KARINA DE OLIVEIRA PELIÇARI
AVALIAÇÃO COMPARATIVA EM PACIENTES COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO DE INÍCIO ADULTO E JUVENIL: PERFIL CLÍNICO, LABORATORIAL E
CITOCINAS IL-6, IL-10 E IL-12
Campinas 2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
KARINA DE OLIVEIRA PELIÇARI
AVALIAÇÃO COMPARATIVA EM PACIENTES COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO DE INÍCIO ADULTO E JUVENIL: PERFIL CLÍNICO, LABORATORIAL E
CITOCINAS IL-6, IL-10 E IL-12
ORIENTADORA: Profª Drª Simone Appenzeller
COORIENTADORA: Profª Drª Lilian Tereza Lavras Costallat
Campinas 2017
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na Área de Concentração em Clínica Médica.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA KARINA DE OLIVEIRA PELIÇARI, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. SIMONE APPENZELLER.
BANCA EXAMINADORA DE DEFESA DE DOUTORADO
[KARINA DE OLIVEIRA PELIÇARI]ORIENTADOR: PROF. DRA. SIMONE APPENZELLER
COORIENTADOR: PROF. DRA. LILIAN TEREZA LAVRAS COSTALLAT
MEMBROS:
1. PROF. DRA. SIMONE APPENZELLER
2. PROF. DR. EVANDRO MENDES KLUMB
3. PROF. DR. LUÍZ CARLOS LATORRE
4. PROF. DR. MANOEL BARROS BÉRTOLO
5. PROF. DR. IBSEN BELLINI COIMBRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
À Dra. Simone Appenzeller, pela orientação, dedicação e pelo amadurecimento que nossas diferenças me proporcionaram. Com certeza, compartilhar seu conhecimento foi fundamental para a execução deste trabalho.
À Dra. Lilian Tereza Lavras Costallat, pela prontidão em oferecer ajuda, tirar dúvidas e apoiar este trabalho, enriquecendo meu conhecimento.
Aos alunos e funcionários do laboratório de reumatologia, pela inestimável ajuda e prontidão, foi um privilégio trabalhar e dividir minha vida com vocês!
À minha família, pelo amor incondicional e incentivo em cada escolha, meus sinceros agradecimentos por cada vez que se alegraram com a minha alegria e me consolaram nos momentos de dificuldades, dúvidas e frustrações, vocês são minha maior inspiração.
Ao Lucas, pelo carinho, apoio e compreensão em todas as etapas deste trabalho.
Aos meus amigos de Campinas, pela parceria nessa caminhada, foi um privilégio dividir risadas, lágrimas, conselhos e sonhos com vocês.
Aos pacientes e voluntários, por tornarem essa pesquisa uma realidade.
À banca examinadora, pela disposição e contribuição com este trabalho.
“Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana, seja apenas outra alma humana.”
Resumo
Objetivo: Comparar longitudinalmente manifestações clínicas e laboratoriais, tratamento e citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e início juvenil (LESj).
Métodos: Incluímos 1261 pacientes consecutivos com diagnóstico fechado de LES que acompanhavam no ambulatório de reumatologia e reumatologia pediátrica da UNICAMP. Os dados clínicos, laboratoriais e tratamento, foram obtidos de 1974 até 2016 atraves de um banco de dados especial. Os dados foram avaliados em dois momentos, no início (6 primeiros meses após o fechamento do diagnostico) e seguimento (após os 6 primeiros meses do fechamento do diagnóstico) da doença. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a idade de início da doença: LESj (inicio da doença ≤18 anos) e LESa (inicio da doença > 18 anos). 336 (27%) pacientes eram LESj [média de tempo de doença 12.1±8.1 anos] e 927 (73%) LESa [média de tempo da doença 19.4±10,7]. Posteriormente, separamos 130 pacientes [63 LESj (média de tempo de doença 7,3±4,2 anos) e 67 LESa (média de tempo de doença 7,7 ] pareados por tempo de doença, e incluímos 40 controles sadios com gênero semelhante aos pacientes para a analise das citocinas. Realizamos 4 coletas de sangue em 4 tempos distintos (TI, TII, TIII e TIV) num período de 2 anos, além das coletas, foram avaliadas manifestações clínicas, laboratoriais, tratamento, atividade da doença (SLEDAI), sintomas de ansiedade (BAI) e depressão (BDI) foram avaliados em todos os tempos. Danos cumulativos (SDI) foram avaliados no ultimo tempo. Os níveis das citocinas Th1 (IL-12) e Th2 (IL-6 e IL-10) foram mensurados pelo teste de ELSIA e comparados através de testes não paramétricos. Foi considerado significativo quando o p
Resultados: No inicio e no seguimento da doença, os pacientes LESj tinham significativamente mais rash malar [início p=0,011 e seguimento p=0,019], ulceras orais [início p=0,002 e seguimento p<0,001], cefaleia [início p<0,001 e seguimento p<0,001], coreia [início p=0,001 e seguimento p=0,001] e proteinuria [início p=0,006 e seguimento p=0,003] que pacientes LESa. Pacientes LESa tinham significativamente mais artrite [início p<0,001 e seguimento p<0,001] e fenômeno de Raynaud [início p=0,001 e seguimento p=0,049]. Anti-dsDNA era significativamente mais frequente em pacientes LESj (p<0,001) e anti-Ro foi mais frequente em pacientes LESa (p=0,020). Pacientes LESj tomavam mais doses de prednisona (p<0,001), azatioprina (p=0,023), ciclofosfamida (p<0,001) e micofenolato (p<0,001). Durante o seguimento, significativamente mais pacientes LESj
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morreram (p=0,020). Em relação às citocinas IL-6 foi mais elevado em pacientes LESa quando comparados com controles sadios (TI p=0,013, TII p=0,015, TIII p=0,004, TIV p=0,634) e IL-12 foi significativamente mais elevada em pacientes LESj quando comparado com controles sadios (TI p=0,04, TII p<0,001, TIII p=0,015, TIV p=0,021). No entanto, não houve diferença significativa em todos os tempos em nenhuma citocina entre pacientes LESa e LESj. Em pacientes LESa, a IL-6 esteve associada a cefaleia (p=0,006), artrite (p=0,044) e nefrite (p=0,012), IL-10 esteve associada a nefrite (p=0,043), hipocomplementemia (p=0,001) e atividade da doença (p=0,001) e IL-12 esteve associada a alopecia (p=0,025) e leucopenia (p=0,044). Em pacientes LESj, IL-6 esteve associada a artrite (p=0,022) e rash malar (p=0,012).
Conclusão: Pacientes LESj tem uma maior frequência de manifestações mucocutâneas e sintomas neuropsiquiátricos, enquanto que LESa tem maior frequencia de artrite. Pacientes LESa e LESj com longo tempo de doença, apresentam níveis similares de citocinas. Em pacientes LESa IL-6 esteve associada a cefaleia, artrite e nefrite e no LESj IL-6 esteve associada a artrite e rash malar. IL-10 esteve associada à nefrite, hipocomplementemia e atividade da doença e IL-12 esteve associada à alopecia e leucopenia no LESa.
Abstract
Objective: To compare longitudinally clinical and laboratory manifestations, treatment and cytokines in childhood (cSLE) and adult-onset (LESa) systemic lupus erythematosus.
Methods: We included 1261 consecutive patients with closed diagnosis of SLE that were followed at the Adult and Pediatric Rheumatology Unit of the State University of Campinas. Clinical, laboratory and treatment data were obtained from 1974 to 2016 through a special database. The data were evaluated in two moments, at onset (6 months after the diagnosis was closed) and follow-up (after the first 6 months after diagnosis) of the disease. Patients were divided into two groups according to the age of disease onset: cSLE (onset of disease ≤18 years) and LESa (onset of disease> 18 years). 336 (27%) patients were cSLE [mean disease duration 12.1 ± 8.1 years] and 927 (73%) LESa [mean disease duration 19.4 ± 10.7]. Subsequently, we separated 130 patients [63 cSLE (mean disease duration 7.3 ± 4.2 years) and 67 LESa (mean disease duration 7.7 ± 3.1)], matched by disease duration, and included 40 controls with similar gender to patients for cytokine analysis. We performed 4 blood samples at 4 different times (TI, TII, TIII and TIV) in a period of 2 years, in addition to the collections, clinical manifestations, laboratorial, treatment, disease activity (SLEDAI), anxiety (BAI) and depression (BDI) symptoms were evaluated at all times. Cumulative damages (SDI) were assessed in the last time. Levels of Th1 (IL-12) and Th2 (IL-6 and IL-10) cytokines were measured by ELISA test and compared by non-parametric tests. It was considered significant when p≤0.05.
Results: At the onset and follow-up of the disease, cSLE patients had significantly more frequently malar rash [onset p=0.011 and follow-up p=0.019], oral ulcers [onset p=0.002 and follow-up p<0.001], migraine [onset p<0.001 and follow-up p<0.001], chorea [onset p=0.001 and follow-up p=0.001] and proteinuria [onset p=0.006 and follow-up p=0.003] than LESa patients. LESa patients had significantly more arthritis [onset p<0.001 and follow-up p<0.001] and Raynaud's phenomenon [onset p=0.001 and follow-up p=0.049]. Anti-dsDNA was significantly more frequent in cSLE patients (p<0.001) and anti-SSA was more frequent in LESa patients (p=0.020). cSLE patients took more doses of prednisone (p<0,001), azathioprine (p=0.023), cyclophosphamide (p<0.001), and mycophenolate (p<0.001). During follow-up, significantly more SLE patients died (p=0.020). In relation to cytokines, IL-6 was higher in LESa patients when compared to healthy controls (TI p=0.013, TII p=0.015, TIII p=0.004, TIV p=0.634) and IL-12 was significantly higher in cSLE patients when compared
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to healthy controls (TI p=0.04, TII p<0.001, TIII p=0.015, TIV p=0.021). However, there was no significant difference at all times in any cytokine between cSLE and LESa patients. In LESa patients, IL-6 was associated with migraine (p=0.006), arthritis (p=0.044) and nephritis (p = 0.012), IL-10 was associated with nephritis (p=0.043), hypocomplementemia (p=0.001) and disease activity (p=0.001) and IL-12 was associated with alopecia (p=0.025) and leukopenia (p=0.044). In cSLE patients, IL-6 was associated with arthritis (p=0.022) and malar rash (p=0.012).
Conclusion: cSLE patients have a higher frequency of mucocutaneous and neuropsychiatric manifestations, whereas LESa patients have a higher frequency of arthritis. cSLE and LESa patients with long disease duration, present similar levels of cytokines. In LESa patients, IL-6 was associated with migraine, arthritis and nephritis and in cSLE, IL-6 was associated with arthritis and malar rash. IL-10 was associated with nephritis, hypocomplementemia and disease activity, and IL-12 was associated with alopecia and leucopenia in LESa.
LISTA DE TABELA
Tabela 1. Critérios revisados para a classificação de LES...17 Tabela 2. Revisão dos critérios de classificação do LES...18 Tabela 3. Manifestações neuropsiquiátricas segundo o ACR...20 Tabela 4. Comparação das principais manifestações clínicas entre pacientes LESa e LESj...22
Capítulo I. Comparação longitudinal de manifestações clínicas e laboratoriais em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj)
Tabela 1. Estudos comparando o perfil da doença entre LESj e LESa...51 Tabela 2. Comparação de manifestações clínicas e laboratoriais entre LESj e LESa………...…52 Tabela 3. Comparção de autoanticorpos entre pacientes LESj e LESa………...……53 Tabela 4. Comparação do tratamento atual entre pacientes LESj e LESa……...…....53
Capitulo II. Comparação longitudinal do perfil de citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj).
Tabela 1. Comparação de manifestações clínicas e laboratoriais em pacientes com LESj vs. LESa nos quatro tempos avaliados...71 Tabela 2. Comparação do score de subtinas de ansiedade e depressão e atividade da doença em pacientes LESj vs. LESa...72 Tabela 3. Comparação de tratamento utilizado em pacientes LESj vs. LESa...73 Tabela 4. Manifestações clínicas e laboratoriais associadas às citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 no LESa e LESj...74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma de inclusão e divisão de indivíduos no estudo...28
Capitulo II. Comparação longitudinal do perfil de citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj).
Figura 1. Comparação do nível de IL-6 nos grupos LESj, LESa e controles sadios nos quatro tempos avaliados...74 Figura 2. Comparação do nível de IL-10 nos grupos LESj, LESa e controles sadios nos quatro tempos avaliados...75 Figura 3. Comparação do nível de IL-12 nos grupos LESj, LESa e controles sadios nos quatro tempos avaliados...75
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS aCL- Anti-cardiolipina
ACR- American College of Rheumatology Anti-dsDNA- Anti-DNA de fita dupla Anti-Sm- Anti-Smith
APC- Células apresentadoras de antígenos AVC- Acidente vascular cerebral
BAI- Inventário de ansiedade de Beck BDI- Inventário de depressão de Beck BHE-Barreira hematoencefálica CMV- Citomegalovírrus
DNA- Ácido dexoxirribonucléico DP- Desvio padrão
EBV- Epstein-Bar
ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ENA- Anticorpos contra antígenos extraídos do núcleo EUA – Estados Unidos da America
FAN- Fator antinuclear
FCM- Faculdade de Ciências Médicas HAS-Hipertensão arterial sitêmica HC- Hospital de Clínicas
HLA- Antígeno leucocitário humano INF-γ - Interferon gama
IL- Interleucina
BAI- Inventário de ansiedade de Beck BDI – Inventário de depressão de Beck BHE – Barreira hematoencefálica LA- Anticoagulante lúpico LCR- Líquido cefalorraquidiano LES- Lúpus eritematoso sistêmico LES NP- Lúpus neuropsiquiátrico NK-células Natural Killer
NMDA- Anticorpos contra o receptor N-metil-d-aspartato NP- Neuropsiquiátrico
RNA- Ácido ribonucléico RPM- Rotação por minuto
SLEDAI- Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index
SDI- Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American College of Rheumatology
Damage Index
SNC- Sistema nervoso central
TCLE- Termo de consentimento livre e esclarecido Th- Linfócitos T helper
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
UNICAMP- Universidade Estadual de Campinas UV- Radiação ultravioleta
Sumário
Resumo...7
Abstract...9
1. Introdução e revisão da literatura...16
1.1 Definição ...16
1.2 Epidemiologia...16
1.3 Critérios classificatórios do LES ...16
1.4 Manifestações clínicas e laboratoriais...18
1.4.1 Apresentação clínica no LES...18
1.4.2 Diferenças na apresentação clínica entre pacientes adultos e juvenis com LES...21 1.5 Patogenia ...22 1.5.1 Susceptibilidade genética ...22 1.5.2 Fatores ambientais ...23 1.5.3 Sistema neuroendócrino ...23 1.5.4 Produção de autoantígenos...23 1.5.5 Hiperatividade de células B e T ...24 2. Justificativa...27 3. Objetivos...27 3.1 Objetivo geral ...27 3.2 Objetivos específicos...27 4. Pacientes e Métodos...28
4.1 Capitulo I. Comparação longitudinal de manifestações clínicas e laboratoriais em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj)...28
4.1.1 Delineamento do estudo...28
4.1.2 Seleção dos pacientes...29
4.1.3 Análise clínico laboratorial e tratamento...29
4.1.4 Análise estatística...30
4.2 Capitulo II. Comparação longitudinal do perfil de citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj)...30
4.2.2 Seleção dos pacientes...30
4.2.3 Seleção dos indivíduos sadios não aparentados...31
4.2.4 Termo de consentimento livre e esclarecido...31
4.2.5 Análise clínico-laboratorial e tratamento...31
4.2.6 Análise de atividade e dano da doença...32
4.2.7 Avaliação dos sintomas de ansiedade e depressão...32
4.2.8 Determinação dos níveis séricos das citocinas...32
4.2.9 Análise estatística...35
5. Resultados... 36
5.1 Capitulo I. Comparação longitudinal de manifestações clínicas e laboratoriais em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj) ...36
5.2 Capitulo II. Comparação longitudinal do perfil de citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj)...54
6. Discussão geral...76
7. Conclusões...84
1. Introdução e revisão de literatura
1.1 Definição
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune, multissistêmica e crônica com intensa participação do sistema imunológico, possui um amplo espectro de manifestações clínicas e laboratoriais e é caracterizada por período de remissão e exacerbação (1-5).
1.2 Epidemiologia
O LES pode atingir ambos os sexos, porém, cerca de 90% dos pacientes do sexo feminino, principalmente na idade reprodutiva (2,6-8).
Muitas populações e etnias não possuem estudos de incidência, porém, nos Estados Unidos da América (EUA), foi estimada uma incidência entre 1,8 a 7,6 por 100.000 pessoas/anos (9). Na Europa, a taxa de incidência varia de 3,3 a 4,8 por 100.000 pessoas/ano (10). Foi reportada uma maior incidência de LES em afro americanos, americanos nativos e asiáticos comparados com caucasianos (11-13). Observa-se a frequência de 1 para cada 250 mulheres negras nos EUA; 22,4 para cada 100.000 asiáticos e 10,3 para cada 100.000 caucasianos (7, 14-17). Entretanto, apresenta-se como uma doença rara entre os negros africanos (18-19).
Um estudo no Brasil observou maior entre caucasoides, principalmente na região sudeste do país (20). Em um estudo realizado em Natal no Rio Grande do Norte, observou-se uma incidência anual de 8,4 por 100.000 habitantes (21).
Aproximadamente 15% a 20% dos diagnósticos são feitos na infância (22-33). A idade para o diagnóstico de LES de início juvenil (LESj), varia na literatura entre 14 e 18 anos (24,34-35). A partir de 2012, considerou-se que em pacientes com o diagnóstico fechado até os 18 anos de idade fossem classificados como LESj (36). Nas crianças, a relação entre mulheres e homens é de 1,4 a 5,8:1; nos adultos varia de 8:1 a 13:1; nos indivíduos de idade mais avançada, esta relação é de 2:1 (22-28,30-33, 37-38).
1.3 Critérios classificatórios no LES
Não existem critérios diagnósticos para o LES, portanto, é imprescindível uma cuidadosa investigação e exclusão de outras doenças, principalmente infecciosas e neoplásicas, entre outras. Em 1982 foi proposto pelo Colégio Americano de Reumatologia (ACR), critérios classificatórios da doença, utilizados para uniformizar os trabalhos de
pesquisa, contudo, também é utilizado para o diagnóstico. O paciente deve apresentar pelo menos quatro dos onze critérios para ter o diagnóstico de LES (39). Estes critérios foram revisados em 1997, e o item “presença de células LE”, constante do critério “alterações imunológicas”, foi excluído, e o teste falso positivo para sífilis foi substituído pela presença de anticorpos antifosfolípides (40) (Tabela 1).
Tabela 1. Critérios revisados para a classificação de LES (39).
Critério Observações
Rash malar Lesão eritematosa fixa em região malar, plana ou em relevo.
Lesão discoide Lesão eritematosa, infiltrada, com escamas queratóticas aderidas e tampões folicurares que evolui com cicatriz atrófica e discromia.
Fotossensibilidade Exantema cutâneo como reação não usual à exposição à luz solar.
Úlceras orais/ nasais Úlceras orais ou nasofaríngeas, usualmente indolores.
Artrite Não erosiva de 2 ou mais articulações
Serosite Pleurite
Pericardite
Doença renal Proteinúria maior que 0,5 g/dia Cilindros
Envolvimento do sistema nervoso central (SNC)
Convulsão Psicose
Alterações hematológicas Anemia hemolítica
Leucopenia menor que 4.000/mm3 Linfopenia menor que 1.500/mm3 Plaquetopenia menor que 100.000 /mm3 Alterações imunológicas Anticorpos Anti-dsDNA
Anticorpos Anti-Sm
Anticorpos antifosfolípide (anticardiolipina IgG/IgM; anticoagulante lúpico, VDRL falso positivo)
Anticorpos anti-nucleares (FAN)
Título anormal, em qualquer época e na ausência de drogas conhecidas por estarem associadas à sindrome do lúpus induzido por drogas
Recentemente, o grupo The Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC) revisou e publicou critérios mais sensíveis para a classificação da doença (41). Os critérios foram subdivididos em clínicos e imunológicos. Na nova classificação de critérios clínicos o lúpus cutâneo foi dividido em agudo e crônico, e a alopecia cicatricial passa a fazer parte dos critérios. Nos critérios imunológicos a hipocomplementemia (C3, C4 e CH50) e o coombs direto+, também integram o novo quadro de critérios. Para o diagnóstico definitivo da doença o paciente deve apresentar quatro ou mais critérios, sendo, pelo menos um critério clínico e um imunológico; ou uma biópsia renal com nefrite lúpica associada ao FAN positivo ou anti-dsDNA positivo (41) (Tabela 2).
Tabela 2. Revisão dos critérios de classificação do LES (41).
Critérios clínicos Critérios imunológicos
Lúpus cutâneo agudo FAN+1
Lúpus cutâneo crônico Anti-dsDNA+2
Úlceras orais Anti-SM+3
Alopecia não cicatricial Anticorpos antifosfolípedes
Sinovite (um ou mais articulações) Complemento reduzido (C3, C4, CH50)
Acometimento renal Coombs direto+
Acometimento neurológico Anemia hemolítica Leucopenia Linfopenia Trombocitopenia 1
Fator antinuclear/ 2Anticorpo anti-DNA de cadeia dupla/ 3Anticorpo Anti-Smith
1.4 Manifestações clínicas e laboratoriais
1.4.1 Apresentação clínica no LES
No LES, as manifestações clínicas são heterogêneas, alguns pacientes apresentam desde o início um caráter multissistêmicos e em outros, apenas um órgão é afetado. Este fator depende do tipo de anticorpo presente e da resposta inflamatória gerada pelo organismo (42). Sintomas inespecíficos como fadiga, perda de peso e febre são frequentemente observados e tem um impacto significativo na qualidade de vida dos pacientes (4,43). Portanto, o curso da
doença pode ser sistematicamente diferente entre os pacientes. O tratamento correto e a detecção precoce podem minimizar danos permanentes ao paciente (42,44).
Envolvimento cutâneo é frequentemente encontrado no LES, afetando de 70-90% dos pacientes. Dentre as manifestações mais comuns estão o eritema malar, lesão discoide e fotossensibilidade, porém, alopecia transitória também é frequentemente descrita em pacientes com a doença ativa, porém, associado com lesões discoides, pode ocasionar cicatrizes ao paciente. Assim como alopecia, as úlceras orais recorrentes também são encontradas quando a doença esta ativa (4, 45-47).
Artralgia e mialgia acometem a maioria dos pacientes. Artrite afeta, geralmente as pequenas articulações da mão e podendo evoluir para erosões. A clássica Artropatia de Jaccoud resulta em deformidade e incapacidade funcional significativa, embora não seja causada por artrite destrutiva (4,45,48).
O comprometimento renal pode ocorrer em qualquer momento da doença, porém em pacientes com LES, pode afetar mais de 30%, sendo uma das manifestações mais letais (4,17). A nefrite lúpica, é muitas vezes assintomática, porém pode ser identificada através de um exame de urina e monitoramento da pressão arterial; é caracterizada por proteinúria (>0,5 g/24 horas), presença de sedimento urinário (hemácias dismórficas, leucócitos) e ainda, achado histológico. A revisão dos critérios de classificação, desenvolvido pela Sociedade Internacional de Nefrologia e da Sociedade de Patologia Renal foram atualizados (49).
O envolvimento do sistema nervoso central (SNC) pode ocorrer de 25% a 70% dos pacientes dependendo do critério diagnóstico aplicado (50-58). As manifestações podem acontecer em qualquer período da doença, incluindo o primeiro sinal clínico em pacientes com LES, os sintomas podem se apresentar em conjunto ou isoladamente, e pode estar associado ou não a outros sinais de atividade em pacientes LES (51-53,59). As apresentações clínicas mais frequentes nos pacientes com LES são cefaleia (20-40%), disfunção cognitiva (10-20%), alterações de humor (10-20%), convulsões 10%), doenças cerebrovasculares (7-10%) e desordens de ansiedade (4-8%) (60).
As manifestações neuropsiquiátricas (NP) podem ser consideradas primárias se diretamente relacionado ao LES em atividade no SNC ou sistema nervoso periférico (SNP), ou secundário, quando relacionados com o tratamento, infecções, alterações metabólicas anormalidades ou outras manifestações sistêmicas, tais como uremia e hipertensão (50).
A dificuldade no diagnóstico consiste na distinção entre alterações neurológicas causadas pelo LES e anormalidades imunológicas tendo papel preponderante eventos secundários, como complicações da hipertensão arterial sistêmica (HAS), distúrbios de
coagulação, distúrbios metabólicos, infecção severa, corticoterapia e arterosclerose (61). Em 1999, o ACR elaborou um consenso para a terminologia e definição das síndromes NP que ocorrem no LES, com a participação de reumatologistas, neurologistas, psiquiatras, entre outros, e definiu 19 síndromes mais prevalentes (61) (Tabela 3). Estes critérios foram posteriormente validados apresentando uma sensibilidade de 91% e especificidade de 46% (62). A baixa especificidade se deu devido à presença de ansiedade, cefaléia, depressão leve, distúrbio cognitivo leve e polineuropatia não confirmada por eletroneuromiografia (62). Quando estas manifestações foram excluídas, observou-se uma especificidade de 93% (62).
Sintomas de depressão e ansiedade são comumente relatados em pacientes com LES e é, provavelmente, devido ao déficit físico e ao estresse de viver com uma doença crônica (63-64). Pacientes com transtornos de depressão e ansiedade, muitas vezes sentem vergonha de assumir publicamente os seus sintomas; alguns métodos de avaliação, como questionários podem ser úteis na identificação desses sintomas nos pacientes (65).
Tabela 3. Manifestações neuropsiquiátricas segundo o ACR (61).
Sistema Nervoso Central Sistema Nervoso Periférico
Meningite asséptica Síndrome de Guillain-Barré Estado confusional agudo Disfunção autonômica
Ansiedade Neuropatia craniana
Doença cerebrovascular Mononeuropatia
Disfunção cognitiva Miastenia grave
Síndrome desmielinizante Plexopatia
Cefaléia Polineuropatia
Transtorno de movimento (Coréia) Transtorno do humor
Mielopatia Psicose Convulsão
Alterações hematológicas que incluem anemia, trombocitopenia e leucopenia são frequentemente encontradas no LES, porém doenças hematológicas mais graves são achados mais raros (4,66). No entanto, algumas manifestações hematológicas podem ser causadas pela fisiopatologia do LES, mas em outras vezes, pode ser encontrado nos pacientes, porém, não ser uma manifestação propriamente da doença, e sim uma consequência ao tratamento com
imunossupressor que diminui a contagem de células brancas e podem evidenciar leucopenia e trombocitopenia (67). A anemia geralmente é normocítica e normocrômica, e surge dependendo da gravidade e duração da doença (76). Trombocitopenia, definida quando a contagem de plaquetas está inferior a 150.000 células/mL, é um achado frequente no LES. O grau é variável. A trombocitopenia transitória muitas vezes aparece durante uma fase de exacerbação da doença sem causar necessariamente hemorragia (4,66). Leucopenia é comum e pode resultar de doença ativa ou devido à reação as medicações (43,66).
Em torno de 25% dos pacientes com LES apresentam envolvimento cardiovascular em algum momento da doença. As complicações cardiovasculares representam a terceira maior causa de morte em pacientes com LES, embora nem todas as doenças cardiovasculares sejam de natureza inflamatória de fato; uma significativa porcentagem é devido à aterosclerose (68). As alterações cardíacas mais comumente descritas no LES são pericardite, miocardite, endocardite e as lesões coronarianas (69-72). Diversos autoanticorpos são encontrados no LES, destacando-se entre estes, o anticardiolipina (ACL) que têm sido associados à presença e patogênese das lesões cardíacas no LES (69,72-74).
Dentre as manifestações pulmonares, a pleurite é encontrada com maior frequência nos pacientes com LES, causando dor toracica, tosse e dispinéia (75). Embora os sintomas possam estar relacionados diretamente à atividade de doença, embolia pulmonar deve ser sempre considerada, principalmente naqueles que têm anticorpos antifosfolípides positivos. As infecções são comuns, e qualquer lesão parenquimatosa deve ser tratada como infecciosa até que se prove o contrário (75-76).
1.4.2 Diferenças na apresentação clínica entre pacientes adultos e juvenis com LES
O LES de início juvenil (LESj) muitas vezes apresenta manifestações clínicas mais agudas e severas quando comparado ao LES de início adulto (LESa). Envolvimento renal e neurológico, além de febre e linfadenopatia são mais frequentes em LESj quando comparado com ao LESa (29, 31, 33, 35, 77-79) (Tabela 4).
Pleurite, presença dos anticorpos Smith (Sm), Ro/SSA (Ro) e anti-La/SSB (anti-La) têm similar frequência entre LESa e LESj (35,78). Artrite, fotossensibilidade, lesões discóides, por outro lado, são mais observados nos pacientes LESa (31,33,35).
Em relação à atividade da doença, pacientes com LESj têm uma doença significativamente mais ativa, não só no início da doença, mas também ao longo do tempo quando comparado com LESa (80-81).
O conhecimento de que o LESj é uma doença potencialmente fatal, e que o tratamento agressivo deve ser introduzido precocemente, pode melhorar significativamente a sobrevida dos pacientes LESj (34).
Tabela 4. Comparação das principais manifestações clínicas entre pacientes LESa e LESj (77).
Principais Manifestações LESa LESj
Alterações hematológicas 75% 70% Linfoadenopatia 35% 65% Manifestação articular 60% 40% Manifestação cutânea 70-80% 90% Manifestação neurológica 20-75% 22-95% Nefrite 30% 50-65% 1.5 Patogenia
A patogenia do LES deve-se, principalmente a lesões teciduais provocadas por reações imunológicas, ou seja, produção de autoanticorpos e o clearance prejudicado de corpos apoptóticos (4,17,82). A etiologia do LES é parcialmente desconhecida, porém sabe-se que o LES pode ser desencadeado pela interação de diversos fatores como: genético, infeccioso, imunológico, hormonal e ambiental (42).
1.5.1 Susceptibilidade genética
A probabilidade de desenvolvimento do LES em gêmeos monozigóticos e dizigóticos são de 24-57% e 2-5%, respectivamente, indicando que a genética tem um papel importante na patogênese do LES (83-84). Genes do antígeno leucocitário humano (HLA), particularmente HLA-DRB1e HLA-DQB1 têm sido associados à susceptibilidade ao LES (85-93). O perfil HLA-DRB1*0301 tem sido associado à susceptibilidade em indivíduos latino-americanos (93). Análises sorológicas específicas mostram que tanto o HLA-DR3 como o HLA-DR2 também são fatores de risco (93). Já o HLA-DR3-DQ2 é um haplótipo que tem forte associação no desenvolvimento do LES em caucasianos (93).
Embora seja conhecida por ocorrer dentro de famílias, não houve ainda identificação de um gene como responsável. Apenas 10% dos pacientes com LES, tem um parente próximo (pai ou irmão), que já tenha ou venha a desenvolver a doença; apenas 5% de filhos de
pacientes com LES vão desenvolver o LES, porém, é comum em gêmeos idênticos; HLA: está associado com HLA-DR2 e HLA-DR3 (94).
1.5.2 Fatores ambientais
Sabe-se que fatores ambientais podem induzir ou agravar o LES como, por exemplo: luz ultravioleta (40-60% dos pacientes são fotossensíveis), alguns fármacos (como Hidralazina e a procainamida), dietas ricas em gorduras saturada, poluentes e cigarro (95).
Há evidências de que a exposição à radiação UV altera a química do DNA e sua localização, bem como a disponibilidade dos antígenos ribonucleiprotéicos (RNP) e Ro (96). Outro fator ambiental envolvido é a exposição a determinados vírus como o Epstein-Bar (EBV) e citomegalovírus (CMV). Após o contato com esses vírus, ocorre um mecanismo chamado de mimetismo molecular entre os antígenos próprios e externos, seguido da ativação inespecífica de linfócitos T e B, resultando na liberação de autoantígenos mais imunogênicos (97).
1.5.3 Sistema neuroendócrino
Anormalidades na função do hipotálamo e/ou hipófise contribuem para a patogênese do LES. Foi observado que alguns pacientes têm hiperprolactinemia e outros têm níveis inadequados do hormônio antidiurético (98).
O LES acomete predominantemente mulheres e em idade fértil. A baixa incidência da doença em homens e em mulheres, tanto na fase pré-puberal quanto pós-menopausa sugere o papel do estrógeno na predisposição à doença (99). O estrógeno influencia na maturação dos linfócitos T e B e ajuda a promover a hematopoese extramedular. Células B autoreativas que se desenvolvem em meio extramedular podem escapar da seleção negativa. Notoriamente, o estrógeno induz a ativação da citidina-desaminase, causando mutações no DNA, o que leva a alteração das vias apoptóticas, permitindo a produção de autoanticorpos (99-100).
1.5.4 Produção de autoanticorpos
Os anticorpos antinucleares (FAN) são frequentes em pacientes com LES, originalmente descritos em 1957 através de um ensaio de imunofluorescência com o tecido do fígado de roedores como substrato (101-102). Mais de 90% dos pacientes com LES têm FAN positivo. Valores de 1:80 ou maiores são aceitos como títulos significativos. Embora sensíveis estes autoanticorpos não são específicos para o LES (101).
Anti-dsDNA é um autoanticorpo altamente específico para o LES, presente em até 70% dos pacientes, mas em menos de 0,5% dos indivíduos sadios ou pacientes com outras doenças autoimunes (101,103). Após a detecção de títulos elevados do anticorpo Anti-dsDNA, cerca de 80% dos pacientes que tinham uma doença estabilizada passam a ter uma doença clinicamente ativa dentro de cinco anos (104).
Aproximadamente 70% dos pacientes com lesões subagudas possuem anticorpo Anti-Ro, que pode estar associado a anticorpos Anti-La (105). Os anticorpos anti-Ro e anti-La são imunoglobulinas específicas contra as proteínas do RNA, sendo que o anti-La normalmente coexiste com o Ro, raramente sendo encontrado sozinho. Além disso, a presença de anti-Ro e anti-La, ou ambos durante a gravidez confere um risco de 1 a 2% maior de bloqueio cardíaco fetal (106).
Os anticorpos anti-receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), NR2a e NR2b têm sido observados em pacientes com manifestações NP. Embora anticorpos anti-NR2 têm sido estudados em pacientes com LES, apenas anticorpos anti-NR2 no líquido cefalorraquidiano (LCR), e não no soro, estão associadas com manifestações NP difusas no LES (107). Os anticorpos antireceptores NMDA no LCR acometem o SNC independente de eventos trombóticos ou vasculite (108). Estes anticorpos no LCR foram associados com manifestações NP em geral (109) e manifestações NP difusas (107); já no soro, foram descritas associações com distúrbio cognitivo (110), depressão (110), défcit de memória recente e de aprendizado (110).
Proteína P ribossomal é um pentâmero composto por 3 fosfoproteínas diferentes. Ela desempenha um papel importante em todas as etapas da síntese protéica. A presença de anticorpos anti-P pode estar associada ao comprometimento do SNC (111-114), rins (115-117) e/ou danos no fígado (118-129).
1.5.5 Hiperatividade de células B e T
Anormalidades imunológicas no LES incluem a hiperatividade funcional dos linfócitos T e B com grande produção de anticorpos policlonais autoreativos, deposição de complexos imunes no tecido conjuntivo, e outras alterações funcionais de linfócito natural Killer. A elevação de células B tem sido o principal mecanismo proposto para a geração de anticorpos antinucleares no LES (111).
Por outro lado, a manutenção de uma resposta imune autoagressiva é facilitada por alteração na função supressora e liberação da resposta humoral. Desconhecemos ainda quais dos múltiplos defeitos imunológicos são fundamentais como causa da doença e quais os
secundariamente induzidos. Embora a participação da imunidade humoral seja evidente, acredita-se também na participação da imunidade celular na patogênese do LES (121).
Os mecanismos de hiperatividade de células B e T envolvem a produção de autoantígenos, que está relacionada ao aumento da apoptose e ao clearance prejudicado de corpos apoptóticos fornecidos continuamente pelo dano tecidual. Um único antígeno inicia uma resposta, mas na ausência do mecanismo de tolerância imunológica, a resposta imune torna-se ininterrupta, envolvendo mais células B e T com especificidade relacionada ao antígeno inicial, até que ambas sejam ativadas por antígenos múltiplos, muitos dos quais são antígenos próprios (122).
Outro mecanismo importante sobre hiperatividade é a expressão aumentada de moléculas de superfície que participam da ativação de células em ambas as populações de células (células B e T) (122). Autoanticorpos podem ativar células T e ajudam na sua diferenciação. O estímulo aumentado na diferenciação e maturação de células T leva a uma produção anormal de citocinas em pacientes com LES (122).
As citocinas são proteínas de baixo peso molecular, produzidas por diferentes células do sistema imunológico inato e adaptativo (123). Elas mediam a ativação e regulação funcional do sistema imunológico através da ligação aos receptores de superfície celular, desempenhando um papel fundamental na diferenciação, maturação e ativação de várias outras células (123-124).
No LES, o perfil de citocinas pode determinar alguns aspectos disfuncionais do sistema imunológico e o envolvimento de vários órgãos. O LES é uma doença heterogênea quanto à apresentação, gravidade da doença e resposta ao tratamento. Perfis alterados de citocinas podem ser responsáveis por essas variações observadas na prática clínica (123).
As citocinas têm um papel importante na patogênese, na atividade do LES e na quebra da barreira hematoencefálica (BHE) (125-128). Um papel importante tem se dado na interação de células Th1/Th2 (células T Helper). As principais citocinas associadas à imunidade celular (Th1) são IL-12, TNF alfa e interferon gama (IFN-g), enquanto que IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 estão associadas com a produção de anticorpos e indução de imunidade humoral (Th2) (129-130). Anormalidades ou desbalanço entre a produção de citocinas tanto Th1 e Th2 estão associados com a patogênese no LES (129-130).
Dentro da Th1, a IL-12, uma citocina pró-inflamatória diferenciada por células dendríticas e fagócitos ativos, Sua produção depende de diferentes mecanismos de regulação da expressão de genes que codificam a IL-12, da expressão de receptores toll-like e ainda da reação cruzada dos diferentes subtipos de células dendríticas, envolvendo citocinas, como
IL-10 e INF-α. Através da regulação negativa, a IL-12 é inibida pela IL-IL-10. A IL-12 induz a produção de INF-γ, favorecendo a diferenciação de células Th1 e também mantém uma ligação entre a resposta imune inata e adaptativa (131-132). No LES, estudos demonstraram que níveis aumentados de IL-12 estão associados à nefrite em pacientes com LES (133) e ainda observou-se uma associação entre IL-12 e dano cumulativo no LES (134). Um estudo mais recente demonstrou que pacientes com LES com o anticorpo anti-P ribossomal positivo apresentavam níveis aumentados de IL-12, sugerindo que os anticorpos promovem um aumento de reposta Th1 em pacientes com LES (135).
A IL-6 é uma citocina secretada por Th2 (122,136). Ela é sintetizada principalmente por monócitos, fibroblastos e células endoteliais, embora a sua secreção também possam ser encontrados em linfócitos T e B. Sua produção é desencadeada por IL-1, IL-2 e TNF-α e diminuída por IL-4, IL-10 e IL-13 (122,137). Um dos papeis mais importantes da IL-6 é o de induzir o amadurecimento dos linfócitos B nas células plasmáticas e aumentar a secreção de imunoglobulina (122,137). Estudos observaram níveis séricos de IL-6 aumentados em pacientes com LES quando comparados a controles sadios e ainda associações de IL-6 com atividade de doença e hematúria (138-139).
A IL-10 também é uma citocina Th2 antiinflamatória produzida, principalmente por monócitos e linfócitos. Ela bloqueia a ativação das APCs (células apresentadoras de antígenos), diminui a expressão de moléculas coestimulatórias e, portanto, atenua a ativação das células T e a secreção de TNF-α (122). IL-10 estimula a proliferação das células B e o
switching de classe de imunoglobulina, resultando em uma maior secreção de anticorpos, que
por sua vez, têm a capacidade de penetrarem em compartimentos extravasculares e promoverem inflamação nos pacientes com LES (134). Um estudo observou a coloração proeminente de IL-10 em células intrarrenais, detectado em rins de pacientes com LES (140). Estudos demonstraram além da associação de IL-10 com atividade de doença, a correlação positiva dessa citocina com escores de SLEDAI (136, 141-142). Um estudo também observou a associação de IL-10 com a presença de anticorpos anti-dsDNA (138).
2. Justificativa
A heterogeneidade do LES tem sido um desafio ao diagnóstico e tratamento, principalmente tentando explicar possíveis mecanismos de ação das citocinas e o seu papel no LES. Pacientes com LES de início adulto e juvenil possuem um diferente espectro de manifestações tornando ainda mais difícil traçar um perfil clínico
Por esse motivo, o entendimento sobre o perfil de cada grupo de pacientes é importante para a identificação de um fenótipo e um possível prognóstico da doença.
3. Objetivos
3.1 Objetivo geral
- Comparar o perfil clínico e serológico de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto e juvenil.
3.2 Objetivos específicos
- Comparar manifestações clinica e laboratoriais em uma coorte de pacientes com LES de início adulto e juvenil.
- Comparar de forma longitudinal, num período de 2 anos, os níveis de citocinas IL-6, IL-10 e IL-12 em pacientes adultos e juvenis com LES e controles sadios, sem história de doença autoimune na família.
- Associar os níveis de IL-6, IL-10 e IL-12 e com atividade da doença e as diferentes manifestações clínicas e laboratoriais apresentadas em pacientes com LES de início adulto e juvenil.
4. Pacientes e métodos
Com o propósito de comparar o perfil dos pacientes LESj e LESa de forma longitudinal utilizamos um banco de dados com 1261 pacientes para avaliar manifestações clínicas, laboratoriais e tratamento, posteriormente, separamos 130 destes pacientes para avaliação do perfil de citocinas (Figura 1). Desta forma, nosso estudo foi dividido em capitulo I e II para melhor apresentação de metodologia e resultados.
Figura 1. Fluxograma de inclusão e divisão de indivíduos no estudo
4.1 Capitulo I Comparação longitudinal de manifestações clínicas e laboratoriais em
pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de inicio adulto (LESa) e juvenil (LESj).
4.1.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional, longitudinal, aberto e sem grupo controle. Através de um banco de dados especial que foi iniciado em 1974, os pacientes tiveram seus dados clínicos, laboratoriais e terapêuticos registrados, estes dados foram atualizados anualmente ou a cada consulta até 2016. Em cada paciente, os dados foram separados em duas etapas: a primeira etapa nomeada início, onde foram avaliadas todas as manifestações clínicas
e laboratoriais quando o paciente recebia o diagnóstico e nos primeiros 6 meses de doença. A segunda etapa é nomeada seguimento, onde todas as manifestações posteriores a 6 meses de doenças foram tabeladas de forma cumulativa. Em seguida, os pacientes foram divididos de acordo com a idade de inicio da doença em LESa (idade de início >18 anos) e LESj (idade de início ≤18 anos) para que pudessem ser comparados.
4.1.2 Seleção de pacientes
Todos os pacientes apresentavam quatro ou mais critérios de classificação para LES revisados pelo Colégio Americano de Reumatologia (ACR) (40). Foram considerados com LESj aqueles que tinham o diagnóstico até os 18 anos de idade (36). Os pacientes LESj e LESa foram recrutados consecutivamente no ambulatório de reumatologia pediátrica e do ambulatório de reumatologia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas.
4.1.3 Análise clínico-laboratorial e tratamento
Todos os pacientes tiveram seus históricos médicos e características clínica e serológicas avaliadas no início da doença (definido como os 6 primeiros meses de início da doença) e seguimento (após 6 meses de início da doença até 2016 de forma cumulativa). Nefrite foi diagnosticada com base em proteinúria superior a 0,5 g / L, alterações de sedimentos urinários e/ou achados histológicos. Alterações hematológicas foram atribuídas ao lúpus apenas na ausência de supressão da medula óssea (leucopenia <4000 células / mm3; plaquetopenia <100 000 células / mm3; anemia hemolítica). Também analisamos a presença de eritema malar, lesões discóides, lesões cutâneas subagudas, vasculite cutânea, fotossensibilidade, úlceras orais, artrite e serosite. O envolvimento neurológico e psiquiátrico foi definido de acordo com ACR (61).
Os anticorpos antinucleares (FAN) foram determinados por imunofluorescência utilizando células HEp-2 como substrato, e positivo se for superior a 1:40. Os anticorpos Anti-dsDNA foram determinados por imunofluorescência indireta utilizando Crithidia como substrato e considerada positiva se superior a 1:20. Os anticorpos precipitantes para antígenos nucleares extraíveis (ENAs), incluindo os anticorpos Anti-Ro, Anti-La e Anti-Sm que foram detectados por ELISA, e considerado positivo se superior a 1:40. O fator reumatóide (FR) foi detectado por nefelometria e positivo se for superior a 10. Os anticorpos anticardiolipina (aCL) dos isótopos IgG e IgM foram medidos por método ELISA (144). O anticoagulante lúpico (LA) ativo foi detectado por ensaios de coagulação plasmáticos livre de plaquetas
obtido por centrifugação dupla, recomendado pelo subcomitê do Comitê Científico e de Normalização da Sociedade Internacional De Trombose e Homeostase (145).
O tratamento prescrito (prednisona, antimalarivo, azatioprina, ciclofosfamida, metatrexat0, micofenolato) da ultima consulta, foi levado em consideração, tabelamos dados como frequência e dosagem das medicações.
4.1.4 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas através do programa SYSTAT, versão 12.0. Os dados foram descritos em frequência e média (DP). Para determinar associações o teste
chi-square ou o teste exato de Fisher foram usados. Para comparar as médias o teste Mann-Whitney U foi utilizado.
4.2 Capítulo II Comparação longutidinal do perfil das citocinas IL-6, IL-10 e IL-12
em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj).
4.2.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional, longitudinal, aberto com grupo controle que utilizou amostras de conveniência. Todos os pacientes (LESj e LESa) e grupo controle que participaram deste estudo tiveram 4 coletas de sangue num período de 2 anos (com intervalo mínimo de 4 meses entre as coletas). No dia de cada retorno ao ambulatório, além da coleta de sangue, também coletamos dados clínicos, laboratoriais e tratamento dos pacientes. Os pacientes também preencheram questionários de sintomas de ansiedade e depressão na data da coleta. Todos os dados obtidos foram separados e tabelados de acordo com o tempo da coleta (TI, TII, TIII e TIV). Os dados como idade dos pacientes e tempo de doença foram coletados no ultimo tempo (TIV).
4.2.2 Seleção dos pacientes
Todos os pacientes apresentavam 4 ou mais critérios de classificação para LES revisados pelo Colégio Americano de Reumatologia (ACR) (40). Foram considerados com LESj aqueles que tinham o diagnóstico até os 18 anos de idade (36). Os pacientes LESj e LESa foram recrutados consecutivamente no ambulatório de reumatologia pediátrica e do ambulatório de reumatologia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. Os pacientes LESj e LESa foram pareados por tempo de doença. Foram também incluídos
controles sadios com gênero semelhante aos pacientes e sem infecções aparentes no dia da coleta, para comparação dos níveis de citocinas.
4.2.3 Seleção dos indivíduos sadios não aparentados
O grupo controle foi constituído por indivíduos sadios com idade e distribuição de gênero semelhante ao grupo de pacientes com LES, que não apresentaram infecções nas datas de coleta de sangue e que concordaram em participar do projeto de pesquisa.
Esses indivíduos sadios pertenciam à mesma região geográfica (Campinas e região), sendo estes amigos de paciente, pesquisadores e profissionais do hospital.
4.2.4 Termo de consentimento livre e esclarecido
Todos os pacientes e voluntários foram previamente informados e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) - UNICAMP (nº920/2007).
4.2.5 Análise clínica-laboratorial e tratamento
Todas as manifestações clínicas e laboratoriais foram obtidas no dia de cada coleta de sangue. Nefrite foi diagnosticada com base em proteinúria superior a 0,5 g / L, alterações de sedimentos urinários e/ou achados histológicos. Síndrome nefrótica foi definida como proteinúria acima de 3,0 g / dia. Alterações hematológicas foram atribuídas ao lúpus apenas na ausência de supressão da medula óssea (leucopenia <4000 células / mm3; plaquetopenia <100 000 células / mm3; anemia hemolítica). Também analisamos a presença de eritema malar, lesões discóides, lesões cutâneas subagudas, vasculite cutânea, fotossensibilidade, úlceras orais, artrite e serosite. O envolvimento neurológico e psiquiátrico foi definido de acordo com ACR (61). O tratamento utilizado no momento da coleta de sangue, como prednisona, cloroquina e azatioprina também foram levadas em consideração.
Os anticorpos antinucleares (FAN) foram determinados por imunofluorescência utilizando células HEp-2 como substrato, e positivo se for superior a 1:40. Os anticorpos anti-DNA cadeia foram determinados por imunofluorescência indireta utilizando Crithidia como substrato e considerada positiva se superior a 1:10. Os anticorpos precipitantes para antígenos nucleares extraíveis (ENAs), incluindo Anti-Ro, Anti-La e Anti-Sm foram detectados por ELISA, e considerado positivo se superior a 1:40. O fator reumatóide (FR) foi detectado por nefelometria e positivo se for superior a 10. Os anticorpos anticardiolipina (aCL) dos isótopos IgG e IgM foram medidos por método ELISA (144). O anticoagulante lúpico (LA) ativo foi
detectado por ensaios de coagulação plasmáticos livre de plaquetas obtido por centrifugação dupla, recomendado pelo subcomitê de Comitê Científico e de Normalização da Sociedade Internacional De Trombose e Homeostase (145).
O tratamento prescrito (prednisona, antimalar e azatioprina) foi levado em consideração e tabelado em todos os tempos (TI, TII, TIII e TIV).
4.2.6 Análise de atividade da doença e dano
A atividade da doença foi medida pelo índice “Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index” (SLEDAI) com variação de 0 a 105 (146). Considerou-se doença ativa quando SLEDAI ≤ 3 (147). Nefrite ativa foi diagnosticada com base em manifestações renais do SLEDAI (proteinúria superior a 0,5 g / L, sedimentos urinária anormal, baixos níveis de complemento). O SLEDAI foi avaliado no dia de cada coleta de sangue, dessa forma obtivemos um SLEDAI por tempo (TI, TII, TIII e TIV). A lesão cumulativa associada ao LES foi determinada utilizando o índice “Systemic Lupus International Collaborative Clinics/ACR” (SLICC) / ACR Damage Index (SDI) (148), cuja pontuação SDI varia de 0 a 47. Foi considerado dano quando a pontuação era ≥1 (148). Por se tratar de danos cumulativos, foi feita uma única avaliação ao final dos quatro tempos em todos os pacientes.
4.2.7 Avaliação de sintomas de ansiedade e depressão
Todos os pacientes preencheram o inventário de depressão de Beck (BDI) (149-150) e inventário de ansiedade de Beck (BAI) (150-151) no dia de cada coleta de sangue. Para pacientes ≤ 16 anos, foi aplicado o Inventário de Depressão Infantil (CDI). Essas escalas que avaliam sintomas de depressão e ansiedade respectivamente consistem em 21 itens, cada um descrevendo um sintoma comum de depressão / ansiedade. Solicita-se ao paciente que ele classifique o quanto foi incomodado por cada sintoma no mês que passou em uma escala de 4 pontos que varia de 0 à 3. Os itens são somados para obter uma pontuação total que pode variar de 0 a 63. Os cortes utilizados para o BDI são: 0-13: sem depressão; 14-19: depressão leve; 20-28: depressão moderada; E 29-63: depressão severa e para o BAI: 0-7: sem ansiedade / nível mínimo de ansiedade; 8-15: ansiedade leve; 16-25: ansiedade moderada; 26-63: ansiedade severa.
4.2.8 Determinação dos níveis séricos das citocinas
Foi coletado um total de 32 mL (8mL por coleta) de sangue venoso de cada paciente, no centro de coleta, em conjunto com os exames de rotina solicitados aregularmente para
avaliação de atividade de doença. A coleta de sangue dos controles foi realizada no mesmo dia da coleta do paciente. Foram realizadas 4 coletas de sangue (TI, TII, TIII e TIV).
As amostras de sangue, após coagulação em temperatura ambiente por 30 minutos, foram centrifugadas, aliquotadas e conservadas a –80°C, para posterior análise no Laboratório de Reumatologia FCM/UNICAMP. As amostras de soro foram obtidas de janeiro/2010 a dezembro/2015.
Os níveis séricos de IL-6, IL-10 e IL-12 foram dosados pelo método de Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA), conforme previamente apresentado na literatura e
descrito a seguir:
4.2.8.1 Técnica de ELISA
A amostra utilizada foi soro, a partir de sangue total, colhido em tubo seco com gel. Esperamos a amostra de sangue total coagular, a temperatura ambiente por 30 minutos. O tubo com a amostra de sangue foi centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos.
PREPARO DE REAGENTES:
1. Solução de lavagem: 100 mL do concentrado foram diluídos em água destilada e/ou deionizada para obtenção de um volume final de 1000 mL.
2. Substrato: O substrato liofilizado foi reconstituído com 6,0 mL de diluente de substrato, 10 minutos antes do uso.
3. O amplificador liofilizado foi reconstituído com de 6,0 mL de diluente do amplificador, 10 minutos antes do uso.
4. Padrão: A solução padrão foi reconstituída com o diluente Calibrador, segundo as especificações impressas no rótulo do frasco do padrão para produzir uma solução estoque.
a. Tubos de polipropileno foram utilizados para montagem da curva de calibração. 500 μL de Calibrador Diluente foram pipetados em cada tubo. A solução estoque foi utilizada para produzir uma série de diluição. Cada tubo foi homogeneizado cuidadosamente antes da próxima transferência. O padrão diluído serviu de padrão elevado. O Calibrador Diluente serviu como padrão zero (0 pg/mL).
PROCEDIMENTO:
1. Todos os reagentes, amostras e padrões de trabalho foram preparados previamente, conforme indicado nas seções anteriores.
2. 50 μL de Diluente de amostra foram adicionados em todos os poços.
3. 200 μL de solução padrão, amostra ou controle foram adicionados em seus respectivos poços. A microplaca foi coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 3 horas à temperatura ambiente.
4. Lavagem
a. O líquido dos poços foi removido por aspiração ou por inversão da microplaca, descartando o conteúdo.
b. O excesso de líquido foi retirado, segurando firmemente a microplaca, pressionando-a em toalha de papel limpa, por 5 vezes.
c. Foram colocados 400 μL de tampão de lavagem em cada poço da microplaca, utilizando uma pipeta multicanal automática.
d. O líquido dos poços foi removido por aspiração ou por inversão da microplaca, descartando o conteúdo.
e. Os passos b, c, d foram repetidos por 5X para um total de seis lavagens.
5. Foram adicionados 200 μL de Conjugado em cada poço. A microplaca foi coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente.
6. A lavagem (passo 5) foi realizada novamente.
7. Foram adicionados 50 μL de Substrato em cada poço. A microplaca foi coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Após incubação a placa não foi lavada.
8. Foram adicionados 50 μL de Amplificador em cada poço. A microplaca foi coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 30 minutos à temperatura ambiente. A adição do Amplificador iniciou o desenvolvimento da cor da solução. Após incubação a placa não foi lavada.
9. Foram adicionados 50 μL de solução de parada em cada poço. A adição da solução de parada não afetou a cor dos poços.
10. A densidade óptica de cada poço foi determinada por uma leitora de microplacas ajustada para 490 nm (variação do filtro de acordo com instruções de cada fornecedor) no prazo de 30 minutos depois de colocada solução de parada.
4.2.8.2 Obtenção de resultados
Após obtenção da média das duplicatas (absorbância), foi subtraída a média do padrão zero. A curva padrão foi desenhada a partir da densidade óptica (absorbância) e as concentrações dos padrões já conhecidos. Os dados puderam ser linearizados por log/log.
Para determinar a concentração de cada citocina de cada amostra, primeiro, encontrou-se o valor da absorbância no eixo-y e estendeu-encontrou-se uma linha horizontal para a curva padrão. No ponto de intersecção, estendeu-se uma linha vertical para o eixo-x e leu-se a concentração correspondente a citocina.
4.2.9 Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SYSTAT versão 12.0. Os resultados foram apresentados através de média e desvio padrão (DP). Utilizamos o teste de Shapiro-Wilks para verificar a normalidade do teste. Por se tratar de uma distribuição não normal utilizamos o teste de Kruskal-Wallis para comparar os níveis das citocinas nos três grupos (LESj, LESa e controles) em cada tempo avaliado (TI, TII, TIII e TIV), quando houve diferença significativa dentro de um tempo, empregamos uma análise de variância e através do teste de Tukey pudemos comparar todos os grupos e determinar as diferenças estatísticas entre eles. A Correlação de Spearman foi utilizada para correlacionar variáveis (Níveis de citocinas e SLEDAI, SDI, BAI e BDI). Para comparar as manifestações clínicas e laboratoriais entre os dois grupos de pacientes (LESj vs LESa) utilizamos o teste de Chi-quadrado ou teste exato de Fisher. Para associação dos níveis de citocinas e variáveis categóricas (manifestações clínicas e laboratoriais) unificamos os 4 tempos e aplicamos o teste de pelo teste U de Mann-Whitney. Para todas as análises, um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
5. Resultados
5.1 Capitulo I Comparação longitudinal de manifestações clínicas e laboratoriais em
pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de inicio adulto (LESa) e juvenil (LESj).
Title. Comparação entre pacientes com lupus eritematoso sistêmico de início adulto e juvenil
Karina de Oliveira Peliçari, Aline Tamires Lapa, Nailú Angelica Sinicato, Mariana Postal, Fernando Augusto Peres, Roberto Marini, Lilian Tereza Lavras Costallat, Simone Appenzeller
Resumo
Objetivos: Avaliação clínica, laboratorial e caracteristicas terapeuticas em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico de início adulto (LESa) e juvenil (LESj)
Metodos: A partir de 1974, pacientes consecultivos atendidos pelo ambulatório de reumatologia adulta e pediátrica da Universidade Estadual de Campinas, tiveram seus dados clínicos laboratoriais e terapêuticos coletados e inseridos em um banco de dados especial que foi atualizado anualmente até dezembro de 2016, 1261 pacientes com LES foram selecionados e divididos de acordo com a idade de inicio da doença, sendo LESj (início da doença ≤18 anos) e LESa (início da doença >18 anos). As frequências foram comparadas através do teste exato de Fisher, foi considerado significativo quando p≤0,05.
Resultados: 336 pacientes LESj [296 (89%) mulheres; média de duração da doença 12.1±8.1 anos] e 927 pacientes LESa [865 (93%) mulheres; média de duração da doença 19.4±10.7 anos] foram incluídos. Comparando pacientes LESj e LESa no início da doença, LESj apresentou uma maior frequência de febre [50% vs. 37%; p<0.001], perda de peso [39% vs. 31%; p=0.011], adenamia [40% vs. 30%; p=0.001], convulsão [10% vs. 4%; p<0.001], psicose [3% vs. 1%; p=0.032], cefaleia [13% vs. 1%; p<0.001], coreia [2% vs. 0.10%; p=0.001], rash malar [53% vs. 46%; p=0.011], fotossensibilidade [57% vs. 50%; p=0.030], ulceras orais [18% vs. 11%; p=0.002] e proteinúria [34% vs. 26%; p=0.006] que pacientes LESa. Pacientes LESa apresentaram uma frequencia maior de artrite [76% vs. 63%; p<0.001] e fenômeno de Raynaud [27% vs. 18%; p=0.049] que pacientes LESj. Comparando autoanticorpos, pacientes LESj, tinham uma frequencia maior na presence do anticorpo
anti-dsDNA [61% vs. 49%; p<0.001] que pacientes LESa e em LESa,o anticorpo Anti-SSA [30% vs. 23%; p=0.020] tinham uma frequência maior que pacientes LESj. Pacientes LESj faziam mais uso de Azatioprina [30% vs. 24%; p=0.023], Ciclofosfamida [14% vs. 7%; p<0.001] e Micofenolato [8% vs. 2%; p<0.001] que pacientes LESa. Durante o tempo de seguimento, pacientes LESj tiveram significativamente mais mortes [47% vs. 9%; p=0.020] comparados com pacientes LESa.
Conclusão: Pacientes LESj tem uma maior frequencia de manifestações clínicas e laboratoriais, quando comparados com pacientes LESa particularmente sintomas neuropsiquiatricos e aparentemente possuem um pior prognóstico.
Introdução
Lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune caracterizada pelo envolvimento multissistêmico com períodos de atividade e remissão (1). LES afeta principalemente mulheres na idade reprodutiva. Entretanto, de 15%–20% dos casos se começaram antes dos 18 anos, que são definidos como LES de início juvenil (LESj) (2). Estudos recentes compararam LESj com LES de início adulto (LESa) demonstrando um diferente perfil de manifestações clínicas e apontam um pior curso da doença e um pior prognóstico em pacientes LESj (3,4).
A relação homem/mulher aumenta durante as décadas no LES. Nos pacientes LESj, com início da doença durante a primeira decada de vida a relação homem/mulher é de 4:3; com início da doença durante a segunda década de vida a relação é de 4:1 e no início adulto é de 9-14:1 dependendo da população estudada. (5-7).
Varios estudos tem comparado caracteristicas clínicas e laboratoriais no LES de acordo com a idade de início, identificando importantes diferenças como uma maior frequencia de nefrite, manifestações neuropsiquiátricas e envolvimento cutâneo em pacientes LESj e uma maior frequência de manifestações articulares em pacientes LESa (8-22) (Tabela 1). Entretanto, caracteristicas da doença variam de acordo com a etinia e status socioeconomico (23-24). Poucos estudos tem analizado diferença na população brasileira, entretanto, nenhum estudo brasileiro avaliou o perfil de manifestações entre pacientes LESj e LESa no início e evolução da doença (17,19). Portanto o objetivo do nosso estudo foi analisar o padrão clínico e imunológico em 927 pacientes LESa e 334 pacientes LESj no início e seguimento da doença e comparar com resultados de estudos prévios.
Métodos
Subjects
Todos os pacientes deste estudo tinham quatro ou mais critérios de classificação do Colégio Americano de Reumatologia (CAR) para LES (24). Os pacientes LESj tiveram diagnostic fechado até os 18 anos ou menos (25). Pacientes LESj e LESa foram recrutados consecutivamente no ambulatório de reumatologia e reumatologia pediatrica no hospital de clínicas da universidade estadual de Campinas. Este estudo foi aprovado pelo comitê de éticas de nossa instituição (Faculdade de ciências médicas da universidade estadual de campinas).
