UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO COM ÊNFASE NA RESPOSTA T REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM
PACIENTES COM GASTRITE
JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM
Belém-Pará 2014
JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICOCOM ÊNFASE NA RESPOSTA T REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM
PACIENTES COM GASTRITE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio Simões Quaresma
Belém – Pará 2014
Graim, Jair Francisco de Santana
Avaliação do perfil imunológico com ênfase na resposta T regulatória ante a infecção do H. Pylori em pacientes com gastrite, Belém-Pará, 2013, 129p, Tese de Doutorado em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários.
JAIR FRANCISCO DE SANTANA GRAIM
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO COM ÊNFASE NA RESPOSTA T REGULATÓRIA ANTE A INFECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI EM
PACIENTES COM GASTRITE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como
requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio Simões Quaresma Instituto de Ciências Biológicas - UFPA.
Banca Examinadora: Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz Instituto Evandro Chagas - IEC/PA
Prof. Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno
Centro de Estudos Superiores do Pará - CESUPA
Profa. Dra. Helen Thais Fuzii
Universidade Federal do Pará - UFPA
Profa. Dra. Fabiola Elizabeth Villanova Universidade Federal do Pará - UFPA
Profa. Dra. Luisa Carício Martins
Núcleo de Medicina Tropical - NMT/UFPA
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.”
À memória de meu pai, por todos os aprendizados e, em particular por me ensinar “o que é certo e o que é errado”. de minha avó, Hilda, exemplo de mulher, minha maior incentivadora. do meu tio, Cecílio, por sempre ter acreditado em mim e por ter sido meu esteio na hora que mais precisava.
AGRADECIMENTOS
A meu Deus por ter me dado o bem mais valioso que um ser humano pode ter, a vida.
À Universidade do Estado do Pará, por ter proporcionado o Programa de Pós-Graduação Interinstitucional com a Universidade Federal do Pará, contribuindo para melhor qualificação de seus docentes;
Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários (BAIP), pelo esmero em contribuir para a formação de profissionais que contribuirão para o engrandecimento de nosso Estado e de toda a Amazônia;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma, por ter aceitado o desafio de orientação deste trabalho, assim como pela sua atenção, paciência, compreensão, incentivo e apoio que nos foi tão valiosos até mesmo nos momentos mais difíceis;
Ao Núcleo de Medicina Tropical (NMT/UFPA) por ter permitido a realização deste trabalho em seus domínios.
Ao Laboratório Sabin que, gentilmente, cedeu o material para a realização desse estudo.
Aos Professores do curso de Pós-graduação a nível de Doutorado em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará.
Ao Prof. Dr. Ricardo Ishak que muito acreditou e me incentivou para que eu pudesse estar realizando e concluindo mais uma das etapas importantes da minha carreira acadêmica.
A Profa. Dra. Rosana Libonati, pela grande contribuição nas orientações em Estatística.
Ao Hospital Ophir Loyola, meu local de trabalho, pela compreensão permitindo que eu pudesse me ausentar para realização deste curso de doutorado.
Ao Prof. Doutor Jorge Rodrigues de Souza, pesquisador do Laboratório de imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da UFPA, pela grande contribuição nas orientações para melhor desenvolvimento deste trabalho.
A Profa. Dra. Tinara Leila de Souza Aarão, pesquisadora do Laboratório de imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da UFPA, professora de imunologia da UEPA, grande colaboradora e incentivadora deste trabalho.
Aos professores da Banca de Qualificação, Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz, Prof. Dr. Ismaelino Mauro Nunes Magno, Profa. Dra. Luisa Carício Martins, Profa. Dra. Hellen Thais Fuzii, a Profa. Dra. Fabiola Elizabeth Villanova.
A Sra. Luciene Dias Cavalcante, Bibliotecária - Coordenadora da Divisão de Documentação e Biblioteca do Hospital Ophir Loyola, pela sua prestimosa colaboração na revisão deste documento.
Aos pacientes que participaram desta pesquisa pela importante contribuição para o desenvolvimento deste estudo.
Aos meus queridos irmãos Rosi e Beto, pelo incentivo e pelo amor que nos mantêm sempre unidos.
A minha esposa, Nildinha, que com paciência e sabedoria soube contornar e compreender os momentos mais tensos;
Aos meus filhos, Antonio Neto e Priscila, presentes de Deus;
Aos meus pais, Antonio (in memorian) e Rosa, meus maiores incentivadores, meus espelhos, meus amigos, meus amores, por tudo que me proporcionaram para que eu pudesse chegar aonde cheguei.
SUMÁRIO LISTA DE TABELAS 10 LISTA DE FIGURAS 11 LISTA DE ABREVIATURAS 13 RESUMO 15 ABSTRACT 16 1 INTRODUÇÃO 17 1.1 O GÊNERO HELICOBACTER 18
1.1.1 A bactéria Helicobacter pylori 19
1.1.1.1 Histórico 19
1.1.1.2 Morfologia da bactéria Helicobacter pylori 21 1.1.1.3 Genoma da bactéria Helicobacter pylori 22
1.1.1.4 Modos de transmissão do H. pylori 25
1.2 EPIDEMIOLOGIA DO H. pylori 26
1.2.1 Prevalência 26
1.3 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA 26
1.3.1 Fatores de colonização 28 1.3.1.1 Motilidade 28 1.3.1.2 Microaerofilismo 30 1.3.1.3 Urease 30 1.3.1.4 HspA e HspB 31 1.3.1.5 Adesinas 31 1.3.2 Fatores de persistência 33 1.3.2.1 Lipopolissacarídeos 33 1.3.2.2 Mimetismo molecular 33 1.3.2.3 Forma cocóide 34
1.3.2.4 Catalase e superóxido dismutase 34
1.3.3 Fatores que induzem a doença 34
1.3.3.2 Citotoxina vacuolizante 35 1.3.3.3 Citotoxina associada ao grupo A (CagA) 38 1.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE DOENÇAS GASTROINTESTINAIS E H.
pylori 42
1.5 RESPOSTA IMUNOLÓGICA AO H. pylori 45
1.6 PRINCIPAIS CÉLULAS ENVOLVIDAS NA RESPOSTA IMUNE
PARA H. pylori 47 1.6.1 Macrófagos 47 1.6.2 Células Epiteliais 49 1.6.3 Células Dendríticas 49 1.6.4 Linfócitos 50 1.6.4.1 Células B 50 1.6.4.2 Células T 51 1.7 LINFÓCITO T REGULADOR 52
1.7.1 Fator de Transcrição FOXP3 54
1.7.2 Mecanismos de ação das Tregs 55
1.7.3 Papel das células T reguladoras nas doenças infecciosas 56
1.8 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO H. PYLORI 57
1.9 OBJETIVOS 61
1.9.1 Objetivo Geral 61
1.9.2 Objetivos Específicos 61
2 MATERIAL E MÉTODOS 62
2.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO 62
2.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO NO ESTUDO 62
2.2.1 Critérios de inclusão 62
2.2.2 Critérios de exclusão 62
2.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 63
2.3.1 2.3.2 Biópsias Análise Histopatológica 63 63
2.4 DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS 63
2.4.1 Detecção Histopatológica do H. pylori 63
2.4.2 Detecção das células CD4, CD8, CD20, Neutrófilos e Linfócitos T
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 66 3 RESULTADOS 67 4 DISCUSSÃO 80 5 CONCLUSÃO 89 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90 ANEXOS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultado das amostras estudadas quanto a presença e ausência de
H. pylori... 67
Tabela 2 - Estatística descritiva da variável CD20... 68
Tabela 3 - Estatística descritiva da variável CD4... 70
Tabela 4 - Estatística descritiva da variável CD8... 71
Tabela 5 - Estatística descritiva da variável Neutrófilos... 72
Tabela 6 - Estatística descritiva da variável FoxP3... 73 Tabela 7 - Frequência de H. pylori quanto ao número de cruzes, onde 0 =
ausência; 1 = uma cruz; 2 = duas cruzes; 3 = três cruzes ...
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Microfotografia Eletrônica do H. pylori, demonstrando sua
morfologia curvada e seus flagelos 21
Figura 2 Representação gráfica do primeiro genoma sequenciado do H. pylori 26695
23
Figura 3 Mosaico do gene vacA adaptado de Atherton et al. 24
Figura 4 Fatores de virulência da bactéria H. pylori 28 Figura 5 Fator de colonização: motilidade e adesão do H. pylori 29
Figura 6 Atividade ureásica do H. pylori 30
Figura 7 Adesão do H. pylori à mucosa gástrica por meio de adesinas 32
Figura 8 Mosaico do gene vacA 36
Figura 9 Representação esquemática dos dois modelos de mecanismo de ação da citotoxina VacA
38
Figura 10 Ilha de patogenicidade Cag (citotoxin antigen associated) 39 Figura 11 Representação esquemática da ação da citotoxina CagA 41 Figura 12 Representação esquemática da resposta imunológica à infecção
pelo H. pylori
45
Figura 13 Estrutura da proteína FOXP3, com domínio repressor, central composto por dedos de zinco (ZnF) e zíper de leucina (Zip), e o domínio forkhead
55
Figura 14 Modelos de mecanismos de ação das Tregs 56 Figura 15 Quantidade de células CD20 encontradas em lâminas H. pylori
positivo e H. pylori negativo
69
Figura 16 Quantidade de células CD4 encontradas nas amostras contendo H. pylori positivo e H. pylori negativo
70
Figura 17 Quantidade de células CD8 encontradas nas amostras contendo H. pylori positivo e H. pylori negativo
71
Figura 18 Quantidade de Neutrófilos encontrados na presença de H. pylori positivo e H. pylori negativo
Figura 19 Quantidade de células Treg (FoxP3) encontradas nas amostras de H. pylori positivo e H. pylori negativo
73
Figura 20 Correlação negativa entre a quantidade de células CD4 e H. pylori 75 Figura 21 Correlação negativa entre a quantidade de células CD8 e H. pylori 76 Figura 22 Correlação negativa entre a quantidade de células CD20 e H.
pylori
77
Figura 23 Correlação positiva entre a quantidade de células Treg FoxP3 e H. pylori
78
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Aminoácidos
Ag Antígeno
AGS Human gastric adenocarcinoma cells AlpA Lipoproteina associada à aderência A AlpB Lipoproteina associada à aderência B APC Antigen presenting cell
ATPase Enzima de ativação da bomba de prótons BabA Blood group antigen binding adesin A BSA Soro Albumina bovina
cagPAI Ilha de patogenicidade cag cagA Cytotoxin associated gene A CCR Receptores de quimiocina CD4 Cluster of diferentation 4 CD8 Cluster of diferentation 8 CTLA Linfócito T citotóxico DNA Deoxyribonucleic acid
ELISA Enzime-linked immunosorbent assay
h hora
FISH Hibridização in situ com fluorescência HE Hematoxilina-Eosina
H. pylori Helicobacter pylori
IARC International Agency for Research on Câncer IFN-γ Interferon gama
IgA Imunoglobulina A IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL Interleucina
INCA Instituto Nacional do Câncer
IPEX Immunodeficiency, poliendocrinopathy and enteropathy X-linked syndrome IS Sequência de inserção Kb Kilobites KDa Kilodaltons KP Lisina-prolina LPS Lipopolissacarídeos Mb Megabites
MALT Mucosa associated lymphoid tissue MAP Mitogen activated protein
min minuto
NAP Proteína ativadora de neutrófilos NF-kB Factor nuclear kB
NOD Nucleotid binding oligomerization domain containing protein OiPA Outer inflamatory protein A
OMPs Outer membrane proteins PCR Polimerase chain reaction pH Produto hidrogeniônico RNA Ribonucleic acid
SabA Sialicacid binding adhesin SOD Superóxido dimutase T.A. Temperatura ambiente TCD4+ Linfócito T auxiliar 4 TCD8+ Linfócito T auxiliar 8 TCR Receptor de células T Th1 Type 1 helper T cells Th2 Type 2 helper T cells TLRs Toll-like receptors
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa Treg Célula T reguladora
vacA Vacuolating cytotoxin gene A
RESUMO
A infecção do estômago pelo Helicobacter pylori é a principal causa de gastrite crônica ativa na metade da população do mundo, muitas vezes evoluindo para formas mais graves de doenças gastroduodenais. Nos casos em que a resposta imune do hospedeiro encontra-se ineficiente a bactéria persiste e a inflamação pode continuar por décadas. A ativação bacteriana das células epiteliais, células dendríticas, monócitos, macrófagos e neutrófilos é guiada pelas células Thelp tipo 1 de resposta adaptativa, porém se fazendo de maneira inadequada. A literatura demonstra que muitos tem sido os caminhos postulados na tentativa de se explicar a falha da resposta imune pelo hospedeiro, dentre eles destacam-se a apoptose das células epiteliais e macrófagos, a inadequada função das células efetoras dos macrófagos e células dendríticas, inibição das células T pelo Vac A e efeito supressor das células Treg. Em muitas doenças, inclusive as formas crônicas de infecção, a desregulação do sistema imune é o ponto de partida. No caso do H. pylori, a condição sine qua non da infecção é a presença da gastrite crônica ativa, caracterizada pelas duas formas de infecção, a forma aguda (neutrófilos) e a crônica (linfócitos). Foram selecionadas 50 amostras de lâminas de pacientes que haviam se submetido ao exame de endoscopia digestiva alta e biópsia da mucosa gástrica, oriundas do Laboratório SABIN, obedecendo os critérios de inclusão e após ter concordado e assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. A análise histopatológica e a detecção histopatológica do H. pylori das amostras foram realizadas no Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará. Para quantificação das interleucinas na mucosa gástrica foram utilizado kits de imunohistoquímica. Todos os dados foram tabulados e analisados estatisticamente, aplicando-se o teste t de MANN-WHITNEY e, também, foi aplicado o teste de correlação de Pearson. Das 50 amostras estudadas, 36 (72%) apresentaram-se infectadas pelo H. pylori e, 14 (28%) não apresentaram contaminação por essa bactéria. As células CD20 apresentaram-se em maior quantidade nas amostras que não continham a bactéria, com média de 8,71, enquanto que as amostras contaminadas pelo H. pylori apresentaram uma média de 7,27. A média de células CD4 encontradas na amostra em pacientes contaminados foi de 15,44, enquanto que nas amostras negativas para o H. pylori a média foi 20,14. A quantidade de células CD8 presentes nas amostras contaminadas determinou uma média de 12,31, naquelas em que a bactéria não estava presente foi de 14,43. Avaliando-se a variável neutrófilo, encontrou-se uma média de 11,14 nos casos em que a bactéria estava presente e, 21,79 naqueles onde não foi encontrada a bactéria. Com relação as células T reguladoras FoxP3, a média encontrada nas amostras infectadas pelo H. pylori foi de 7,4, já nas amostras negativas para esse microrganismo a média foi 2,92.
ABSTRACT
The infection of the stomach by Helicobacter pylori is the major cause of chronic active gastritis in half the world's population, often progressing to more severe forms of gastroduodenal diseases. In cases where the host immune response is inefficient by the bacteria and inflammation may persists for decades. The bacterial activation of epithelial cells, dendritic cells, monocytes, macrophages and neutrophils is guided by the type 1 cells Thelp adaptive response, but doing in inapropriate way. The literature shows that many ways has been postulated in an attempt to explain the failure of the immune response by the host, among them stand out apoptosis of epithelial cells and macrophages, the inadequate effector cell function of macrophages and dendritic cells, inhibition of T cells by Vac A and suppressive effect of Treg cells. In many diseases, including chronic forms of infection, the deregulation of the immune system is the starting point. In the case of H. pylori, the sine qua non condition of infection is the presence of chronic active gastritis, characterized by two forms of infection, the acute form ( neutrophils ) and chronic ( lymphocytes ) . 50 samples were selected slides from patients who were submitted to the examination of high digestive endoscopy and biopsy of the gastric mucosa, resulting from the SABIN Laboratory, following the inclusion criteria and having agreed and signed the Instrument of Consent . Histopathological analysis and histopathological detection of H. pylori samples were performed at the Department of Tropical Medicine of the Federal University of Pará for quantification of interleukins in the gastric mucosa were used immunohistochemistry kits . All data were statistically tabulated and analyzed by applying the t MANN-WHITNEY test and also was applied Pearson correlation test . Of the 50 samples studied , 36 ( 72 % ) were infected by H. pylori, and 14 ( 28 % ) showed no contamination by this bacteria . The CD20 cells showed up in greater quantities in the samples that did not contain the bacteria , with an average of 8.71, while the samples contaminated by H. pylori had an average of 7.27 . The average CD4 found in patients infected sample was 15.44 , while the negative samples for H. pylori average was 20.14. The quantity of CD8 cells present in contaminated samples determined an average of 12.31 , those in which bacteria was not present was 14.43 . Evaluating the variable neutrophils, was found a mean of 11.14 in cases where the bacteria was present and 21.79 those where the bacteria was not found. About FoxP3 regulatory T cells, the average found in the samples infected by H. pylori was 7.4, while in the negative samples for this microorganism, the average was 2.92 .
1. INTRODUÇÃO
O Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria espiralada gram-negativo, que coloniza a mucosa gastroduodenal dos seres humanos (Blaser, 1990). A fase inicial da infecção pelo H. pylori é caracterizada pelo desenvolvimento de uma gastrite aguda, com aumento transitório de secreção ácida e da resposta inflamatória, sendo precursora para o desenvolvimento de gastrite crônica ativa com denso infiltrado celular na mucosa, que com o passar dos anos tende a decrescer (Gisbert et al., 2000). Contudo, o quadro inflamatório persiste por vários anos e causa sérios danos à mucosa gástrica, podendo evoluir para doenças gastroduodenais mais graves (Dunn et al., 1997; Gisbert et al., 2000; Ladeira et al., 2003).
A infecção pelo H. pylori é considerada um dos maiores fatores na patogênese de várias doenças gastrointestinais, tais como: gastrite crônica, gastrite atrófica, úlceras pépticas, carcinoma e linfoma gástrico (Longuimire, 1977, Machi et al., 1996, César et al., 2005; Álvares et al., 2006). Contudo, a maioria dos pacientes infectados permanece portadores assintomáticos por toda a vida e somente 20% podem evoluir para uma patologia gastroduodenal mais grave no decorrer da vida (Ladeira et al., 2004; Thomazini et al., 2006). A grande variabilidade nas manifestações clínicas da infecção pelo H. pylori está associada a vários fatores, tais como, fatores de virulência bacteriana, fatores ambientais e fatores genéticos dos hospedeiros, ou a combinação destes (Coelho et al., 2000, Roder, 2002; Ladeira et al., 2003).
Muitos estudos vêm demonstrando que o H. pylori apresenta uma grande diversidade genômica, linhagens geneticamente distintas vem sendo descritas em diferentes regiões, sendo associadas com o desenvolvimento de diferentes doenças (Peek et al., 1999; Blaser & Berg, 2001; Salama et al., 2001).
Nos últimos anos vem se intensificando a pesquisa de marcadores de patogenicidade, por técnicas moleculares, na tentativa de detectar cepas bacterianas associadas ao desenvolvimento de doenças gastroduodenais graves, como úlceras pépticas e câncer gástrico. Entre estes marcadores, o CagA e os alelos do VacA têm sido amplamente estudados (González-Valencia et al., 2000; Censini et al., 2001), estando associados à patogênese das doenças gastroduodenais, fato relevante para sua identificação (Atherton et al., 1995; Higashi et al., 2004)
Altas taxas de prevalência de doenças gastrointestinais são encontradas no Brasil, em particular, a região Norte é que apresenta maiores valores, principalmente no
que diz respeito ao número de casos de câncer gástrico (Brasil, Ministério da Saúde, 2008)
As estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA) para 2010 demonstram uma incidência de 14 casos novos para cada 100 mil homens e de 8 para cada 100 mil mulheres, variando de acordo com as diversas regiões (Brasil, Ministério da Saúde, 2010).
Apesar de o câncer gástrico vir apresentando uma diminuição da incidência e da taxa de mortalidade em vários países, até mesmo no Brasil, este tipo de câncer ainda se constitui em importante problema de saúde pública, especialmente no Estado do Pará (Araujo et al., 1993; Resende et al., 2006)
A estimativa para incidência de casos novos de câncer de estômago em 2010 no Estado do Pará, segundo o Instituto Nacional do Câncer, é de 420 casos em homens (10,82 do total de neoplasias) e 230 casos em mulheres (6,15 do total de neoplasias), sendo que na capital do Estado, Belém, estima-se destes casos 190 homens e 120 mulheres (Brasil, Ministério da Saúde, 2010).
1.1 O GÊNERO HELICOBACTER
O gênero Helicobacter foi definido por estudos de composição do RNA ribossômico (Romaniuk, 1987), de seqüenciamento e hibridação do DNA da bactéria (Goodwin et al, 1989). Juntamente com outros gêneros (Campylobacter, Arcobacter e Wolinella), constitui a superfamília VI de bactérias gram-negativos (Vandamme et al, 1991).
A morfologia do H. pylori é homogênea, quando observada à microscopia ótica e eletrônica, apresentando-se com estrutura encurvada ou espiralada, de superfície lisa e extremidades arredondadas, móvel, não esporulada e microaerófila. Tem a largura aproximada entre 0,5μm a 0,1μm e 3μm de comprimento, constituindo-se de quatro a seis flagelos unipolares embainhados e bulbos terminais nas extremidades lisas (Warren & Marshall, 1984).
Atualmente, o gênero Helicobacter é composto de, no mínimo, 27 espécies com propriedades comuns, particularmente aquelas relacionadas com a vida no estômago, podendo-se localizar no fundo e no corpo gástrico, contudo essas bactérias são encontradas, principalmente, na região antral do estômago (Blaser & Berg, 2001). O H. pylori pode distribuir-se de maneira focal, segmentar ou difusa ao longo da mucosa
gástrica (Warren & Marshall, 1984), localizando-se no interior ou sob a camada de muco que recobre o epitélio da superfície ou das foveólas, em íntimo contato com a membrana luminal das células epiteliais que revestem a mucosa gástrica (Ladeira et al, 2003).
Esta bactéria apresenta uma capacidade excepcional de aderência (Thomsen et al., 1990). Estando adaptada para colonizar somente a mucosa gástrica, sendo que raramente é observada em áreas de metaplasia intestinal. Fator de grande importância para o seu papel na patogênese da úlcera péptica duodenal é que no duodeno o H. pylori coloniza áreas de metaplasia gástrica (Marshall et al., 1985; Queiroz & Mendes, 1993). O H. pylori apresenta afinidade pelas células mucíparas gástricas, fato este ligado a composição neutra do muco gástrico, que é diferente dos mucopolissacarídeos ácidos produzidos pelas células caliciformes da metaplasia intestinal (Queiroz & Mendes, 1993).
1.1.1 A bactéria Helicobacter pylori
1.1.1.1 Histórico
Ao longo de séculos, a presença de um microorganismo na mucosa gástrica foi tida como improvável, por se acreditar que nesta região não haveria condições habitáveis, em razão da presença de ácido clorídrico produzido a partir das células parietais do estômago (Dunn et al., 1997).
Pesquisadores alemães, em 1875, detectaram na mucosa gástrica bactérias espirais, que não cresceram em culturas, sendo, por este motivo, desprezadas (Blaser, 2005).
O cientista italiano Giulio Bizzozero, em 1892, demonstrou bactérias espiraladas colonizando o ambiente ácido de estômago de cães. Passados três anos, Salomon também encontrou espiroquetas no estômago de cães e gatos (Marshall & Warren, 1984).
Krienitz, em 1906, descreveu a presença de bactérias espiraladas em estômago humano em pacientes portadores de câncer gástrico (Krienitz, 1906). Neste mesmo ano, Balfour, encontrou microorganismos espiralados em úlceras gástricas de cães e macacos.
Em 1939, Doenges (apud Marshall & Warren, 1999) descreveu também a presença de microorganismos espiralados, similares ao descrito por Balfour, quando de autópsias de estômagos de macacos Rhesus e seres humanos.
Palmer, em 1954, ao corar espécimes gástricas com Hematoxilina-eosina (HE), não identificou tais microorganismos, fato este que desestimulou as pesquisas nesta área, pois acreditava-se que a presença de bactérias guardava relação com a contaminação da mucosa do estômago (Palmer, 1954).
Steer e Steer & Colin Jones, em 1975, utilizando microscopia ótica e eletrônica para estudo de espécimes gástricos de pacientes sem lesão da mucosa gástrica e outros com úlcera gástrica, demonstraram a presença de bactérias (Steer, 1975; Steer & Colin Jones, 1975).
Robin Warren, em 1979, redescobriu a bactéria, que, posteriormente, juntamente com Barry Marshall, utilizando-se de biópsias gástricas de pacientes portadores de gastrite crônica, retornou com a pesquisa na tentativa de novamente isolar este microorganismo, sendo que para isso aplicou o método de isolamento a semelhança do gênero Campilobacter (Marshall & Warren, 1984).
Em 1982, de maneira acidental, Marshall e Warren, aumentando o período de incubação, conseguiram, pela primeira vez, isolar a bactéria Helicobacter pylori (Marshall & Warren, 1984; Marshall, 1986; Marshall, 1994). Inicialmente recebeu o nome de Campilobacter pyloridis, em função de sua localização e similaridade com as bactérias do gênero Campilobacter, observada na coloração pelo Gram e cultura em condições microaerófilas (Dunn et al., 1997; Parsonnet et al., 1997). Passado algum tempo o nome da bactéria passou a se chamar de Campilobacter pylori (Marshall & Goldwin, 1987).
No ano de 1984, voluntariamente, Marshall e Warren, ingeriram caldo de cultura da bactéria, correlacionando-a, desta feita, como agente causal da inflamação gástrica (Marshall, 1986).
Por volta do ano de 1989, após vários estudos taxonômicos envolvendo esta bactéria, observou-se diferenças em relação ao gênero Campilobacter, reconhecendo-se um novo gênero, o Helicobacter. Inicialmente, envolvendo duas espécies: H. pylori, microorganismo da mucosa gástrica humana e Helicobacter mustalae, encontrada na mucosa gástrica de mustelídeos, popularmente conhecidos como furões (De Groote et al., 1999)
Em 2005, Marshall e Warren, em razão dos estudos realizados com o Helicobacter pylori, receberam o Prêmio Nobel de Medicina (Mandeville et al, 2009).
1.1.1.2 Morfologia da bactéria Helicobacter pylori
O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativo, pertencente à Família Helicobacteriaceae, que apresenta duas formas diferentes: a espiralada e a cocóide. A forma espiralada (Figura 1) tem as extremidades arredondadas, estrutura curva, que muitas vezes lembra a letra “S”, aproximadamente tem de 2,5 a 5,0μm de comprimento e, 0,5 a 1,0μm de espessura. Em geral, possui de 4 a 6 flagelos unipolares e embainhados e em formato de hélices. Cada flagelo possui, aproximadamente, 30μ de comprimento e 2,5μm de espessura (Goldwin & Amstrong, 1990).
Figura 1: Microfotografia eletrônica da bactéria H. pylori Fonte: http://www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/Assets/Bio307/vinardone
A forma cocóide apresenta membrana circular, superfície espessa e irregular, apresentando poucas estruturas intracitoplasmáticas e grânulos, onde se observa em seu interior um bacilo em forma de “U” circundado pelos flagelos (Saito et al., 2003).
Em condições adversas, tais como aerobiose, pH alcalino, alta temperatura, incubação prolongada, tratamento com antibióticos, tratamento com inibidores da bomba de prótons, tratamento com óxido nítrico, ocorre mudança da forma espiralada para a cocóide. O que faz pensar que a forma cocóide é uma morfologia de resistência, capaz de suportar as condições adversas do meio, associada à transmissão da bactéria, sendo capaz de infectar água e alimentos, retornando à forma espiralada quando as condições do meio ambiente forem propícias (Cole et al., 1997).
Estudos demonstram que existem três modos de colonização da bactéria na mucosa gástrica: aderidas à superfície das células do epitélio gástrico, livres na secreção mucosa (sem contato com as células gástricas) e intercelular quando se encontram entre as células epiteliais (Goldwin & Amstrong, 1990).
1.1.1.3 Genoma da bactéria Helicobacter pylori
Para se chegar ao completo seqüenciamento do genoma do H. pylori, foram realizadas diversas análises a fim de se demonstrar a estrutura genômica e a diversidade desta bactéria. O H. pylori foi a primeira espécie bacteriana a ter seu genoma seqüenciado e comparado de duas cepas isoladas independentemente (Tomb et al., 1997).
O tamanho do genoma do H. pylori é variável, entre 1.6 a 1.73 Mb. Estudos demonstram que em aproximadamente 40% dos H. pylori isolados contém plasmídeos que variam de tamanho, entre 1.5 a 23.2, entretanto não foram encontrados neles genes que codificam fatores de virulência (Tomb et al., 1997).
A primeira cepa seqüenciada foi a 26695, isolada de um paciente que apresentava gastrite, no Reino Unido (Tomb et al.,1997). No ano de 1998, o genoma da linhagem J99 foi isolado nos Estados Unidos a partir de um paciente com úlcera duodenal (Hancock et al., 1998).
Observa-se diferenças na organização, quando se alinha os dois genomas, onde regiões estão invertidas ou translocadas para outra região e, nessas situações, também, é possível observar a presença de elementos de inserção ou repetitivos (Tomb et al., 1997; Alm et al., 1999).
O genoma de cepa “26695” consiste em aproximadamente 1,7 milhão de pares de bases, com aproximadamente 1620 genes , enquanto que o genoma de cepa “J99” consiste também de aproximadamente 1,7 milhão de pares de bases, com 1490 genes (Figura 2). Quando comparadas as duas linhagens seqüenciadas, observa-se que a organização do genoma e do proteoma de ambas as cepas são similares, onde somente 7% da J99 e 26965 são únicos para cada uma das cepas (gene 89 e 117, respectivamente). Estudos demonstram que a maioria desses genes cepa específicos estão localizados em uma região única e variável do genoma denominada zona de plasticidade (Marshall et al., 1998; Alm et al., 1999). Observa-se também grandes
diferenças genéticas nas duas cepas seqüenciadas, chegando até a 6% de diferença nos nucleotídeos (Pylori Gene Web Server).
Figura 2: Representação gráfica do genoma seqüenciado do H. pylori J99. Fonte: http://www.helicobacterspain.com/imagenes/rggJ99.htm
Estudos a respeito do genoma do H. pylori demonstram que vários mecanismos podem contribuir para a diversidade genética desta bactéria. Dentre eles destacam-se os rearranjos intragênicos que podem ocorrer na bactéria, tais como deleções, duplicações, inversões e translocações de partes do genoma. Observa-se que muitos desses rearranjos podem ocorrer como resultado da presença de DNA repetitivo. O DNA do H. pylori possui um grande número de sequências de DNA repetitivo, bem como sequências de inserção (IS605) (Alm et al., 1999; Björkholm & Salama, 2003).
Garcia-Vallvé afirma que o H. pylori é competente para transformação natural e, aparentemente, recombina com eficiência o DNA ganho por transformação ao genoma, levando a uma diversidade considerável (Garcia-Vallvé et al.,2002).
Estudos apontam que as variações genômicas das cepas podem ser responsáveis pela codificação de diferentes fatores de virulência, sendo capazes de determinar diversos tipos de lesão no hospedeiro. Por isso, o estudo do genoma está direcionado para a compreensão da patogênese e o conhecimento da habilidade deste organismo para causar doença (Ladeira et al.,2003).
No banco de dados do genoma, há 62 genes da categoria “patogênese”. As cepas sequenciadas têm Cag (ilha de patogenicidade) longas de aproximadamente 40 Kb (sucessão de genes responsáveis pela patogênese), com mais de 40 genes. O gene cagA (citotoxin antigen associated) é considerado marcador de ilha de patogenicidade cag
(cag-PAI), e está fortemente associado ao risco para desenvolvimento do câncer gástrico (Ladeira et al., 2003). Tal ilha de patogenicidade está normalmente ausente em cepas de H. pylori isoladas de humanos que são portadores assintomáticos (Telford et al., 1994).
O gene vacA encontra-se presente em todas as cepas do H. pylori e compreende duas partes variáveis, “s” e “m” (Figura 3). A região s (codifica sinal peptídico) encontra-se localizada no final da cadeia 5’ e tem dois alelos, s1 ou s2, sendo que para o alelo s1 ainda existem três subtipos: s1a, s1b e s1c. Já a região média (m) tem os alelos m1 ou m2. A combinação em mosaico dos alelos da região s com os alelos da região m determina a produção de citotoxinas, responsáveis pelo grau de virulência do H. pylori (Ladeira et al., 2003). Assim, as cepas portadoras do genótipo vacA s1/m1 produzem grande quantidade de toxina, enquanto as cepas s1/m2, pouca ou nenhuma toxina. As cepas vacA do tipo s1a parecem ser mais patogênicas que as s1b e s1c ou s2, estando mais relacionadas com úlcera péptica. As cepas do tipo m1 estão associadas a um maior risco de danos para as células epiteliais do que as do tipo m2 (Ladeira et al., 2003).
Figura 3: Mosaico do gene vacA adaptado de Atherton et al. Fonte: Ladeira et al., 2003, p. 339.
Estudos têm demonstrado que o H. pylori possui uma grande diversidade genômica, assim como linhagens geneticamente distintas vem sendo descritas em diferentes regiões, estando relacionadas com o desenvolvimento de diversas doenças (Van Doorn et al., 1999; Martins et al., 2005; Wen et al., 2007).
Membros de uma determinada população são infectados por cepas de H. pylori que, caracteristicamente, infectam aquela população, assim como em toda a população
humana. Com isso pesquisadores se permitem estudar padrões de migração humana utilizando-se de cepas do H. pylori. A exemplo disto poderia ser estabelecido que o H. pylori em índios amazônicos tem sua origem no leste asiático em vez de européia, o que faz crer que os primeiros imigrantes chegaram aqui há pelo menos 11.000 anos (Wen et al., 2007).
1.1.1.4 Modos de Transmissão do H. pylori
Apesar de cerca de 50% da população mundial estar contaminada pelo Helicobacter pylori, os mecanismos de transmissão constituem-se, ainda, em motivos de muita controvérsia. Têm sido atribuídas as vias oral-oral e fecal-oral como sendo as principais formas de transmissão, muito embora as taxas reais não tenham sido estabelecidas até o momento (Marschall, 2000).
O homem é o principal hospedeiro do Helicobacter pylori, enquanto que o estômago é considerado o seu reservatório (Dunn et al., 1997).
A água contaminada por matéria fecal constitui importante fonte de infecção (Klein et al, 1991). Já se conseguiu isolar a bactéria das fezes de indivíduos colonizados (Kelly et al., 1994). Mais recentemente foi relatado que a bactéria Helicobacter pylori pode ser transmitida sexualmente por via oral-anal (Eslick, 2001).
Outro fator importante diz respeito à aglomeração familial como causa da transmissão da bactéria Helicobacter pylori, que pode ser observado nos estudos em que se obteve sorologia positiva em mais de 80% de irmãos colonizados com esta bactéria (Drumm et al, 1990; Rodrigues et al., 2005). Corroborando este fato, foi constatada uma maior incidência de H. pylori em crianças com pais infectados, em relação às crianças cujos pais não eram portadores deste microorganismo (Malaty et al, 1991; Gold et al., 2001).
Esta bactéria já foi isolada em culturas realizadas com material proveniente de vômitos, fezes diarréicas e salivas (Perry et al., 2006).
Além das causas ambientais que contribuem para a transmissão do Helicobacter pylori, há estudos que indicam que fatores do hospedeiro exercem importante papel nas taxas de infecção e nas conseqüências patológicas induzidas pelo microorganismo (Atherton, 1997; Ladeira et al, 2003).
1.2 EPIDEMIOLOGIA DO H. PYLORI
1.2.1 Prevalência
O Helicobacter pylori apresenta distribuição cosmopolita, sendo encontrada em habitantes dos cinco continentes (Go, 2002). Cerca da metade da população do globo terrestre apresenta gastrite induzida pelo H. pylori (Blaser & Berg, 2001). A prevalência da infecção do H. pylori varia em conformidade com alguns fatores, tais como idade, nível sócio-econômico e a raça. Estudos sorológicos demonstram que a prevalência de infecção por Helicobacter pylori aumenta com a idade e é maior nos países em desenvolvimento (Logan & Walker, 2001). Na França, a soropositividade em indivíduos menores de 18 anos é de 70%, enquanto na Argélia e na Costa do Marfim, está em torno de 62% e 64%, respectivamente (Ladeira et al, 2003).
Estudos demonstram que a infecção pelo Helicobacter pylori, em países desenvolvidos, ocorre após os três ou cinco anos de idade; já em países em desenvolvimento, observa-se que em crianças com menos de um ano de idade já podem estar contaminadas (Mégraud et al., 1989; Carvalho et al, 1991). No Brasil, na cidade de Belo Horizonte, foi desenvolvido um estudo com indivíduos entre sete meses e 16 anos de idade, onde pode ser observado que o indivíduo mais jovem infectado tinha 3 anos e que a positividade de infecção pela bactéria aumentava com a idade, atingindo 82% dos indivíduos maiores de 12 anos e com baixo nível sócio-econômico (Carvalho et al, 1991).
1.3 PATOGÊNESE E FATORES DE VIRULÊNCIA
A infecção pelo Helicobacter pylori é considerada um dos mais importantes fatores na patogênese de um amplo espectro de patologias gástricas, tais como gastrite crônica, gastrite atrófica, úlceras pépticas, carcinoma e linfoma gástrico (César et al, 2005; Álvares et al, 2006). Entretanto, a maioria dos pacientes infectados pela bactéria permanecem portadores assintomáticos por toda a vida, sendo que somente 20% desses pacientes podem evoluir para uma patologia gastroduodenal mais grave no decorrer da vida (Ladeira et al, 2004; Thomazini et al, 2006). O resultado clínico da infecção pelo H. pylori é determinado pela complexa interação entre fatores do hospedeiro e da
bactéria. Enquanto que os fatores do hospedeiro permanecem desconhecidos, a identificação dos da bactéria avança continuamente (Roder, 2002; Ladeira et al, 2003).
Sabe-se que a resistência ao ácido clorídrico é de vital importância na patogênese do Helicobacter pylori, uma vez que, sem este atributo biológico, a bactéria não teria condições de colonizar a mucosa do estômago (Ladeira et al, 2003).
Na fase precoce de colonização, o Helicobacter pylori necessita atravessar a camada de muco que protege o epitélio gástrico. Esta camada é formada por um gel viscoelástico que confere proteção química e mecânica ao revestimento epitelial, inclusive contra bactérias (Jenks & Kusters, 2000). Contudo, lipases e proteases sintetizadas pelo Helicobacter pylori degradam a camada de muco, o que facilita a progressão da bactéria (Wallace et al., 1991; Hwang et al., 2002). Além disso, o Helicobacter pylori move-se facilmente devido à morfologia em espiral e aos flagelos e, com isso, atravessa a camada de muco, fazendo com que estabeleça íntimo contato com as células epiteliais de revestimento (Jenks & Kusters, 2000). Outras enzimas, sintetizadas pela bactéria, tais como superóxido dismutase, catalase e arginase, conferem proteção contra a atividade lítica de macrófagos e neutrófilos, impedindo uma resposta eficaz do hospedeiro (Hazell et al., 1991).
Muito embora a mucosa gástrica esteja bem protegida contra infecções bacterianas, o H. pylori encontra-se altamente adaptado a este meio, através do desenvolvimento de mecanismos próprios que garantem a sua sobrevivência. Vários são os fatores envolvidos nesse processo, podendo ser divididos em três classes (Figura 4): fatores de colonização; fatores de persistência e fatores que induzem doença (Moran, 1996).
Figura 4 – Fatores de virulência da bactéria H. pylori (Moran, 1996)
1.3.1 Fatores de colonização
Tais fatores permitem ao patógeno se estabelecer no hospedeiro.
Aproximadamente, 20% da bactéria H. pylori encontram-se aderidas ao nível da superfície do muco das células epiteliais gástricas. Espécimes gástricas quando observadas a luz da microscopia eletrônicas encontram-se aderidas ao nível das junções intercelulares, algumas vezes no fundo dos espaços celulares, com mudança do citoesqueleto no local de adesão e, também, internalizadas nas células epiteliais, sugerindo que a adesão envolve interações moleculares especializadas com a mucosa gástrica (Chen et al., 2001, Necchi et al., 2007).
Para que o H. pylori possa sobreviver no ambiente gástrico esta capacidade de colonizar a superfície do epitélio gástrico é de fundamental importância, sendo que vários fatores de colonização encontram-se envolvidos, dentre eles destacam-se como principais:
1.3.1.1 Motilidade
A forma espiralada da bactéria, associada à presença de quatro ou seis flagelos unipolares faz com que a bactéria H. pylori rapidamente se movimente na luz do
estômago (onde o pH é muito baixo), atravessando o lago mucoso, que é um dos mecanismos de defesa da mucosa gástrica (Figura 5), para uma área onde o pH encontre-se próximo do neutro, favorecendo seu crescimento. Tal motilidade constitui-se em um mecanismo imprescindível para que a bactéria continue colonizando o estômago, ainda que mecanismos de defesa do hospedeiro, como a acidez e peristaltismo gástrico, possam atuar, permitindo a aproximação da bactéria às células epiteliais gástricas (Aguilar et al., 2001). Os flagelos do H. pylori são compostos por sub unidades de flagelina e cobertos com uma dupla camada de fosfolipídeos, que tem como finalidade protegê-los contra a acidez gástrica (Fox & Wang, 2002).
Figura 5 - Fator de colonização: motilidade e adesão do H. pylor. Fonte: h.pylori.info/.
1.3.1.2 Microaerofilismo
A bactéria H. pylori é microaerofílica, ou seja, necessita de pequenas quantidades de oxigênio para sobreviver (Olson & Maier, 2002).
1.3.1.3 Urease
Dada a sua potente atividade ureásica o H. pylori é capaz de sobreviver no meio ácido do estômago (Figura 6). A enzima urease, que é uma proteína de alto peso molecular (500 a 600KDa), atua promovendo a hidrólise da uréia [CO(NH2)2], que está
presente em condições fisiológicas no suco gástrico, convertendo a uréia em dióxido de carbono (CO2) e amônia (NH3). As moléculas de amônia reagem com a água formando
íons de amônio (NH4+) e bicarbonato (HCO3-), que são capazes de neutralizar o meio ao
redor da bactéria, atingindo um pH em torno de 6 (Aguilar et al.,2001). A amônia atua como receptor de íons H+ , gerando pH neutro no interior da bactéria, o que confere ao Helicobacter pylori resistência à acidez gástrica (Weeks & Sachs, 2001). Assim, a bactéria fica protegida dos efeitos deletérios do pH ácido do estômago. A urease compreende 6% do total de proteínas sintetizadas pela bactéria, o que representa grande investimento energético motivado pela sua ação essencial como fator de colonização (Jenks & Kusters, 2000).
A maior parte da urease sintetizada pela bactéria situa-se em seu citoplasma. A produção de amônia depende da entrada de uréia na bactéria, que é controlada por uma proteína de membrana sensível ao pH. Esta proteína é codificada por um gene da família urease, conhecido como urel (Walsh, 2000; Weeks, 2000; Weeks & Saches, 2001). Cepas de Helicobacter pylori com deleção de urel não sobrevivem em pH ácido (Ladeira et al, 2003). A entrada de uréia na bactéria é acelerada em pH 5 e diminuída em pH 7 (Weeks, 2000). A entrada de uréia é altamente específica, não sendo facilmente saturada, e independe de temperatura e energia (Weeks & Sachs, 2001). Portanto o Helicobacter pylori possui um mecanismo que permite a liberação do substrato uréia sobre a urease em condições que é necessária a alcalinização local do meio ambiente (Ladeira et al, 2003). A proteína urel atua como portão de um canal, que também permite o refluxo de urease, aumentando o pH periplasmático e do microambiente próximo, prevenindo acúmulo tóxico de uréia dentro da bactéria (Walsh, 2000; Weeks & Sachs, 2001).
A proteção do H. pylori pela urease ainda confere uma apoptose das células gástricas in vitro e a inibição da somatostatina gástrica liberada em animais, o que traria como conseqüências alterações na fisiologia da digestão como um todo (Aguilar et al., 2001).
Desta forma, o H. pylori fica protegido dos efeitos adversos do pH ácido do estômago, o que lhe confere acesso à camada protetora de muco. Somado a este fato, a amônia ainda tem atividade citotóxica, aumentando a permeabilidade da célula epitelial para prótons e, possivelmente, participe como mediador da resposta imunológica local, uma vez que é potente ativador de monócito in vitro (Gobert et al., 2002).
1.3.1.4 HspA e HspB
O H. pylori possui as proteínas de choque térmico (Hsp) homólogas as de humanos, HspA e HspB, cuja a expressão destas proteínas acredita-se aumentar a atividade da urease e influenciem na habilidade da bactéria tolerar as condições extremas do estômago (Dunn & Blaser, 1997).
1.3.1.5 Adesinas
Para garantir a sua colonização, o H. pylori necessita aderir-se firmemente as células gástricas, para tanto lança mão de um conjunto de substâncias que facilitarão
essa adesão, as adesinas (Figura 7). Presentes na superfície da bactéria, as adesinas são estruturas as quais reconhecem especificamente determinados receptores da mucosa gástrica, que são estruturas glicoconjugadas, ligando-se e iniciando a colonização bacteriana (Blaser, 1992; Dunn et al., 1997; Covacci et al., 1999).
Figura 7 - Adesão do H. pylori à mucosa gástrica por meio de adesinas. Fonte: h.pylori.info/.
Estudos demonstram que o mecanismo de adesão da bactéria ao epitélio gástrico ainda não está totalmente elucidado, estes estudos fazem referência que a adesina BabA (blood-group antigen-binding adhesin A) do H. pylori utiliza como receptores os antígenos fucolizados de grupo sanguíneos Lewis b (Leb) e H tipo 1 (H-1), expressos na superfície epitelial da mucosa gástrica (Covacci et al., 1999; Yamaoka et al., 2008). Parece que a aderência promovida pela BabA tem um papel crítico no que diz respeito a transferência de fatores de virulência bacterianos, que são responsáveis em promover lesão na mucosa do estômago, quer seja de maneira direta ou em decorrência da resposta inflamatória e/ou auto-imunidade (Ilver et al., 1998). Além do que, bactérias que se mantêm aderidas firmemente estão menos vulneráveis à acidez gástrica e, também, não são eliminadas através dos movimentos peristálticos (Silveira et al., 2005).
O estudo realizado por Ilver et al. (1998) demonstraram que a maior freqüência de úlcera péptica encontra-se naqueles indivíduos que apresentam grupo sanguíneo O,
que equivale ao antígeno de Lewis b, em razão da carga bacteriana ser maior nesses indivíduos (Ilver et al., 1998).
Em estudos mais recentes observa-se que a análise da sequência genômica das cepas 26695, J99 e HPAG1 H. pylori, mostra a presença de cinco famílias maiores de proteínas da membrana externa, que corresponde a 4% do genoma bacteriano. Dentre estas, temos as adesinas, que se ligam a carboidratos modificados nas glicoproteínas das células dos hospedeiros, como a adesina ligada ao antígeno do grupo sanguíneo (BabA), adesina ligada ao ácido siálico (SabA), lipoproteínas associada à aderência (AlpA e AlpB), proteína inflamatória da membrana externa (OipA) (Yamaoka, 2008; Matteo et al., 2010).
1.3.2 Fatores de persistência
A literatura demonstra que a bactéria H. pylori permanece no estômago por um período longo de tempo, muitas vezes permanecendo por toda a vida do indivíduo infectado. Uma vez que a infecção pelo H. pylori é crônica, é capaz de ativar a resposta imunológica no hospedeiro, determinando um processo inflamatório crônico. Dentre os mecanismos de persistência, destacam-se:
1.3.2.1 Lipopolissacarídeos (LPS)
Também denominados endotoxinas, os LPS são glicolipídios tóxicos fosforilados, presentes na superfície das bactérias gram-negativos, atuando como principal antígeno de superfície (Berstad et al., 2001).
1.3.2.2 Mimetismo molecular
O mimetismo de antígenos é considerado um dos mais importantes mecanismos de evasão do sistema imunológico do hospedeiro (Aguilar et al., 2001; Aguiar et al., 2002). A estrutura da cadeia O-específica do LPS em diferentes tipos de H. pylori pode mimetizar antígenos da estrutura do grupo sanguíneo Lewis (Lea, Leb, Lex, Ley) que estão presentes na mucosa do estômago normal de seres humanos e a expressão desses antígenos Lewis na superfície da bactéria pode camuflar a bactéria e contribuir para a sobrevivência da mesma no estômago (Aguilar et al., 2001; Berstad et al., 2001; Aguiar
et al., 2002). O papel do mimetismo, portanto, é permitir o escape da bactéria aos mecanismos de reconhecimento do sistema imune, o que contribui para a cronicidade da infecção (Dunn et al., 1997; GO & Crowe, 2000). Segundo Wirth et al.(1997), a bactéria H. pylori não expressaria antígenos Lewis apenas, mas também a expressão fenotípica Le do hospedeiro, o que sugere uma adaptação da bactéria ao hospedeiro.
1.3.2.3 Forma cocóide
Em determinadas condições, que envolva estresse ambiental, a bactéria H. pylori modifica-se, convertendo a sua forma espiral para a forma cocóide, considerada uma forma de resistência, originada da forma bacilar, que se adapta transitoriamente às condições impróprias do ambiente, garantindo ao microorganismo sua sobrevivência ao meio até que esta possa chegar ao estômago do hospedeiro onde irá replicar-se (Costa et al., 1999).
1.3.2.4 Catalase e superóxido dismutase
As enzimas catalase e superóxido dismutase (SOD) extracelular são produzidas em quantidades satisfatórias e são considerados fatores de resistência da bactéria aos mecanismos líticos oxidativos dos fagócitos polimorfonucleares, o que causa a morte desses últimos e determina lesão epitelial aguda, sendo importantes fatores de sobrevivência da bactéria frente à mucosa gástrica inflamada (Ladeira et al., 2003).
1.3.3 Fatores que induzem a doença
Além dos fatores de colonização e persistência, a bactéria H. pylori possui fatores de virulência que são responsáveis pela produção de substâncias tóxicas que atuam agredindo as células epiteliais gástricas para obtenção de nutrientes e de melhor fixação na mucosa gástrica, entretanto tais fatores determinam, normalmente, sérios danos ao hospedeiro (Yakoob et al., 2009). Dentre esses fatores, destacam-se:
1.3.3.1 Proteases e lipases
Enzimas sintetizadas pela bactéria H. pylori, atuam diminuindo o efeito protetor da camada de muco do epitélio gástrico, facilitando a progressão da bactéria, levando à penetração do ácido na superfície das células epiteliais, causando sérios danos à mucosa gástrica (Vinall et al., 2002).
1.3.3.2 Citotoxina vacuolizante (VacA)
Considerada a maior toxina secretada pelo H. pylori sua ação citotóxica encontra-se produzida em mais de 50% dos casos isolados de H. pylori, estando relacionada epidemiologicamente com a destruição dos tecidos e úlceras pépticas (Aguilar et al., 2001; Muller et al., 2002).
Na literatura encontram-se vários estudos demonstrando diversos mecanismos da atividade tóxica da VacA contra as células do hospedeiro (Aguilar et al., 2001; Ashour et al., 2002, Muller et al., 2002; Ando et al., 2006). Acredita-se que esta toxina induz alterações no trânsito intracelular vesicular em células eucarióticas, o que leva a formação de grandes vacúolos contendo sinais de recentes lisossomos e endossomos. Tal mecanismo interfere na apresentação de antígeno ao sistema imunológico por prejudicar o processo e apresentação do antígeno pela célula apresentadora de antígeno (Aguilar et al., 2001; Muller et al., 2002; Gebert et al., 2003, Ando et al., 2006).
Cerca de 50% a 60% dos diferentes tipos da bactéria H. pylori produzem a citotoxina vacuolizante VacA, muito embora o gene da VacA esteja sempre presente em todas as cepas bacterianas isoladas (Ando et al., 2006).
Apesar do gene da citotoxina vacuolizante (VacA) estar presente em todos os tipos de H. pylori, o mesmo apresenta variações estruturais entre os alelos vacA, particularmente em duas regiões. Essas variações alélicas se concentram na região N-terminal (s1a, s1b, s1c e s2) e próximo à região do meio (m1 e m2), que descreve as diferenças na produção da citotoxina ou na atividade vacuolizante (Figura 8). Assim, alelos VacA estão relacionados com incremento de úlceras pépticas. As regiões s e m têm sido associadas a diferentes manifestações clínicas; assim, o alelo s1a/m1 é associado com maior destruição do epitélio gástrico e úlcera duodenal (Ladeira et al., 2003; Ando et al., 2006).
Figura 8 – Mosaico do gene vacA. Fonte: Adaptado de Athernon et al., 1997
Estudos mostram ainda que s1a/m1 tem maior virulência, enquanto vacAs2 são raramente associados com doença ulcerosa péptica, assim como são raras em determinadas populações. Com base nessas informações, os genótipos vacA não podem ser usados de maneira segura no sentido de discernir o risco de desenvolvimento de doença gastroduodenal no hospedeiro. Esses estudos ainda demonstram que o alelo s1c é fenotipicamente diferente de s1a e s1b (Aguilar et al. 2001; Yamaoka et al., 2002; Ladeira et al., 2003; Ando et al., 2006).
O gene vacA codifica uma protoxina de aproximadamente 140 kDa de massa. Tal prototoxina é processada antes de ser secretada, sendo retirada da região aminoterminal a porção do peptídeo sinal e, posteriormente, da região carboxiterminal, o fragmento transmembrânico, que é separado da toxina no momento da secreção, resultando em uma toxina com peso de aproximadamente 88 kDa. A proteína processada pode ser secretada ou permanecer na superfície da bactéria (Cover et al., 1994; Telford et al., 1994).
A proteína secretada forma uma estrutura monomérica que é composta na região aminoterminal pelo domínio P37 (34kDa) e na porção carboxiterminal pelo domínio P58 (54kDa), esses dois domínios estão interligados por uma região de loop, sensível a ação de proteases (Telford et al., 1994; Cover et al., 1994).
As estruturas monoméricas quando expostas a um pH ácido (<5,5) ou básico (>8,0) unem-se formando uma estrutura oligomérica, que pode ser composta por 6 a 7 estruturas monoméricas e possui baixa atividade citotóxica. Mas em condições
favoráveis a estrutura oligomérica se dissocia e os monômeros exercem alto poder citotóxico (Mcclain et al., 2000).
A ligação da VacA com a superfície da célula gástrica é o primeiro passo para a intoxicação celular. Estudosde Padilla et al. (2000) demonstraram que a VacA possui a capacidade de ligar-se a diferentes tipos de células e tem múltiplos sítios de ligação na superfície das células.
A porção P37 da proteína VacA é considerada importante na internalização da toxina e no desenvolvimento do processo de intoxicação celular e a porção P58 é responsável pela ligação do monômero ao receptor celular (Mcclain et al., 2000).
Alguns estudos demonstram que a citotoxina VacA é capaz de alterar a junção célula-célula e modificar a resistência elétrica trans-epitelial celular, criando uma rota paracelular (célula → bactéria) de permeabilidade de pequenas moléculas orgânicas e íons, tal como, Fe3+ e Ni2+, que são essenciais para o crescimento da bactéria.
Entretanto, o mecanismo que causa esse processo ainda não foi identificado (Papini et al., 1998; Montecucco et al., 2001).
Experimentos de Tombola et al.(1999) têm demonstrado que a inserção da toxina VacA na membrana plasmática leva a formação de poros ânions seletivos, importantes a sobrevida da bactéria na célula.
Reyrat et al. (2000) propõem dois diferentes modelos de mecanismos de ação da VacA. O primeiro modelo propõe que o domínio P58 media a ligação à célula alvo, e a porção P37 seria injetada no citosol da célula alvo, onde enzimaticamente alteraria alvos citoplasmáticos específicos levando a formação de vacúolos e a apoptose. Entretanto, ainda não se conseguiu demonstrar alguma atividade enzimática da porção P37, nem tão pouco foram descritos possíveis alvos citoplasmáticos (Galmiche et al., 2000; Reyrat et al., 2000; Papini et al., 2001).
O segundo modelo descreve que tanto a porção P37, quanto a porção P58 estão envolvidos na capacidade de inserir-se na membrana plasmática da célula alvo e na formação de canais condutores de íons. Sendo que a porção P58 seria responsável pela interação com a membrana plasmática e, também, pela inserção do P37 na porção transmembrana. O domínio P37 é capaz de suportar a ação dos lisossomos, importante na manutenção dos canais, uma vez que este é endocitado e transportado para o citoplasma dentro de um endossoma (Tombola et al., 1999). No endossoma, a toxina VacA aumenta a permeabilidade dos ânions deste compartimento, determinando a ativação da bomba de prótons ATPase, levando à introdução do Hidrogênio no
endossoma, que na presença de amônia, em particular a gerada pela urease do H. pylori, leva ao acúmulo de íons acidotróficos (NH4+), estimulando o afluxo de água para dentro
da célula, essencial na formação dos vacúolos (Figura 9) (Papini et al., 1993; Tombola et al., 1999).
Figura 9 – Representação esquemática dos dois modelos de mecanismo de ação da citotoxina VacA . Fonte: Adapatado de Papini et al., 2001.
1.3.3.3 Citotoxina associada ao grupo A (CagA)
O citotoxin antigen associated (cagA) foi o primeiro gene cepa-específico identificado no Helicobacter pylori, estando fortemente associado ao risco para desenvolvimento do câncer gástrico (Peek & Blaser, 1997; Lu et al., 2005). As cepas cag A+ tendem a ser mais virulentas e induzem níveis mais altos de expressão das citocinas, tais como IL-1b e IL-8 (Chollet-Martin et al., 1993, Blaser & Berg, 2001;
Hull et al., 2001). Pacientes infectados por cepas que expressam cagA têm probabilidade três vezes maior de desenvolver câncer gástrico do que aqueles infectados por cepas cagA- (Parsonnet et al, 1997). O gene cagA é considerado marcador da ilha de patogenicidade cag (cag-PAI), que possui de 35 a 40 Kb, comporta 31 genes (Blaser & Berg, 2001) e é encontrada em cerca de 60% das cepas ocidentais. A ilha cag-PAI é um componente do genoma do Helicobacter pylori que contém genes homólogos aos de outras bactérias que codificam componentes do sistema de secreção do tipo IV, que atua como agulha e serve para injetar moléculas efetoras da bactéria na célula hospedeira, permitindo que a bactéria module vias do metabolismo celular da célula hospedeira (Figura 10), incluindo a expressão de proto-oncogenes (Covacci et al, 1999; Ladeira et al, 2003).
Figura 10 - Ilha de patogenicidade Cag (citotoxin antigen associated). Fonte: Suerbaum & Michetti, 2002, p. 1117.
Componentes do Helicobacter pylori induzem alterações na fosforilação de tirosinas, nas vias de sinalização e de transdução da célula hospedeira, resultando em rearranjos do citoesqueleto e alterações morfológicas que estimulam a célula a se espalhar e se alongar de maneira idêntica à produzida pelo fator de crescimento de
hepatócitos (Segal et al, 1996; Asahi et al, 2000; Ondebreit et al, 2000; Stein et al, 2000). Além disso, fatores da bactéria podem induzir a desfosforilação de proteínas normalmente fosforiladas (Atherton, 2000).
A proteína cagA do Helicobacter pylori atua como um antígeno altamente imunogênico. A estrutura do gene revela uma região 5’ altamente conservada, mas com uma região 3’ com número variável de seqüências repetitivas, o que leva à variação do comprimento da proteína. Como a proteína CagA é fortemente imunogênica, qualquer variação em seu comprimento pode levar a diferentes respostas do hospedeiro, incluindo diferentes graus de resposta inflamatória (Ladeira et al, 2003).
Estudos da variabilidade da região 3’ do gene cagA para investigar as diferenças nesta região estariam relacionadas a diferentes processos patológicos, demonstraram que 86% de uma das variantes eram provenientes de pacientes com câncer gástrico e concluíram que outras diferenças na região 3’ do gene cagA podem estar relacionadas a diferentes processos patológicos (Yamaoka et al, 1998).
A função da citotoxina CagA ainda não está totalmente elucidada, entretanto, alguns experimentos têm demonstrado que cepas cagA positivas quando inoculadas em cultura de células gástricas, como por exemplo, AGS (células do câncer gástrico), induzem alterações na morfologia destas células, com acentuado alongamento e aumento celular, determinando rearranjo no citoesqueleto e aumento da motilidade, alterações essas denominadas de “fenótipo Beija-flor” (Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004; Higashi et al., 2004).
Assim, o CagA é um marcador de cepas virulentas do H. pylori, associadas mais comumente, com úlcera péptica e câncer gástrico, e sua detecção tem se mostrado clinicamente relevante, ao menos na maioria dos países do Ocidente (Kuipers et al, 1995; Higashi et al, 2002; Higashi et al, 2004).
Experimentos demonstram que a proteína CagA é translocada para dentro das células do estômago através de um sistema de secreção do tipo IV (TFSS), onde ocorre a formação de uma estrutura similar a uma seringa que introduz a proteína CagA no citoplasma da célula gástrica. Embora pouco se conheça a respeito, sabe-se que os genes que codificam esse sistema de secreção também estão localizados na ilha de patogenicidade. Esses experimentos revelam que cepas do H. pylori mutantes com deficiência na funcionalidade do sistema de injeção tipo IV são incapazes de induzir o fenótipo Beija-flor, o que faz crer que a translocação da CagA é um pré requisito para
alteração morfológica da célula (Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004; Figueiredo et al., 2005).
A molécula CagA apresenta sítios de fosforilação de tirosina, reconhecidos pelos domínios SHP2, presentes nas moléculas sinalizadoras, o que faz com que essas moléculas se liguem aos receptores tirosinoquinases. Tais receptores podem ativar as proteínas Ras assim como a cascata de Map-quinase (proteinoquinases ativadas por mitógenos), determinando sinalização ao núcleo da célula e alterando o citoesqueleto da mesma, estimulando a proliferação e diferenciação celular (Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004; Higashi et al., 2004). Contudo, experimentos de Higashi et al. (2004), demonstraram que a citotoxina CagA pode, através das proteínas sinalizadoras, enviar sinalização diretamente ao núcleo da célula, independentemente da ativação de proteínas Ras, conforme se observa na Figura 11.
O prolongado estímulo das proteínas sinalizadoras pela toxina CagA, determina uma sinalização inadequada estimulando a apoptose celular. Somado a este fato, uma replicação celular aumentada determina uma ocorrência maior de mutações, e o acúmulo dessas mutações pode condicionar a uma expressão de oncogenes, alterando o controle celular e, conseqüentemente, o desenvolvimento de neoplasias (Higashi et al., 2002; Hatakeyama, 2003; Blaser & Atherton, 2004).
Figura 11 - Representação esquemática da ação da citotoxina CagA. Fonte: Adaptado de Higashi et al., 2004.
