Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais
AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELA IMUNIZAÇÃO COM LEVEDURAS RADIOATENUADAS
DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO ANIMAL
Estefânia Mara do Nascimento Martins
Dissertação apresentada ao Curso de pós-graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre
Área de concentração: Aplicações de técnicas nucleares Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade Co-orientador: Dr Alfredo Miranda Góes
Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais
AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELA IMUNIZAÇÃO COM LEVEDURAS RADIOATENUADAS
DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO ANIMAL
Estefânia Mara do Nascimento Martins
Dissertação apresentada ao Curso de pós-graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre
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DEDICO Ao meu pai, com todo amor e carinho, pelo grande homem que ele foi e por tudo que eu sou.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me conceder a serenidade, perseverança e humildade nos momentos mais difíceis da vida.
Ao meu orientador e amigo, Antero, pelos ensinamentos, pela disponibilidade, ajuda e orientação diária, pelos puxões de orelha também! Obrigada!
Ao meu Co-orientador, Alfredo Góes, pela receptividade, atenção e carinho. Como você mesmo diz: “A macaca está evoluindo!!!”
Ao Bê, pela ajuda, disponibilidade e alegria contagiante.
À todos do CDTN pela convivência agradável, pelo carinho e constante ajuda. Em especial ao Lameiras, Eduardo, Ana Maria, Vilma, Wilmar, Adelina, Gino, Tiaozinho, Donizete, Wagner, Dona Geralda, Nívia, Virgínia, Machado, Fausto às companheiras da ginástica, ao prof. Edgar e aos colegas do espanhol, ao pessoal do LIG, ao pessoal da gráfica e aos bolsistas Alisson, Paulinho, Vanessa R., Fabiano, Marcus e Tiago. Ai que saudade!!!!
Ao grande amigo Vlamir sempre presente e pronto para ajudar. Obrigada demais!
Às professoras Raquel e Maria José pelos ensinamentos.
Ao Zacarias e ao Geraldinho pelo apoio técnico.
Ao pessoal do laboratório de radiobiologia, Paulo, Juliana Soprani, Juliana Lage, Thaíssa, Rômulo, Sidney, Fred, Karine, Bárbara, Priscila, Edinho, em especial às amigas Marcella sempre tão sensata, pé no chão, econôoooooooomica, à Marina pelo apoio, ajuda e carinho constante e a Lu Tchurururu, pela amizade, companheirismo, alegria....Some da minha vida não, viu!
Aos colegas do Mestrado, em especial à Val, Carol, Karine, Vanessa, Andreza, Daniel, Léo, Paul, Nelson, Tiago, Bruno, Cíntia etc....
Aos amigos do LICM Dri, Tiago, Nath, Luiza, Carol, Cris, Mário, Paula, Luara, Gui, Inácio, Karine, Ana, Cris Torres, Marina, Tércio, Ju, Susana, Peu e Bete, em especial à Vivi, pela ajuda, pelos conselhos, almoços, desabafos...
À Rogéria, Natália e Jankerle pela ajuda nas histologias.
À Mirinha pela simpatia, disponibilidade e ajuda. Muito Obrigada!
Aos primões Evandro e Conrado pela amizade, presença e pelas palhaçadas e trapalhadas.
Ao amigo do coração, Kinho, pelos anos de convivência, inúmeras noites de conversa, conselhos e trocas de experiência.
Aos amigos da faculdade Raquel, Ciça, Giancarlo, Andréa, Michele, Patrícia, Fernando....
Aos professores da faculdade Hudson, Esther, Sandra, Márcia e Ricardo.
Aos Deuses e aos meninos da Casablanca pelas confusões que me fazem esquecer o estresse do dia a dia.
À vovó pela paciência, carinho, pelas marmitinhas gostosas...
À Cacá pela amizade, pelas conversas, conselhos, incentivo e apoio.
Ao Cláudio pelo carinho com a nossa família e por fazer a Cacá feliz. Aos meus irmãos, Rafa e Kikinha, pela amizade e alegria. Amo vocês!
Às amigas Lu, Flavinha, Camila, Jackie e Edinha sempre presentes em minha vida.
À mamãe, pelas orações, pelo amor incondicional e por respeitar e entender a minha ausência. Amo você!
Ao Pedro, Geni e Dani pelos momentos agradáveis.
Ao PETECA, meu gostoso, mais uma vez por todos os abraços e bjinhos e carinhos sem ter fim. Obrigada pelo apoio, presença....com você eu enfrentei esta etapa com mais perseverança e tranqüilidade. Te amo!
Ao CNEM pela bolsa e apoio financeiro.
À FAPEMIG e IAEA pelo apoio financeiro.
À Andreia, Roseli e Fulgêncio pela disponibilidade.
AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELA IMUNIZAÇÃO COM LEVEDURAS RADIOATENUADAS DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO
ANIMAL
Estefânia Mara do Nascimento Martins
RESUMO
Paracoccidioides brasiliensis é o agente da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença sistêmica crônica prevalente na América Latina. Até o momento, não existe uma vacina eficaz para esta enfermidade. O potencial da radiação gama para a atenuação de patógenos e desenvolvimento de uma vacina foi explorado neste trabalho. Em nosso laboratório desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Estas perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram a sua morfologia, a síntese e secreção de proteínas, o metabolismo oxidativo e o seu perfil antigênico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora induzida pela imunização com as leveduras radioatenuadas em modelo animal. A atenuação da virulência das leveduras radioatenuadas foi avaliada em camundongos BALB/c e Nude-Nude. O efeito protetor foi avaliado em grupos de camundongos BALB/c submetidos a uma ou duas imunizações. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, que foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os camundongos foram sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. Os órgãos removidos foram usados para recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs), análise histológica e determinação de citocinas. Os soros foram coletados semanalmente para avaliar os títulos de IgG e o padrão de IgG1 e IgG2a produzido no curso da infecção. Para avaliar o tipo de resposta imune desencadeada, as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-5 foram determinadas por PCR em tempo real. As leveduras radioatenuadas perderam a sua virulência, pois não foram capazes de provocar infecção em camundongos BALB/c e Nu/Nu. Nenhuma UFC foi recuperada nem foram observadas alterações histopatológicas nos camundongos infectados com o fungo radioatenuado. Os camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado mostraram altos níveis de produção do anticorpo IgG, enquanto a infecção com as leveduras radioatenuadas não estimulou alterações significativas destes níveis. Os camundongos infectados com a levedura radioatenuada apresentaram um aumento na
produção de IFN-γ e TNF-α, indicando uma estimulação da imunidade celular. O ensaio de proteção realizado com camundongos imunizados uma vez mostrou uma redução significativa na recuperação das UFCs avaliadas 30 dias após o desafio. Entretanto, foi verificado um aumento na recuperação das UFCs dos tecidos 90 dias após o desafio. Apesar de um grau significativo de proteção ter sido alcançado, estes resultados mostram que somente uma imunização não foi suficiente para conferir uma proteção a longo prazo, uma vez que alguns focos do fungo não foram eliminados. Uma proteção eficiente foi desenvolvida no grupo dos camundongos imunizados duas vezes. A imunização foi capaz de reduzir a infecção inicial e desencadear uma proteção a longo prazo. Uma proteção de 99,5% foi obtida nos camundongos analisados 90 dias após desafio. Neste mesmo período os níveis de IFN-γ e TNF-α aumentaram significativamente, enquanto os de IL-10 e IL-5 diminuíram. Quando analisados 30 dias após o desafio os camundongos não desenvolveram um padrão totalmente polarizado de resposta Th1/Th2, mas uma tendência para um padrão Th1 foi evidente após 90 dias. Os níveis de IgG aumentaram em ambos os grupos após o desafio. Concluímos que a imunização com as leveduras radioatenuadas foi capaz de desencadear uma resposta imune protetora a longo prazo. Estas células são uma ferramenta valiosa em estudos da imunidade protetora e na pesquisa de vacina para a PCM.
Palavras - chave: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidioidomicose; irradiação gama; proteção; vacina.
EVALUATION OF THE PROTECTION INDUCED BY THE IMMUNIZATION WITH RADIOATTENUATED YEAST CELLS OF Paracoccidioides brasiliensis IN
ANIMAL MODEL
Estefânia Mara do Nascimento Martins
ABSTRACT
Paracoccidioides brasiliensis is fungus agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic systemic disease prevalent in Latin American. To date, there is no effective vaccine. The potential of gamma radiation for pathogens attenuation and vaccine development was explored in this work. In our laboratory were developed yeast cells of P. brasiliensis attenuated by gamma radiation, which lose the reproductive ability, while retaining the morphology, the synthesis and secretion of proteins, the oxidative metabolism and the expression of the antigens present in the native yeast. The aim of the present work was to evaluate the protection elicited by the immunization with this cells in animal model. The virulence attenuated was evaluated in BALB/c and Nude-Nude mice. The protector effect was evaluated in BALB/c mice groups immunized once or twice. Each group was divided in three sub groups that were challenge 30, 45 or 60 days after the immunization. The mice were sacrificed 30 and 90 days after challenge. The removed organs were used for colony-forming units (CFU’s) recover, histopathological analysis and cytokine determination. The sera were collected weekly to evaluate the IgG antibody titers and the IgG1 and IgG2a pattern in the course of infection. To evaluate the type of elicited immune response the cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-10 and IL-5 were determined by real time PCR. The radioattenuated yeast loses its virulence since fails in producing infection in BALB/c and Nude-Nude mice. No CFU’s were recovered neither histological changes observed in the mice infected with the radioattenuated cells. The mice infected with the not irradiated P. brasiliensis showed a high level of antibody production while the infection with the radioattenuated yeast did not significantly change the antibody level. The mice infected with the radioattenuated yeast presented an increase in the IFN-γ and TNF-α production
and an inhibition of the IL-10 synthesis, indicating a stimulation of the cellular response. The protection assay performed with mice immunized once showed a significant reduction in the CFU’s recovery evaluated 30 days after the challenge. However, when examined 90 days after the challenge the CFU’s recovered from organs increased. Even so a significant degree of protection has been reached these results point that only one immunization was not enough to confer a long lasting protection, since some focus of the fungi were not eliminated. An efficient protection against highly infective forms of P. brasiliensis was developed in the mice group immunized twice. The immunization was able to reduce the initial infection and elicited a long lasting protection. A 99,5 % protection was obtained in the mice analyzed 90 days post challenge. At the same time the levels of IFN-γDQG71). increased significantly while the IL-10 and IL-5 decreased. When analyzed after 30 days, the mice had not developed a totally polarized pattern of Th1/Th2 response but, a trend to a Th1 response was evident after 90 days. The level of IgG increased in both immunized groups after the challenge. We concluded that the immunization with the radioattenuated yeast cells was able to elicit a long lasting protective immune response and these cells are valuable tool for protective immunity studies and vaccine research for PCM.
Key Words: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidioidomycosis; gamma irradiation; protection; vaccine.
SUMÁRIO Pág.
RESUMO VIII
ABSTRACT X
LISTA DE FIGURAS XV
LISTA DE GRÁFICOS XVI
LISTA DE TABELAS XVIII
LISTA DE ABREVIATURAS XIX
I – INTRODUÇÃO 22
I.1 – Paracoccidioidomicose: Um Breve Histórico 23
I.2 – Epidemiologia 24
I.3 – Paracoccidioides brasiliensis 25
I.4 – Fatores de virulência envolvidos no estabelecimento da PCM 27
I.5 – Patologia da PCM 29
I.6 – Mecanismos de defesa do organismo contra a PCM I.6.1 - Imunidade Inata
I.6.1.1 - Neutrófilos e Macrófagos I.6.1.2 - Células Natural Killer I.6.1.3 - Sistema Complemento I.6.2 - Imunidade Humoral
I.6.3 - Imunidade Celular
31 31 31 32 32 33 34
I.7 – Reação granulomatosa 35
I.8 – Diagnóstico 36
I.9 – Tratamento 38
II – JUSTIFICATIVA 40
III – OBJETIVO III.1 - Objetivo geral
III.2 - Objetivos específicos
44 45 45 IV – METODOLOGIA 46 IV.1 - Camundongos 47 IV.2 - Microrganismos 47
IV.3 – Avaliação da viabilidade celular 48
IV.4 - Recuperação da virulência do P. brasiliensis 48
IV.5 - Preparação do exoantígeno Mexo 49
IV.6 - Dosagem de proteínas - Método de Bradford 49
IV.7 - Infecção e imunização experimental nos camundongos utilizados nos ensaios de virulência e proteção
50
IV.8 - Ensaio de virulência 50
IV.9 - Ensaio de proteção em PCM experimental 51
IV.10 - Recuperação de UFCs 53
IV.11 - Histologia 53
IV.12 - Obtenção dos soros de camundongos 53
IV.13 - Ensaio de ELISA 54
IV.14 - Análise do perfil de citocinas IV.14.1 - Extração do RNA total
IV.14.2 - Síntese de cDNA por transcriptase reversa IV.14.3 - PCR em tempo real
55 55 55 55
IV.15 - Análise estatística 57
V – RESULTADOS 58
V.1 - Avaliação da virulência 59
V.1.1 - Recuperação de UFCs 59
V.1.2 - Análises histopatológicas dos órgãos de camundongos infectados 61 V.1.3 - Reatividade de IgG anti-Mexo induzida pelo P. brasiliensis não irradiado e e
radioatenuado
65
V.1.4 - Perfil da produção de IgG anti-Mexo nos soros de camundongos BALB/c induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não irradiado
67
V.1.5 - Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros de camundongos BALB/c induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não irradiado
69
V.1.6 - Dosagem de citocinas por PCR em tempo real 72
V.2 - Avaliação da atividade protetora 78
V.2.1 - Recuperação de UFCs 78
V.2.3 - Produção de IgG anti–Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados e desafiados
93
V.2.4 - Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros de camundongos BALB/c imunizados
96
V.2.5 - Dosagem de citocinas por PCR em tempo real nos camundongos imunizados duas vezes 100 VI – DISCUSSÃO 105 VII – CONCLUSÃO 117 VIII – PERSPECTIVAS 120 IX - REFERÊNCIA 122 X - ANEXOS 139
X.1 - Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG) 140
LISTA DE FIGURAS Pág.
FIGURA 1: Micélio filamentoso do P. brasiliensis. 27 FIGURA 2: Células leveduriformes multinucleadas do P. brasiliensis. 27 FIGURA 3: Histopatologia representativa das lesões causadas pelo P. brasiliensis
não irradiado (G1) nos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c.
63
FIGURA 4: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c infectados com o P. brasiliensis radioatenuado e não infectados.
64
FIGURA 5: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3A), removidos 30 e 90 dias após infecção desafio.
89
FIGURA 6: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3C), removidos 30 e 90 dias após infecção desafio.
90
FIGURA 7: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c, imunizados duas vezes (subgrupo G4A), removidos após as infecções desafio com o P. brasiliensis não irradiado.
91
FIGURA 8: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c, imunizados duas vezes (subgrupo G4C), removidos 30 dias após o desafio.
LISTA DE GRÁFICOS Pág. GRÁFICO 1: Reatividade de IgG presente nos soros dos camundongos BALB/c
frente ao antígeno Mexo.
66
GRÁFICO 2: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c. 68 GRÁFICO 3: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos
BALB/c infectados com P. brasiliensis não irradiado.
70
GRÁFICO 4: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis radioatenuado.
71
GRÁFICO 5: Quantificação por PCR em tempo real de IFN-γ no pulmão dos camundongos BALB/c.
73
GRÁFICO 6: Quantificação por PCR em tempo real de TNF-α no pulmão dos camundongos BALB/c.
74
GRÁFICO 7: Quantificação por PCR em tempo real de IL–10 no pulmão dos camundongos BALB/c.
75
GRÁFICO 8: Quantificação por PCR em tempo real de IL–5 no pulmão dos camundongos BALB/c.
76
GRÁFICO 9: Recuperação de UFCs verificada após 30 dias nos órgãos do camundongo BALB/c imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis.
80
GRÁFICO 10: Recuperação de UFCs verificada após 90 dias nos órgãos do camundongo BALB/c imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis.
81
GRÁFICO 11: Recuperação de UFCs verificada após 30 dias nos órgãos do camundongo BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis.
82
GRÁFICO 12: Recuperação de UFCs verificada após 90 dias nos órgãos do camundongo BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis.
83
GRÁFICO 13: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados uma única vez com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização.
GRÁFICO 14: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização.
95
GRÁFICO 15: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados uma única vez com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados com o fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após imunização.
97
GRÁFICO 16: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados com o fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após imunização.
99
GRÁFICO 17: Quantificação por PCR em tempo real IFN-γ no pulmão dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes.
101
GRÁFICO 18: Quantificação por PCR em tempo real de TNF-α no pulmão dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes.
102
GRÁFICO 19: Quantificação por PCR em tempo real de IL-10 no pulmão dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes.
103
GRÁFICO 20: Quantificação por PCR em tempo real de IL-5 no pulmão dos camundongos BALB/c imunizados duas vezes.
LISTA DE TABELAS Pág.
TABELA 1 : Unidade formadora de colônia (UFCs) recuperadas dos tecidos de camundongos BALB/c após 30 dias de infecção com P. brasiliensis não irradiado (G1) e radioatenuado (G2) e dos camundongos Nude–Nude infectados com a levedura radioatenuada
60
TABELA 2 : Unidade formadora de colônia (UFCs) recuperadas dos tecidos de camundongos machos BALB/c após 90 dias de infecção com P. brasiliensis não irradiado (G1) e radioatenuado (G2)
60
TABELA 3: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c, 30 e 90 dias após a infecção com P. brasiliensis não irradiado e radioatenuado
62
TABELA 4: Proteção obtida pelas imunizações com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis
84
TABELA 5: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados uma única vez, 30 e 90 dias após a infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado (G1)
87
TABELA 6: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados duas vezes consecutivas, 30 e 90 dias após a infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado
88
LISTA DE QUADROS Pág.
QUADRO 1: Grupos experimentais utilizados no ensaio de virulência 51 QUADRO 2: Grupos experimentais utilizados no ensaio de proteção 52
INTRODUÇÃO LISTA DE ABREVIATURAS
Abs. Absorbância
BHI "Brain heart infusion" - Infuso cérebro coração BSA “Bovine seric albumin” - Albumina sérica bovina CD(4/8)++ “cluster of differentiation” – Grupo de diferenciação
cDNA DNA complementar
CDTN Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear CETEA Comitê de ética em pesquisa animal
Co Cobalto
Ct “Threshold cycle” – Ciclo limiar DNA Ácido Desoxirribonucléico
D.O Densidade ótica
DTH “delayed-type hipersensitivity” - Hipersensibilidade do tipo tardia EDTA "Ethylenediaminetetraacetic Acid" - Ácido etilenodiamino tetra-acético MEC Matriz extracelular
ELISA “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” - Ensaio imunoenzimático gp43 Glicoproteína de 43 kDa
H2O2 Água oxigenada
HCl Ácido Clorídrico
GAPDH Gliceraldeído -3-fosfato-desidrogenase IFN-γγ Interferon gama
IgG Imunoglobulinas gama IgG1 Imunoglobulina gama 1 IgG2a Imunoglobulina gama 2a IgG2b Imunoglobulina gama 2b IgG3 Imunoglobulina gama 3 IgA Imunoglobulina alfa
IgE Imunoglobulina E
INTRODUÇÃO IL Interleucina IL-2 Interleucina 2 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-6 Interleucina 6 IL-10 Interleucina 10
kGy Kilo Gray
KDa Kilo Dalton
LIG Laboratório de irradiação gama
Min minuto
MEXO Antígenos de membrana e secretados
NK “Natural killer cells”- Célula matadora natural
NO Óxido nítrico
NaOH Hidróxido de sódio
NCM Membrana de Nitrocelulose OPD Ortofenilenodiamino
Pb Paracoccidioides brasiliensis
Pb 18 Amostra de P. brasiliensis de um isolado virulento humano PbAg Antígeno somático das leveduras do P. brasiliensis
PBMC “peripheral Blood mononuclear cells” – Células mononucleares do sangue periférico
PBS “Phosphate buffer solution” – Tampão fosfato
PBS-C “Phosphate buffer solution”- caseina – Tampão fosfato - caseína PCM Paracoccidioidomicose
PMSF “Phenylmethylsulphonylfluoride" q.s.p quantidade suficiente para
RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro r.p.m Rotação por minuto
INTRODUÇÃO SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de duodecilsulfato de
sódio
TEMED N, N, N’, N’- tetrametiletilenodiamino
7*) “Transforming growth factor beta” – Fator beta de crescimento e transformação
TH Células T auxiliares
Th1 Células T auxiliares do tipo 1 Th2 Células T auxiliares do tipo 2 TNF-αα Fator de necrose tumoral alfa UFCs Unidades formadoras de colônia
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO I.1 - Paracoccidioidomicose: Um Breve Histórico
A paracoccidioidomicose (PCM), ou blastomicose sul americana, é uma infecção fúngica granulomatosa e sistêmica causada pelo Paracoccidioides brasiliensis (Almeida, 1930).
A descrição inicial da PCM e do seu agente etiológico foi realizada em 1908, na cidade de São Paulo, Brasil, por Adolf Lutz.
Em 1912 Afonso Splendore cultivou o fungo e a partir de estudos micológicos e histológicos, associados aos novos dados clínicos sobre a doença, o caracterizou morfológica e biologicamente.
Floriano Paulo de Almeida (1930), em estudo comparativo, demonstrou a diferença entre a paracoccidioidomicose e a coccidioidomicose, estabelecendo um novo gênero dentro do reino dos fungos, Paracoccidioides. O agente etiológico da PCM foi então denominado como P. brasiliensis de acordo com as regras de nomenclatura de Linneu.
Essa micose profunda recebeu várias denominações (blastomicose brasileira, blastomicose sul-americana, granuloma paracoccidióidico, granulomatose paracoccidióidica, granuloma ganglionar maligno de origem blastomicética, adenomicose, doença de Lutz, doença de Lutz Splendore-Almeida), porém a expressão paracoccidioidomicose foi oficialmente consagrada em 1971, em Medellin (Colômbia).
Segundo Coutinho (2002), a doença pode ser considerada um problema de saúde pública no Brasil devido à taxa de mortalidade média anual de 1,45/milhão de habitantes e a distribuição espacial não homogênea entre as diferentes regiões e estados. Além disso, sua importância em saúde coletiva relaciona-se aos custos sociais e econômicos derivados, não apenas da doença em atividade, que ocorre em indivíduos na sua fase mais produtiva de vida, mas também das freqüentes seqüelas secundárias a essa micose, motivo comum da
INTRODUÇÃO incapacitação para o trabalho. Neste contexto, justificam-se os esforços científicos realizados a fim de se conhecer o micro habitat exato do P. brasiliensis, o modo de viver saprofítico na natureza e a relação do fungo com o seu ambiente e com seu hospedeiro, bem como as respostas imunológicas e as alterações fisiológicas desencadeadas durante a doença (Restrepo, 1985a). Essas questões são importantes e, até que elas se esclareçam, a prevenção da paracoccidioidomicose continuará sendo uma tarefa difícil.
I.2 - Epidemiologia
A Paracoccidioidomicose é uma micose profunda, de distribuição geográfica restrita aos países latino - americanos situados entre 23º ao norte e 35º ao sul do Equador; desde o México até a Argentina. Entretanto, esta micose não apresenta distribuição uniforme por todo o continente, restringindo-se apenas a alguns países (Restrepo, 1985a).
Os países com alta endemicidade situam-se em regiões conhecidas como reserváreas, com temperaturas médias entre 10 – 28ºC, umidade relativa alta e pluviosidade anual entre 800 a 2000mm/ano (Londero & Melo, 1988) com inverno curto e verão chuvoso (Restrepo, 1985a). São áreas com altitude entre 50 e 1700m, solo geralmente ácido, presença de rios e de florestas tropicais e subtropicais ou de transição para o cerrado (Lacaz et al., 1994a).
Por não ser de notificação compulsória, não é possível estabelecer com exatidão a prevalência e incidência da doença (Lacaz, 1982), sendo estimadas a partir de casuísticas já publicadas e da estatística de hospitais universitários (Lacaz, 1956). A partir desses dados, verifica-se que a micose, na sua forma ativa e progressiva, tem incidência maior no Brasil, Venezuela, Colômbia (Restrepo, 1985a) e Guatemala (Lacaz, 1982). Segundo Restrepo e colaboradores (2001), entre 90 milhões de habitantes residentes em áreas endêmicas da
INTRODUÇÃO América Latina, aproximadamente 10 milhões poderiam estar infectados com P. brasiliensis.
O Brasil apresenta o maior número de casos já relatados mundialmente (Retrepo, 1985a), sendo São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e Mato Grosso do Sul os estados mais acometidos (Wanke & Londero, 1994). Destes estados, São Paulo é o que possui o maior número de casos. Os casos de PCM relatados em regiões não endêmicas são referentes aos pacientes que já haviam residido ou visitado áreas endêmicas da micose (Greer & Restrepo, 1977; Ajello & Polonelli, 1985).
A Paracoccidioidomicose ocorre, principalmente, entre os trabalhadores rurais de todas as faixas etárias, sendo mais freqüente em indivíduos com idade entre 30 e 60 anos (Franco et al., 1989).
Durante a infância e puberdade, a incidência da moléstia é igual em ambos os sexos; entretanto, na idade adulta, apesar de ambos os sexos expostos ao fungo poderem adquirir uma infecção subclínica, a evolução ocorre com maior freqüência nos homens. Acredita-se que este fato se deve a proteção conferida pelo estrógeno à mulher adulta; além de sua menor exposição ao microambiente do P. brasiliensis (Restrepo et al.,1984).
I.3 - Paracoccidioides brasiliensis
P. brasiliensis é um fungo assexuado, termodimórfico causador da paracoccidioidomicose (Almeida, 1930).
O habitat natural do P. brasiliensis ainda não está bem estabelecido, mas acredita-se que o fungo viva, saprofiticamente, a temperatura ambiente (25ºC), sob a forma micelial em solo úmido e ácido com vegetação abundante e clima temperado. No hospedeiro, a
INTRODUÇÃO 37ºC, adquire a forma leveduriforme, sendo este processo reversível (Tonelli & Freire, 2000).
Este fungo já foi isolado em solos de matas usadas para o plantio de café em áreas endêmicas como o Brasil, Argentina e Venezuela, e tem sido isolado de tatus que vivem em áreas de alta incidência da doença (Bagagli et al., 1998; Silva Vergara et al., 2000). Além disso, a PCM infecção foi recentemente detectada em exames histopatológicos e sorológicos de cadelas adultas da raça Doberman (Ricci et al., 2004; Farias et al., 2005).
No solo e em detritos vegetais, o fungo sob condições de stress celular, principalmente devido à privação nutricional, produz conídeas que, quando separados do micélio parental, exibem dimorfismo dependendo da temperatura em que se encontram (Bustamante-Simon et al., 1985; Restrepo et al., 1986; Restrepo et al., 1988).
No hospedeiro infectado ou em meio de cultura enriquecido com nutrientes são encontradas leveduras arredondadas, com 5 a 25 µm de diâmetro, dupla parede refringente, com ou sem gemulação, isoladas ou agrupadas ao redor da célula mãe (Figura 2). Esta esporulação múltipla que caracteriza o P. brasiliensis em sua vida parasitária, se assemelha ao aspecto típico de “roda de leme”. A 25ºC, o fungo apresenta-se sob a forma de micélio filamentoso do tipo conídeas intercalares, pedunculado e com hifas terminais ou artroconídeos septatos em dimensões que possibilitam sua chegada ao alvéolo pulmonar (Figura 1). As conídeas, células uninucleadas, quando incubadas à 37ºC transformam – se em células leveduriformes multinucleadas (Tonelli & Freire, 2000).
INTRODUÇÃO
O P. brasiliensis sintetiza um complexo de substâncias antigênicas (polissacarídeos, peptídeos e lipídeos) que interagem com o sistema imune do hospedeiro. Vários desses componentes estão localizados na parede do fungo (antígenos de superfície), enquanto outros são sintetizados e liberados pelo fungo no meio (exoantígenos). Há ainda os antígenos somáticos ou celulares que são obtidos de células lisadas intra e extracelularmente (Franco, 1986; Diniz et al.,2001; Reis et al., 2005).
I.4 – Fatores de virulência envolvidos no estabelecimento da PCM
Muitos fatores de virulência, associados tanto ao agente quanto ao hospedeiro, estão envolvidos no estabelecimento da infecção ou doença causada pelo P. brasiliensis. Entre os principais fatores podemos destacar os efeitos hormonais, os constituintes da parede celular (α-(1,3)-glucana e β-(1,3)-glucana) e as glicoproteínas gp43, GAPDH e serina – tiol (San Blas & San Blas 1993; Hogan et al., 1996; Puccia et al., 1999).
Durante a fase da puberdade, onde há imaturidade sexual, a doença é equivalente em ambos os sexos (Franco, 1986). Porém, na fase adulta, a paracoccidioidomicose é mais
FIGURA.2: Células leveduriformes
multinucleadas do P. brasiliensis – Fonte: Demicheli et al., 2007.
FIGURA.1: Micélio filamentoso do P.
brasiliensis - Fonte: http:
INTRODUÇÃO freqüente no sexo masculino. A resistência das mulheres à doença parece estar relacionada a fatores hormonais (Brummer et al., 1990). Hormônios femininos, como o estrógeno 17 -β - estradiol (E2), se ligam com alta afinidade e especificidade às proteínas citosólicas do P. brasiliensis inibindo a transformação do micélio em levedura (Hogan et al., 1996; Restrepo et al., 1988)
A variação morfológica do P. brasiliensis, dependente da temperatura, é acompanhada da variação na proporção e no arranjo espacial entre os polissacarídeos (α-(1,3)-glucana e β-(α-(1,3)-glucana) presentes em sua parede celular (Restrepo et al., 1984; San Blas et al., 1987). Na forma saprofítica do fungo, a parede celular possui principalmente o polímero de glicose β-(1,3)-glucana, enquanto que na sua forma parasitária há uma predominância de α-(1,3)-glucana (San Blas et al.,1977; Franco, 1986; Hogan et al., 1996). Segundo San-Blas & San Blas (1982) a existência de grande quantidade de α-(1,3)-glucana na parede celular está associada com a virulência do fungo, a qual é atenuada quando o microrganismo é subcultivado por um longo período de tempo. Por outro lado, a passagem da amostra atenuada em animais ou o seu cultivo em meio suplementado com soro fetal bovino restabelece os níveis de α-(1,3)-glucana e o fungo readquire sua virulência inicial (Franco, 1986). A glicoproteína β-(1,3)-glucana, presente em maior proporção em amostras de baixa virulência como a P265, é capaz de induzir uma reação inflamatória granulomatosa maior do que as amostras virulentas (Figueiredo et al., 1993; Silva et al., 1994).
A adesão de microrganismos patogênicos às células do hospedeiro e à superfície da mucosa é outro passo fundamental no estabelecimento da infecção (Vicentini et al., 1994). Os componentes da membrana basal da matriz extracelular (MEC) de tecidos de
INTRODUÇÃO mamíferos, tais como laminina, fibronectinas e colágeno têm sido identificados como alvos para adesão do P. brasiliensis (Mendes-Giannini et al., 2000). A glicoproteína de superfície celular (gp43), principal antígeno secretado pelo fungo, é uma molécula mediadora na ligação do fungo à laminina (Vicentini et al., 1994). Essa interação entre os receptores específicos localizados na membrana das células do hospedeiro e seu ligante complementar presente na superfície do microrganismo favorece a adesão e invasão de macrófagos pelo P. brasiliensis, bem como estimula a sua replicação e disseminação nos tecidos (Franco, 1986; Vicentini et al., 1994). Além disso, de acordo com Popi e colaboradores (2002), a gp43 inibe, in vitro, a fagocitose do fungo pela não ativação dos macrófagos peritoneais de camundongos e a liberação de NO e H2O2. Desta forma, acredita-se que esta glicoproteína
media um mecanismo de escape do fungo, pois facilita o estabelecimento e desencadeamento de infecção primária em hospedeiros susceptíveis (Popi et al., 2002).
Recentemente, Barbosa e colaboradores (2005) demonstraram que a proteína GAPDH, expressa pelo P. brasiliensis, também é capaz de se ligar à componentes da matriz extracelular mediando o processo de aderência e internalização do fungo.
A protease extracelular produzida pelo P. brasiliensis, serina – tiol, é mais um provável fator de virulência que pode hidrolizar componentes da membrana basal, como a fibronectina, laminina, colágeno IV e proteoglicanas (Carmona et al., 1995; Puccia et al., 1998; Puccia et al., 1999). Esta atividade enzimática, em colaboração com a gp43 e GAPDH, poderia aumentar a capacidade de disseminação do fungo (Soares et al., 1998).
I.5 - Patologia da PCM
A infecção é adquirida pela inalação das conídeas infectantes presentes no meio ambiente. Estes propágulos, devido às suas dimensões pequenas, alcançam os alvéolos
INTRODUÇÃO pulmonares e transformam - se em células leveduriformes, estabelecendo assim o complexo primário da infecção (McEwen et al., 1987).
O foco primário geralmente é assintomático podendo regredir espontaneamente com a destruição do fungo e formação de cicatrizes estéreis. Eventualmente pode desenvolver a doença ativa e causar lesões pulmonares localizadas ou benignas com subsequente disseminação para outros órgãos e tecidos com estabelecimento de foco de latência após a involução das lesões primárias (Bazan et al., 1991). Este quadro assintomático e as várias manifestações clínicas da doença – aguda e crônica - são dependentes tanto das condições genéticas, imunológicas, ocupacionais e sócio econômicas em que o hospedeiro se encontra quanto da virulência das amostras de P. brasiliensis (Tonelli & Freire, 2000).
Clinicamente, a PCM pode se manifestar sob duas formas distintas, a forma juvenil aguda (subaguda) e a forma crônica (adulta).
A forma aguda ou subaguda ocorre em menos de 10% dos casos de paracoccidioidomicose. A maioria dos doentes são crianças e adolescentes de ambos os sexos, e ocasionalmente pode ocorrer em adultos jovens. Há uma progressão rápida do fungo com o acometimento do sistema reticuloendotelial (linfonodos, baço, fígado e medula óssea) (Tonelli & Freire, 2000) conduzindo a um grave comprometimento da imunidade celular, diminuição dos linfócitos T e a presença de altos níveis de anticorpos específicos (Calich et al.,1998).
Já a forma crônica corresponde a mais de 90% dos casos diagnosticados, sendo mais freqüente em adultos do sexo masculino com idade entre 30 e 50 anos (Tonelli & Freire, 2000). Geralmente os casos são provenientes de recidivas do foco primário pulmonar quiescente por longo período de tempo (Bazan et al., 1991).
INTRODUÇÃO I.6 - Mecanismos de defesa do organismo contra a PCM
Tanto a resposta imune humoral quanto a mediada por células representam um importante papel nos mecanismos de defesa do hospedeiro contra o P. brasiliensis. No entanto, esses mecanismos dependem largamente da imunidade inata e da ativação de células T helper (TH) no controle inicial da infecção (Yoneto et al., 1999).
Como dito anteriormente, a doença apresenta um amplo espectro de manifestações imunológicas e clínicas, que varia desde as formas benignas até as mais graves dependendo da resistência do indivíduo (Pina et al., 2004). Entre os pacientes com PCM, os altos níveis de anticorpos específicos, a ativação policlonal e a resposta imune celular deprimida estão associados com as formas mais graves da doença, enquanto que a imunidade mediada por células está fortemente envolvida na resistência ao fungo (Cano et al., 1998; Calich, 1998). I.6.1 - Imunidade Inata
I.6.1.1 - Neutrófilos e Macrófagos
A fagocitose, realizada por neutrófilos e macrófagos, é considerada um importante mecanismo efetor no controle da PCM. Quando o P. brasiliensis alcança os alvéolos pulmonares, há inicialmente uma interação com os macrófagos alveolares com posterior indução de compostos quimiotáticos, os quais estimulam a migração de neutrófilos em direção ao local de liberação desses mediadores, fortalecendo com isso os mecanismos de defesa do organismo (Franco, 1986). Em pacientes com as formas disseminadas e nos infectados com as amostras mais virulentas do fungo, os neutrófilos fagocitam normalmente, porém apresentam deficiência na digestão do microrganismo (Franco, 1986). Entretanto, os neutrófilos contribuem para a morte do fungo através da liberação de metabólitos de oxigênio e degranulação após a ligação do fungo à sua superfície (Dias et al., 2005).
INTRODUÇÃO Em macrófagos não ativados, foi demonstrado que há multiplicação dos fungos internalizados, porém estas células quando ativadas pelo IFN - DSUHVHQWDP XPD habilidade fungicida importante na proteção contra a infecção (Cano et al., 1998; Popi et al., 2002). Além disso, estas células ativadas produzem espécies reativas de nitrogênio (NOs) que inibem o dimorfismo do fungo auxiliando no controle da infecção (Gonzalez et al., 7DQWR R ,)1 TXDQWR R 71) . FRQIHUHP UHVLVWência ao indivíduo pela formação de granulomas e produção de NO (Soares et al., 2001).
I.6.1.2 - Células Natural Killer
As células Natural Killer (NK) limitam o crescimento em cultura do P. brasiliensis (Franco, 1986). Entretanto, apesar destas células terem se mostrado importantes no desencadeamento de resposta imune inata contra uma variedade de patógenos, devido a sua atividade citotóxica e produção de citocinas (especialmente IFN - Yoneto et al., 1999), em pacientes com PCM, foi observada uma atividade reduzida destas células em relação a dos indivíduos normais (Peraçoli et al., 2003).
Estes dados sugerem que as células NK não exercem um papel crucial contra o P. brasiliensis, sendo incapazes de controlar a sua disseminação após infecção inicial (Peraçoli et al., 2003).
I.6.1.3 - Sistema Complemento
O sistema complemento pode ser ativado pelo P. brasiliensis, o qual desencadeia uma fagocitose mais eficiente pelos macrófagos devido à atuação dos componentes do complemento na opsonização do microrganismo (Calich et al., 1985). Entretanto, Burger e colaboradores (1985) sugeriram que a presença do componente do complemento C5 não está associada a proteção contra a doença, uma vez que as linhagens de camundongos
INTRODUÇÃO isogênicos, com e sem deficiência de C5, exibiram a mesma suscetibilidade à infecção experimental com o fungo patogênico.
I.6.2 - Imunidade Humoral
Como relatado anteriormente, é importante considerar a resposta imune humoral envolvida na proteção contra o P. brasiliensis. Os anticorpos contribuem para a proteção do hospedeiro contra o microrganismo que se encontra extracelularmente, através de mecanismos tais como opsonização, ativação do sistema complemento, neutralização de toxinas e inibição da aderência do fungo à célula do hospedeiro. Intracelularmente, o agente infeccioso produz estímulos antigênicos capazes de induzir a produção específica de anticorpos anti - P. brasiliensis (Restrepo, 1975; Restrepo, 1982). Este fato é observado na paracoccidioidomicose, onde os altos níveis de anticorpos específicos estão associados com as formas mais severas da doença (Calich,1998). A análise dos títulos de anticorpos em soros de pacientes é utilizada para auxiliar no diagnóstico, acompanhamento da evolução da doença e resposta ao tratamento da PCM (Franco,1986).
Todas as classes de imunoglobulinas podem ser detectadas em pacientes infectados, com predomínio da classe IgG. Há uma ativação policlonal com aumento nos níveis de IgG, IgA e IgE, que provavelmente atuam na opsonização do agente infeccioso juntamente com os componentes do complemento (Calich,1985). Os níveis de IgG e IgE aumentam com a disseminação da doença e severidade de suas formas clínicas (Franco,1986), sendo que na fase crônica localizada, seus níveis são baixos. Os níveis de IgA mostraram – se elevados principalmente na fase crônica e os níveis de IgM se mantiveram dentro dos limites normais em todas as fases da PCM (Baida et al., 1999).
INTRODUÇÃO I.6.3 - Imunidade Celular
A imunidade celular é considerada o principal mecanismo de defesa contra o P. brasiliensis (Franco, 1986; Cano et al., 1998; Souto et al., 2000). A importância dos linfócitos T na doença foi demonstrada em estudos utilizando – se camundongos atímicos, Nude (Nu/Nu), que são desprovidos de timo e, portanto deficientes de imunidade mediada por células T (Kerr et al., 1988; Burger et al., 1996). Segundo Burger e colaboradores (1996), estes animais desenvolveram infecção severa e generalizada com intenso parasitismo e apresentaram sobrevida menor do que os normais. Entretanto, os animais conservaram a habilidade de controlar a disseminação fúngica durante as fases iniciais da infecção (Calich et al., 1998). Estes fatos demonstram a importância dos linfócitos T e da imunidade inata no estabelecimento da imunidade protetora contra a infecção por P. brasiliensis (Calich et al., 1998).
Como em várias doenças crônicas, os fatores responsáveis pela depressão da imunidade celular estão presentes na paracoccidioidomicose. A natureza destes fatores inibitórios ainda não está bem elucidada, mas acredita-se que anticorpos específicos, complexos imunes, produtos do próprio fungo e outras substâncias podem exercer um efeito imunossupressor (Franco,1986).
Os linfócitos T podem se diferenciar em linfócito T citotóxico e linfócito T auxiliar (Th1 e Th2). Segundo Calich e colaboradores (1998), a resistência à PCM está associada a ativação progressiva e equilibrada de células T CD4+ do tipo Th1, enquanto que a susceptibilidade refere-se a ativação precoce e intensa de células CD4+ do tipo Th2 e CD8+.
Os linfócitos do tipo Th1 e Th2, apesar de não serem distinguidos fenotipicamente , apresentam diferenças quanto ao tipo de resposta imunológica desencadeada e o padrão e citocinas liberadas (Calich & Kashino, 1998). Apesar de não haver um padrão de resposta
INTRODUÇÃO imune Th1/Th2 totalmente polarizado (Calich, 1998) os linfócitos do tipo Th1 produzem FLWRFLQDV,/,)1H71).HHVWLPXODPDUHVSRVWDLPXQHFHOXODUHQTXDQWRRWLSR Th2 favorece a produção de IL - 4, IL - 5, IL – 6 e IL - 10 e desencadeiam a imunidade humoral (Arruda et al., 2004; Pina et al., 2004). As células TCD8+ são necessárias para a remoção eficiente de fungos dos tecidos de camundongos infectados com P. brasiliensis, pois possuem uma atividade protetora precoce e eficaz na resposta imune desencadeada pelos animais suscetíveis (Calich et al., 1998; Cano et al., 2000).
I.7 – Reação granulomatosa
A resposta tecidual do hospedeiro ao P. brasiliensis é caracterizada pela reação de hipersensibilidade do tipo granulomatosa, com participação ativa de células T, atuando no recrutamento e na ativação dos macrófagos. Evidências diretas e indiretas indicam que o granuloma esta intimamente relacionado à resposta imune do hospedeiro, podendo representar uma resposta tecidual imunoespecífica destinada a destruir, bloquear e impedir a multiplicação do fungo (Franco, 1986).
Os granulomas causados pela reação ao P. brasiliensis são constituídos por macrófagos e linfócitos, sendo que os primeiros estão localizados na parte central e os últimos na periferia destes. As células gigantes, formadas a partir da fusão de macrófagos, são encontrados no interior dos granulomas. As células viáveis do fungo podem ser observadas no interior das células gigantes ou livres apresentando brotamento simples ou múltiplo (Franco, 1989).
Os linfócitos T sensibilizados pelos antígenos fúngicos concentram – se no sítio de interação com o microrganismo. Quando ativados secretam diferentes linfocinas, as quais atuam na resposta imune celular. Concomitante a secreção, há formação de edema local e
INTRODUÇÃO vasodilatação, ativação de macrófagos, diferenciação e maturação em células epitelioides, ativação de fibroblatos e aumento na síntese de colágeno (Franco, 1986).
É importante salientar que, em pacientes com a doença benigna, a resposta imune induz a formação de granulomas compactos e densos com níveis baixos de células fúngicas enquanto que nos pacientes que desenvolvem a doença severa, há geralmente, a formação de granulomas frouxos, associados com grandes quantidades de células fúngicas viáveis (Moscardi-Bacchi et al., 1994).
I.8 - Diagnóstico
O diagnóstico conclusivo da paracoccidioidomicose é obtido laboratorialmente através da demonstração e do reconhecimento do agente em preparados histológicos, exame a fresco ou em cultivo. Tais procedimentos são conhecidos como técnicas diretas de diagnóstico (Londero & Melo, 1998).
A microscopia direta permite a visualização de células leveduriformes arredondadas, isoladas ou agrupadas, apresentando dupla parede refringente; com brotamentos simples ou múltiplos (Lacaz, 1994b).
Os exames histológicos revelam formação granulomatosa, com presença de células epitelióides e células gigantes multinucleadas. Células fúngicas viáveis podem ser encontradas no interior destas últimas ou livres nos tecidos (Faria, 1971; Bogliolo, 1976).
Nem sempre os procedimentos de observação microscópica e isolamento fúngico são acessíveis. Neste caso métodos indiretos auxiliam no diagnóstico de pacientes com sinais ou sintomas clínicos sugestivos da PCM.
INTRODUÇÃO A sorologia permite o acompanhamento do paciente durante e após o tratamento, através do exame de amostras seriadas do soro (Restrepo, 1984; Mendes et al., 1994; Marques, 2003).
Vários são os testes sorológicos freqüentemente utilizados para detecção de anticorpos específicos: imunodifusão dupla (ID), contra – imunoeletroforese (CIE), reação de fixação de complemento (FC), Imunofluorescência indireta (IF), ensaio imunoenzimático (ELISA) e immunoblotting (Restrepo, 1992). A técnica de escolha utilizada deve aliar sensibilidade à especificidade, para que o valor preditivo seja máximo e reproduzível (Marques, 2003).
Os resultados destes testes, no entanto, devem ser criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados clínicos, dados epidemiológicos e outros exames laboratoriais, para um diagnóstico definitivo (Marques, 2003).
O uso de testes sorológicos na rotina de diagnóstico da paracoccidioidomicose é limitado devido, principalmente, as dificuldades na obtenção de antígenos purificados do P. brasiliensis, na padronização dos testes sorológicos e reatividade cruzada (Puccia,1986). Além disso, tratam – se de técnicas ainda restrita a poucos serviços e mais utilizadas na área da pesquisa.
A reação intradérmica com a paracoccidioidina é utilizada na determinação de áreas endêmicas da paracoccidioidomicose através de inquéritos epidemiológicos, não sendo adequada para diagnosticar a doença (Lacaz, 1956; Fava Netto, 1976). Devido à depressão da imunidade celular, a reação pode ser negativa nas formas graves da doença enquanto pode – se observar positivação do teste em grande número de casos tratados com sucesso e em pacientes sensíveis à paracoccidioidina (Fava Netto et al., 1969). Além disso, indivíduos não portadores da PCM, que residem ou residiram em zonas endêmicas da doença, podem desenvolver reação positiva ao antígeno (Lacaz,1951)
INTRODUÇÃO Outros exames complementares como hemograma, dosagem de proteína C reativa e exame de imagens são utilizados com freqüência para diagnóstico da extensão do acometimento da micose.
I.9 - Tratamento
A eficácia do tratamento da PCM depende não somente da droga anti-fúngica escolhida, mas também da implementação de medidas que melhorem as condições gerais do paciente e do acompanhamento pós terapêutico prolongado, para evitar recidivas da doença (Veronesi, 1997; Tonelli & Freire, 2000).
O paciente, antes de iniciar a terapêutica anti–fúngica específica, necessita de medidas para o melhoramento do seu quadro nutricional e da imunodepressão celular associada a infecção pelo P. brasiliensis. Além disso, devem-se diagnosticar e tratar infecções concorrentes como enteroparasitoses e co-infecções bacterianas (Marques, 2003).
A escolha da melhor opção terapêutica tem que levar em consideração não apenas a eficácia e segurança da droga anti-fúngica, mas também o acesso do paciente ao medicamento durante todo o tratamento. Uma vez que a maioria dos indivíduos acometidos por esta micose apresenta condição sócio econômica precária e, portanto são incapazes de custear o tratamento prolongado. Desta forma, a medicação prescrita deve ser preferencialmente fornecida gratuitamente pelo sistema de saúde público (Veronesi, 1997).
Atualmente, as drogas mais utilizadas no tratamento da PCM pertencem ao grupo dos sulfanamídicos (Restrepo et al., 1990), dos antibióticos poliênicos, particularmente a anfotericina B (Lacaz & Sampaio, 1958) e dos derivados de imidazol (Restrepo, 1990).
O tratamento é prolongado e apesar de não haver um consenso quanto a um esquema terapêutico deve-se considerar os critério de cura (clínico, micológico, radiológico e
INTRODUÇÃO imunológico) e acompanhamento periódico após a interrupção do tratamento para reduzir as chances de recidivas da doença (Del Negro,1974).
A suspensão precoce do tratamento causa altos índices de reativação da doença e isso tem feito com que o tratamento seja demorado (em média, de seis meses a dois anos). Atualmente, sugere-se que o tratamento seja dividido em duas fases: (1) ataque - que visa ao controle dos sinais clínicos e (2) manutenção - que visa reduzir as chances de recidiva da \doença (Mendes et al., 1994; Reis & Colombo, 1999).
JUSTIFICATIVA
JUSTIFICATIVA Até o momento não há vacina efetiva contra a PCM, nem para qualquer outra micose de importância médica. Apenas uma vacina profilática baseada em esférulas de Coccidioides immitis inativadas por formalina foi testada em humanos, mas esta não conferiu proteção em uma triagem randomizada (Pappagianis, 1993; Cole et al., 2004). Dessa forma, torna-se necessário pesquisar novas alternativas na busca de uma vacina preventiva ou terapêutica contra a paracoccidioidomicose, tendo em vista as dificuldades encontradas no tratamento prolongado e nas constantes recidivas da doença.
Muitas vacinas vivas, obtidas a partir de patógenos atenuados, tem sido utilizadas com sucesso na prevenção de muitas doenças. A grande vantagem atribuída a este tipo de imunização é devida à capacidade dos microrganismos atenuados de apresentarem seus antígenos seqüencialmente ao hospedeiro e poderem até mesmo sintetizar antígenos que só são produzidos durante a infecção. Estes mimetizam a infecção natural sendo capazes de desencadear uma resposta imune protetora duradoura, devido ao estabelecimento de uma memória imunológica, mas sem o risco uma infecção progressiva (Hiramoto et al., 2002).
Um exemplo bem sucedido e bastante conhecido é a vacina BCG utilizada na prevenção da tuberculose. O microrganismo, Mycobacterium bovis, foi atenuado acidentalmente após o cultivo da bactéria, in vitro, por um período prolongado de 13 anos. Após sucessivas passagens da amostra em cultura, foi observada perda gradual da virulência e alterações da sua morfologia sem alteração da sua imunogenicidade. A BCG tem sido utilizada com êxito sem registros de grandes complicações (Andrade, et al., 2005). A vacina tríplice viral, constituída de vírus vivos atenuados, contra sarampo, caxumba e rubéola, também tem se mostrado eficaz desde seu licenciamento no início da década de 70. Os eventos imediatos de hipersensibilidade após a administração da vacina viva são extremamente raros, sendo contra - indicada apenas em pessoas com história de reação
JUSTIFICATIVA anafilática após ingestão de ovo ou da neomicina contida na formulação da vacina (Andrade et al., 2005).
As vacinas utilizando microrganismos vivos atenuados por radiação ionizante têm sido estudadas desde 1950 (Walles & Kusel, 1992). Porém, a utilização de fungos radioatenuados nunca foi explorada para este propósito.
As irradiações com raios gama e raios X se apresentaram de forma consistente como bons agentes de atenuação para uma variedade de patógenos. Os microrganismos radioatenuados, freqüentemente, perdem a sua capacidade patogênica, mantendo seus aspectos morfológicos, e estimulam uma resposta imune específica. Em alguns casos os patógenos atenuados por radiação ionizante, por razões ainda não esclarecidos, são mais imunogênicos que os controles não irradiados (Walles & Kusel, 1992).
Vacinas radioatenuadas contra o Dictyocaulus viviparus, causador da bronquite parasitária em bovinos, tem sido utilizadas com êxito desde 1958 (Taylor et al., 1986). Em adição, larvas irradiadas utilizadas no controle da bronquite parasitária provocada por D. filaria sp. em carneiros e cabras (Sharma et al.,1988), e na imunização de cães contra Ancylostoma caninum (Vinayak et al., 1981) têm sido empregadas em escala comercial.
Imunizações efetivas em animais de laboratório têm sido alcançadas utilizando vários protozoários irradiados, incluindo espécies de Plasmodium (Herrington et al.,1990; Clyde,1990), Leishmania (Yang et al.,1991; Rivier et al., 1993; Bonetti et al., 1993), Trypanosoma (Vos & Gardiner, 1990) e Toxoplasma gondii (Duquesne et al.,1991). Estudos em modelos animais utilizando cercárias radioatenuadas de Schistosoma mansoni também conferiram alto grau de proteção, contra a esquistossomose (Coulson, 1997).
Em adição, Hiramoto e colaboradores (2002) imunizaram camundongos com taquizoítos de Toxoplasma gondii atenuados por irradiação. Após a infecção desafio com os
JUSTIFICATIVA cistos do parasita, houve um aumento da sobrevivência dos animais imunizados. Os taquizoítos irradiados perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram seu metabolismo respiratório, a capacidade de invadir células e de sintetizar proteínas.
Além dos exemplos citados acima, resultados satisfatórios foram obtidos nos estudos de muitos helmintos e nematódeos, incluindo Onchocerca volvulus (Prince et al., 1992), Brugia malayi (Yates & Higashi, 1986), Brugia pahangi (Chusattayanond & Denham, 1986), Toxocara canis (ABO-Shehada et al., 1991), Nippostrongylus brasiliensis (Wedrychowicz et al., 1984), Trichinella spiralis (Agyei-Frempong & Catty, 1983) e Ascaris suum (Urban & Tromba, 1982) e várias espécies de Schistosoma (Dean, 1983).
Em humanos, uma vacina obtida a partir de esporozoítos irradiados de Plasmodium falciparum foi testada em voluntários. Esta foi capaz de estimular uma resposta imune protetora contra a malária (Hoffman et al., 2002).
Em nosso laboratório desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Demonstramos que estas leveduras perderam a capacidade de produzir infecção e de se multiplicar, porém mantiveram preservadas sua viabilidade, atividade metabólica e conservaram também a capacidade de sintetizar os mesmos antígenos presentes nas leveduras nativas (Demicheli et al., 2006). Demostramos ainda que as leveduras radioatenuadas conservam seus aspectos ultraestruturais fundamentais, embora uma extensiva degradação do DNA tenha sido verificada (Demicheli et al., 2007). A partir disso, iniciamos uma nova etapa da nossa pesquisa com o propósito de verificar se as leveduras radioatenuadas seriam um imunógeno eficaz, capaz de estimular uma reposta imune protetora contra a PCM em modelos animais.
OBJETIVOS
OBJETIVOS III.1 - Objetivo geral
• Avaliar a capacidade das leveduras radioatenuadas do P. brasiliensis de induzir uma resposta imune protetora em modelo animal.
III.2 - Objetivos específicos
• Avaliar a perda da virulência da levedura radioatenuada em camundongos susceptíveis e imunodeficientes.
• Realizar ensaios de proteção, em modelo animal, utilizando as leveduras radioatenuadas para imunização.
• Avaliar a influência do número de imunizações no estabelecimento da resposta. • Avaliar a influência do tempo no estabelecimento da resposta imune.
• Avaliar a resposta protetora de curto e longo prazo.
• Analisar a resposta imune humoral induzida pelas leveduras radioatenuadas.
• Analisar a dinâmica da produção dos isotipos de IgG (IgG1 e IgG2a) nos animais imunizados e infectados.
• Analisar a dinâmica da produção de citocinas IFN - γ, TNF - α, IL - 10 e IL - 5 nos animais infectados e imunizados.
METODOLOGIA
METODOLOGIA IV.1 - Camundongos
Camundongos machos susceptíveis (BALB/c), com 6 a 8 semanas de idade, foram cedidos pelo centro de bioterismo do ICB/UFMG. Camundongos machos imunodeprimido (Nude - Nude), também com 6 a 8 semanas de idade, foram cedidos pelo centro de bioterismo da UFOP. Os animais foram mantidos sob condições livres de patógenos específicos.
Os protocolos, utilizados neste trabalho para os experimentos realizados com animais, foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG), número do protocolo 132/2006 (anexo 1).
IV.2 - Microrganismos
A amostra de P. brasiliensis (Pb18), utilizada na infecção dos camundongos, foi obtida de um isolado virulento humano e mantida em meio de cultura YPD (extrato de levedura 0,5%, peptona 0,5% e dextrose 1,5%) - ágar, à temperatura de 35ºC, com repiques semanais.
A cultura de P. brasiliensis, crescida em meio sólido, foi radioatenuada no laboratório de irradiação gama do CDTN/CNEN, em fonte uniforme de 60Co, na presença de oxigênio e a temperatura ambiente. A dose utilizada para atenuação do microrganismo foi de 6,5kGy a uma taxa de dose de 1000 Gy/h (Demicheli et al., 2006).
METODOLOGIA IV.3 – Avaliação da viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada pelo método modificado de coloração com verde Janus. O extrato de células de P. brasiliensis (20µL) foi incubada 20µL do corante verde Janus 0,05%. Após 8 minutos de incubação a proporção de células viáveis foi determinada por contagem em câmera de Neubauer. Por este método as células viáveis permanecem descoradas e as células mortas se coram em azul.
IV.4 - Recuperação da virulência do P. brasiliensis
Como mencionado anteriormente, o P. brasiliensis perde a sua virulência após o seu cultivo prolongado em meio de cultura. Passagens sucessivas da amostra atenuada em animais regeneram os polímeros constituintes da parede celular do fungo recuperando a sua virulência inicial (Castañeda et al., 1987; Brummer et al., 1990; Kashino et al., 1990; San-Blas & Vernet, 1977).
Camundongos machos BALB/c sadios foram infectados pelo plexo orbital com 107 células viáveis de P. brasiliensis. Após 30 dias de infecção, os animais foram sacrificados e seus pulmões homogeneizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,5M, pH 7,2. Em seguida, 300 µL do macerado foi plaqueado em meio BHI (infuso cérebro-coração) – ágar suplementado com soro fetal bovino 4%, sobrenadante de cultura 5% e gentamicina 1µL/mL. A virulência do fungo foi recuperada em camundongos BALB/c após duas infecções sucessivas, com intervalo de 30 dias cada.
METODOLOGIA IV.5 - Preparação do exoantígeno MEXO
As colônias não irradiadas de P. brasiliensis, crescidas em meio YPD-ágar durante 7 dias foram ressuspendidas em PBS 0,15M, vortexadas por 30 seg. e centrifugadas em uma rotação de 12000 rpm por 30 min, a 4ºC. O sobrenadante coletado foi filtrado (filtro estéril 0.45mm) e armazenado em glicerol 10% a – 20º C(Reis et al., 2005). A dosagem da proteína foi feita pelo método de Bradford (Bradford, 1976).
IV. 6 - Dosagem de proteínas - Método de Bradford
Primeiramente, uma curva padrão de diluição 0,5 a 1,5 µg de proteína/20µL de H2O
foi realizada utilizando-se uma solução padrão de albumina bovina (BSA) 1 mg/mL. Concomitantemente a essa curva, 20µL da amostra a ser dosada foi adicionada, em duplicata, a cada poço da placa de microtitulação, juntamente com 180 µL do reagente de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250 0,1% em solução aquosa contendo etanol 5% e ácido fosfórico 10%, filtrado em papel de filtro número 1). A placa foi mantida por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz e os valores de absorbância determinados a 595nm em leitor de Elisa (Elx800, Bio-Tek Instruments. Inc.). Os valores obtidos foram comparados com a curva padrão de BSA conforme a fórmula:
Concentração de proteína = Abs x Fc x Fd x Cv. No qual: - Abs: média das leituras das amostras em duplicata
- Fc: fator de conversão = concentração de proteína para cada ponto da curva de BSA. - Fd: fator de diluição
METODOLOGIA IV.7 - Infecção e imunização experimental nos camundongos utilizados nos ensaios de virulência e proteção
Para a infecção e imunização, os camundongos machos BALB/c e Nude/Nude foram anestesiados intraperitonealmente com uma solução contendo quetamina 20% e xilazina 20% em 60% de PBS 0,15M. Em seguida, os animais foram infectados e imunizados pelo plexo orbital, via endovenosa, com 1x105 células viáveis de P. brasiliensis não irradiado e
radioatenuado.
IV.8 - Ensaio de virulência
A atenuação da virulência de P. brasiliensis foi avaliada a partir das unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas em camundongos infectados com a levedura radioatenuada e análise histológica dos órgãos dos animais infectados.
Os camundongos utilizados no teste de virulência foram infectados com P. brasiliensis não irradiado ou radioatenuado. Os camundongos BALB/c e Nude/Nude foram divididos em quatro grupos experimentais; Grupo controle positivo (G1-não irradiado), composto por 6 camundongos machos BALB/c infectados com o P. brasiliensis não irradiado; Grupo 2 (G2-radioatenuado), composto por 6 camundongos machos BALB/c infectados com P. brasiliensis radioatenuado; Grupo 5 (G5-Nude infectado), composto por 3 camundongos machos Nude-Nude infectados com a levedura radioatenuada e Grupo 6 (G6-Nude controle), composto por 2 camundongos Nude-Nude que não sofreram qualquer intervenção. Os órgãos (pulmão, baço e fígado) removidos dos animais sacrificados 30 e 90 dias após a infecção foram utilizados para contagem de UFCs (unidade formadora de colônia), análise histológica e dosagem de citocinas.
METODOLOGIA Quadro 1: Grupos experimentais utilizados no ensaio de virulência
G1-não irradiado
Grupo dos camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis não irradiado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.
G2-radioatenuado
Grupo dos camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis radioatenuado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.
G5-Nude infectado
Grupo dos camundongos Nude-Nude infectados com P. brasiliensis radioatenuado, sacrificados 30 dias após a infecção.
G6-Nude controle
Grupo dos camundongos Nude–Nude não infectados.
IV.9 - Ensaio de proteção em PCM experimental
Para checar o efeito protetor conferido pelas leveduras radioatenuadas de P. brasiliensis, os camundongos BALB/c foram divididos em cinco grupos experimentais; Grupo dos animais não infectados (Controle negativo), composto por 3 camundongos sadios, que não sofreram qualquer intervenção; Grupo controle positivo (G1-não irradiado), composto por 6 camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado; Grupo 2 (G2-radioatenuado), composto por 6 camundongos machos BALB/c imunizados com P. brasiliensis radioatenuado; Grupo dos animais imunizados (G3), composto por 18 camundongos imunizados, uma única vez, com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis. Este grupo foi dividido em três subgrupos que foram desafiados com o P. brasiliensis não irradiado 30 (G3A), 45 (G3B) e 60 (G3C) dias após a imunização e sacrificados 30 e 90 dias após o desafio; Grupo dos animais imunizados (G4), composto de 18 camundongos imunizados duas vezes consecutivas, com intervalo de 15 dias, com a levedura
METODOLOGIA radioatenuada de P. brasiliensis. De forma semelhante ao grupo anterior este foi dividido em três subgrupos que foram desafiados com P. brasiliensis não irradiado 30 (G4A), 45 (G4B) e 60 (G4C) dias após a segunda imunização e sacrificados 30 e 90 dias depois.
Os órgãos (baço, fígado e pulmão) removidos dos animais sacrificados foram utilizados para contagem de UFCs, análise histológica e dosagem de citocinas.
Quadro 2: Grupos experimentais utilizados no ensaio de proteção
G1- não irradiada Grupo dos animais controle infectados com P. brasiliensis não irradiado.
G2-radioatenuado Grupo dos camundongos BALB/c imunizados com P. brasiliensis radioatenuado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.
G3 – imunizados 1x Grupo dos animais imunizados, uma única vez, com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis, desafiados 30 (G3A), 45 (G3B) e 60 (G3C) dias após a imunização e sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. G4 – imunizados 2x Grupo dos animais imunizados duas vezes consecutivas, com intervalo de 15 dias, com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis, desafiados 30 (G4A), 45 (G4B) e 60 (G4C) dias após a segunda imunização e sacrificados 30 e 90 dias após o desafio.
Controle negativo Grupo dos camundongos não infectados.
A eficiência da atividade protetora, conferida pela levedura radioatenuada, foi analisada comparando-se a diferença entre o número total de UFCs recuperadas após a infecção desafio (NI), com o número total recuperado do grupo controle (NC), conforme a fórmula descrita abaixo:
