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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAPÁ PRÓ-REITORIA DE ENSINO E GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAPÁ PRÓ-REITORIA DE ENSINO E GRADUAÇÃO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA

BIANCA LIFFEY BRITO MARINO

ESTUDO in silico DE COMPOSTOS NATURAIS COMO POTENCIAIS INIBIDORES DA MAO-B PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON

Macapá

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BIANCA LIFFEY BRITO MARINO

ESTUDO in silico DE COMPOSTOS NATURAIS COMO POTENCIAIS INIBIDORES DA MAO-B PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Farmácia da Universidade Federal do Amapá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia.

Orientadora: Profª. Drª. Lorane Izabel da Silva Hage Melim.

Macapá

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BIANCA LIFFEY BRITO MARINO

ESTUDO in silico DE COMPOSTOS NATURAIS COMO POTENCIAIS INIBIDORES DE MAO-B PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON.

Data de Aprovação: __________/____________/_________

__________________________________________________________________ Orientadora: Profª. Drª. Lorane Izabel da Silva Hage Melim – UNIFAP

__________________________________________________________________ Avaliador: Prof. Dr. Rodrigo Alves Soares Cruz– UNIFAP

__________________________________________________________________ Avaliador: Prof. MSc. Jaderson Vieira Ferreira – UNIFAP

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Farmácia da Universidade Federal do Amapá, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Bacharel em Farmácia.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado sabedoria para as escolhas que fiz e que me levaram a esse trabalho, além da saúde e de todos que pôs em minha vida para ajudar nessas escolhas.

Aos meus pais pela paciência, por me patrocinarem durante toda a vida acadêmica, por terem sido meus alicerces quando tudo parecia desabar e não medirem esforços para que eu pudesse levar os estudos adiante.

À esta instituição pelo fornecimento de estrutura física, apoio financeiro cedido através da Fundação Universitária para bolsa de iniciação científica, e aos profissionais que se dedicam a ajudar nós alunos a ter um ensino de qualidade.

À minha querida orientadora Lorane Izabel da Silva Hage Melim, carinhosamente chamada de mãe, que pacientemente e incansavelmente me repassou os ensinamentos da academia e da vida para que eu realizasse esse trabalho. E ao digníssimo professor e colega de laboratório Jaderson Vieira Ferreira que me ajudou nas etapas dos estudos e aconselhou quanto aos empecilhos da graduação.

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Seu conhecimento não deve ser usado para lutar ou derrotar os inimigos, mas para achar uma maneira de reconciliar o mundo e fazer de todos os seres humanos uma família. (Adaptado de Morihei Ueshiba)

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RESUMO

Com o aumento da expectativa de vida aumentou também o surgimento de enfermidades relacionadas ao fator idade, como as doenças neurodegenerativas, que são caracterizadas pela morte neuronal de regiões focais do cérebro. A Doença de Parkinson (DP) é uma dessas doenças, causada pela diminuição da síntese de dopamina na substância negra. O tratamento farmacológico para DP consiste no controle sintomático via restituição de dopamina, através do uso de levodopa e inibidores da enzima monoamina oxidase B (MAO-B). O presente estudo tem como objetivo identificar produtos naturais como potenciais candidatos a fármacos com atividade inibitória de MAO-B, comparando-os, por métodos in silico, com medicamento Selegilina (1), para o tratamento de DP. Para tanto, realizou-se os seguintes procedimentos: busca dos produtos naturais relatados na literatura com atividade inibitória de MAO-B; modelagem molecular dos produtos naturais; simulação de docking; obtenção das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas; e predição de atividade biológica. Dos resultados, encontraram-se somente quatro produtos naturais Amburosideo A (2), Harmam (3), Harmalina (4) e Harmalol (5) com teste experimental para o tratamento de modelo de Parkinson induzido; para os descritores de reatividade química o produto que apresentou os resultados mais próximos da Selegilina foi Harmalol em seis descritores; no Mapa de Potencial Eletrostático, o potencial eletrostático molecular negativo é distribuído nas duplas ligações, especificamente nos átomos eletronegativos (oxigênio e nitrogênio), e o potencial eletrostático molecular positivo encontra-se nos hidrogênios ligados a átomos doadores de hidrogênio; para a simulação de docking, a molécula padrão Selegilina apresentou 8 interações em seis aminoácidos diferentes e o resultado mais próximo foi do produto 4 por apresentar 8 interações com os mesmos aminoácidos; para as propriedades ADME o produto 4 apresentou três resultados próximos a Selegilina, enquanto que os produtos 3 e 5 apresentaram somente um resultado, e para as propriedades toxicológicas os produtos 4 e 5 apresentaram melhores resultados que a Selegilina; para a predição de atividade no PASS somente a Harmalol não apresentou atividade, enquanto que no SEA somente Amburosideo A e Harman apresentaram atividade relacionada DP. Com isso, dos produtos naturais estudados, a molécula Harmalina apresentou resultados satisfatórios, tornando-se um potencial candidato a fármaco.

Palavras-chave: Parkinson. Monoamina oxidase B. Compostos naturais. Modelagem

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ABSTRACT

With the increase in life expectancy has also increased the emergence of diseases related to age, such as neurodegenerative diseases, which are characterized by neuronal death of focal regions of the brain. Parkinson's disease (PD) is one such disease, caused by decreased dopamine synthesis in the substantia nigra. Pharmacological treatment for PD consists of symptomatic control through dopamine restitution through the use of levodopa and monoamine oxidase B (MAO-B) inhibitors. The present study aims to identify natural products as potential candidates for drugs with MAO-B inhibitory activity, comparing them by in silico to Selegiline (1) for the treatment of PD. Procedures: search for natural products reported in the literature with MAO-B inhibitory activity; molecular modeling of natural products; docking simulation; pharmacokinetic and toxicological properties; and prediction of biological activity. From the results, four natural products were found: Amburoside A (2), Harmam (3), Harmaline (4) and Harmalol (5) with experimental test for the treatment of induced Parkinson's model; for the chemical reactivity descriptors the product that presented the closest results of Selegiline was Harmalol in six descriptors; in the Map of Electrostatic Potential, the negative electrostatic potential is distributed in the double bonds, specifically in the electronegative atoms (oxygen and nitrogen), and the positive molecular electrostatic potential is in the hydrogens connected to atoms donors of hydrogen; for the docking simulation, the standard Selegiline molecule showed 8 interactions in 6 different amino acids and the closest result was product 4 because it had 8 interactions with the same amino acids; for ADME properties, product 4 presented three results close to Selegiline, while products 3 and 5 presented only one result, and for the toxicological properties products 4 and 5 presented better results than Selegiline; for the prediction of activity in the PASS only Harmalol did not present activity, whereas in the SEA only Amburoside A and Harman presented PD related activity. Therefore, of the natural products studied, the molecule Harmaline presented satisfactory results, becoming a potential drug candidate.

Keywords: Parkinson's disease. Monoamine oxidase B. Natural compounds. Molecular Modeling.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química das moléculas estudadas, Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol

(5)...

26

Figura 2 - Representação dos orbitais HOMO nas moléculas Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harmam (3), Harmalina (4), Harmalol (5)... 29

Figura 3 - Representação dos orbitais LUMO para as moléculas Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harmam (3), Harmalina (4), Harmalol (5)... 30

Figura 4 - Mapas de potencial eletrostático molecular dos compostos naturais Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5)... 34

Figura 5 - Resultado da simulação de docking com o menor RMSD para a validação do complexo 4A79... 35

Figura 6 - Representação da simulação de docking molecular dos aminoácidos do sítio ativo da MAO-B e as moléculas estudadas: Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5)... 36

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Cálculo do EHOMO, EHOMO−1, ELUMO, ELUMO+1 e gap para as moléculas

Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harmam (3), Harmalina (4) eHarmalol (5) em nível B3LYP/6-31G** e a matriz de correlação de Pearson... 28

Tabela 2 - Descritores moleculares da reatividade química e estabilidade molecular de Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5) e a matriz de correlação de Pearson... 31

Tabela 3 - Resultado da simulação de docking entre as moléculas estudadas e os aminoácidos do sítio ativo da enzima MAO-B... 39

Tabela 4 - Predição Farmacocinética e toxicológicas das moléculas Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5)... 43

Tabela 5 - Predição de atividade biológica com o webservidor PASS para o medicamento padrão Selegilina (1) e os produtos naturais Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5)... 45

Tabela 6 - Predição de atividade biológica com o webservidor SEA para o medicamento padrão Selegilina (1) e os produtos naturais Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5)... 46

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADME Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção

AIH Absorção Intestinal Humano

AST Área de superfície total BHE Barreira Hematoencefálica COMT Catecol O-metiltransferase

DA Dopamina

DP Doença de Parkinson

EH Energia de hidratação

ET Energia Total

GAP Diferença de energia entre HOMO e LUMO HOMO Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia

HOMO-1 Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia em um nível abaixo IMAO Inibidores da enzima monoamina oxidase B

L-DOPA Ácido (S)-2-amino-3-(3,4-di-hidroxifenil propanoico) LogP Coeficiente de Lipofilicidade

LPP Ligação nas Proteínas Plasmáticas

LUMO +1 Orbital Molecular Desocupado de Menor Energia em um nível acima LUMO Energia do Orbital Molecular Desocupado de Menor Energia

MAO-B Monoamina oxidase B

MDCK Maden Darby Canine Kidney (células de rins canino) MEP Mapa de Potencial Eletrostático

MM Massa Molecular

MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina

Pcaco-2 Permeabilidade das células de Adenocarcinoma de Cólon humano

PM Polarizabilidade Molecular

PreADMET Webservidor para predição das propriedades farmacocinéticas

RM Refratividade Molecular

TFD Teoria do Funcional da Densidade

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LISTA DE SÍMBOLOS

χ Eletronegatividade de Mulliken

η Dureza molecular

1 / η Moleza molecular

µ Potencial químico

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Estágios da DP segundo Braak e colaboradores (2003)... 16

Quadro 2 - Estágio da Doença de Parkinson pela escala de Hoehn e Yahr... 17

Quadro 3 - Classes de medicamentos utilizados para o tratamento da Doença de Parkinson... 19

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 OBJETIVOS... 16 2.1 OBJETIVO GERAL... 16 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 16 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 17 3.1 DOENÇA DE PARKINSON... 17 3.2 EPIDEMIOLOGIA... 18

3.3 TRATAMENTOS DISPONÍVEIS PARA DOENÇA DE PARKINSON... 19

3.4 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE PARKINSON... 21

3.5 A MODELAGEM MOLECULAR NO PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS... 23

4 MATERIAL E MÉTODOS... 24

4.1 BUSCA PELAS ESTRUTURAS DOSPRODUTOS NATURAIS... 24

4.2 MAPAS DE POTENCIAL ELETROSTÁTICO MOLECULAR (MEP)... 24

4.3 DESCRITORES DE REATIVIDADE GLOBAL... 25

4.4 DESCRITORES DE RELAÇÃO QUANTITATIVA ENTRE ESTRUTURA E ATIVIDADE (QSAR)... 25

4.5 CONSTRUÇÃO DA MATRIZ DE DADOS E SELEÇÃO DE PROPRIEDADES MOLECULARES ... 25

4.6 ESTUDO DE DOCKING MOLECULAR USANDO O PROGRAMA GOLD 26 4.7 PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS (ADME) E TOXICOLÓGICAS.... 27

4.8 PREDIÇÃO DE ATIVIDADE... 28

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 29

5.1 PRODUTOS NATURAIS ENCONTRADOS NA LITERATURA... 29

5.2 REATIVIDADE QUÍMICA E ANÁLISE ESTATÍSTICA DE COMPOSTOS ESTUDADOS... 30

(14)

5.3 MAPAS DE POTENCIAL ELETROSTÁTICO MOLECULAR (MEP)... 36

5.4 SIMULAÇÃO DE DOCKING ... 39

5.5 PREDIÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS (ADME) E TOXICOLÓGICAS... 46

5.6 PREDIÇÃO DE ATIVIDADE: PASS e SEA... 49

5.6.1 PASS... 50

5.6.2 SEA... 51

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 54

(15)

1 INTRODUÇÃO

A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela morte neuronal na região da substância negra, a qual é responsável pela síntese do neurotransmissor dopamina (DA), considerando-se que esse neurotransmissor está associado com as atividades motoras e cognitivas. Por consequência da degradação de DA ocorre um distúrbio no controle dos movimentos devido à baixa concentração na fenda sináptica. A causa da degradação ainda não foi descoberta, porém surgiram duas hipóteses para explicar a fisiopatologia da DP, sendo uma relacionada com lesão cerebral causada pela excitotoxicidade que consiste em um aglomerado de substâncias, e outra é a produção de radicais livres pela ação da Monoamina Oxidase B (MAO-B) quando degrada a dopamina, acarretando no estresse oxidativo (ALMEIDA, 2013; FOLLMER et al., 2013).

A DP possui origem desconhecida dificultando, assim, encontrar a cura, mas possibilita a formulação de medicamentos para o tratamento com o objetivo de evitar os sintomas e prolongar a vida do indivíduo portador de DP. A população de risco se encontra na faixa etária de 65 anos, como a população mundial está envelhecendo, consequentemente aumentando o número de pessoas com alguma doença neurodegenerativa. O diagnóstico da DP é clínico e feito principalmente através da identificação dos quatro sinais cardinais: bradicinesia, tremor de repouso, instabilidade postural e rigidez.

O tratamento farmacológico para DP consiste basicamente no controle sintomático via restituição de DA, principalmente através da administração de seu precursor L-DOPA [ácido (S)-2-amino-3-(3,4-di-hidroxifenil propanoico)] ou através do uso de inibidores da enzima monoamina oxidase (IMAO), porém esses IMAO possuem uma série de efeitos colaterais indesejáveis no sistema nervoso central (insônia, irritabilidade, agitação, hipomania, supressão do sono movimento rápido dos olhos), bem como disfunções cardiovasculares (hipotensão ortostática) ou distúrbios sexuais (FOLLMER, 2013).

Em conjunto com a Química Computacional, a Modelagem Molecular ajuda a compreender os alvos mais atrativos na representatividade da gênese ou progressão do processo patológico. Através de técnicas de triagem virtual, o manejo de dados e mapeamento da estrutura 3D de alvos moleculares e ligantes pode ser feito com tempo e custos reduzidos em relação às técnicas convencionais para a identificação e otimização dos novos candidatos a fármacos, para posteriormente pressupor o mecanismo de interação entre a enzima e as moléculas estudadas através do docking molecular.

(16)

Uma vez que o tratamento de doenças neurodegenerativas é direcionado para a prevenção ou estabilização da progressão da doença, ou para tratamento dos sintomas primários (cognitivos) e secundários (psiquiátricos). Esse estudo aborda a comprovação teórica de produtos naturais isolados a partir de plantas pertencentes a flora brasileira para o tratamento da DP, com o objetivo de comparar os produtos naturais encontradas na literatura com a Selegilina, que é um dos fármacos da classe de IMAO, através de cálculos de descritores, docking molecular, predição de propriedades farmacocinéticas e toxicológicas e predição de atividade, para assim, determinar os produtos naturais com atividade inibitória de Monoamina oxidase B (MAO-B) como candidatos a fármacos para DP.

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Selecionar produtos naturais com grande afinidade e especificidade pelo sítio-alvo da enzima Monoamina Oxidase B e com maior atividade intrínseca, tornando-os candidatos a fármacos para o tratamento da doença de Parkinson.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Selecionar produtos naturais da flora brasileira descritos na literatura com atividade inibitória da enzima monoamina oxidase B;

b) Realizar a modelagem molecular para os produtos naturais selecionados anteriormente para obtenção dos descritores de relação quantitativa estrutura atividade (QSAR), mapas de potencial eletrostático e a matriz de correlação de Pearson.

c) Realizar o estudo de docking molecular para o medicamento referência e os produtos naturais selecionados com a enzima monoamina oxidase B.

d) Determinar as propriedades farmacocinéticas, toxicológicas e a predição da atividade biológica.

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3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 DOENÇA DE PARKINSON

Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa causada pela necrose dos neurônios dopaminérgicos localizados na substância negra, região do cérebro responsável pela síntese do neurotransmissor dopamina (DA). Essa degradação leva a uma diminuição da DA na fenda sináptica, consequentemente, ocorre um distúrbio no controle dos movimentos, tendo em vista que esse neurotransmissor está relacionado com funções motoras e cognitivas. Hoje, são estudadas as possíveis causas dessa neurodegeneração e chegou-se às seguintes hipóteses: uma relacionada com lesão cerebral devido à excitotoxicidade, em que há um acúmulo de glutamato na região onde se encontram os neurônios dopaminérgicos, e outra relacionada com o estresse oxidativo causada pela monoamina oxidase B (MAO-B) quando degrada a dopamina liberando radicais livres (CAMPOS et al., 2011; FOLLMER, 2013).

A MAO-B é uma das isoformas da enzima monoamina oxidase que participa do sistema adrenérgico sendo responsável pelo metabolismo de algumas catecolaminas com maior seletividade pela dopamina além de metabolizar a 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) que é uma neurotoxina relacionada com o aparecimento da síndrome parkinsoniana, na qual irá originar MPP+ que é a substância ativa da MPTP capaz de gerar lesões nos neurônios doparminégicos (SOUZA, 2011).

Braak e colaboradores (2003) são considerados revolucionários perante as descobertas e definições na DP. Com a pesquisa utilizando corpos de Lewy como marcador neuropatológico para a DP, o autor definiu seis estágios evolutivos demostrados no Quadro 1:

Quadro 1 - Estágios da DP segundo Braak e colaboradores (2003).

Estágio1 (inicial) Acometimento do núcleo motor dorsal dos nervos glossofaríngeo e vago, e a zona reticular intermediária e do núcleo olfatório anterior. Estágio 2 Comprometimento adicional dos núcleos da rafe, núcleo reticular

gigantocelular e do complexo lócus ceruleous.

Estágio 3 Comprometimento da substância negra do mesencéfalo.

Estágio 4 Comprometimento das regiões poresencefálicas, mesocortex temporal.

Estágio 5 Afeta as regiões de associação do neocrotex e o neocortex pré-frontal. Estágio 6 Afeta as regiões pré-motoras e motora primária são afetadas.

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Este estudo serve para melhor compreensão da fisiopatologia da DP, porém o diagnóstico da DP consiste na avaliação clínica, principalmente através da identificação dos quatro sinais cardinais: bradicinesia, tremor de repouso, instabilidade postural e rigidez. Baseado nesses quatro sinais cardinais, Hoehn e Yahr desenvolveram uma escala, demonstrada no Quadro 2, para avaliar a progressão da doença e assim escolher o tratamento correto para o paciente.

Quadro 2 - Estágio da Doença de Parkinson pela escala de Hoehn e Yahr.

Estágio 0 Nenhum sinal da doença

Estágio 1 Doença unilateral

Estágio 1,5 Envolvimento unilateral e axial

Estágio 2 Doença bilateral sem déficit de equilíbrio

Estágio 2,5 Doença bilateral leve, com recuperação no “teste do empurrão” Estágio 3 Doença bilateral leve a moderada; Alguma instabilidade postural

ou Capacidade de viver independente

Estágio 4 Incapacidade grave, ainda capaz de caminhar ou permanecer de pé sem ajuda

Estágio 5 Confinado à cama ou cadeira de rodas a não ser que receba ajuda Fonte: TIAGO et al., 2010.

3.2 EPIDEMIOLOGIA

Estudos em populações europeias apontam que a DP acomete 1,8% de indivíduos acima de 65 anos, podendo atingir 2,6% dos indivíduos acima de 85 anos. Alguns autores afirmam não existir diferença de prevalência entre os sexos, porém estudos em populações americanas apontam maior prevalência em homens brancos. (ALMEIDA, 2013).

Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a projeção da população do Brasil e das Unidades da Federação são de 207.059.323, sendo que grande parte dessa população são de pessoas acima dos 65 anos (IBGE, 2016), tendo em vista que a DP acomete os indivíduos dessa faixa etária, há previsão de aumento de novos casos consequentemente aumentando o número de pacientes e tratamentos para DP. Infelizmente, no Brasil não há dados do quantitativo percentual dos pacientes diagnosticados com a DP, porém supõe-se que houve aumento tendo em vista o aumento da qualidade de vida pelo fato das pessoas conseguirem alcançar a idade acima dos 65 anos.

(20)

3.3 TRATAMENTOS DISPONÍVEIS PARA DOENÇA DE PARKINSON

Segundo o Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para DP, Portaria SAS/MS nº 228, 10 de maio de 2010, o tratamento tende a reduzir o processo de evolução da doença, realizando a neuroproteção e o controle dos sintomas. A distinção do tipo de tratamento em neuroprotetor e sintomático depende do diagnóstico.

Para a neuroproteção, estudos relataram que a Selegilina e vitamina E obtiveram resultados significativos quanto ao início do uso de levodopa, ou seja, no estágio inicial da doença o paciente não necessitaria do uso de levodopa, porém estudos randomizados e controlados comprovou que esses medicamentos não obtiveram resultados definitivos para neuroproteção. Enquanto que IMAOs demonstraram resultados positivos, como melhora no desempenho motor do paciente, mas comparados com medicamentos de outra classe (entacapona), não mostraram diferença significativa (GOETZ et al., 2005; PICON et al., 2010).

Para o tratamento sintomático devem-se classificar os pacientes segundo o grau dos sintomas. No Protocolo é divido em sintomas leves sem prejuízo funcional tendo o tratamento com amantadina e anticolinérgicos, mas por apresentarem muitos efeitos adversos são substituídos por levodopa. Sintomas com prejuízo funcional, o tratamento também é com levodopa, porém seu uso prolongado e/ou com altas doses provocam flutuações motoras, sendo substituída por agonistas dopaminérgicos os quais são apomorfina, bromocriptina, entres outros, essa classe auxilia na prevenção de flutuações motoras. Pacientes com DP em uso de levodopa que não respondem mais ao tratamento são prescritos agonistas dopaminérgicos (bromocriptina, cabergolina e pramipexol) e inibidores da enzima Catecol O-metiltransferase (COMT) (tolcapona e entacapona) (GOETZ et al., 2005; PICON et al., 2010).

Com isso, os fármacos que atualmente são utilizados para o tratamento de Parkinson no Brasil são levodopa, bromocriptina, pramipexol, amantadina, biperideno, triexifenidil, selegilina, tolcapona e entacapona. A levodopa é o fármaco mais utilizado por ser a substância precursora da dopamina pela síntese dopaminérgica (GOETZ et al., 2005; PICON et al., 2010). No Quadro 3 são mostrados as classes de medicamentos e seus principais representantes utilizados no tratamento da DP.

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Quadro 3 - Classes de medicamentos utilizados para o tratamento da Doença de Parkinson.

Fonte: FERRAZ, 1999; BRAVO; NASSIF, 2006; SAITO, 2011;

CLASSE AÇÃO MEDICAMENTO

CONTRA-INDICAÇÕES EFEITOS ADVERSOS Agonistas doparminérgicos Aumento na síntese, liberação e inibição da recaptação da dopamina no striatum de pacientes parkinsonianos Amantadina Epilepsia, insuficiência cardíaca, confusão mental. Náuseas Tontura Insônia Depressão Irritabilidade Hipotensão Fibrose Insuficiência hepática Alterações psiquiátricas Sudorese Infecções Alterações no trato urinário Xerostomia Taquicardia Neoplasmas benignas Anorexia. Bromocriptina Gravidez, lactantes, hipersensibilidade a outros alcaloides, distúrbios psíquicos. Cabergolina Histórico de alterações cardíacas Apomorfina Anticolinérgicos centrais Bloqueia a transmissão colinérgica e diminui o nível de acetilcolina cerebral restaurando-se o equilíbrio com a dopamina.

Biperideno Glaucoma e alterações no aparelho digestório.

Triexifenidil Glaucoma e gravidez.

Inibidores da MAO-B Inibição seletiva e irreversível da enzima monoamina oxidase B. Selegilina Movimentos involuntários e anormais,

psicose grave, úlcera hepática, tremos, gravidez e lactação.

Rasagilina

Uso com outros IMAOs, ciclobenzoprim, Hypericum perforatum, analgésicos narcóticos, insuficiência hepática e anestesia geral. Inibidores da COMT. Inibidores seletivos da enzima catecol- O-metil-transferase tolcapone Distúrbios hepáticos, síndrome neurolépticos, hipertemia, IMAOs não

seletivos.

entacapone

Distúrbios hepáticos, alterações cardíacas, síndrome neurolépticos,

uso com entacapona e IMAOs não seletivos.

Precursor da dopamina Ao contrário da DA, a levodopa atravessa a barreira hematoencefálica, depois é convertida pela enzima L-aminoácido aromático descarboxilase Levodopa

IMAOs não seletivos, problemas nas glâdulas

endócrinas, glaucoma, doenças psiquiátricas

grave, gravidez e lactação.

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3.4 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE PARKINSON

Atualmente, os pesquisadores estão baseando-se em substância naturais para planejar um fármaco, tendo em vista que os sintéticos possuem muitos efeitos colaterais dificultando a aderência dos pacientes ao tratamento. Por outro lado, os medicamentos derivados de plantas medicinais são bem aceitos pela população, além de valorizar as plantas nativas, endêmicas e de ocorrência no território em que são estudadas. E para a DP, os estudos são voltados para plantas que apresentam atividade biológica antiparkinsoniana podendo ser antioxidante e/ou neuroprotetora, tendo em vista que os produtos naturais são mais seguros e eficazes (KOPPULA et al., 2012).

Dentre elas, encontraram-se plantas presentes na flora brasileira que estão descritas no Quadro 4. No geral, os estudos realizados com essas plantas foram em testes com camundongos com a DP induzida em que apresentou atividade inibitória de MAO-B e na MPP+, sendo utilizado o extrato em que se percebeu também uma diminuição significativa das lesões causadas pelo estresse oxidativo (CANUTO; SILVEIRA, 2006; ALMEIDA, 2010; CAMPOS et al., 2011).

No Quadro 4 são mostradas outras plantas estudadas e algumas já utilizadas para o tratamento de DP pelo mundo. Estas apresentaram atividades como estimulantes do SNC e adaptógenos que são substâncias inespecíficas capazes de gerar um alto estado de resistência protegendo o organismo de agentes oxidantes e de morte celular induzida por 6-OHDA e MPP+. Outras plantas apresentaram também ação na geração de radicais livres, diminuindo os níveis de superóxido mitocondrial (KOPPULA et al., 2012).

Com isso, pode-se perceber que vários estudos estão se dirigindo para a descoberta de plantas medicinais com propriedades antioxidantes, mais precisamente com atividade em MPP+ no tratamento de DP. Porém, como demonstrado nos estudos, essas atividades biológicas são para tratamento sintomático e precisam de outro medicamento para auxiliar no tratamento. Portanto, a busca por novos inibidores naturais de MAO-B é essencial para o tratamento da DP.

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Quadro 4 - Plantas encontradas na flora brasileira que apresentam atividade.

Fonte: Elaborada pela própria autora.

NOME CIENTÍFICO

NOME

POPULAR ÁREA DE OCORRÊNCIA REFERÊNCIA

Amburana cearensis Cumaru

Toda América do Sul, principalmente Nordeste

brasileiro.

ALMEIDA, 2010

Melissa officinalis Erva-cidreira Região mediterrânea e no continente americano

AOYAMA, et al, 2011.

Passiflora incarnata Maracujá Por todo o Brasil, KILLIP, 1938

Paulina cupana Guaraná Nativa do Brasil, Amazônia. SOMNER, et al, 2015.

Valleriana officinalis Valeriana

Norte (Amazonas, Pará) Nordeste (Bahia, Maranhão)

Sudeste (Espírito Santo,

Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo)

Sul (Paraná, Rio Grande do

Sul, Santa Catarina)

SOBRAL, 2015

Croton celtidifolius Pau-de-sangue

Sudeste (Espírito Santo,

Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo)

Sul (Paraná, Rio Grande do

Sul, Santa Catarina)

CORDEIRO et al., 2015

Ginkgo biloba Ginkgo biloba nativa da China, Coreia e

Japão FILHO, et al., 2010

Chrysanthemum indicum Crisantêmo Continente Asiático, principalmente Chile e Coréia . KOPPULA et al., 2012

Gastrodia elata Tian Ma Nepal, Butão, Índia, Japão, Coréia, Sibéria e Taiwan

KOPPULA et al., 2012

Polygala tenuifolia Yuan Zhi Continente Asiático, principalmente China.

KOPPULA et al., 2012

Bacopa monnieri Água hissopo

Índia, Nepal, Sri Lanka, China, Taiwan, Vietnã, bem

como na Flórida, no Havaí

SOUZA e HASSEMER, 2015

Hyoscyamus niger

Meimendro-negro Distribuída na Europa e Ásia.

KOPPULA et al., 2012

Hibiscus asper Hibiscus Distribuído na África e

Madagascar.

KOPPULA et al., 2012

(24)

3.5 A MODELAGEM MOLECULAR NO PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS

O planejamento racional de novos candidatos a fármaco envolve vários fatores para que se obtenha uma molécula com eficácia e segurança. Dos fatores relacionados ao planejamento têm-se as propriedades farmacocinéticas e toxicológicas juntamente com a biodisponibilidade em que são estudados in vitro através de cultura de células ou in vivo com modelos animais (ratos ou camundongos), portanto, para cada molécula planejada faz-se esses estudos e isso é a causa do alto custo e maior tempo para os resultados da pesquisa, tanto para as Universidades quanto para a indústria farmacêutica (ANDRADE; TROSSINI; FERREIRA, 2010).

Uma das estratégias utilizadas no planejamento racional basear-se na interdisciplinaridade da Química Orgânica, Farmacologia, Química Computacional, que usadas dessa forma surge uma nova ciência chamada Química Medicinal. Essa ciência estuda diretamente as relações entre estrutura e atividade, as modificações moleculares para melhorar a atividade ou dar uma nova atividade biológica, e os ensaios para obter como produto final um fármaco. A metodologia mais utilizada na Química Medicinal é a abordagem fisiologia, em que baseia-se no conhecimento prévio da fisiopatologia da doença a ser estudada, posteriormente faz-se a escolha do alvo terapêutico podendo ser uma enzima ou um receptor, e desse modo estudar a relação das estruturas moleculares que estão relacionadas com esse alvo para propor modificações nas estruturas com o objetivo de melhora-las ou mudar sua atividade, como por exemplo de agonista para antagonista, aplicando as técnicas de Modelagem Molecular para realizar essas modificações e definir os diferentes tipos de interações envolvidas. Porém, para as outras etapas do planejamento de fármaco é necessário o estudo da Tecnologia Farmacêutica onde irão ser empregados os conhecimentos farmacotécnicos para elaboração do medicamento (BARREIRO, 2002).

Para diminuir o tempo e os custos das pesquisas adicionou-se nas etapas o estudo in

silico, que consiste na utilização de softwares e com o avanço da tecnologia foram

desenvolvidos computadores de alto nível capazes de realizar os cálculos das propriedades físico-químicas, predições farmacocinéticas e toxicológicas, simulações de interação entre ligante e alvo, além de predição de atividade biológica baseada na similaridade química. Dessa forma, o estudo in silico possibilita a obtenção de moléculas promissoras para continuar nas etapas in vitro ou in vivo (LIMA, 2007).

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4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 BUSCA PELAS ESTRUTURAS DOS PRODUTOSNATURAIS

Para propor novos candidatos a fármaco com atividade biológica de inibição da enzima monoamina oxidase B (MAO-B) para o tratamento da DP, primeiramente, será feita uma busca em banco de dados online das moléculas naturais que são descritas literatura como inibidores naturais de MAO-B.

4.2 MAPAS DE POTENCIAL ELETROSTÁTICO MOLECULAR (MEP)

Um importante conceito explorado neste estudo é a correlação da atividade da estrutura dos inibidores estudados através das características do mapa de potencial eletrostático. O MEP permite a utilização de uma análise qualitativa para localizar sítios reativos numa molécula, e determinar os papéis desempenhados por ambos os efeitos eletrônicos e estéricos (tamanho/forma) sobre a sua potência. É de fundamental importância que a visualização do MEP forneça informações qualitativas sobre as moléculas, tais como o comportamento da interação entre um ligante e o receptor (PLUKIGER, 2001).

O MEP num dado ponto (x, y, z) na vizinhança de uma molécula é definida em termos da energia de interação entre a carga elétrica gerada a partir dos elétrons das moléculas, núcleos e uma carga de teste positivo (um prótons) situado em r. Para os compostos estudados, os valores V(r) foram calculadas pela equação abaixo, como descrita por Politzer e Murray (2002):

onde ZA é a carga do núcleo A, localizada em RA, p(r/) é a função da densidade eletrônica da molécula, e r/ é variável de integração simulado (PLUKIGER, 2001).

Os MEPs foram gerados a partir da carga atômica no nível TFD B3LYP/6-31G** calculada no programa Gaussian 03 (FRISCH et al., 2003), e os resultados foram visualizados com o auxílio do programa Molekel (PLUKIGER, 2001).

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4.3 DESCRITORES DE REATIVIDADE GLOBAL

Nesse estudo, foram calculados, com o auxílio do programa GaussView 5.0 (DENNINGTON et al., 2009), usando o conjunto de base B3LYP/6-31G** implementado com o programa Gaussian 03 (FRISCH et al., 2003 ) e o método Teoria do Funcional da Densidade (TFD), 11 descritores de reatividade: energia total (ET), eletronegatividade de Mulliken (χ), dureza molecular (η), moleza molecular (1/η), potencial químico (µ), índice eletrofilicidade global (ω), Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia (HOMO), um nível abaixo do Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia (HOMO-1), Energia do Orbital Molecular Desocupado de Menor Energia (LUMO), um nível acima Orbital Molecular Desocupado de Menor Energia (LUMO +1), diferença de energia entre HOMO e LUMO (GAP = HOMO-LUMO) estes descritores são indicadores de estabilidade e reatividade química (CHATTARAJ, 2007; PADMANABHAN, 2007).

4.4 DESCRITORES DE RELAÇÃO QUANTITATIVA ENTRE ESTRUTURA E ATIVIDADE (QSAR)

Os seguintes descritores QSAR para os inibidores e os compostos naturais relatados da literatura foram calculados: a área de superfície total (AST), volume molecular (VM), refratividade molecular (RM), polarizabilidade molecular (PM), coeficiente de lipofilicidade (logP), massa molecular (MM) e energia de hidratação (EH) de acordo com o programa

HyperChem 6.02 (CHEMPLUS, 2000). Os descritores moleculares selecionados foram

fornecer informações valiosas sobre a influência eletrônica, estérica, hidrofílica e hidrofóbica nos inibidores selecionados.

4.5 CONSTRUÇÃO DA MATRIZ DE DADOS E SELEÇÃO DE PROPRIEDADES MOLECULARES

Com a determinação de todos os descritores moleculares, foi possível construir a matriz de dados. Antes de iniciar a análise foi necessário fazer a padronização da matriz de dados X=(n, m) contendo os inibidores nas linhas (em nosso estudo os compostos estudados) e os descritores calculados nas colunas, onde n é o número de compostos estudados e m é o número de variáveis. O objetivo da padronização é dar a cada variável um peso igual em termos matemáticos, cada variável foi centrada na média e escalada para a variância unitária.

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A seleção das variáveis foi iniciada com a análise da matriz de correlação de Pearson (SANTOS et al., 2014) entre as variáveis e a atividade biológica, os descritores que tiverem pequena ou nenhuma correlação (menor do que 0,20, valor de correlação de corte) serão descartadas. As análises de correlação de Pearson foram realizadas com os softwares Pirouette 3.01 (PIROUETTE, 2001) e Statistica 6.1 (STATISTICA, 2004). O objetivo final da análise foi avaliar os descritores que melhor se correlacionam com a atividade biológica para propor os novos candidatos a fármacos para tratamento de DP.

4.6 ESTUDO DE DOCKING MOLECULAR USANDO O PROGRAMA GOLD

O docking molecular é um método computacional intensivo e proeminente no processo de descobrimento de fármaco. O benefício do docking é identificar o modo de ligação dos ligantes no sítio de ligação da enzima ou receptor através de interações-chave específicas e de predizer a afinidade de ligação entre os complexos proteína-ligante (GUPTA et al., 2014).

O programa GOLD (do inglês, “Genetic Optimisation for Ligand Docking”) utiliza o algoritmo genético (GA) para fins de experimentos de docking flexível de ligantes dentro de sítios de ligação de proteínas. Uma população de soluções potenciais (isto é, possíveis orientações de ancoragem dos ligantes) está configurada de forma aleatória (VERDONK et al., 2003). Cada membro da população é codificado como um cromossomo que contém as informações sobre o mapeamento de ligações de hidrogênio de átomos do ligante para (complementares) ligações de hidrogênio de átomos da proteína, mapeamento de pontos hidrofóbicos no ligante para pontos hidrofóbicos na proteína e a conformação em torno das ligações flexíveis do ligante e grupos hidroxílicos da proteína. Para predizer como uma molécula pequena irá ligar-se a uma proteína é difícil e nenhum programa pode garantir sucesso. A próxima etapa a ser realizada é medir a maior precisão possível da confiabilidade do programa, isto é, a chance de que ele vai fazer uma boa predição em uma determinada instância. Por esse motivo, o GOLD tem sido testado com um grande número de complexos extraídos do PDB. A conclusão geral desses testes foi que as soluções melhor classificadas pelo GOLD estavam corretas em 70-80% dos casos (VERDONK et al., 2003).

Dada à estrutura cristalográfica do alvo, o docking molecular automaticamente apresenta amostras das conformações dos ligantes com uma região específica de ligação do receptor. Tem sido usado de maneira bem-sucedida para identificar substâncias ativas filtrando aqueles que não se encaixam no sítio ativo. O sítio de ligação das enzimas estudadas humana foi definido com todos os resíduos dentro de uma esfera de 10 Å de raio localizado ao centro do sítio ativo. Para a

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etapa inicial dos experimentos de docking alguns parâmetros do GA foram aplicados para buscar os modos de ligação dos produtos naturais selecionados mantendo-os rígidos, já que haverá a necessidade de preservar a pose (conformação + orientação bioativa) similar do inibidor complexado originalmente utilizando como molécula de referência. Dez soluções de docking foram calculadas para cada produto natural selecionado e o GoldScore foi analisado. Além disso, a função de score de energia foi utilizada para avaliar a energia livre de ligação das interações entre o receptor e os ligantes. A análise visual das poses também foi levada em conta a escolha da melhor energia livre (∆G) (VERDONK et al., 2003; GUPTA et al., 2014).

Uma busca de máxima eficiência foi realizada (autoconfiguração de 100% de eficiência). Os melhores produtos naturais selecionados nesta etapa foram classificados de acordo com a função de pontuação PLPFitness que avaliou os modos de ligação dessas substâncias ao sítio de ligação. Uma inspeção visual foi realizada para a seleção das melhores poses dos produtos naturais selecionados que revelaram interações com os resíduos de aminoácidos do sítio ativo da enzima estudada.

4.7 PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS (ADME) E TOXICOLÓGICAS

O organismo do ser humano consiste em componentes como transportadores, canais, receptores e enzimas no qual está relacionado a absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADME/Tox) de uma molécula a ser administratada em um indivíduo. Utilizando o PreADMET (VYAS et al., 2008) é possível determinar as propriedades farmacocinéticas da estrutura, através da predição ADME, onde prevê a absorção intestinal humana (AIH),permeabilidade celular em células Caco-2 e MDCK, permeabilidade na barreira hematoencefálica (BHE), ligações às proteínas plasmáticas (LPP). Yamashita (2000), afirma que estas células têm sido recomendadas como modelo in vitro de confiança para a predição de absorção oral da droga candidata. Além disso, pode prever as propriedades toxicológicas que os compostos podem causar, tais como mutagenicidade e carcinogenicidade.

As propriedades farmacocinéticas e toxicológicas foram calculadas para todos os compostos naturais selecionados da literatura.

4.8 PREDIÇÃO DE ATIVIDADE

Com o estudo in silico pode-se prever, também, a atividade biológica de moléculas utilizando programas computacionais online livre. Dentre os programas existentes, os mais

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utilizados são o PASS (http://www.akosgmbh.de/pass/index.html), o qual prediz com alta acurácia (70- 80%) até 2000 atividades biológicas para compostos químicos, e o SEA (http://sea.bkslab.org/) que utiliza a abordagem de conjunto de semelhança das moléculas relacionada às proteínas com base na similaridade química estabelecida entre seus ligantes, através da busca em grandes bancos de dados de compostos e criar mapas de similaridade de destino cruzado.

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5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 PRODUTOS NATURAIS ENCONTRADOS NA LITERATURA

Na Figura 1, observam-se as moléculas descritas na literatura e utilizadas nesse estudo: Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5), que foram desenhadas no programa ChemSketch 12.0 (LEAL et al., 2005; ALMEIDA, 2010; CAMPOS et al., 2011; FOLLMER et al., 2013;ACD, 2014; INGAL; SANJAY, 2014).

Figura 1 - Estrutura química das moléculas estudadas, Selegilina (1), Amburosideo A (2),

Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5).

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Como medicamento padrão, foi selecionada a Selegilina, por ser o fármaco pertencente a classe dos inibidores da MAO-B que é mais utilizado na terapia da PD. Esse fármaco é um inibidor irreversível que em altas doses apresenta atividade antidepressiva, tem ação neuroprotetora frente ao MPTP e seus efeitos simpatomiméticos estão relacionados a metabólitos de metanfetamina, porém devido aos seus efeitos adversos os pacientes abandonam o tratamento (FOLLMER et al., 2013).

Das várias plantas relatadas na literatura, encontraram-se somente duas plantas,

Amburana cearensis e Passiflora incarnata, que possuem estudos experimentais, para

avaliação de atividade neuroprotetora em modelos de DP induzida e crescem na flora brasileira, porém o mecanismo de ação dos produtos naturais não foi elucidado.

A. cearensis (sin. Torresea cearensis) é uma planta pertencente à família

Leguminosea, popularmente conhecida por diversas designações, como imburana de cheiro, cerejeira e cumaru (CANUTO; SILVEIRA, 2006).Os glicosídeos fenólicos encontrados na A.

cearensis, Amburosideo A e B tiveram sua atividade biológica avaliada em culturas de células

expostas à neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA), um derivado hidroxilado da dopamina que possivelmente é formado endogenamente em pacientes com a DP, porém, somente o amburosideo A apresentou neuroproteção (LEAL et al., 2005; ALMEIDA, 2010).

P. incarnata conhecida popularmente como maracujá, palavra de origem indígena

(tupi),é uma planta uma herbácea, trepadeira, oriunda do norte da América do Sul. Os principais constituintes das folhas de P. incarnata são flavonoides (0,25%), tais como vitexina, isovitexina, orientin, isoorientin, apigenina e kampferol. Alcaloides com base em viz sistema anel ß-carbolina, harman, harmina, harmalina e harmalol são referidos como sendo compostos anti-Parkinson eficazes (INGALE; SANJAY, 2014). Outros estudos com a P. incarnata, com o extrato aquoso das folhas secas, avaliaram-se os efeitos do extrato em

animais que foram induzidos experimentalmente por neurolépticos para desenvolverem a catalepsia de PD, pois este é um modelo animal usado para o rastreio de fármacos (ALMEIDA, 2010; CAMPOS et al., 2011).

5.2 REATIVIDADE QUÍMICA E ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS COMPOSTOS ESTUDADOS

O estudo da correlação dos descritos, geralmente, é feito para identificar a sua relação com a atividade do composto estudado correlacionando-os com IC50 que é a concentração inibitória de 50% de viabilidade celular. Porém, os produtos naturais encontrados na literatura

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não apresentaram IC50, portanto o estudos da correlação nesse trabalho teve como objetivo selecionar os descritores que apresentaram correlação com a estabilidade molecular através das constantes Energia Total e Energia de Hidratação.

Na Tabela 1 mostra os resultados das moléculas Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5) para os descritores EHOMO, EHOMO−1, ELUMO,

ELUMO+1, Gap em nível B3LYP/6-31G** (POLITZER, 2002) e a matriz da Correlação de

Pearson em função da ET no qual 1 representa uma correlação absoluta positiva, 0 para nenhuma correlação, e -1 para um total correlação negativa (SANTOS et al., 2014).

Tabela 1 - Cálculo do EHOMO, EHOMO−1, ELUMO, ELUMO+1 e gap para as moléculas Selegilina

(1), Amburosideo A (2), Harmam (3), Harmalina (4) e Harmalol (5) em nível B3LYP/6-31G**

e a matriz de correlação de Pearson. Moléculas EHOMO (eV) EHOMO–1 (eV) ELUMO (eV) ELUMO+1 (eV) Gap (eV) Energia Total (e.V) 1 -8,552 -8,809 4,126 4,190 -12,678 -556,5567 2 -5,744 -6,416 -0,674 -0,592 -0,369 -152,757 3 -7,727 -8,233 2,632 4,027 -10,359 -569,151 4 -7,204 -8,283 2,764 4,566 -9,968 -645,160 5 -7,749 -8,714 3,954 4,685 -11,702 -646,313 EHOMO 1.000 0.947 -0,949 -0,854 0,956 0,799 EHOMO - 1 1.000 -0,996 -0,965 0,997 0,939 ELUMO 1,000 0,9401 -0,9867 -0,910 ELUMO + 1 1,000 -0,968 -0,995 gap 1,000 0,939 ET 1,000

Fonte:Elaborada pela autora, 2017.

Na Figura 2, são mostradas as imagens de Energia do orbital HOMO que é a propriedade que informa os valores relacionados à afinidade de elétrons das moléculas estudadas, caracterizada pela capacidade de realizar ataques de nucleófilos (SOLOMONS, 2012; HAGE-MELIM et al., 2014), como mostrado na Tabela 1, para HOMO os valores variaram de -8,55 eV a -5,744 eV, menor e maior para as moléculas Selegilina e Amburosideo A, respectivamente. Tendo a molécula Harmalol o valor de -7,749 eV sendo mais próximo da

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molécula padrão Selegilina. Para HOMO-1, os valores variaram de -8,809 eV e -6,416 eV, menor e maior para as moléculas Selegilina e Amburosideo A, respectivamente, tendo como valor mais próximo da molécula padrão o Harmalol com o valor de -8,714 eV.

O valor de correlação de Pearson para o HOMO com a energia total foi 0,799 eV demonstrando que há uma correlação positiva e para HOMO-1 0,939eV a correlação foi positiva.

Figura 2 - Representação dos orbitais HOMO nas moléculas Selegilina (1), Amburosideo A

(2), Harmam (3), Harmalina (4), Harmalol (5).

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Na Figura 3, apresentam-se as imagens de energia do orbital LUMO que é a propriedade que informa os valores relacionados à afinidade de elétrons das moléculas estudadas, caracterizada pela susceptibilidade do composto em relação aos ataques de nucleófilos, o mesmo conceito serve para os outros orbitais de LUMO, por exemplo LUMO+1 (SOLOMONS, 2012; HAGE-MELIM et al., 2014), como mostrado na Tabela 1, para LUMO os valores variaram de -0,674 eV e -4,126 eV, menor e maior valor para as moléculas Amburosideo A e Selegilina, respectivamente. Tendo a molécula Harmalol o valor 3,954 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina. Para LUMO+1, os valores variaram de -0,592 eV e 4,685 eV, menor e maior para as moléculas Amburosideo A e Harmalol respectivamente, tendo como valor mais próximo da molécula padrão a Harman com o valor de 4,027 eV. Na Tabela 1 encontra-se o valor de correlação de Pearson para o LUMO com a energia total foi -0,997 eV demonstrando que há uma correlação negativa e de LUMO+1 -0.995 demonstrando correlação negativa.

A diferença entre essas energias de orbitais HOMO-LUMO identificados como GAP, é um indicador importante de estabilidade molecular e reatividade química. Quanto mais baixos os valores de GAP mais reativas serão as moléculas, enquanto que os valores mais altos indicam uma elevada estabilidade molecular (SILVA et al., 2010), como mostrado na Tabela 1, para GAP os valores variaram de -12,678 eV e -0,369 eV menor e maior para as moléculas Selegilina e Amburosideo A, respectivamente. Tendo a molécula Harmalol com -11,702 eV sendo o valor mais próximo da molécula padrão Selegilina. O valor de correlação de Pearson para o GAP com a energia total foi 0,9387 eV demonstrando que há uma correlação positiva sendo esta a melhor correlação da matriz.

A energia total (ET) é a propriedade que correlaciona a estrutura com a reatividade química, correspondente a soma da energia de repulsão nuclear e a energia eletrônica, em que esta última determina a posição fixa dos núcleos da molécula para assim estimar sua estabilidade (SOLDI, 2011), como mostrado na Tabela 1, para ET os valores variaram de -646,313 eV e -152,757 eV, menor e maior para as moléculas Harmalol e Amburosideo A, respectivamente. Tendo a molécula Harman o valor -569,151 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina.

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Figura 3 - Representação dos orbitais LUMO para as moléculas Selegilina (1), Amburosideo

A (2), Harmam (3), Harmalina (4), Harmalol (5).

Fonte: Elaborada pela autora, 2017.

A Tabela 2 mostra os resultados das moléculas Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5) em nível B3LYP/6-31G**e a matriz de correlação de Pearson com a EH, com o valor mínimo de -0,9738.

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Tabela 2 - Descritores moleculares da reatividade química e estabilidade molecular de

Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5) e a matriz de correlação de Pearson

Moléculas Χ (eV) µ (eV) η (eV) 1/η (eV) EH(Kcal/mol)

1 0,082 -0,082 0,234 4,277 -0,25 2 0,004 -0,004 0,007 147,601 -33,35 3 0,094 -0,094 0,191 5,254 -4,91 4 0,082 -0,082 0,183 5,460 -6,27 5 0,070 -0,070 0,215 4,651 -8,73 χ 1,000 0,999 -0,925 -0,971 0,968 µ 1,000 -0,925 -0,986 0,968 η 1,000 0,914 -0,974 1/η 1,000 -0,972 EH 1,000

Fonte: Elaborada pela autora, 2017.

A eletronegatividade (χ) é a propriedade do átomo que mede sua força de atrair elétrons para si, em que o mesmo faz uma ligação com outro átomo. Esta propriedade pode ser utilizada para estimar a capacidade de uma molécula para atrair elétrons para outra, quando existe uma interação entre estas duas moléculas (CUNHA et al., 2015), como mostrado na Tabela 2, para χ os valores variaram de 0,004 eV a 0,094 eV para as moléculas Amburosideo A e Harman, respectivamente. Tendo a molécula Harmalina o valor 0,082 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina. O valor de correlação de Pearson para eletronegatividade com a EH foi 0,994 eV demonstrando que há uma correlação positiva.

O potencial químico (µ) é a propriedade relacionada com o aumento da energia livre de Gibbs proveniente da adição de um número infinitesimal de moles de um componente da mistura de substância adicionada por mole, em condições de T, P, o número de moles de outros componentes constantes. Essa propriedade pode ser expressa como uma função de outras funções termodinâmicas (E, H, A, S), uma vez que os parâmetros são alterados (CUNHA et al., 2015) como mostrado na Tabela 2, os valores variaram de 0.094 eV a -0,004eV menor e maior para as moléculas Harman e Amburosideo A, respectivamente. Tendo a molécula Harmalina o valor -0,082 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina.

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O valor de correlação de Pearson para potencial químico com a EH foi 0,989 eV demonstrando que há uma correlação positiva.

O conceito de dureza (η) e moleza (1/η) química molecular foi formulado de acordo com o conceito de ácidos e bases de Lewis. As moléculas que possuem um elevado potencial de ionização e alta eletronegatividade têm alta dureza. Portanto, se pode dizer que a dureza representa a resistência de uma molécula à deformação, e moleza representa a facilidade com que uma molécula é deformada (CUNHA et al., 2015). Como mostrado na Tabela 2, para dureza os valores variaram de 0,007 eV a 0,234 eV, menor e maior valor para as moléculas Amburosideo A e Selegilina, respectivamente, tendo a molécula Harmalol o valor 0,215 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina. Para moleza, os valores variaram de 4,277 eV a 147,601 eV, menor e maior para as moléculas Selegilina e Amburosideo A, respectivamente, tendo a molécula Harmalol o valor 4,651 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina. Os valores de correlação de Pearson com EH para a dureza foi -0,974 eV e para moleza -0,960 eV demonstrando que ambos possuem uma relação negativa.

A EH está relacionada à estabilidade de diferentes conformações moleculares em solução aquosa fornecendo informações a respeito do tipo de interação que pode ocorrer entre os compostos e seu respectivo receptor biológico e indica também a separação entre os compostos ativos e inativos (CUNHA et al., 2015), como mostrado na Tabela 2, os valores variaram de -33,35 eV e -0,25 eV, menor e maior para as moléculas Amburosideo A e Selegilina, respectivamente. Tendo a molécula Harman o valor 4,91 eV sendo mais próximo da molécula padrão Selegilina.

5.3 MAPAS DE POTENCIAL ELETROSTÁTICO MOLECULAR (MEP)

A visualização dos mapas de MEP é mostrada na Figura 4, para os compostos investigados. As regiões realçadas de vermelho representam regiões negativas que a molécula tem uma maior probabilidade de fazer ataque nucleofílico, e regiões azuladas são positivos, a evidência das regiões onde há maior probabilidade de o composto sofrer ataque nucleofílico (SOLOMONS, 2012; CUNHA et al., 2015). Para identificar as principais características relacionadas às regiões doadoras e aceptoras de elétrons de Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5) foram realizadas avaliações qualitativas resultando na região dos grupos amina e éster destacados por coloração vermelha no MEP como doador de elétrons, enquanto as regiões amida e hidroxila são destacadas por azul no MEP como aceptor de elétrons.

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Verificou-se que o potencial eletrostático molecular negativo é distribuído nos átomos de nitrogênio presente no grupo amina terciária (-C=N-C) e na carbonila (C = O). O potencial eletrostático positivo nos compostos investigados foi distribuído uniformemente ao longo dos anéis aromáticos, sendo mais evidente no grupo amina secundária (-C-NH-C). Os valores menor e maior do potencial eletrostático positivo foram 0.03563 ua e 0.08419 ua, para as moléculas Selegilina e Amburosideo A, respectivamente. Enquanto que a molécula com o valor mais próximo da molécula padrão Selegilina foi a Harmalina com o valor de 0.06920. Os valores próximos e distantes correspondentes ao potencial eletrostático negativo foram de -0.08505 ua e -0.03589 ua, para as moléculas Amburosideo e Selegilina, respectivamente. Enquanto que a molécula Harmalol com o valor de -0.07597au possui maior semelhança com a molécula padrão Selegilina.

A região de potencial eletrostático é negativo devido aos átomos de nitrogênio presentes nos grupos aminas e dos átomos de oxigênio na carbonila, que é a característica mais notável de MEP. A distribuição da densidade dos elétrons em torno destes grupos funcionais pode ser responsável pela atividade dos compostos. A presença de uma superfície negativa perto dos átomos de nitrogênio presentes nos grupos aminas e dos átomos de oxigênio na carbonila sugere que estes compostos têm um local reativo para ataque eletrofílico. Assim, no caso de um ataque eletrofílico contra uma zona eletronegativa, há uma preferência para que possa ocorrer através destas regiões (SOLOMONS, 2012; CUNHA et al., 2015).

Através da análise de mapas de MEP (Figura 4), a seleção de moléculas inativas pode ser evitada. Para a molécula Selegilina destacam-se as regiões de vermelho (potencial eletrostático molecular negativo) no anel aromático e no carbono da tripla ligação, possuindo 2 regiões, indicando que essas regiões são propícias à ataque nucleofílicos, e as regiões em azul (potencial eletrostático molecular positivo) nos hidrogênios possuindo 5 regiões, no total de 7 regiões, indicam que são protegidas de ataques nucleofílicos. Com isso, verificou-se que, nos quatro produtos naturais, o potencial eletrostático molecular negativo é distribuído nas duplas ligações, especificamente nos átomos eletronegativos (oxigênio e nitrogênio), e o potencial eletrostático molecular positivo encontra-se nos hidrogênios ligados a átomos doadores de hidrogênio, podendo liberar esse hidrogênio para uma possível interação. Para as moléculas 2, 4 e 5 obtiveram-se duas regiões vermelhas e três regiões azuis, com cinco regiões no total. Para a molécula 3 obteve-se uma região vermelha e duas regiões azuis, com três regiões no total. Com tudo, pôde-se dizer que o MEP das moléculas naturais possui semelhanças com o MEP da molécula padrão Selegilina.

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Figura 4 - Mapas de potencial eletrostático molecular dos compostos naturais Selegilina (1),

Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5).

Fonte: Elaborada pela autora, 2017.

1

3

4 5

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5.4 SIMULAÇÃO DE DOCKING

Para o estudo da simulação do docking considerou-se como ligante o medicamento padrão Selegilina (1) e os produtos naturais Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4), Harmalol (5) e como enzima a MAO-B. Para isso, primeiramente, foi feita a seleção a partir do banco de dados Protein Data Bank (PDB) da estrutura cristalográfica da MAO-B depositada na forma de complexo sob o código 4A79, com a resolução de 1,89 Å. O programa utilizado foi o GOLD que utiliza o algoritmo genético para fins de experimentos de docking flexível de ligantes dentro de sítios de ligação de proteínas (VERDONK et al., 2003). E este será utilizado para identificar o sítio de ligação da MAO- B para que seja feita a simulação da interação entre os ligantes e a enzima.

A validação do programa para simulação do docking consiste na replicação do resultado experimental das posições dos átomos do ligante em relação ao sítio ativo da enzima, adquirido do complexo cristalográfico, e através do programa GOLD 5.4 foram realizados vários testes de acoplamentos na tentativa de obter as mesmas posições dos átomos do resultado experimental. O método mais utilizado para analisar se o programa conseguiu repetir o resultado experimental é o cálculo do Desvio Quadrático Médio (RMSD) na qual estudos anteriores mostraram que resultados menores de 2Å possuem alta taxa de sucesso para a replicação do resultado experimental (COLE et al., 2005). Por meio do programa Discovery Studio Vizualizer (ACCELRYS, 2007) foi possível visualizar o teste com o menor RMSD de 1,381 Å comparado com a posição do ligante oriundo do resultado experimental do complexo 4A79, mostrado na Figura 5.

Figura 5 - Resultado da simulação de docking com o menor RMSD para a validação do

complexo 4A79.

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As interações hidrofóbicas ocorrem entre regiões apolares como anéis aromáticos e metilas. As ligações de hidrogênio convencionais são caracterizadas quando uma molécula aceptora de próton interage com uma molécula doadora de próton devido à diferença de eletronegatividade. Este tipo de acoplamento ocorre entre átomos eletronegativos tais como flúor, oxigênio e cloro (PICANÇO et al., 2015). As ligações de ponte de hidrogênio com a distância abaixo ou igual a 3 Å são relevantes para afirmar que há interação, enquanto que as ligações hidrofóbicas possuem distância abaixo ou igual a 5 Å para que haja interação entre os aminoácidos e a molécula ligante (RODRIGUES, 2000)

A Figura 6 mostra as possíveis interações entre os aminoácidos do sítio ativo que foram selecionados conforme descrito na literatura: TYR398, TYR435, PHE343, LEU171, TYR326, ILE316, PRO104, PRO104, ILE199, LEU171, CYS172, TRP119 (BRIDA et al., 2012) e o medicamento padrão Selegilina juntamente com os produtos naturais estudados. As análises demonstraram que as possíveis ligações foram na maioria interações de ponte de hidrogênio e hidrofóbicas, as 5 moléculas tiveram apenas um aminoácido em comum CYS172, porém todas as moléculas tiveram interação com mais de 3 aminoácidos entre os 12 do sítio ativo.

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Figura 6 – Representação da simulação de docking molecular dos aminoácidos do sítio ativo

da MAO-B e as moléculas estudadas: Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5).

Fonte: Elaborada pela autora, 2017.

1

5 4

2

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Na Tabela 3 são mostrados os resultados da simulação de docking com as possíveis interações para a molécula padrão Selegilina (1), Amburosideo A (2), Harman (3), Harmalina (4) e Harmalol (5).

A simulação de docking entre a Selegilina e os aminoácidos da MAO-B apresentou 8 possibilidades de ligações em 6 aminoácidos diferentes do sítio ativo: CYS172, TYR326, PRO104, ILE316, ILE199, LEU171. Todas as interações são hidrofóbicas com o aminoácido CYS172 obteve-se uma interação de van der Waals entre o átomo de enxofre do aminoácido e o anel aromático da molécula com distância de 4,73Å; com o aminoácido TYR326 observaram-se duas interações hidrofóbicas, uma entre o anel aromático do aminoácido e o carbono do radical metila da molécula, e a outra entre os anéis aromáticos tanto do aminoácido quanto da molécula, com distâncias 5,28Å e 5,46Å, respectivamente. Com o aminoácido PRO104 obteve-se uma interação hidrofóbica entre um grupo alquil do aminoácido e o átomo de hidrogênio da molécula com distância de 3,99Å. Com o aminoácido ILE316 observaram-se duas interações hidrofóbicas, entre um grupo alquil do aminoácido e o carbono do radical metila, e outra interação entre o grupo alquil e o carbono terciário, com distâncias de 4,84Å e 4,64Å, respectivamente. Com o aminoácido ILE199 obteve-se uma interação hidrofóbica entre um grupo alquil do aminoácido e o carbono do radical metila da molécula com distância de 4,22Å. Com o aminoácido LEU171 obteve-se uma ligação hidrofóbica entre um grupo alquil do aminoácido e o anel aromático da molécula com distância de 4,24Å.

A simulação entre a Amburosideo A e os aminoácidos da MAO-B apresentou 7 ligações em 5 aminoácidos diferentes: LEU171, CYS172, TYR398, TYR435 e ILE199. A maioria das ligações é do tipo hidrofóbica com quatro interações, e também ocorreram três interações de ponte de hidrogênio entre os átomos de hidrogênio (H) e oxigênio (O). Com o aminoácido LEU171 obteve-se uma interação do tipo hidrofóbica entre o grupo alquil do aminoácido e o anel aromático da molécula com distância de 3,97Å. O aminoácido CYS172 apresentou duas interações, uma do tipo ponte de hidrogênio entre o H do aminoácido e O da molécula com distância de 2,65 Å, e a outra do tipo hidrofóbica entre um grupo alquil do aminoácido e o anel aromático da molécula, com distância de 5,06Å. Com o aminoácido TYR398 obteve-se uma interação do tipo ponte de hidrogênio entre os átomos de O do aa e o H da molécula com distância de 2,11Å. O aminoácido TYR435 apresentou uma interação ponte de hidrogênio entre o O da hidroxila do aminoácido e o H da molécula, com distância de 2,51Å. O aminoácido ILE199 apresentou duas interações hidrofóbicas, entre grupos alquil do aminoácido e o anel aromático da molécula, com distâncias de 3,83Å e 4,89Å.

Referências

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