BIOLOGIA CELULAR. Msc. Jessica Borges de Oliveira

BIOLOGIA CELULAR

Métodos de estudo da célula: microscopia, técnicas de

preparo de lâminas, métodos moleculares

• Microscopias ópticas

• Microscopias eletrônicas • Estudos das células vivas

Introdução

• Macroscópicas

Introdução

• As unidades de medida utilizadas:

micrômetro (µm), para a microscopia óptica;

nanômetro (nm) e o angstrom (Å), para a microscopia eletrônica.

PRINCIPAIS UNIDADES DE MEDIDAS USADAS NA MICROSCOPIA

ESTA UNIDADE ESTÁ SENDO SUBSTITUÍDA PELO NANÔMETRO MICRÔMETRO (µm) NANÔMERO (nm) 1mm = 1.000 μm 1μm = 1.000 nm 1nm = 10 Å ÂNGSTROM (Å) 5

Introdução

Introdução

• Poder de ampliação: capacidade de um aparelho

aumentar uma imagem. Na microscopia é dado pelo produto entre a ampliação das oculares e a ampliação das objetivas.

• Poder de resolução: capacidade de um aparelho

fornecer imagens distintas de dois pontos distintos.

• Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos

O que determina, a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho do objeto.

HEMÁCIAS ESPOROS DE

LEVEDURAS

CÉLULAS TUBULARES DO EPITÉLIO RENAL

EXEMPLO DE LIMITE DE RESOLUÇÃO:

É A MENOR DISTÂNCIA QUE DEVE EXISTIR ENTRE DOIS PONTOS PARA QUE ELES APAREÇAM INDIVIDUALIZADOS.

Introdução

Introdução

Técnicas usadas em citologia Citoquímicas

Imunocitoquímicas Radiofotografia

Microscopias ópticas

• Serve para ampliar um objeto.

• Funciona com um conjunto de lentes que ampliam a imagem.

• A iluminação é natural ou artificial.

• É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar uma parte óptica que amplia as imagens.

REVÓLVER PARAFUSO MACROMÉTRICO PARAFUSO MICROMÉTRICO CONDENSADOR OBJETIVAS OCULARES BRAÇO OU SUPORTE PLATINA BASE LÂMPADA

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

BACTÉRIAS CÉLULAS SANGUÍNEAS CÉLULA LEUCÓCITOS

Microscopias ópticas

“Aparelho com lentes ópticas que maximiza um ser ou estruturas minúsculas a um tamanho de boa observação”

Microscopias ópticas

Condensador

Sua finalidade é projetar um cone de luz sobre as células que estão sendo examinadas ao microscópio.

Após atravessar as células, esse feixe luminoso, em forma de cone, penetra nas objetivas.

Objetivas

Projetam uma imagem aumentada , no plano focal das oculares, que novamente a amplia.

Oculares

As imagens fornecidas pela oculares podem ser percebidas pela retina.

OBJETIVAS

(COM OCULAR DE 10X)

AMPLIAÇÃO TOTAL

(VER SEMPRE AS OCULARES)

04 x 40 X

10 x 100 X

40 x 400 X

100 x

(Sempre usar com óleo de Imersão) 1000 X

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

Microscopias ópticas

A microscopia óptica continua sendo e será ainda por um longo tempo uma técnica bastante utilizada na indústria de microeletrônica.

Os microscópios tradicionais possuem como vantagens a sua disponibilidade, custo relativamente baixo se comparados aos equipamentos de outras técnicas, proporciona uma medida não destrutiva da amostra e é possível se analisar toda a lâmina.

A desvantagem está na sua resolução e precisão limitadas pelos sistemas ópticos tradicionais. Contudo, ainda é o meio mais prático para medidas qualitativas.

MICROSCOPIA ÓPTICA EM LÂMINA DE TECIDO

SANGUÍNEO HEMÁCIAS

MICROSCOPIA ELETRÔNICA (ME) DE BACTÉRIAS COMENSAIS

EOSINÓFILOS

LEUCÓCITO

LINFÓCITO

DIFERENÇAS DE IMAGENS ENTRE UM MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) E UM MICROSCÓPIO ELETRÔNICO (ME)

Microscopias eletrônicas

Microscópio Eletrônico de

Transmissão – MET _{Eletrônico de} Microscópio Varredura - MEV

Microscopias eletrônicas

Microscopias eletrônicas

Microscopias eletrônicas

Espinha de ouriço

Microscopias eletrônicas

Microscopias eletrônicas

Microscopias eletrônicas

Microscopias eletrônicas

Estudos das células vivas

Como visualizar células e diferentes estruturas celulares???

Estudos das células vivas

Microscópio óptico

• Séc. XIX e XX: avanço do microscópio óptico, de luz ou fotônico (do grego photos, luz);

Estudos das células vivas

Microscópio eletrônico

• A partir da década de 50;

• Fornece aumento do objeto de 5.000 a 100.000x.

✓ Microscópio eletrônico de transmissão

Para cortes ultrafinos, corados com metais pesados contraste (imagem preto e branco).

✓ Microscópio eletrônico de varredura

Para espécimes espessos ou células inteiras que tenham sido previamente fixadas (imagem em 3D).

Estudos das células vivas

• Técnicas para observação de células ao microscópio óptico

Observação vital

Esfregaço

Esmagamento

Estudos das células vivas

Observação vital

• Material biológico vivo é colocado entre a lâmina e lamínula;

Estudos das células vivas

Esfregaço

• Material biológico constituído por células isoladas ou pouco unidas entre si: espalhamento sobre a lâmina; Ex: sangue.

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Estudos das células vivas

Preparação histológica

• Fixação, inclusão em parafina, corte em micrótomo, coloração e montagem da lâmina histológica permanente; Ex: tecidos animais.

Análises moleculares do DNA

Os avanços permitiram conhecer, sequenciar e até alterar o código genético de um ser vivo. Essas informações têm sido aplicadas em muitas situações que envolvem a nossa vida, tais como:

serviços de aconselhamento genético, prevenção de doenças hereditárias e diagnóstico pré-natal sobre anomalias genéticas em fetos;

 identificação de pessoas com base na análise de DNA;  testes de paternidade;

Análises moleculares do DNA

A tecnologia de manipulação do DNA tem melhorado a qualidade de vida das pessoas com diabetes. A técnica do DNA recombinante permitiu que bactérias transgênicas produzissem uma insulina idêntica a do pâncreas humano, evitando assim complicações por alergia.

Compare as vantagens da insulina produzida com base na técnica da clonagem molecular com a insulina produzida por outras

Análises moleculares do DNA

Dependendo do objetivo, além de bactérias, outros organismos também são utilizados para clonar segmentos de DNA. Observe:

Os vírus bacteriófagos são utilizados como vetores e podem clonar fragmentos maiores de DNA;

 Outra maneira de obter clones de segmento de DNA é a utilização da levedura Sacchamyces cerevisae, que recebe um segmento de DNA plasmidial e, ao ser reproduzido, transmite as células filhas às substâncias que se quer produzir.

Outro método que tem numerosas aplicações é a eletroforese. Consiste na separação de substâncias (DNA, RNA ou proteínas) utilizando um campo elétrico. Veja o procedimento da separação em gel do DNA:

1- Submetem-se fragmentos de DNA em uma placa contendo gel de algarose (carboidrato extraído da parede celular de algas) que recebe uma corrente elétrica;

2- Os fragmentos de DNA percorrem o gel e se deslocam em direção ao polo elétrico positivo (os menores se movimentam mais rapidamente que os maiores).

3- Quando a corrente elétrica é desligada, os fragmentos param em posições diversas em forma de bandas ou faixas.

4- Aplica-se brometo de etídio (C₂₁H₂OBrN₃) – corante que adere ao DNA – que, quando iluminado com raios ultravioletas, fluoresce e possibilita a visualização das bandas de DNA.

O resultado da eletroforese é uma imagem fotográfica semelhante a um “código de barras” ou “impressão digital”: é o DNA fingerprint. Observe a imagem! Film e d e ba nd as de DN A

Equipamento para eletroforese em gel

Imagem: Jeffrey M. Vinocur / GNU Free Documentation License.

Imagem: Mnolf / GNU Free Documentation License.

Hibridação molecular e detecção de pessoas pelo DNA

Nos seres eucarióticos, o corte do DNA por uma endonuclease de restrição produz uma quantidade muito grande de fragmentos, impossível de se visualizar na separação eletroforética.

Para que a visualização aconteça, usa-se a técnica da hibridação molecular; dessa forma, apenas determinadas bandas de DNA são evidenciadas.

“A hibridação molecular é uma técnica empregada na identificação de pessoas e consiste em tratar o gel de modo a separar as cadeias duplas dos fragmentos de DNA e de sequências específicas especiais, as chamadas sondas de DNA. Dessa forma, apenas determinadas bandas são marcadas e podem ser analisadas.”

No caso da identificação de pessoas, as sequências de DNA usadas para detectar o DNA fringerprint são chamadas VNTR (Variable

Number of Tandem Repeats), isto é, “número variável de repetições

em sequências”, e são formadas por repetições de poucos nucleotídeos.

As sequências de DNA utilizadas para identificar pessoas

 As amostras dos envolvidos são tratadas com endonucleases de restrição;

 Depois, são colocadas em uma mesma placa de gel e tratadas com uma sonda que revela certos tipos de VNTR;

 O resultado é um padrão de faixas mostrado como um filme.

Com exceção dos gêmeos univitelínicos, cada pessoa tem um padrão específico de repetições herdados dos pais.

Aplicações práticas de DNA fingerprint

Fonte:

http://aprendaki.webcindario.com/testes/images/an5.GIF

Teste de paternidade: compare os códigos de barra da mãe e da criança com o código de barra dos dois prováveis pais. A criança deve ter 50% do padrão de barras da mãe e 50% do padrão de barras do pai.

Descubra quem é o pai da criança!

A popularidade do DNA se deve, entre outros fatores, aos testes de paternidade propagados pela mídia.

Mãe Criança Homem A Homem B

Teste de paternidade. Identificação de pessoas em investigações policiais ou judiciais.

Aconselhamento genético. Para realizar o exame de DNA, basta

ter qualquer amostra biológica, como pele, cabelo, sangue, sêmen, entre outras.

Os testes que utilizam DNA fingerprint são tão seguros que fornecem 99,9% de certeza.

Observe que as três bandas de DNA de origem paterna (não encontradas na mãe) ocorrem no homem B.

Se você respondeu homem B, parabéns!

Mãe Criança Homem A Homem B

Plantas Transgênicas

Que são organismos transgênicos?

Os Organismos Geneticamente Modificados (OGM), ou transgênicos, são aqueles que recebem genes de outras espécies.

Curiosidade: os cientistas conseguiram introduzir, na planta do tabaco, um gene de vagalume capaz de sintetizar a enzima luciferase que catalisa, nesse inseto, a degradação da luciferina (proteína que produz luz). O gene clonado em plasmídeo multiplicou-se em bactérias e, depois de purificado, foi injetado na célula de fumo. O gene modificado passou para o DNA da planta, que, quando regada com luciferina, emitia luz como o vagalume.

O peixe-zebra também conhecido popularmente como paulistinha ou bandeirinha foi o primeiro animal geneticamente modificado a ser

vendido em grande escala. Observe o detalhe das características do peixe antes e depois da transgenia.

Peixe Glofish: resultado do peixe-zebra geneticamente modificado.

Peixe-zebra: primeiro animal genetica-mente modificado para fins comerciais.

OPERAÇÃO (PRÁTICA LABORATORIAL)

NORMAS E CONDUTAS NA PRÁTICA LABORATORIAL

1. OBEDECER TODAS AS NORMAS DE BIOSEGURANÇA (EPI/EPC). 2. LAVAR AS MÃOS NA ENTRADA E NA SAÍDA APÓS A PRATICA.

3. É OBRIGATÓRIO QUE VOCÊ CONHEÇA AS PARTES ÓPTICAS E MECÂNICAS DOS MICROSCÓPICOS ANTES DE USÁ-LO.

4. NÃO MANUSEAR O APARELHO COM AS MÃOS SUJAS OU MOLHADAS 5. NUNCA DESLOQUE O APARELHO COM A LÂMPADA ACESA.

6. NA REMOÇÃO DO EQUIPAMENTO, SEGURE-O FIRMEMENTE COM UMA DAS MÃOS NO BRAÇO E A OUTRA NA BASE.

7. É PROIBIDO O USO DE CÂMARAS FOTOGRÁFICAS DURANTE A EXPOSIÇÃO DA AULA PRÁTICA.

COMO USAR O MICROSCÓPIO

USANDO A OBJETIVA 100x

1. INICIE SEMPRE PELA OBJETIVA DE MENOR AUMENTO.

2. NA OBSERVAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO, OLHE PELA OCULAR E MOVA O MACROMÉTRICO MUITO LENTAMENTE, ASSIM QUE A IMAGEM APARECER, MESMO CONFUSA, PARE E COMPLETE A FOCALIZAÇÃO COM O MICROMÉTRICO.

 O USO DA OBJETIVA DE IMERSÃO É MAIS DELICADA POIS, A DISTÂNCIA FOCAL ENTRE A FACE DA OBJETIVA E A PARTE SUPERIOR DA LAMÍNULA, DIMINUI QUANDO A AMPLIAÇÃO É AUMENTADA.

COLORAÇÃO

QUASE TODAS AS ORGANELAS SÃO TRANSPARENTES E INCOLORES, O QUE DIFICULTA SEU ESTUDO MICROSCÓPICO, LOGO A COLORAÇÃO FACILITA A

VISUALIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS DOS TECIDOS.

PARA VENCER ESSA DIFICULDADE, FORAM CRIADOS NUMEROSOS PROCESSOS DE COLORAÇÃO QUE TORNAM VISÍVEIS OS DIVERSOS COMPONENTES

 SÃO OS COMPONENTES DOS

TECIDOS QUE SE CORAM FACILMENTE COM CORANTES ÁCIDOS (Ex:EOSINA)

EX: ESTRUTURAS BÁSICAS

(ORGANELAS CITOPLASMÁTICAS)

A MAIORIA DOS CORANTES COMPORTA-SE COMO ÁCIDOS OU BASES

 SÃO OS COMPONENTES DOS

TECIDOS QUE SE CORAM FACILMENTE COM CORANTES BÁSICOS (Hematoxilina)

EX: ESTRUTURAS ÁCIDAS (NÚCLEOS)

TÉCNICAS DE COLORAÇÃO MAIS USUAIS, TÉCNICA DE IMPREGNAÇÃO PELA PRATA E ALGUNS DOS RESULTADOS OBTIDOS COM ELAS:

TÉCNICAS CONSTITUINTES NÚCLEOS CITOPLASMA FIBRAS COLÁGENAS FIBRAS RETICULARES HE HEMALÚMEN (Hematoxilina), EOSINA HEMATOXILINA FÉRRICA AZUL PRETO ROSA ROSA TRICRÔMICO DE MASSON FUCCINA ÁCIDA E PONCEAU DE XILIDINA, VERDE-LUZ VERMELHO VERDE IMPREGNAÇÃO ARGÊNTICA PARA FIBRAS RETICULARES SOLUÇÕES DE

 OS MICROSCÓPIOS MODERNOS UTILIZAM LASERS COMPLEXOS, DETECTORES EXTREMAMENTE SENSÍVEIS, OBJETIVAS PODEROSAS.

 PERMITEM FILMAR DIVISÃO CELULAR, O TRÁFICO DE MOLÉCULAS DENTRO

DAS CÉLULAS, PERMITEM OBSERVAR CERTAS PROTEÍNAS NO CÉREBRO DE ANIMAIS VIVOS ETC.

EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO

1.Defina microscópio, suas principais estruturas ópticas e mecânicas, observando os cuidados a serem utilizados no manuseio deste aparelho.

2.Diferencie Poder de Resolução de Limite de Resolução.

3.Quais os cuidados a serem observados antes de manusear o aparelho? 4.Defina Ampliação Total.

5.Cite 6 elementos estruturais de um Microscópio Óptico.

6.Quais os dois principais corantes da Técnica de coloração por HE? 7.Quais os cuidados individuais que se deve ter ao uso dos laboratórios? 8.Defina Equipamento de Proteção Individual (EPI).

9.Qual a importância dos Equipamento de Proteção Coletiva (EPC)? 10.Cite 5 condutas inapropriadas dentro de um laboratório.

• Células Procarióticas • Células Eucarióticas