PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
APLICADAS À SAÚDE
TAINAH OLIVEIRA MOURA
PAPEL DE HMGB1 NO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO
ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
LAGARTO- SE 2017
, T. O . PAP E L DE H M GB 1 NO PR OCE S S O DE RE PAR O Ó S S E O AL VE O L AR E M CA M U ND O NGOS 2017
PAPEL DE HMGB1 NO PROCESSO DE REPARO
ÓSSEO ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção parcial do grau de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Palanch Repeke Co-orientador: Prof. Dr ª Andreia Espíndola Vieira Ribeiro
LAGARTO- SE 2017
PAPEL DE HMGB1 NO PROCESSO DE REPARO
ÓSSEO ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção parcial do grau de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde.
Aprovado em: ____∕____∕____
_______________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Palanch Repeke _______________________________________________________
1º examinador: Prof. Dr. Miburge Bolivar Gois Junior
_______________________________________________________ 2ºexaminador: Prof. Dr. Paulo Alexandre Galvanini
PARECER ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________
Ao meu guia, Deus, a quem entrego a minha vida, meus anseios e minhas vitórias. Hoje te agradeço por mais essa vitória, pois sem a tua ajuda e o teu apoio jamais teria alcançado. Todas as vezes que me peguei pensando negativo, que não conseguiria, o senhor estava lá, segurando na minha mão e me mostrando o melhor caminho. E como diz a letra de uma música de Padre Fábio: “Toda Honra e toda glória, é Dele a vitória alcançada em minha vida...”
À minha Mãe, que não descansou na torcida, e que certamente orou dias e noites para que Deus estivesse sempre comigo. Obrigada por ser esse exemplo de fé e amor. Ao meu Pai, que nunca pensou duas vezes ao investir no meu futuro, e que tenho como um dos maiores exemplos de determinação e coragem. Vocês sempre estiveram presentes me apoiando e me incentivando a ser melhor a cada dia. Muito obrigada por, muitas vezes, acreditarem mais em mim do que eu mesma. Amo vocês.
Aos meus irmãos, Tauane, Athawan e Iraê, amo vocês infinitamente, mesmo que eu mal demonstre, mas não consigo imaginar minha vida sem vocês. Obrigada pela cumplicidade, amizade, conselhos e ajudas. Nossa família é a minha fortaleza e sou muito grata por Deus ter feito ela tão maravilhosa assim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Eduardo Palanch Repeke, por todo conhecimento compartilhado, por estar sempre disposto a me ajudar como também pela paciência e incentivo constante. Muito obrigada por todo suporte e pela confiança diante deste desafio.
À minha co-orientadora Prof. Drª Andreia Espíndola Vieira Ribeiro, por toda atenção, colaboração e aprendizado durando esta fase. Muito obrigada por me receber tão bem.
Aos professores do programa PPGCAS, por terem sido tão importante na minha vida acadêmica, seja durante as disciplinas cursadas, palestras, seminários ou até mesmo em discussões produtivas durante esta jornada. Foi uma honra compartilhar com vocês seus conhecimentos. Em especial ao Prof. Dr. Miburge, pelo incentivo e amizade desde a graduação. Muito obrigada.
Aos amigos que conquistei nesta fase, por dividirem comigo o mesmo sonho de sermos mestres, pela amizade, união, força e pelos momentos maravilhosos que me proporcionaram. Vocês foram fundamentais desde momentos de descontração até discussões cientificas produtivas. Não menos importantes, aos meus amigos de vida que me apóiam e me incentivam diariamente a ser eu mesma e a não desistir dos meus sonhos. Muito obrigada.
À Universidade Federal de Sergipe- UFS, pela oportunidade e por todo suporte necessário para o desenvolvimento deste mestrado. Em especial ao Departamento de Odontologia da UFS (DOD-UFS), pelo apoio e suporte para o desenvolvimento da pesquisa.
Às técnicas do laboratório de histologia da FOB∕USP, pela gentileza e colaboração. À Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe- FAPITEC-SE, pelo suporte através da bolsa de mestrado.
Enfim, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização desta pesquisa: OBRIGADA.
Papel de HMGB1 no processo de reparo ósseo alveolar em camundongos.
Embora a relação entre a formação óssea e a resposta imune∕inflamatória mostre-se extremamente importante para o processo de reparo ósseo, tal interação permanece pouco compreendida. Enquanto uma resposta imune∕inflamatória exacerbada está associada à reabsorção óssea, uma resposta ideal transitória de baixa magnitude é essencial no processo. Nesse contexto, a sinalização mediada por receptores tipo Toll (TLRs) e receptores RAGE desempenha um papel fundamental no inicio da resposta imune∕inflamatória através do reconhecimento de padrões moleculares associados a danos (DAMPs). Um dos principais DAMPs reconhecidos pelo TLR4 e RAGE é a proteína HMGB1. Uma vez ativados por HMGB1, estes receptores são capazes de gerar diversos mediadores inflamatórios importantes no processo de reparo ósseo alveolar. Ainda assim, não são claros os mecanismos de “trigger” da produção de citocinas e mediadores inflamatórios com relação ao reparo ósseo, nem a quantidade necessária. Visto isso tivemos como objetivo investigar a influencia do ligante HMGB1 na geração de resposta imune∕inflamatória e no reparo ósseo subseqüente à extração do incisivo superior de camundongos. Para isso, foram utilizados 40 camundongos divididos em dois grupos [Grupo controle- WT; Grupo GLY – tratado com glicirrizina (inibidor de HMGB1)] e analisados quanto ao reparo ósseo alveolar nos períodos de 0, 7, 14, 21 dias após exodontia. Amostras foram submetidas ao processamento histológico e foram analisadas ao microscópio óptico para caracterização histomorfométrica (qualitativa e quantitativa), e analisadas por MicroCt para descrição de estruturas ósseas. Na análise histomorfométrica, os resultados mostram maior densidade de coágulo no grupo GLY no período de 14 dias (p<0,05); como também mais células inflamatórias no período de 7 e 14 dias comparado ao controle (p<0,05). Como também, apresentou maior densidade de fibroblastos nos períodos de 7, 14 e 21 dias e menor densidade de fibras em 7 dias ( p<0,05). O grupo GLY apresentou menores densidades de vasos nos períodos de 7, 14 e 21 dias. (p<0,05). Apensar de não demonstrar diferença singnificativa na formação óssea, o grupo GLY apresentou menores quantidades de osteoblastos e maiores de osteoclastos comparado ao grupo controle nos tempos de 7 e 14 dias (p<0,05). Quanto ao MicroCt, as imagens de ambos os grupos foram realizadas e não apresentou diferença significativa entre os grupos. Portanto, a inibição da proteína HMGB1 não foi capaz de interferir na cinética de reparo ósseo alveolar em camundongos, mas apresentaram diferenças em alguns componentes participantes da cinética do reparo ósseo alveolar.
The role of HMGB1 in the bone repair alveolar in the mice.
Although the relationship between bone formation and the immune / inflammatory response is extremely important for the bone repair process, such interaction remains poorly understood. While an exaggerated immune / inflammatory response is associated with bone resorption, an ideal transient response of low magnitude is essential in the process. In this context, signaling mediated by Toll receptors (TLRs) and RAGE receptors plays a key role in initiating the immune / inflammatory response through the recognition of molecular patterns associated with damage (DAMPs). One of the major DAMPs recognized by TLR4 and RAGE is the HMGB1 protein. Once activated by HMGB1, these receptors are able to generate several important inflammatory mediators in the process of alveolar bone repair. Nevertheless, the mechanisms of "trigger" of the production of cytokines and inflammatory mediators with respect to the bone repair, nor the amount necessary, are not clear. In view of this, we aimed to investigate the influence of the HMGB1 ligand on the generation of immune / inflammatory response and on the bone repair subsequent to the extraction of the superior incisor of mice. For this, 40 mice were divided into two groups [Control Group - WT; Group GLY - treated with glycyrrhizin (HMGB1 inhibitor)] and analyzed for alveolar bone repair in the periods of 0, 7, 14, 21 days after exodontia. Samples were submitted to histological processing and analyzed under optical microscopy for histomorphometric characterization (qualitative and quantitative), and analyzed by MicroCt for description of bone structures. In the histomorphometric analysis, the results showed a higher clot density in the GLY group in the 14-day period (p <0.05); As well as more inflammatory cells in the period of 7 and 14 days compared to the control (p <0.05). As well, it presented higher density of fibroblasts in the periods of 7, 14 and 21 days and lower density of fibers in 7 days (p <0.05). The GLY group had lower vessel densities in the periods of 7, 14 and 21 days. (P <0.05). The GLY group presented lower osteoblasts and higher osteoclasts compared to the control group at 7 and 14 days (p <0.05). Regarding the MicroCt, the images of both groups were performed and did not present significant difference between the groups. Therefore, inhibiton of HMGB1 protein was not able to interfere in the kinetics of alveolar bone repair in mice, but showed differences in some components involved in alveolar bone repair kinetics.
Figura 1: Domínios funcionais de HMGB1... 19
Figura 2: Desenho esquemático representando a ativação dos receptores
TLRs e RAGE por HMGB1 e posterior sinalização intracelular... 20
Figura 3: Cirurgia de extração de incisivo superior direito em
camundongos C57Bl/6-WT... 26
Figura 4: Imagem morfológica tridimensional por MicroCT (CTvox), do
processo de reparo alveolar do grupo controle (WT) e Glicirrizina (Gly)
nos períodos de 0h,7, 14 e 21 dias pós-exodintia... 33
Figura 5: Representação gráfica de volume trabecular (TV), volume de
osso (BV), densidade de volume de osso (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N) e espaçamento trabecular (Tb.Sp) com
relação aos grupos WT e GLY referente a 7, 14 e 21 dias... 34
Figura 6: Fotomicrografia representativa do Grupo WT e GLY nos
tempos de 0h,7,14 e 21 dias na objetiva de 10x e de 40x... 36
Figura 7: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros
coágulo sanguíneo (a) e outras estruturas (b) presentes no alvéolo dental de camundongos dos grupo controle (WT) e experimental ( GLY) nos
períodos de 0h,7,14 e 21 dias pós- exodontia... 38
Figura 8: Análise comparativa da densidade de área dos parâmetros
células inflamatórias (a), fibras (b), fibroblastos (c) e vasos 9d) no reparo ósseo alveolar entre o grupo controle (WT) e experimental ( GLY) nos
períodos de 0h,7, 14 e 21 dias pós- exodontia... 39
Figura 9: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros
osteoblastos (a), osteoclastos (b), e osso (c) presentes no alvéolo dental de camundongos nos grupos controle (WT) e experimental (GLY) nos
Tabela 1: Relação dos grupos experimentais avaliados de acordo com o
% por cento
ºC grau Celsius
µm Micrometro
ALP fosfatase alcalina
AP-1 proteína ativadora 1
BV volume de osso
BV∕TV densidade de volume de osso
C57BI∕6 (WT) camundongo 57 black∕6
COL – 1 colágeno do tipo 1
CT ciclo limiar
cm Centímetro
DAMPs padrões moleculares associados a danos
DOD-UFS departamento de odontologia da Universidade Federal de Sergipe
DNA ácido desoxirribonucléico
cDNA ácido desoxirribonucleico complementar
EDTA ácido etilenodiamino tetraacético
et al. Colaboradores
FGF fator de crescimento fibroblasto
FOB-USP Faculdade de Odontologia de Bauru – USP
GLY Glicirrizina
HE hematoxilina e eosina
HMBG1 caixa 1 de grupo de alta mobilidade
HSP proteína de choque térmico
h Horas
IGF fator de crescimento insulina
kDa unidade de massa atômica
LTDA sociedade empresarial de responsabilidade limitada
mg/Kg miligrama por quilo
MVs matriz extracelular
nSMase2 Esfingomielinase-2
OCN osteocalcina
OPG Osteoprotegerina
PAMPs padrões moleculares associados a patógenos
pH potencial hidrogeniônico
PRRs receptores de reconhecimento de padrões
P38 MAPK proteína quinase ativada por mitógeno P38
RAGE receptor para produtos finais de glicosilação avançada
RANK receptor de ativação do fator nuclear Κappa
RANKL ligante do receptor de ativação do fator nuclear Kappa
Runx2 fator de transcrição ao runt 2
RNA ácido ribonucléico
Tb.N Número trabecular
Tb.Sp espaçamento trabecular
Tb.Th espessura trabecular
TV volume trabecular
TLRs receptores semelhantes a Toll
VEGF fator de crescimento do endotélio vascular
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA... 15 2 OBJETIVOS... 23 2.1 OBJETIVO GERAL... 23 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 23 3 MATERIAL E MÉTODOS... 25 3.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO... 25 3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO... 26 3.3 COLETA DE AMOSTRAS... 26 3.4 PROCEDIMENTOS HISTOTÉCNICOS... 27
3.5 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS, ANÁLISE MORFOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA... 28
3.6 ANÁLISE DESCRITIVA POR MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA... 29
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 30
4 RESULTADOS... 32
4.1 ANÁLISE DESCRITIVA POR MICROTOMOGRAFIA (MICROCT) NO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS EXODONTIA EM CAMUNDONGOS... 32
4.2 ANÁLISE QUANTITATIVA POR MICROTOMOGRAFIA (MICROCT) NO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS EXODONTIA EM CAMUNDONGOS... 33
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA DA CINÉTICA DO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUDONGOS... 35
4.4 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUDONGOS... 37
5 DISCUSSÃO... 44
6 CONCLUSÃO... 50
REFERÊNCIAS... 52
INTRODUÇÃO E REVISÃO
DE LITERATURA
1 - INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
A osteoimunologia é um campo da imunologia que visa compreender o papel do sistema imunológico no tecido ósseo, pois eles têm moléculas regulatórias como citocinas, receptores e fatores de transcrição que são comuns e essa relação pode ser a chave para a compreensão de diversas doenças inflamatórias que envolvem a reabsorção óssea (TAKAYANAGI, 2005; HAN; KAWAI; TAUBMAN, 2007). Após perda de tecido ósseo devido a fraturas ou lesões inflamatórias osteolíticas, como na exodontia, é necessário um adequado processo de reparo e neoformação óssea para que ocorra o restabelecimento da homeostasia tecidual e recuperação de suas funções, favorecendo as possíveis terapias reabilitadoras (PERES; LAMANO, 2011). Dentre as possíveis estratégias para a modulação terapêutica do reparo ósseo, podemos destacar a modulação da resposta imune∕inflamatória cuja relação com a formação óssea mostra-se extremamente importante para o processo de reparo, todavia tal interação permanece pouco compreendida (MILLS; SIMPSON, 2012). Enquanto uma resposta imune∕inflamatória exacerbada está associada à reabsorção óssea, estudos mostram que a inibição da resposta imune∕inflamatória com antiinflamatórios (mesmos os mais específicos como os não-esteroidais) influenciam de forma negativa os processos de reparo ósseo e a osseointegração (KALYVAS; TARENIDOU, 2008; JACOBSSON et al., 1994). Apesar disso, estudos que tratam da interação resposta imune∕inflamatória e reparo ósseo ainda são escassos, já que a maioria dos estudos encontrados na literatura tem se concentrado na influência de células e mediadores imunológicos na ativação de osteoclastos e no processo de reabsorção óssea (THEILL; BOYLE; PENNINGER, 2002). Portanto, do ponto de vista clínico, não se sabe exatamente quando é realmente necessária a modulação da resposta imune e inflamatória, visto que a depender do tipo e intensidade da resposta, o impacto no tecido ósseo pode variar significativamente.
Inicialmente é fundamental compreendermos a interação entre sistema ósseo e imunológico para depois buscarmos modular a atividade das células ósseas em situações de resposta imune e inflamatória. O tecido ósseo é um tecido mineralizado e bastante dinâmico, que apresenta alta taxa de renovação mesmo em homeostase. Esse processo de renovação é mediado por três tipos de células, osteoblastos, osteoclastos e osteócitos, que são responsáveis pela constante remodelação do tecido, em ciclos de reabsorção e deposição óssea, chamado de
“couple bone formation” (MACKIEWICZ et al., 2011; LIU; ZHANG, 2015). A integridade do tecido ósseo depende da manutenção de um delicado equilíbrio entre a formação óssea, realizada pelos osteoblastos e a reabsorção óssea pelos osteoclastos. Em meados da década de 1990, foi descoberto o sistema RANKL / RANK / OPG que ilustra de forma interessante a interação entre o sistema ósseo e imunológico, uma vez que tais moléculas têm funções em ambos os sistemas. RANKL (ligante do receptor de ativação do fator nuclear κB), seu receptor celular RANK (receptor de ativação do fator nuclear κB) e osteoprotegerina (OPG), que atua como receptor "decoy" de RANKL, foram identificados como os principais componentes moleculares do sistema de remodelação óssea (BOYCE; XING, 2008; ASAGIRI; TAKAYANAGI, 2007). A ligação entre RANKL e RANK, expresso nos precursores de osteoclastos, é o principal evento estimulatório para sua diferenciação e posterior ativação de osteoclastos. As atividades de RANKL são reguladas por OPG, que inibe a reabsorção óssea impedindo a interação entre RANKL e RANK, favorecendo a formação óssea. Contudo, o desequilíbrio desse sistema ocasiona doenças do metabolismo ósseo (CAETANO-LOPES; CANHÃO; FONSECA, 2009; CHEN et al., 2017). A presença exacerbada de fatores osteoclastogênicos é a principal causa da reabsorção óssea patológica, a presença destes mesmos fatores na quantidade "ideal" é fundamental no processo de reparo ósseo, mediando à maturação do osso primário em osso secundário (MILLS; SIMPSON, 2012). Portanto, alterações no balanço da expressão destes fatores osteoclastogênicos estão relacionadas como eventos chaves na patogênese de doenças inflamatórias no tecido ósseo (BOYCE; XING, 2008; REPEKE et al., 2010).
Em condições homeostáticas, a reabsorção da matriz óssea através dos osteoclastos resulta na liberação de fatores de crescimento e mediadores osteoblastogênicos responsáveis pelo aumento na expressão de moléculas envolvidas na diferenciação e ativação de osteoblastos, como o fator de transcrição Runx2; proteínas produzidas pelos osteoblastos durante a formação da matriz orgânica do tecido ósseo, como o colágeno do tipo 1 (COL-1) e osteocalcina (OCN); e durante o processo de mineralização, como a fosfatase alcalina (ALP); sendo em conjunto mediadores essenciais aos processos de osteogênese de reparo ósseo (BAEK; KIM, 2011; LONG, 2011). No entanto, devemos considerar que o processo de remodelação óssea „ideal‟ descrito acima se diferencia das situações com lesões ósseas pela ausência de mediadores imunes e inflamatórios. Nestes casos, assim como no processo de reparo tecidual ou ósseo e neoformação óssea se iniciem, é necessária uma resposta inflamatória inicial, que influenciam significativamente em diversas etapas do processo de
reparo (SCHRODER; TSCHOPP, 2010; FUKATA; VAMADEVAN; ABREU, 2009). Etapas estas que começa com a formação de um coágulo sanguíneo, seguido por infiltração de células inflamatórias e posteriormente, a migração de tecido granulação que ajuda a estabilizar a matriz extracelular. Este tecido conjuntivo mais denso é eventualmente substituído por osso tecido recém formado e, finalmente, por osso lamelar e medula óssea (LIN et al., 2011).
De forma geral, pode-se considerar que a resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro envolve etapas bem estabelecidas, entre as quais podemos destacar as fases de reconhecimento, efetuação e regulação. Existem várias classes de receptores no sistema imune que são importantes para o reconhecimento inicial e para a indução subsequente da resposta pró-inflamatória, denominados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) (TANG et al., 2012; BIDWELL; YANG; ROBLING, 2008). Através da expressão de PRRs, como por exemplo, os TLRs (receptores do tipo Toll) e os NLRs (receptores do tipo NOD), diferentes tipos celulares são capazes de reconhecer uma variedade de moléculas derivadas de microrganismos, coletivamente denominadas PAMPs (padrões moleculares associados a patógenos) (FUKATA; VAMADEVAN; ABREU, 2009). Se por um lado, PAMPs são moléculas provenientes de patógenos, naturalmente associadas a estímulos infecciosos, moléculas derivadas do próprio hospedeiro, de outro lado DAMPs (padrões moleculares associados a danos) são liberadas em situações de estresse, dano e/ou morte celular ou ainda lesão dos tecidos, como por exemplo a exodontia (TANG et al., 2012). Apesar de origens diferentes, tanto PAMPs quanto DAMPs podem compartilhar receptores (PRRs) semelhantes na fase de reconhecimento e iniciação da resposta, sendo que ambos podem gerar efeitos inflamatórios (FUKATA; VAMADEVAN; ABREU, 2009; BIANCHI, 2006).
Em especial, os DAMPs são moléculas que têm um papel fisiológico dentro da célula, mas adquirem funções adicionais quando são expostas ao ambiente extracelular: alertam o corpo sobre o perigo, estimulam uma resposta inflamatória e, finalmente, promovem o processo de regeneração. Os DAMPs estão ligados a inflamação e conseqüentemente a inibição de respostas inflamatórias mediadas por DAMP é uma estratégia promissora para melhorar o tratamento clínico de doenças inflamatórias provocadas por infecção e∕ou lesões. No entanto, é importante considerar que DAMPs não são apenas sinais de perigo, mas também peças centrais na reparação de tecidos (VÉNÉREAU; CERIOTTI; BIANCHI, 2015). Além disso, vale ressaltar que no âmbito do reparo ósseo alveolar, tanto PAMPs como DAMPs podem estar presentes, embora se acredite que em condições homeostáticas e "ideais"
(não infecciosas), a presença microbiana seja relativamente baixa, e consequentemente os DAMPs desempenhariam um papel potencialmente mais importante que PAMPs na iniciação da resposta do hospedeiro.
Especificamente, os TLRs são proteínas transmembranares do tipo I com ectodomínios contendo repetições ricas em leucina que medeiam o reconhecimento de PAMPs e de DAMPs.Vários organismos expressam a família TLR, especialmente mamíferos, e 13 tipos de TLRs já foram relatados. Os receptores TLR1, -2, -4, -5, e -6 são expressos na superfície celular, enquanto TLR3, -7, -8, -9, são expressos no endossoma (SATOH; AKIRA, 2016). Os TLRs desempenham papel importante no sistema imune, estando presentes em diversos tipos celulares, como células dendríticas e macrófagos, células residentes do tecido conjuntivo, como fibroblastos, e também em células do tecido ósseo, como osteoclastos e osteoblastos (AKIRA et al., 2006). Independente do tipo celular, a cascata de sinalização deflagrada pós ativação dos diferentes TLRs apresentam algumas semelhanças, como a participação da proteína intracelular MyD88, essencial na resposta gerada através destes receptores (SZATMARY, 2012; SATOH; AKIRA, 2016). MyD88 é responsável por mediar etapas iniciais da sinalização que levam a ativação e translocação nuclear de fatores de transcrição como NFκB, AP-1 e IRF, que resultam na expressão de citocinas e outros mediadores inflamatórios (MIDWOOD; PICCININI, 2010; FUKATA; VAMADEVAN; ABREU, 2009). Estudos têm sugerido papéis importantes das vias de sinalização TLR4 / MyD88 e TLR2 / MyD88 na regulação da inflamação e do metabolismo ósseo em várias doenças osteolíticas (MADEIRA et al., 2013; LIU et al., 2014). Apesar dos TLRs terem sido originalmente descobertos como receptores para reconhecimento de produtos bacterianos, atualmente são considerados importantes no reconhecimento de DAMPs (KONO; ROCK, 2008).
Um dos principais DAMPs reconhecidos pelos receptores TLRs é a proteína HMBG1 (“high-mobility group Box-1”). HMGB1 é composta por 215 aminoácidos, tem um peso molecular de aproximadamente 30 kDa e apresenta três domínios funcionais. Os dois primeiros consistem em dois box (box A e box B) carregadas positivamente com atividade de ligação ao DNA e uma cauda C-terminal (terminal carboxilo) com carga negativa que mediam a ligação ao nucleossoma e aumenta atividade transcricional da proteína (Figura 1). Além disso, o box B também contém a atividade relacionadas a citocinas enquanto que o box A é antagonista para esta função (MAGNA; PISETSKY, 2014; BIDWELL; YANG; ROBLING, 2008).
Figura 1: Domínios funcionais de HMGB1. Box B positivamente carregadas com domínios básicos que ligam ao DNA. O box B demonstra atividade de citocinas em que o Box A é antagonista. A cauda ácida terminada com carboxilo negativamente medeia a ligação ao DNA do nucleossoma e aumenta a atividade transcricional desta proteína. (Adaptada de (BIDWELL; YANG; ROBLING, 2008)
Assim, HMGB1 é uma proteína abundante, possui importantes atividades biológicas dentro, bem como fora da célula. Além do mais, o efeito de HMGB1 pode interagir com o DNA e as histonas para determinar a estrutura da cromatina e regular processos chaves tais como a transcrição, como também quando translocada para o citoplasma pode mediar o processo de autofagia. Seu efeito fora da célula faz com que HMGB1 adquira uma nova identidade para servir como um alarme ou um padrão molecular associado a dano (DAMP) (HARRIS; ANDERSSON; PISETSKY, 2012; ANDERSSON; TRACEY, 2011). Como tal, HMGB1 pode desempenhar múltiplos papéis na patogênese das doenças inflamatórias e auto-imunes e mediar processos que vão desde a inflamação até o reparo (ANDERSSON; HARRIS, 2010).
Dentre as diversas funções, HMGB1 atua similarmente a uma citocina pró-inflamatória, sendo que recentemente, foi demonstrada sua participação na osteoclastôgenese na presença de RANKL (SAKAI et al., 2012; YANG et al., 2008). Em relação ao tecido ósseo e mais especificamente ao reparo ósseo, HMGB1 demonstra ser liberada por osteoblastos e osteócitos, apresentando-se como molécula alvo para a inicialização da resposta inflamatória pós injúria óssea (YANG et al., 2008). Estudos mostram que HMGB1 está associado aos receptores TLR2 e TLR4, portanto, demonstra ser capaz de induzir a produção de diversas
citocinas que possuem papéis fundamentais na resposta imune/inflamatória e no processo de reparação tecidual em geral (MAGNA; PISETSKY, 2014; SAKAI et al., 2012).
Entretanto, apesar de importantes, os receptores TLRs não são os únicos no sistema imune/inflamatório a responder a situações de perigo via estímulo gerado por HMGB1. Por exemplo, de maneira similar o receptor RAGE (receptor para produtos finais de glicosilação avançada) também demonstra papel importante no reconhecimento de diversas DAMPs (Figura 2). RAGE é um receptor transmembrana membro da superfamilia das imunoglobulinas capaz de induzir a resposta inflamatória através da ligação em diversos ligantes, como o HMGB1 (HARRIS; ANDERSSON; PISETSKY, 2012). Como mostrado em estudo in vitro, a sinalização HMGB1 através de RAGE medeia quimiotaxia; proliferação e diferenciação de células imunes e outras células; e regulação positiva dos receptores de superfície celular, incluindo TLR4. (ANDERSSON; TRACEY, 2011). Sendo assim, mesmo com o bloqueio de Myd88 (e conseqüentemente bloqueio dos receptores TLRs) em um processo de reparo ósseo alveolar, outras vias pode estar atuando de forma compensatória à resposta HMGB1/TLRs.
Figura 2 - Desenho esquemático representando a ativação dos receptores TLRs e RAGE por HMGB1 e posterior sinalização intracelular. Setas da cor azul determinam indução/ativação.
Estudos demonstram que RAGE está associado a diversas patologias inflamatórias, como artrite reumatóide, doença periodontal e diabetes (TANG et al., 2012). Em relação ao tecido ósseo, camundongos geneticamente deficientes para não apresentar o receptor RAGE apresentam uma massa óssea maior quando comparados a camundongos normais (WT) e um número menor na quantidade de osteoclastos, demonstrando um papel importante no metabolismo ósseo (DING et al., 2006; ZHOU et al., 2006). Quando ativado, o receptor RAGE gera uma cascata de sinalização responsável pela translocação para o núcleo celular dos fatores de transcrição NFKB e AP-1, fundamentais na formação e ativação do osteoclastos e importantes na transcrição de diversas citocinas e quimiocinas de caráter inflamatório (cascata esta que ativa os mesmos fatores de transcrição da cascata via TLR4) (SORCI et al., 2013; LIU et al., 2014).
De forma geral, observamos um mecanismo fundamental para a resposta imune/inflamatória, seja ela de qualquer origem. Tanto receptores da família TLRs, quanto RAGE demonstram através de suas características alvos em potencial para novas estratégias de aperfeiçoar e entender o processo de reparo ósseo. Consequentemente, surgem novos questionamentos do papel e da importância de tais moléculas para a formação óssea. E principalmente, dúvidas sobre qual a intensidade de ativação necessária dos receptores TLRs e RAGE via HMGB1, para que haja uma resposta imune/inflamatória controlada, afim de um reparo ósseo rápido e eficiente, e não uma resposta inflamatória de maneira exacerbada, prejudicando o reparo ósseo normal.
Desse modo, a descoberta das sinalizações mediadas pelo ligante HMGB1 apresenta-se como um possível alvo de interesapresenta-se para o estudo entre a relação do sistema imune e ósapresenta-seo (osteoimunologia). Os resultados do presente estudo visam contribuir para o aprimoramento dos conhecimentos dos mecanismos celulares envolvidos na resposta imune/inflamatória necessária para o reparo do tecido ósseo.
2 - OBJETIVOS
2.1 - OBJETIVO GERAL:
• Caracterizar o papel de HMGB1 na resposta imune/inflamatória do processo de reparo ósseo alveolar em camundongos.
2.2 - OBJETIVO ESPECÍFICO:
• Analisar morfometricamente o processo de reparo ósseo alveolar em camundongos C57Bl/6 por meio da inibição de HMGB1 através da droga Glicirrizina.
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Foram utilizados 40 camundongos C57BI∕6 (WT), do tipo selvagem, machos, com idade aproximada de 8 semanas e divididos em dois grupos (controle-WT e GLY- tratado com glicirrizina), os quais foram obtidos e mantidos no biotério da Faculdade de Odontologia de Bauru (FOB-USP). Durante o protocolo experimental todos os animais foram dispostos em gaiolas de polipropileno (cinco camundongos por gaiola), com temperatura ambiente de 22 ± 2ºC e no ciclo de 12horas claro∕escuro. Foram alimentados com ração sólida (Ração Ativada Produtor - Anderson & Clayton S.A.) e água, sendo ofertado ração triturada por 24hs após a cirurgia. Os 20 animais de cada grupo foram analisados de acordo com os períodos pós exodontia (0h,7,14 e 21 dias). Para cada período foram utilizados 5 camundongos para a análise MicroCt∕histomorfométrica, como descrito na tabela 1. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da FOB∕USP (nº 07∕2014). (ANEXO 1)
Os animais do grupo experimental (GLY) foram tratados com glicirrizina, um glicósideo de triterpeno natural derivado do alcaçuz, no qual estudos anteriores demonstraram que a glicirrizina inibi a atividade de HMGB1 (ZHAO et al., 2017; MOLLICA et al., 2007). Para administração via intraperitoneal, foram diluídos 200mg∕kg em 1 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato) e DMSO (sulfóxido de dimetilo) e administrado doses de 1mg∕kg a cada 24hs nos períodos iniciais.
Tabela 1: Relação dos grupos experimentais avaliados de acordo com o número de animais por período e tipo de análise realizada.
Grupos Períodos Histomorfometrica
MicroCt
WT
0d 5
7d 5
21d 5 HMGB1 0d 5 7d 5 14d 5 21d 5 Total 40 3.2 - PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
As exodontias foram realizadas com os animais sob anestesia geral via intramuscular com cloridrato de quetamina injetável com nome comercial de Dopalen® (Agribrans do Brasil LTDA) na dosagem de 100mg∕kg e cloridrato de xilazina injetável com nome comercial de Anasedan® (Agribrands do Brasil LTDA) na dosagem de 20mg∕kg. O incisivo superior direito de cada animal foi extraído com a utilização de uma sonda exploradora nº5 devidamente afiada para desinserção dos tecidos moles e luxação do dente e uma pinça previamente desgastada para a apreensão e extração do dente (Figura 3).
Figura 3: Cirurgia de extração de incisivo superior direito em camundongos C57Bl/6-WT.
3.3 - COLETA DE AMOSTRAS
Ao final de cada período experimental (0 hora, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia), os animais foram eutanasiados por meio de injeção de dose excessiva de anestésico via intramuscular. Em seguida, as amostras constituídas pelas maxilas contendo os alvéolos
foram coletadas com o emprego de uma lâmina n°20 acoplada ao cabo de bisturi e a carcaça desses animais foram congeladas e descartadas no lixo biológico aos cuidados da FOB-USP.
Incialmente, uma maxila de cada período (0h, 7, 14 e 21 dias) de ambos os grupos foram previamente fixadase destinadas à obtenção das imagens pela técnica de microtomografia computadorizada. Posteriormente, as amostras destinadas à análises microscópicas foram fixadas em solução de formol tamponado a 10% (pH 7,2), armazenadas em temperatura ambiente e depois lavadas em água corrente (“over-night”). O acondicionamento em etanol 70% foi um cuidado adicional, cujo objetivo era manter a fixação previamente obtida com o formol, mas evitar a superfixação do tecido por este primeiro reagente, o que poderia desnaturar os antígenos necessários para a marcação de imuno-histoquímica.
3.4 - PROCEDIMENTOS HISTOTÉCNICOS
Após a fixação em formol por 48 horas, acondicionamento em fixador alcóolico, as amostras foram lavadas e desmineralizadas em solução de EDTA pH 7,2 (solução contendo 4,13% de Titriplex III Merck® e 0,44% de hidróxido de sódio) à temperatura ambiente, por um período aproximado de quarenta dias, respeitando as trocas semanais da solução desmineralizadora e monitoramento por meio da análise radiográfica. Posteriormente, as amostras foram lavadas em água corrente por 24 horas visando à total remoção de EDTA, e em seguida submetidas à técnica de rotina para inclusão em parafina Histosec® (parafina + resina). Para inclusão, foi realizada a desidratação das amostras em 3 banhos de soluções de etanol 100% (dois banhos de por 4 horas, seguido de um banho de 12 horas). Em seguida as amostras desidratadas passaram por 3 banhos de 1 hora em soluções de xilol, e por fim foram incluídas em parafina para confecção dos blocos.Os blocos de parafina foram submetidos a cortes histológicos semi-seriados no eixo transversal (perpendicular ao longo eixo do alvéolo dental) ,utilizando-se um micrótomo Leica Jung RM 2045. Foram obtidos cortes de 4µm de espessura para coloração com Hematoxilina e Eosina (HE), com intervalos de 500μm, abrangendo os terços coronal, médio e apical do alvéolo (VIEIRA et al., 2015). Todo o processo histológico foi realizado no laboratório do departamento de Histologia da Faculdade de Odontologia de Bauru (FOB-USP).
3.5 - PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS, ANÁLISE MORFOLÓGICA E HISTOMORFOMÉTRICA
Para as análises histológicas descritiva (qualitativa) e histomorfométrica (quantitativa), foram obtidas 6 lâminas de cada animal, com 8 cortes semi-seriados em cada lâmina, os quais foram corados em HE e observados e analisados em microscópio óptico. A análise histológica descritiva foi realizada com emprego de um microscópio óptico binocular (OLYMPUS, modelo CH-2), sendo considerado o terço médio do alvéolo dental dos diferentes períodos experimentais (0 hora, 7, 14 e 21 dias) para ambos os grupos. Optou-se por uma descrição histológica qualitativa mais abrangente da evolução do processo de reparo alveolar em objetivas menores (4x e 10x), e uma análise descritiva mais detalhada em objetiva de aumento de 40x, acompanhando os eventos de reparação óssea conforme os seguintes eventos: presença e reabsorção gradativa do coágulo sanguíneo; presença de infiltrado inflamatório; formação de tecido de granulação e sua transição para tecido conjuntivo, e deste para tecido ósseo neoformado; processo de remodelação das trabéculas ósseas neoformadas (evidenciado pela presença de osteoclastos); trabéculas ósseas já remodeladas, evidenciadas por linhas de reversão; maturação do tecido ósseo neoformado, sugerida pela presença de tecido medular. A análise histomorfométrica foi realizada por meio da avaliação da densidade de área das estruturas constituintes do tecido alveolar durante o reparo, sendo considerados os seguintes parâmetros histológicos: coágulo sanguíneo; infiltrado inflamatório (consideradas células inflamatórias polimorfonucleares e mononucleares distinguíveis em HE); vasos sanguíneos; fibras colágenas (consideradas fibras colágenas todas as fibras presentes no alvéolo devido ao seu predomínio em relação aos outros tipos de fibra); fibroblastos; matriz óssea; osteoblastos; osteoclastos; outras estruturas (espaço preenchido por líquido intersticial, medula óssea ou estruturas dentárias). Dos parâmetros histológicos supracitados, aqueles correspondentes ao tecido conjuntivo (fibroblastos, fibras colágenas, vasos sanguíneos e infiltrado inflamatório) e ao tecido ósseo (matriz óssea, osteoblastos e osteoclastos), também foram analisados em conjunto, sendo somadas as densidades de área das estruturas correspondentes a cada tecido, proporcionando um dado mais abrangente para análise da cinética do reparo. A densidade de área foi obtida por meio de contagem de pontos coincidentes sobre os critérios histológicos supracitados, com o emprego de uma lente ocular 15X, F.N. 12, um retículo de contagem com referência de 1x1 e uma objetiva de imersão com o aumento de 100x, em microscópio óptico binocular (OLYMPUS CX21). O retículo utilizado constitui uma grade composta por um
quadrado que limita a área a ser estudada, e que contém um conjunto de 10 linhas paralelas sucessivas, divididas igualmente por 10 pontos, formando um sistema de 100 pontos. Assim, a sobreposição do retículo sobre o campo histológico permitiu a contagem de estruturas que eram coincidentes com os pontos do retículo, no qual foi considerado ao todo 13 campos microscópicos distintos, dispostos regular e sistematicamente sobre um único corte histológico. Para cada animal, consideram pelo menos 3 cortes histológicos abrangendo o terço médio do alvéolo, sendo portanto contados ao todo 39 campos. Os campos foram escolhidos com intervalos regulares em cada corte, de maneira a se obter uma amostra representativa de toda área do corte. O cálculo da densidade de área (Da) foi obtido pela contagem de pontos coincidentes sobre as estruturas consideradas (Pi) e o número total de pontos existentes no retículo (P), sendo adotada a seguinte regra (Da = 100 x [ΣPi/ ΣP]). O total de pontos ocupados pelo alvéolo foi considerado 100%, sendo Pi estabelecido como percentual relativo a este, ocupado por cada uma das estruturas consideradas com os valores resultantes da contagem dos 3 cortes histológicos de cada animal (VIEIRA et al., 2015). Posteriormente foram calculadas a média e o desvio padrão dos percentuais obtidos nos animais pertencentes ao mesmo grupo. A etapa de análise histológica foi realizada no laboratório de radiologia do departamento de Odontologia da Universidade Federal de Sergipe (DOD-UFS)
3.6 - ANÁLISE POR MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (MICROCT)
A MicroCT foi empregada como um método complementar, para permitir uma análise descritiva e quantitativa por reconstrução tridimensional (3D) do reparo ósseo alveolar durante os diferentes períodos experimentais (0h, 7, 14 e 21 dias) em ambos os grupos, facilitando também o entendimento anatômico do modelo experimental. Para tanto, as maxilas coletadas acondicionadas em fixador alcoólico, foram escaneadas em MicroCT da marca SkyScan, modelo 1174 (Kontich, Bélgica), onde foram reconstruídas e analisadas com softwares próprios do aparelho (NRecon, Dataviewer, e CT-Vox).O escaneamento das maxilas foi realizado com um tempo de aquisição de 33 minutos, utilizando-se os seguintes parâmetros tomográficos: 50 kV, 800 uA, com filtro de 0,5 mm Al, com 180 graus de rotação e intervalo de exposição de 1 grau, sendo as imagens capturadas com uma resolução de 1304 x 1024 pixels, com um tamanho de voxel de 14,12 µm. Uma vez escaneadas, os espécimes foram encaminhados para o laboratório de Histologia da FOB-USP, para dar sequência ao
processamento histotécnico de rotina. As imagens obtidas a partir das maxilas escaneadas ("slices" ou cortes tomográficos) foram reconstruídas no software NRecon v1.6.4.8 (Skyscan), com parâmetros de reconstrução padronizados para todas as amostras. Na sequência, para obtenção das imagens tridimensionais em diferentes planos de secção (transaxial e sagital), as imagens reconstruídas no software NRecon foram realinhadas no software DataViewer1.4.4.0,e posteriormente reconstruídas em 3D no software CTvox 2.3, por meio de renderização de volume, técnica que permite uma análise interativa da morfologia óssea de todo o alvéolo dental (VIEIRA et al., 2015).
3.7 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análises entre apenas dois grupos foi utilizado o teste “t” Student. As análises de mais de dois grupos foi utilizado o teste de variância (ONE WAY ANOVA) seguido do post test Tukey. Para todas as analises, os valores de p< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os testes estatísticos, adequados aos experimentos, grupos e valores obtidos foram aplicados através do programa GraphPad Prism5.
4 - RESULTADOS
4.1- ANÁLISE DESCRITIVA POR MICROTOMOGRAFIA (MICROCT) DO PROCESSO DE REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUNDONGOS
Por meio da reconstrução tridimensional das maxilas escaneadas em MicroCT, demonstrou-se comparativamente o processo de reparo ósseo alveolar dos grupos controle (WT) e experimental (GLY) ao longo dos tempos 0h, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia (Figura 4). Dentro de uma escala de densidade tomográfica, as estruturas mais claras (hiperdensas) representam o tecido ósseo maduro que compõe as demais estruturas ao redor do alvéolo dental, servindo como parâmetro de comparação com a densidade tomográfica observada na área do alvéolo dental ao longo dos diferentes períodos.
No período de 0 hora, observou-se na região do alvéolo direito uma área hipodensa correspondente ao coágulo sanguíneo e nenhuma área hiperdensa dentro do alvéolo na imagem dos dois grupos (Figura 4). Com 7 dias, surgiu algumas áreas hiperdensas indicando o ínicio da formação ossea de forma centrípeta, ou seja das paredes laterais do alvéolo em direção ao centro, em ambos os grupos. Assim como, alguns espaços hipodensos no interior do alvéolo, possivelmente coorrespondente ao tecido de granulação e coágulo renanescente sendo mais presente no grupo GLY (Figura 4). Com 14 dias, observou-se uma neoformação óssea atingindo a região central do alvéolo, evidente pela presença trabéculas ósseas neoformadas e mineralizadas de forma semelhantes em ambos grupos analisados (Figura 4). Aos 21 dias, foi evidenciado grandes áreas hiperdensas correspondente a formação óssea mais intensa ocupando quase toda região do alvéolo, tanto na imagem do grupo controle como no grupo experimental. Cabe resaltar que no período de 21 dias, o alvéolo do grupo GLY apresenta menor intensidade de áreas hiperdensas que surgerem mais espaçamento entre as trabéculas formadas, sugerindo áreas de região medular (Figura 4).
De forma geral, as imagens demonstraram que camundongos WT e do grupo GLY apresentaram um processo de reparo muito semelhante ao longo dos períodos estudados em relação à formação de tecido ósseo.
Figura 4: Imagem morfológica tridimensional por MicroCT (CTvox), do processo de
reparo alveolar do grupo controle ( WT) e experimental (GLY) nos períodos de 0h, 7, 14 e 21 dias pós-exodontia. A imagem ilustra o corte na secção transaxial (equivalente ao
plano transversal utilizado para os cortes histológicos). Barra de escala = 0,5 mm.
4.2- ANÁLISE QUANTITATIVA POR MICROTOMOGRAFIA (MICROCT) DO
PROCESSO DE REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM
CAMUNDONGOS
Com relação à análise quantitativa da neoformação óssea por MicroCT, observou-se os parâmetros de volume trabecular (TV), volume de osso (BV), densidade de volume de osso (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N) e espaçamento trabecular (Tb.Sp) através da comparação entre os grupos WT e GLY nos períodos de 7, 14 e 21 dias. E conforme foi demonstrado na análise das imagens tridimensionais, não houve diferença significativa entre os períodos do grupo controle com os do grupo experimental (Figura 5).
Figura 5: Representação gráfica de volume trabecular (TV), volume de osso (BV), densidade de volume de osso (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N) e espaçamento trabecular (Tb.Sp) com relação aos grupos WT e GLY referente a 7, 14 e 21 dias pós-exodontia. A análise estatística foi feita por análise de variância (ANOVA 1) com o post test Tukey. (p<0,05). Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre os grupos WT e GLY, dentro do mesmo período experimental, e também no grupo WT e GLY nos tempos de 7, 14 e 21 dias.
4.3-ANÁLISE HISTOLÓGICA DESCRITIVA DO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUNDONGOS
Na análise histológica realizou-se inicialmente uma descrição qualitativa da cinética do reparo ósseo alveolar nos cortes histológicos do alvéolo dental de camundongos WT, sendo estes dados utilizados como processo fisiológico controle para comparação do reparo ósseo alveolar em camundongos inibidos por glicirrizina (GLY) nos períodos de 0h, 7 e 14 dias pós-exodontia. Desta forma, foram observados os seguintes eventos histológicos: no tempo de 0 hora, observaram-se alvéolos predominantemente preenchidos por coágulo sanguíneo e alguns espaços vazios que caracterizam um possível exsudato inflamatório e presença de alguns resquícios do ligamento periodontal nos dois grupos. No 7º dia, os alvéolos dos WT e GLY apresentaram coágulo em proporção bem menor, e aumento no infiltrado inflamatório (composto por células inflamatórias polimorfonucleares e mononucleares distinguíveis em HE); também foi observado tecido de granulação com presença de pequenos vasos sanguíneos, fibroblastos e fibras colágenas. Em algumas regiões, foi observado neoformação óssea com a presença de osso primário com osteoblastos. Ao 14º dia, em ambos os grupos, a quantidade de trabéculas ósseas foi maior em relação ao 7º dia, ocupando o centro do alvéolo e a presença de alguns osteoclastos. Também foi observado o aumento de vasos sanguíneos no tempo de 14 dias (Figura 6).
De uma forma generalista, em uma visão panorâmica do terço médio do alvéolo dental nos aumentos de 10x e 40x, a cinética do processo de reparo alveolar nos grupos WT e GLY seguiram padrão semelhante, com formação de coágulo sanguíneo no período de 0 hora, passando pela formação de matriz conjuntiva provisória e início da formação óssea aos 7 dias. Posteriormente, uma maior quantidade de trabéculas óssea e de vasos sanguíneos aos 14 dias, e por fim, um aumento da área ocupado por tecido ósseo com trabéculas maiores e ainda a presença de vasos aos 21 dias.
Figura 6: Fotomicrografia representativa do Grupo WT e GLY nos tempos de 0h,7,14 E 21 dias. Cortes histológicos foram obtidos provenientes dos alvéolos após exodontia do incisivo superior com a objetiva de 10x e 40x. (Coloração em H.E.; barra = 100 μm)
4.4 – ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA COMPARATIVA DO REPARO ÓSSEO ALVEOLAR PÓS-EXODONTIA EM CAMUDONGOS
Para a análise quantitativa, as estruturas descritas foram previamente categorizadas dentro de diferentes parâmetros histológicos, tais como: coágulo sanguíneo, infiltrado inflamatório, fibroblastos, fibras colágenas, vasos sanguíneos, matriz óssea, osteoblastos, osteoclastos e outras estruturas. Dessa forma, cortes histológicos do terço médio do alvéolo dental dos camundongos foram corados em HE. Foram sistematicamente quantificados por meio de cálculo de densidade de área (%), permitindo assim uma análise comparativa dos eventos ocorridos entre os grupos WT e GLY durante os períodos de 0h, 7, 14, e 21 dias. Para organizar a disposição dos resultados de acordo com os tecidos observados na seqüência do reparo, primeiro serão apresentados os resultados relativos ao coágulo sanguíneo e outras estruturas, em seguida os resultados referentes aos parâmetros de tecido conjuntivo (infiltrado inflamatório, vasos sanguíneo, fibroblastos e fibras) e por fim, de tecido ósseo (matriz óssea, osteoblastos e osteoclastos).
Em relação à densidade de coágulo sanguíneo, a cinética foi similar entre os camundongos WT e os GLY, apresentando uma intensa densidade de coágulo no período de 0 hora, com diminuição aos 7 dias. Quando comparado os camundongos WT com os do grupo GLY, observa-se uma quantidade significativamente maior de coágulo residual nos camundongos WT no período de 7 dias pós-exodontia (p<0,05; Figura 7a), e posteriormente aos 14 dias, não há mais a presença de coágulo. Entretanto, apesar dos camundongos GLY, apresentarem menor densidade no período de 7 dias quando comparado com o controle, observa-se que o coágulo persiste em 14 dias, apresentando maior densidade ao comparar com o WT (p<0,05; Figura 7a), e só com 21 dias eles apresentam densidades semelhantes aos camundongos WT. Na análise da densidade do parâmetro "outros" foi observado diferença significativa entre os dois grupos no período de 21 dias (WT vs GLY; p>0,05). Nos períodos mais iniciais, o parâmetro “outros” foi inerente aos espaços vazios ocupados possivelmente por exsudato inflamatório. Nos períodos mais tardios, como aos 14 e 21 dias, a densidade de área de "outras estruturas" aumentou em ambos os grupos, sendo que neste período o parâmetro foi referente à presença de medula óssea entre as trabéculas neoformadas (Figura 7b).
a)
b)
Figura 7: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros coágulo
sanguíneo (a) e outras estruturas (b) presentes no alvéolo dental de camundongos dos grupo controle (WT) e experimental (GLY) nos períodos de 0h, 7, 14 e 21 dias pós- exodontia. Os resultados representam os valores da média e desvio padrão em cada um dos
períodos analisados. (* p< 0,05) indica diferença estatisticamente significante entre os grupos WT e GLY, dentro do mesmo período experimental. As letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante dentro do grupo entre os períodos analisados.
O u t r o s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 5 1 0 1 5 W T G L Y * b a a a a b c b C o á g u l o D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 5 1 0 1 5 2 0 W T G L Y * * a b c c a b c b c
Em relação ao total das estruturas referentes ao tecido conjuntivo (infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos, fibroblastos e fibras colágenas), foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos WT e GLY (Figura 8). Considerando a densidade dos fibroblastos, foi observado maior quantidade nos camundongos GLY, nos períodos de 7, 14 e 21 dias (p<0,05; Figura 8c) que por sua vez apresentou menor densidade de volume de fibras colagénas no período de 7 dias pós-extração quando comparados aos camundongos WT (p<0,05; Figura 8b). De forma interessante, a densidade de vasos sanguíneos nos camundongos GLY foi menor quando comparado aos camundongos WT nos períodos de 7, 14 e 21 dias (p< 0,05; Figura 8d), que em compensação apresentou maior densidade de células inflamatórias no período de 7 dias e 14 dias quando comparado aos camundongos WT (p<0,05; Figura 8a).
a) b) F i b r a s D ia s D e n s id a d e d e á re a (% ) 0 7 14 21 0 1 0 2 0 3 0 4 0 W T G L Y * a b c d a b c d C é l u la s I n f la m a t ó r ia s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 5 1 0 1 5 2 0 W T G L Y * * a b a a b b a b c a
c)
d)
Figura 8: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros células
inflamatórias (a), fibras (b), fibroblastos (c) e vasos (d) presentes no alvéolo dental de camamundongos dos grupos controle (WT) e experimental (GLY) nos períodos de 0h,7,14 e 21 dias pós- exodontia. Os resultados representam os valores da média e desvio
padrão em cada um dos períodos analisados. (* p< 0,05) indica diferença estatisticamente significante entre os grupos WT e GLY, dentro do mesmo período experimental. As letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante dentro do grupo entre os períodos analisados. V a s o s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 1 0 2 0 3 0 4 0 W T G L Y * * * a b c d a b b c F i b r o b l a s t o s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 W T G L Y * * * b a b c c a b b
Na análise individual dos componentes de tecido ósseo (osteoblastos, osteoclastos e matriz óssea), foram observadas diferenças significativas (p<0,05) nos tempos de 7, 14 e 21 dias para osteoblastos e osteoclastos. Os camundongos GLY apresentaram menor densidade de osteoblastos nos período de 7 e 14 dias, e apenas ao 21º dia que essa densidade foi maior quando comparados com os camundongos WT (p<0,05; Figura 9a). Já em relação aos osteoclastos, os camundongos GLY apresentaram maior densidade de área nos períodos de 7, 14 e 21 dias quando comparados com os camundongos WT (p<0,05; Figura 9b). Entretanto, não apresentou diferença significativa na matriz óssea em nenhum dos períodos analisados (Figura 9c). a) b) O s t e o c l a s t o s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 W T G L Y * * * b a b b a b a b c O s t e o b l a s t o s D ia s D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 5 1 0 1 5 W T G L Y * * * c a b b c a b b
c)
Figura 9: Análise comparativa da densidade de área (%) dos parâmetros osteoblastos (a),
osteoclastos (b), e osso (c) presentes no alvéolo dental de camundongos nos grupos controle (WT) e experimental (GLY) nos períodos de 0h,7,14 e 21 dias pós- exodontia.
Os resultados representam os valores da média e desvio padrão em cada um dos períodos analisados. (* p< 0,05) indica diferença estatisticamente significante entre os grupos WT e GLY, dentro do mesmo período experimental. As letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante dentro do grupo entre os períodos analisados.
M a t r iz Ó s s e a D e n s id a d e d e á r e a (% ) 0 7 14 21 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 a b c d a b c c D ia s W T G L Y
5- DISCUSSÃO
A maioria dos estudos realizados referente a reparo ósseo foi desenvolvido em modelos de fraturas. Entretanto, não podemos generalizar o conhecimento do processo de consolidação de fraturas para o reparo ósseo devido as suas particularidades, como o tipo de fratura e a presença ou não de imobilização. Além disso, a maior parte do processo ocorre por ossificação endocondral através da formação inicial de tecido cartilaginoso que é substituído por tecido ósseo, posteriormente (MILLS; SIMPSON, 2012; MARSELL; EINHORN, 2011) Assim, o processo de reparo ósseo alveolar torna-se um modelo de estudo interessante já que ele é um processo complexo, sequencial e regulado por diferentes tipos de células e tecidos (LIN et al., 2011). Desse modo, é um processo que possibilita uma possível compreensão da interação do sistema imunológico e ósseo através de análises histológicas, como o realizado neste estudo.
Conforme o resultado da análise histológica descritiva, notou-se uma sequência de reparo similar entre camundongos WT e GLY. De forma que ocorreu uma adequada formação de coágulo sanguíneo no período de 0 hora, passando pelo estágio inflamatório ao redor do 7º dia e de intensa atividade de remodelação óssea ao 14º dia até o preenchimento dos alvéolos dentais com tecido ósseo maduro permeado por tecido medular aos 21 dias. Tais resultados são compatíveis com a cronologia de reparo ósseo alveolar em camundongos WT, já descrita em trabalhos anteriores (VIEIRA et al., 2015; REPEKE et al., 2010).
Além disso, estudos demonstram que alguns eventos da seqüência do reparo através da histologia estão bem descritos. Imediatamente a extração do incisivo, o alvéolo é preenchido por coágulo sanguíneo, com plaquetas ativas que contribuem para a liberação de fatores de crescimentos como IGF, TGF-β, FGF, VEGF e células inflamatórias, e inicia-se a formação de uma rede de fibrina. Em seguida, ocorre gradativamente a invasão de fibroblastos que se originam da diferenciação de células mesenquimais e de fibroblastos derivados do ligamento periodontal. Comitantemente ocorre a proliferação de vasos sanguíneos que tem origem de células endoteliais e a formação de tecido de granulação devido a presença numerosa de fibroblastos e fibras. Depois se inicia a formação de matriz orgânica por osteoblastos, seguido por mineralização da matriz e formação de trabéculas ósseas que correspondente de diferenciação e mineralização óssea, e consequentemente a diminuição de células e vasos (LIN et al., 2011; RODRIGUES et al., 2011).
Desta forma, nossa primeira observação concreta foi que a inibição de HMGB1 não foi capaz de impossibilitar a completa regeneração óssea alveolar pós-extração do incisivo em camundongos. Assim, apesar das particularidades que os camundongos GLY desenvolveram no processo de reparo ósseo, ao final dos 21 dias pós-extração o alvéolo se encontrava totalmente reparado. Adicionalmente, a inibição não alterou a ordem cronológica dos eventos, fato este que pode minimizar a importância de tal alvo a primeira vista, porém é essencial do ponto de vista farmacológico, uma vez que o objetivo em longo prazo de estudos de reparo ósseo é facilitar e agilizar o processo e não pará-lo por completo ou atrapalhá-lo.
Porém, apesar da sequência de eventos no reparo ósseo alveolar demonstrarem ser semelhante entre os grupos, a inibição de HMGB1 foi capaz de interferir na quantidade de alguns parâmetros analisados da resposta em determinados períodos de tempo. Em relação aos camundongos GLY, que corresponde a camundongos com a inibição da proteína HMGB1, observamos uma maior densidade de fibroblastos quando comparado aos camundongos WT. Apesar disto, interessantemente este fato não reflete na densidade de fibras colágenas, sugerindo desta forma que por meio de algum mecanismo os fibroblastos altamente presentes nos camundongos GLY não estão produzindo fibras colágenas na mesma intensidade que os fibroblastos dos camundongos WT, ou que a inibição da proteína HMGB1 esteja interferindo na degradação do colágeno ou na produção do mesmo.
Sabe-se que a ativação dos receptores TLRs gera uma cascata de sinalização intracelular essencial para a ativação do fator de transcrição nuclear NFkB, este por sua vez é um dos responsáveis pela transcrição e posterior produção das enzimas MMPs, cujo papel é de degradação do colágeno, gerando desta forma um quadro paradoxal (ALMALKI; AGRAWAL, 2016; ACCORSI-MENDONÇA et al., 2008). Apesar da ligação de HMGB1 gerar estímulos intracelulares para transcrição de MMPs, este mecanismo não é essencial, existindo outras vias e outros estímulos que por fim transcrevem o mRNA de uma das enzimas da família MMP. Assim, com a inibição da HMGB1, outro mecanismo compensatório pode desempenhar o papel de produção de MMP, de uma forma até mesmo mais intensa.
Resultado interessante também foi encontrado na densidade de coágulo e células inflamatórias entre camundongos WT e GLY. Fisiologicamente, no primeiro estágio do processo de reparo, imediatamente após a exodontia, ocorre a formação e subsequente maturação do coágulo sanguíneo. Tal processo inicia uma série de eventos celulares e moleculares que resultam gradualmente no estabelecimento do tecido de granulação e do
