Técnicas moleculares do Laboratório de Biologia Molecular. MSc. Daniele Portela de Oliveira Prof. Sandra Aidar de Queiroz

Técnicas moleculares do

Laboratório de Biologia Molecular

MSc. Daniele Portela de Oliveira Prof. Sandra Aidar de Queiroz

INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência)

Gregor Mendel (1865) ‘leis da hereditariedade’

Gregor Mendel (1865)

Redescobriram os trabalhos de Mendel e formularam as leis da hereditariedade

INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência)

Hugo De Vries et al. (1900)

Friedrich Miescher (1868)

Publicou uma nova substância no material nuclear de células chamada de nucleína

Walther Flemming (1882)

Descobriu o processo de mitose e o comportamento dos cromossomos durante a divisão celular.

Phoebus Aaron Theodor Levene (1909)

Teoria do tetranucleotídeo – repetições monótonas dos

nucleotídeos. Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e Timina (T).

Wilhelm L. Johannsen (1909)

Chamou de gene a unidade descrita por Mendel. Unidade de transferência de hereditariedade.

Thomas Hunt Morgan (1911)

INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência)

Demonstrou que os genes estão arranjados de forma linear nos cromossomos.

Frederick Griffith (1928)

Evidências sobre o papel do DNA

Oswald T. Avery (1944)(esq.) e seus colaboradores Colin MacLeod e Maclyn McCarty demonstraram o princípio transformante proposto por

Frederick Griffith em 1928.

INÍCIO DO MELHORAMENTO (Como Ciência)

Linus Pauiling com modelos da estrutura alfa hélice de proteínas, também se dedicou a resolver a estrutura do DNA

Crick  Físico e Biólogo. Estudou a estrutura cristalina da hemoglobina

Watson  Biólogo com tese em Zoologia. Estou o efeito do raio X na multiplicação de vírus que infectam bactérias (Copenhagen).

Conheceu Wilkins em Napóles  mudou sua pesquisa para difração de DNA

1° Watson e Crick – a hélice de DNA era composta por 3 cadeia de nucleotídeos.

Peter  Filho de Linus Pauling foi fazer doutorado com Kendrew.

2° Watson e Crick perceberam o erro na molécula através do artigo de Pauling e corrigiram. Concluíram que os fosfatos estavam do lado de fora da hélice.

Conversas entre Wilkins, Franklin, Watson e Crick concluíram finalmente a estrutura do DNA

Crick, Watson e Wilkins (1962) Prêmio Nobel de Medicina ou Fisiologia – Estrutura do DNA

WATSON E CRICK (1953) – DNA

Elucidaram o código universal genético

Watson e Crick(1953)

Estudos de migração, seleção e deriva genética

Polimorfismo

Definição:

Formas alternativas de um

mesmo segmento de DNA.

Resultado de uma mutação

(evento).

1% na população

Tipos de polimorfismos (marcadores)

A) Variação no número de cópias (mini e

microssatélites): sequências adjacentes que se

repetem em número variado.

– NÃO OCORRE EM ÉXON

– Mini x Micro  Tamanho da sequência repetitiva (Tandem)

B) SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

– Substituição de um único nucleotídeo

– A forma de polimorfismo mais abundante no genoma

– Ocorre em qualquer região

– Éxon  PODE alterar a sequência de aa na proteína (mutação não sinônimo)

– Anemia falciforme, BLAD, K-caseína(BB)

C) Indel

– In/Del: Inserção/deleção

– Éxon  Efeito deletério por inviabilizar a proteína

C) Indel

Utilização dos marcadores

• Mecanismos de herança mendeliana

– Humanos, bovinos e suínos – Doenças hereditárias

• Mecanismos relacionados a características

complexas (Georges e Anderson, 2003)

– Essas características são controladas por muitos genes, que podem resultar em complexas interações alélicas e interações não-alélicas, e são influenciadas pelo ambiente.

Marcadores moleculares

• Sequenciamento do genoma

 Bibliotecas virtuais de várias espécies  NCBI-GenBank

Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

 Seleciona  Nucleotide (All databases)  Busca  Sequência e/ou espécie

• Emprego dos QTL

– Seleção Assistida por marcadores (MAS)

– Eliminar animais portadores de alelos deletérios – Exemplo: mutação responsável pela síndrome do

estresse dos suínos (gene PSS)

– Exemplo: (BLAD) mutação no gene que codifica a proteína CD18, responsável pela síndrome de

deficiência de adesão dos leucócitos (Hol)

– Exemplo: mutação relacionada a sindactilia dos bovinos

• Desvantagens do uso da MAS para

características quantitativas

– Emprego do genótipo de um marcador

– Conduz a rápida fixação de um alelo selecionado – Desconsidera o efeito poligênico

• Vantagens do uso da MAS

– Características com baixa herdabilidade e difícil mensuração

– Estudos de expressão gênica  RNA

– Teste de paternidade  DNA-fingerprint – Variabilidade genética  + 2 alelos

– Parâmetros populacionais  Endogamia

Extração de DNA

• Qualquer procedimento laboratorial envolvendo análise de DNA ou RNA tem que passar pelo processo de extração

• Em geral, baseia-se em 4 etapas básicas (protocolos de extração)

– Etapas:

1. Lise das membranas lipídicas 2. Purificação do DNA

3. Precipitação do DNA 4. Reidratação do DNA

1. Lise das membranas lipídicas

a) Membranas: fosfolipídios + proteínas

b) Rompimento da membrana celular e dos compartimentos membranosos (organelas)

c) Provocada por uma solução detergente

2) Purificação do DNA

a) Remoção de componentes celulares como proteínas, organelas e restos celulares

b) Proteinase K  Desnaturação das proteínas

c) Fenol  Remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa

d) Clorofórmio  ajuda a desnaturar proteínas e remover o fenol residual

e) NaCL₂  ajuda a manter a proteínas dissolvidas no líquido extraído, impedem que precipitem

3) Precipitação do DNA

a) DNA é solúvel em água, mas insolúvel em álcool

a) Usa-se etanol para precipitar o DNA b) Quanto mais gelado o etanol menos

solúvel o DNA vai estar

b) Retira-se o álcool para formação do pellet

4) Reidratação do DNA

a) Após a retirada do álcool, o DNA precisa se

solubilizar em algum solvente: Água ultra-pura ou uma solução Tampão

a) Este solvente servirá para armazenamento do DNA extraído

b) Deve ser livre de contaminantes e enzimas capazes de destruir o DNA

b) Armazenar o DNA a - 20 º C

Como PCR funciona?

Objetivo

• Multiplicar um trecho específico do DNA.

Como funciona?

Replicação do DNA

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

• PCR -> Polymerase Chain Reaction

Multiplicação “in vitro” de um trecho específico de DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis) resultando na produção de milhares de cópias da sequência desejada sem o uso de um organismo vivo.

Breve Histórico

• Saiki, et al. (1985) desenvolveu a técnica

• Kary Mullis (1987) inovou

 Gene β-globina humana

 Nobel de Química em 1993

Perkin-Elmer

• Conceito de primer de PCR

• Taq -> DNA polimerase termoestável isolada da bactéria de fontes termais Thermus aquaticus  Temperatura de até 117°

• 1989 -> DNA Thermal Cycler

(primeiro Termociclador automático)

Como PCR funciona?

a) desnaturação das cadeias do DNA genômico

b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a sequência a ser amplificada

c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC d) reinício do ciclo

Como PCR funciona?

• A quantidade final de DNA segue uma função exponencial:

N = N₀ . 2n

N -> Número final de cadeias de DNA

N₀ -> Número inicial de DNA molde (template)

DNA molde

Primer

GoTaq (Promega)

H₂O

Extraído de uma amostra (sangue, pelo, sêmen) ou de um RNA, convertida para cDNA.

Sequência de DNA que serve como ponto de início de replicação. Forward e Reverse.

Taq + Tampão + MgCL₂ + dNTP’s

Água ultra pura e livre de cargas elétricas (H2O miliQ

Tipos de reações de PCR

RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)

• Parte de uma amostra de RNA. Primer inespecífico. • É fundamental nos estudos de expressão gênica.

Multiplex PCR

• Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de

primers específico.

45309...TAAAGGCAGGAGTAATAAAGTATGTTA

CCAAGAAATGTAAGTTTCAGATGTTTAATGACTCATT

GTTATCTTCTCACTATTAATTTAGGATGTCTAAACAA

GGACGGACAATCATCTTCTCCATTCATCAGCCTCGTT

ATTCCATCTTCAAGTTGTTTGATAGCCTCACCTTGTT

GGCCTCGGGAAGACTCATGTTCCACGGGCCTGCTCAG

GAGGCCTTGGGGTACTTTGGAGCCATAGGTATGGTTG

CCTTTTTTGTGCTGTAAGATCCTTCATTAATAGTATC

CTAAAGGAGAACAAAGGAGTCACTTGGAGCACTGTTT

GATCTTTGAGTAGATATACATATATCACAGTTTCCAC

TGCTCCGAAACATCTTCGGTTAGTTTGGTGTTA...

Desenho de Primers

Otimizando o PCR

• Concentração de Mg

_{na reação}

 Cofator da enzima Tht (Thermus thermophillus) Polimerase

• Temperatura de anelamento dos primers

Gradiente  definição da temperatura de anelamento 48,3 49,4 50,5 51,6 52,7 53,8 54,9 56

Eletroforese em Gel

• Função: Separar e as vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, cargas ou conformação.

• Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico,

migram para o pólo positivo ou negativo.

– Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

• Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar e também para manter o pH mais ou menos constante.

Eletroforese em Gel

• Gel composto de agarose ou poliacrilamida

• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.

 Usada em concentrações de 0,5 a 2%  Fácil de preparar

 Não-tóxico

 Ampla capacidade de separação de fragmentos  Baixa resolução

Eletroforese em Gel

• Gel composto de agarose ou poliacrilamida

• Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida.

 Usada em concentrações de 3,5 a 20%.

 Difíceis de preparar. Precisam ser montados em placas de

vidro

 Acrilamida é um potente neurotóxico

 Baixa capacidade de separação de fragmentos  Alta resolução

Visualização da PCR

• O tampão da amostra possui uma mistura de corantes:

 Azul de Bromofenol (Corante)

 Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade)

Polimorfismos de comprimento

de fragmentos de restrição - RFLP

• Variação individual no número e no tamanho dos fragmentos formados pela digestão do DNA com uma enzima de restrição.

• Resultante de mutações pontuais, que eliminam ou criam sítios de restrição para determinada enzima

• Podem originar eventos de inserção ou de deleção entre dois sítios de restrição adjacentes.

Polimorfismos de comprimento

de fragmentos de restrição - RFLP

• Dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e submetido a clivagem por enzima de restrição;

• Após a extração, o DNA dos indivíduos é tratado com enzima de restrição, que o corta em um grande número de pontos (sítios de restrição), gerando uma enorme quantidade de fragmentos;

• As diferenças na sequência de DNA dos indivíduos resulta na clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que são separados através de eletroforese em gel de agarose.

Polimorfismos de comprimento

de fragmentos de restrição - RFLP

Técnica de RFLP

Consiste na identificação por hibridização do DNA

1- Extração do DNA

2- Digestão por enzimas de restrição

3- Separação dos fragmentos (eletroforese)

4- Transferência do DNA para membrana de nylon

5- Hibridação (fragmentos x sondas marcadas)

6- Autoradiografia (exposição da membrana a

filme de raio X ou compostos luminescentes

7- Análise da segregação

Técnica de RFLP

Aplicações do RFLP

• Diversidade genética

• Construção de mapas de ligação e

• Mapeamento de QTLs

RFLP

• Limitações

 Passos intensivos de mão de obra

 Inexistência de biblioteca de sondas disponível

• Vantagens

 Varredura em praticamente todo o genoma

 Expressão co-dominante (hetero e homozigoto)  Alta repetibilidade e consistência

Identificação de mistura de leite bovino em leite bubalino por PCR-RFLP/Hae III da β-casein gene (exon VII)

A –variante bovina

B –variante bubalina 1 (Índia) C –variante bubalina 2 (Brasil)

Extração de DNA feita a partir de queijo

Otaviano et al, 2008

Marcadores moleculares

• Métodos de análise da estrutura e função do

material genético, e de equipamentos de alta

capacidade de processamento de amostras,

métodos estatísticos e ferramentas de

informática, resultando na ciência conhecida