o número de casos suspeitos da infecção analisados foi muito semelhante para os dois gêneros, sendo 42,5% de homens e 57,5% de mulheres. Além disso, as taxas de prevalência foram praticamente as mesmas para os dois gêneros 17,3% e 17,7%, para homens e mulheres, respectivamente (Tabela 2).
27 Tabela 2. Distribuição dos casos positivos pelo ZIKV e taxas de prevalência da infecção em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte, de acordo com o gênero.
Número de casos estudados
Gênero Negativos % Positivos % Total % Homens 124 82,7 26 17,3 150 42,5 Mulheres 167 82,2 36 17,7 203 57,5 Total 291 82,4 62 17,6 353 100 Fonte: (AUTORIA PRÓPRIA)
Foram confirmados laboratorialmente casos da infecção pelo vírus Zika em pacientes de ambos os sexos e em todas as faixas etárias, mas a maioria dos pacientes infectados estava na faixa etária de até 50 anos (Tabela 3). Tabela 3. Distribuição por faixa etária dos casos positivos para ZIKV em pacientes do Estado do Rio Grande do Norte.
Faixa etária Número de casos positivos %
0-10 12 19,3 11-20 7 11,3 21-30 9 14,5 31-40 12 19,3 41-50 12 19,3 51-60 4 6,4 61-70 4 6,4 >70 2 3,2 Total 62 99,7
28 5 DISCUSSÃO
Em outubro de 2014, vários municípios do estado do Rio Grande do Norte, especialmente Natal, notificaram a ocorrência de uma doença exantemática, acompanhada de prurido, febre baixa e dor articular, que não se enquadrava nas definições de caso suspeito de sarampo, rubéola ou dengue (FANTINATO et al., 2016). Devido ao fato de alguns pacientes apresentarem edema articular, a infecção pelo vírus chikungunya (CHIKV) foi também investigada. No entanto, os resultados dos exames sorológicos e pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram negativos para o CHIKV (LUZ, SANTOS E VIEIRA, 2015). Em fevereiro de 2015, o estado da Paraíba registrou indivíduos que apresentavam o mesmo quadro observado no Rio Grande do Norte (FANTINATO et al., 2016).
Em março de 2015, o Centro de Informações Estratégicas em Vigilância em Saúde do Estado do Maranhão (CIEVS/ MA) iniciou, no município de Barra do Corda, uma investigação dos casos de síndrome exantemática de origem indeterminada (FANTINATO et al., 2016). Além do Rio Grande do Norte, Maranhão e Paraíba, mais seis estados da região Nordeste notificaram a ocorrência de síndrome exantemática ao CIEVS nacional, no período de outubro de 2014 a março de 2015. Somente em 15 de maio de 2015, foi confirmada a etiologia da doença, sendo identificado o vírus Zika como agente etiológico, confirmando, pelo Ministério da Saúde, a presença desse vírus no Brasil como responsável por casos autóctones da doença, antes restrita aos continentes africano e asiático (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
O presente estudo analisou amostras de um total de 353 pacientes de ambos os gêneros e de diferentes faixas etárias, sendo 115 amostras do ano de 2014 e 238 amostras de 2015, com suspeita clínica de infecção pelo vírus zika. As amostras foram analisadas pela técnica da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR). A infecção pelo vírus zika foi confirmada em 12 pacientes com suspeita da infecção, cujas amostras foram coletadas no ano de 2014, revelando uma taxa de prevalência de 10,4% da infecção pelo vírus zika naquele ano. No de 2015, dos 238 pacientes com suspeita da doença analisados, 50 se apresentaram positivos para o vírus, o que corresponde a uma taxa de prevalência anual de 21,0%. Isso
29 mostra que o pico da epidemia da infecção pelo ZIKV no Estado do Rio Grande do Norte ocorreu no ano de 2015, quando o número de casos confirmados da infecção foi duas vezes maior que o ano de 2014.
Em 2015, no Rio Grande do Norte, até a Semana Epidemiológica 3(SE) nº
13 foram notificados 329 casos suspeitos do vírus zika e em 2016, no mesmo período, foram notificados 1.534, com um maior número de casos suspeitos na SE nº 7 (Figura 5). Dos casos notificados em 2015, foram confirmados 76, o que representa uma prevalência de 23,10%. Em 2016, apenas 3 foram confirmados, revelando uma prevalência próxima de zero (SECRETÁRIA DE SAÚDE PÚBLICA, 2016). Isso mostra uma grande redução do número de casos da doença, quando comparado ao ano anterior, conforme observado no nosso estudo, para o qual a prevalência da infecção foi de 21%. A provável explicação para esse fenômeno é o esgotamento de indivíduos susceptíveis ao vírus na comunidade.
Figura 5. Casos notificados de vírus Zika, Rio Grande do Norte, 2015 e 2016
(Fonte: Secretaria de Saúde Pública-SESAP/RN. Dados atualizados em 02/04/2016) Em 2015, foram registrados no Brasil 37.011 casos prováveis de doença aguda pelo vírus Zika, com uma taxa de incidência de 17,9 casos/100 mil habitantes. Foram registrados três óbitos atribuídos ao vírus Zika no ano de 2015, sendo um no Maranhão, um no Pará e um no Rio Grande do Norte (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2018). Em 2016, até a SE 52,
3 Semana Epidemiológica se trata de uma padronização internacional que permite a distribuição temporal dos casos e comparabilidade entre os mesmos. As Semanas Epidemiológicas iniciam-se no domingo e terminam no sábado.
30 foram registrados 215.319 casos prováveis de febre pelo vírus Zika no país (Figura 6), com taxa de incidência de 105,3 casos/100 mil habitantes, distribuídos em 2.306 municípios, tendo sido confirmados 130.701, o que representa (60,7%) do total dos casos. Em 2016, ocorreram 8 óbitos por vírus Zika, sendo quatro no Rio de Janeiro, dois no Espírito Santo, um no Maranhão e um na Paraíba (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2016).
Figura 6. Casos prováveis de febre pelo vírus Zika, Brasil, 2016
(Fonte: Secretaria de Vigilância em Saúde-Ministério da Saúde. Dados atualizados em 17/01/2017).
Nossos resultados mostram ainda que a infecção ocorreu tanto em homens como mulheres, não havendo diferença de prevalência em relação ao gênero. Isso mostra que homens e mulheres estão igualmente expostos ao vírus, ao contrário do observado por Coelho et al (2016), que encontraram maior prevalência da infeção em mulheres. Esses autores sugerem que a transmissão sexual pode desempenhar um fator importante na transmissão de ZIKV, o que pode ter contribuído para uma proporção mais elevada de casos em mulheres. No Rio de Janeiro, com relação ao número de casos registrados mesmo após correção do viés representado pelo maior número de mulheres grávidas incluídas no estudo, as mulheres ainda continuaram a ser a maioria dos casos de infecção, quando comparadas aos homens, sendo a maioria delas na faixa etária sexualmente ativa. No estudo desenvolvido por Campos, Bandeira e Sardi (2015) sobre o Surto do Vírus Zika na Bahia, a maioria dos pacientes positivos para o ZIKV eram mulheres. Considerando o Brasil como um todo, no período
31 de 2015-2017, houve predomínio do sexo feminino (66,7%) (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2018).
Todas as faixas etárias foram atingidas, com um maior número de casos na faixa etária até os 50 anos, havendo uma redução do número de casos a partir dos 51 anos de idade. Diferentemente do que se apresentou no estudo realizado por Campos, Bandeira e Sardi (2015), no qual a idade média das pessoas infectadas era de 28 anos. A faixa etária mais afetada no Brasil como um todo no período de 2015 a 2017 foi de 20 a 39 anos, média de 29 anos, para 2015, 31 anos em 2016 e 27 anos em 2017, todos com idades abaixo da encontrada no presente estudo (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2018).
Dados atuais do ZIKV no Rio Grande do Norte mostram que em 2018 nas Semanas Epidemiológicas de 1 a 29 foram registrados 375 casos prováveis de Zika, representando uma incidência de 10,78 casos por 100.000 habitantes nesse período. No mesmo período de 2019, foram registrados 627 casos prováveis, revelando uma incidência de 18,02 casos por 100.000 habitantes. Observa-se um aumento do número de casos do período de 2018 a 2019. No entanto, em 2019, segundo a Secretaria de Saúde Pública (2019), nenhum caso de zika foi confirmado no estado e em 2018 no mesmo período foram confirmados 49 casos (Figura 7).
Figura 7. Classificação dos casos prováveis de Zika, Rio Grande do Norte, 2018 e 2019.
32 No Brasil como um todo, em 2018, até a Semana Epidemiológica (SE) 33, foram registrados 6.669 casos prováveis de Zika. No mesmo período de 2019, foram registrados 9.813 casos prováveis (Figura 8) (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2019).
Figura 8. Casos prováveis de Zika, Brasil, 2018 e 2019
(Fonte: Secretaria de Vigilância em Saúde-Ministério da Saúde. Dados de 2018 atualizados em 09/01/2019; de 2019, em 23/08/2019).
A análise da taxa de incidência (número de casos/100 mil habitantes) de casos prováveis de Zika em 2019, até a SE 33, segundo regiões geográficas, evidencia que as regiões Nordeste, Centro-Oeste e Norte apresentam os maiores valores: 6,7 casos/100 mil habitantes, 6,2 casos/100 mil habitantes e 4,9 casos/100 mil habitantes, respectivamente (Tabela 4). É importante destacar que nenhuma região apresenta taxa de incidência maior do que 100 casos/100.000 habitantes, mas ocorre a dispersão do vírus em todas as regiões brasileiras. Entretanto, essa circulação viral difere, quando se observa cada unidade da federação individualmente (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2019). Nas análises, destacam-se os Estados do Tocantins 32,3 casos/100 mil hab.), Rio Grande do Norte (27,0 casos/100 mil hab.), Alagoas (18,0 casos/100 mil hab.) e Espírito Santo (15,7 casos/100 mil hab.) (Tabela 4), sendo confirmados dois óbitos por Zika no estado da Paraíba. Nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Mato Grosso, Distrito Federal, Maranhão,
33 Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte e Sergipe, não foi confirmada a presença do vírus Zika (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2019).
Tabela 4. Número de casos prováveis e incidência de Zika, por região e Unidade da Federação do Brasil, 2018 e 2019.
(Fonte: Secretaria de Vigilância em Saúde-Ministério da Saúde. Dados de 2018 atualizados em 09/01/2019; de 2019, em 23/08/2019. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). População estimada em 01/07/2018).
34 De acordo com a Tabela 4, o Estado do Rio Grande do Norte se destaca com a segunda maior taxa de incidência do país e a primeira da Região Nordeste, com 27,0 casos/100 mil habitantes. Além disso, a média nacional foi de 4,7 casos para cada grupo de 100 mil habitantes, enquanto a do Rio Grande do Norte foi de 27,0.
35 6 CONCLUSÕES
Constatou-se neste estudo que o ZIKV circulou no Estado do Rio Grande do Norte durante o período de 2014 e 2015, com um pico de incidência em 2015, atingindo igualmente homens e mulheres, especialmente na faixa etária de zero a 50 anos. A taxa de prevalência global da infecção foi de 17,6%, sendo 10,4% para o ano de 2014 e 21,0% para 2015.
De acordo com os dados do Ministério da Saúde, a situação atual do vírus zika no país se agravou de 2018 para 2019, com um aumento do número de casos prováveis da doença, embora não tenha havido a confirmação laboratorial. O Estado do Rio Grande Norte aparece como o segundo do país e o primeiro da Região Nordeste em número de casos prováveis de infecção pelo vírus zika, apresentando taxa de incidência de 27 casos por 100 mil habitantes. No entanto, não foi confirmado nenhum caso da doença ZIKV em 2019.
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