UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO: BIOMEDICINA – HABILITAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS
INGRID CAMELO DA SILVA
AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE RESISTÊNCIA A POLIMIXINA B
EM ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES
NO BRASIL
Niterói 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO: BIOMEDICINA – HABILITAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS
INGRID CAMELO DA SILVA
AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE RESISTÊNCIA A POLIMIXINA B EM ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES NO BRASIL
ORIENTADORA: Dra. ANA PAULA D’ALINCOURT CARVALHO ASSEF
CO-ORIENTADOR: Msc. CAIO AUGUSTO MARTINS AIRES
Niterói
2016
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal
Fluminense como requisito para obtenção do Grau de Bacharel. Área de concentração: Análises Clínicas
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO : BIOMEDICINA – HABILITAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS
INGRID CAMELO DA SILVA
AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE RESISTÊNCIA A POLIMIXINA B EM ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES NO BRASIL
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Ana Paula D’Alincourt Carvalho Assef - Orientadora FIOCRUZ
Profa. Dra. Julia Peixoto de Albuquerque UFF
Profa. Dra. Renata Fernandes Rabello UFF
Niterói 2016
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação em Biomedicina da
Universidade Federal
Fluminense como requisito para obtenção do Grau de Bacharel. Área de concentração: Análises Clínicas
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AmpC Tipo de β-lactamase
ATM Aztreonam
BrCast Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
CAZ Ceftazidima
CCBH Coleção de Culturas de Bactérias de Origem Hospitalar
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIP Ciprofloxacina
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CTX Cefotaxima
DNA ÁcidoDesoxirribonucléico
EMB Eosin Methyleneblue Agar
ES Espirito Santo
ETP Ertapenem
FEP Cefepime
FOT Fosfomicina
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
GES do inglês Guiana extended spectrum β-lactamase
GEN Gentamicina
GO Goiás
IPM Imipenem
IOC Instituto Oswaldo Cruz
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
ITU Infecção do trato urinário
KPC-KP Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-K. pneumoniae
LACEN Laboratório Central de Saúde Pública
LAPIH Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar
LPS Lipopolissacarídeo
MEM Meropenem
MBL Metallo-β-lactamase
MDR do inglês Multidrug Resistance
NDM New Delhi Metallo-β-lactamase
OMS Organização Mundial da Saúde
OXA Oxacilinase
PBP Proteínas ligadoras de penicilina
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDR do inglês Pandrug-resistance
PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado
RJ Rio de Janeiro
RS Rio Grande do Sul
RNA Ácido ribonucléico
SIM Sulfito Indol e Motilidade
SXT Sulfametoxazol/Trimetropim
TSI Tripe Sugar Iron
UTI Unidade de Terapia Intensiva
RESUMO
A emergência de espécies da família Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemases tem se tornado um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, pois são resistentes a todos os β-lactâmicos e geralmente apresentam resistência a outras classes de antimicrobianos. Desta forma, as polimixinas são umas das últimas opções de tratamento. Como consequência ao aumento da utilização de polimixinas, tem sido observado um aumento da resistência a estas drogas. Apesar de não estar completamente elucidado, o conhecimento dos mecanismos de resistência às polimixinas é essencial para a manutenção de sua viabilidade. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a frequência de resistência à polimixina B em 101 isolados clínicos de enterobactérias produtoras de carbapenemases, além de analisar o perfil de susceptibilidade a outras classes de antimicrobianos, determinar a concentração inibitória mínima para a polimixina B e analisar a diversidade genética dentre os isolados resistentes a esse antimicrobiano. A seleção de 101 isolados foi formada pelas espécies Klebsiella pneumoniae (n=83), Enterobacter aerogenes (n=6) e Enterobacter
cloacae (n=12) produtores das carbapenemases do tipo KPC (53,4%), NDM (24,6%) e
OXA-48 (22%) obtidas de amostras clínicas e de vigilância de pacientes atendidos em hospitais de quatro estados brasileiros (RJ, RS, GO, ES). Os isolados foram recuperados a partir de sangue (36%), urina (37%), swabs de vigilância (9%), ponta de cateter (7%), secreções respiratórias (5%), secreções diversas (4%) e líquor (2%). Foram observadas altas taxas de resistência para os β-lactâmicos testados (>75%) pelo método de disco-difusão. O antimicrobiano com menor taxa de resistência foi a fosfomicina (5,9%). Uma amostra apresentou resistência a todas as classes de antimicrobianos testados. Quatorze (13,8%) demonstraram resistência à polimixina B pelo médodo de Etest, entretanto observamos a confirmação dessa resistência pelo método de microdiluição em caldo em apenas 11 (10,8%). As espécies encontradas resistentes a polimixina B foram K. pneumoniae (n=10) e E. aerogenes (n=1), as quais 45,4% possuíam o gene KPC, 45,4% o gene OXA-48 e 9,2% o gene NDM. PCR para a detecção do gene mgrB (associado à resistência às polimixinas) revelou presença do gene aparentemente íntegro em 7 isolados, presença do gene possivelmente alterado em 2 isolados e ausência de amplificação em 2 isolados. A PCR do gene mcr-1 demonstrou que nenhum dos isolados é portador desse gene. A análise do polimorfismo genético demonstrou a presença de clones distintos de acordo com a carbapenemase encontrada. Esse estudo alerta para a presente resistência à polimixina B no Brasil, além de destacar a necessidade de adoção de medidas de contenção e
monitoramento destes isolados resistentes à polimixina B, no intuito de evitar a sua
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...1
1.1 Família Enterobacteriaceae e Importância Clínica...1
1.1.1 Klebsiella pneumoniae: Características Gerais...2
1.1.2 Enterobacter spp: Características Gerais...3
1.2 Tratamento de infecções causadas por Enterobacteriaceae...4
1.3 Antimicrobianos β-lactâmicos...5
1.4 Resistência aos Carbapenêmicos...7
1.4.1. Carbapenemases...8
1.5 Antimicrobianos da Classe das Polimixinas...14
1.6 Resistência às Polimixinas...16
1.7 Epidemiologia da Resistência às Polimixinas...20
2 OBJETIVOS...22
2.1 Objetivos Gerais...22
2.2. Objetivos Específicos...22
3 MATERIAIS E MÉTODOS...23
3.1 Amostras Bacterianas...23
3.2 Teste de susceptibilidade a antimicrobianos...24
3.2.1 Teste de difusão em ágar...24
3.2.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de polimixina B...24
3.3 Confirmação da presença dos genes de carbapenemases, mgrB e mcr-1 por técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...25
3.3.1 Extração do DNA bacteriano...26
3.3.2 Reação de amplificação dos genes de resistência...26
3.3.3 Eletroforese em gel de agarose...27
3.4 Determinação do Polimorfimo Genético...28
3.4.1 Extração do DNA bacteriano...28
3.4.2 Digestão com enzima de restrição e corrida eletroforética...29
3.4.3 Critério para avaliação dos perfis...29
4 RESULTADOS...30
4.1 Seleção dos Isolados Bacterianos...30
4.3 Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos...32
4.3.1 Teste de difusão em ágar...32
4.3.2 Teste de sensibilidade a Polimixina B...32
4.4 Detecção do gene mgrB...34
4.5 Pesquisa do gene mcr-1...35
4.6 Avaliação do polimorfismo genético dos isolados resistentes à polimixina B...36
5 DISCUSSÃO...37
6 CONCLUSÃO...42
1 INTRODUÇÃO
1.1 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE E IMPORTÂNCIA CLÍNICA
A família Enterobacteriaceae é composta por um grupo grande e heterogêneo de bacilos Gram-negativos de importância médica e científica que se caracterizam por serem anaeróbios facultativos, fermentadores, reduzirem o nitrato a nitrito, não apresentarem citocromo oxidase e crescerem rapidamente numa variedade de meios de cultura seletivos ou não. São bactérias imóveis ou, quando móveis, dotadas de flagelos peritríquios (FARMER, 2003; WINN et al. 2006). Esses micro-organismos estão amplamente distribuídos na natureza e são encontrados em solo, água, vegetais e, como indica o nome da família, no trato intestinal de seres humanos e animais vertebrados (WINN et al., 2008). Essas bactérias representam cerca de 80% dos isolados significantes de bactérias Gram-negativas em laboratórios clínicos (EISENSTEIN, ZALEZNIK, 2000).
De acordo com a clínica, as enterobactérias podem ser divididas em patógenos intestinais primários e patógenos oportunistas, sendo consideradas os principais agentes de infecções comunitárias do sistema urinário. Estão entre os mais importantes agentes causadores de infecções relacionadas à assistência à saúde, incluindo pneumonias, infecções do trato urinário, infecções da corrente sanguínea e infecção de sítio cirúrgico (RONALD et al. 2001).
As infecções primárias são infecções iniciais em uma pessoa anteriormente sadia, as quais comportam-se como infecções agudas (BLACK, 2002). Já as infecções oportunistas são aquelas causadas por micro-organismos que constituem a microbiota, que usualmente não causam doença, mas podem causá-las em determinadas condições, sendo caracterizados como organismos oportunistas. As condições que criam oportunidades para esses micro-organismos causarem enfermidades são: deficiência das defesas normais do hospedeiro, introdução de microrganismos em sítios onde causam infecção, distúrbios da microbiota normal (BLACK, 2002). Vários membros da família Enterobacteriaceae podem causas infeções oportunistas, incluindo septicemia, pneumonia, meningite e infecções do trato genito-urinário. Como exemplos de gêneros que podem causar essas infecções, temos:
Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Morganella, Providencia, Serratia, entre
outros. Em situação normal, os organismos da microbiota intestinal não invadem outras partes do organismo, mas podem acontecer infecções oportunistas se o hospedeiro apresentar uma
redução temporária de suas defesas imunológicas (ARAUJO, NASCIMENTO, 2013).
Desde meados da década de 1990, o termo “infecções hospitalares” foi substituído por “infecções relacionadas à assistência em saúde” (IRAS), sendo essa designação uma ampliação conceitual que incorpora infecções adquiridas e relacionadas à assistência em qualquer ambiente (HORAN, ANDRUS, DUDEK, 2008). As enterobactérias possuem uma grande importância clínica por estarem frequentemente associados a IRAS (ANVISA, 2014), que abrangem infecções adquiridas no hospital, ambulatório, cuidados domiciliares e também infecções ocupacionais. As IRAS apresentam impacto sobre letalidade hospitalar, duração da internação e custos. O aumento das condições que induzem à internação de indivíduos cada vez mais graves e imunocomprometidos, somado ao surgimento da resistência aos antimicrobianos utilizados nos tratamentos, confere às IRAS especial relevância para a saúde pública (PADOVEZE, FORTALEZA, 2014).
Em ambientes hospitalares, as infecções bacterianas vêm sendo a principal causa de mortalidade em pacientes internados, particularmente para aqueles provenientes de unidades de terapia intensiva (UTI) (MENDES, TURNER, 2001). Estima-se que, nessas unidades, o risco de um paciente internado contrair uma infecção seja de cinco a dez vezes maiores do que para aqueles nas enfermarias em geral. Primeiramente, os pacientes confinados em UTI apresentam-se acometidos por uma diversidade de doenças graves, o que leva a um comprometimento de suas defesas imunológicas e são frequentemente submetidos a procedimentos invasivos de diferentes naturezas, como implantação de cateteres venosos e tubo endotraqueal, assim como a período de internação prolongado, o que aumenta a probabilidade de serem colonizados por bactérias provenientes do ambiente hospitalar (WUNDER et al, 2004).
As principais espécies de enterobactérias envolvidas em infecções hospitalares são
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca), Escherichia coli, Enterobacter spp., Proteus spp. e Serratia
spp. (SIRVERT DM et. al, 2013).
1.1.1 Klebsiella pneumoniae: Características Gerais
A espécie Klebsiella pneumoniae foi o patógeno classicamente descrito por Friedländer em 1882 isolada de pulmões de pacientes que morreram após pneumonia. Essa bactéria encapsulada foi inicialmente chamada de bacilo de Friedländer, mas em 1886 foi renomeada para Klebsiella. Posteriormente, foi descrita como um microrganismo saprófito, que não apenas colonizava o trato gastrointestinal humano, pele e nasofaringe, mas também
causava infecções urinárias e do trato biliar, osteomielite, entre outros. Como agente de infecções comunitárias, K. pneumoniae é um patógeno com potencial de ocasionar infecções do trato urinário (ITUs), pneumonia, bacteremia e infecções supurativas focais, incluindo abscesso hepático e suas graves complicações, como meningite e endoftalmite (YEH et al. 2007; YU et al, 2007; VUOTTO et al, 2014).
K. pneumoniae é a espécie mais relevante clinicamente do gênero Klebsiella e é
responsável por 70% das infecções humanas causadas por este gênero (HANSEN, GOTTSCHAU, KOLMOS, 1998). Nos humanos, acomete, principalmente, pacientes imunocomprometidos que fazem uso de ventilação mecânica, cateteres e os que recebem tratamento prolongado com antibióticos. A sua transmissão ocorre através do contato pessoa-pessoa ou pela contaminação do meio ambiente, apesar de ser menos frequente (CDC, 2016).
Essa espécie é considerada um dos cinco microrganismos mais associados à pneumonia e infecções de corrente sanguínea (GALES et al, 2012), além de ser frequente em infecções do trato respiratório inferior e infecções de pele e tecidos (SADER et al, 2004). O isolamento de K. pneumoniae com reduzida sensibilidade à clorexidina, um desinfetante amplamente utilizado em hospitais, tem sido relatado. A resistência à clorexidina contribui para a persistência desta linhagem em ambientes hospitalares, bem como, pode proporcionar uma vantagem seletiva para esta estirpe de K. pneumoniae no ambiente hospitalar (NAPARSTEK et al., 2012).
1.1.2 Enterobacter sp: Características Gerais
O gênero Enterobacter foi denominado de Aerobacter durante muitos anos, devido a sua intensa produção de gás. Em 1960, Hormaechae e Edwards propuseram a nova designação de Enterobacter para esse gênero, que compreenderia as espécies Enterobacter
aerogenes e Enterobacter cloacae (DWORKIN et al., 2006).
As espécies de Enterobacter são encontradas no ambiente, como na água, esgoto, vegetais e no solo. Antes do uso difundido dos antibióticos, estas espécies eram pouco isoladas em infecções, no entanto, são cada vez mais encontradas causando infecções hospitalares, como ITU e bacteremia. Além disto, são ocasionalmente encontradas causando infecções adquiridas na comunidade (SANDERS & SANDERS, 1997; DWORKIN et al., 2006; MEZZATESTA et al., 2012).
clínico como bactérias oportunistas e têm emergido como patógenos hospitalares de pacientes de terapia intensiva, especialmente os que utilizam ventilação mecânica (MEZZATESTA et al 2012). A prevalência de infecções por Enterobacter sp. em enfermarias clínicas cresceu devido a introdução de cefalosporinas de espectro estendido e carbapenêmicos na antibioticoterapia. A consequência dessa antibioticoterapia é a emergência de isolados de E.
aerogenes resistentes a última linha de antibióticos utilizados no ambiente hospitalar
(DAVIN-REGLI, PAGÈS, 2015).
E. cloacae é ubiquitário de ambiente terrestre e aquático. Essa espécie está presente na
microflora no trato intestinal de humanos e outros animais e pode ser patogênico para plantas e insetos (MEZZATESTA et al, 2012). É também conhecido como patógeno hospitalar contribuindo para bacteremia, endocardite, artrite séptica, osteomielite, infecções em pele e tecidos, infecções respiratórias e urinárias (FATA et al, 1996). E. cloacae frequentemente contamina dispositivos médicos hospitalares, como os intravenosos (DUGLEUX et al, 1991). Surtos hospitalares também podem estar associados com a colonização de certos equipamentos cirúrgicos e soluções de limpeza operatórias (WANG et al, 2000). Sua habilidade de formar biofilmes e secretar várias citotoxinas (enterotoxinas, hemolisinas) é importante para sua patogenicidade (FERNANDEZ-BACA et al., 2001; MEZZATESTA et al., 2012; PESTOURIE et al., 2014). E. cloacae tornou-se a terceira espécie da família
Enterobacteriaceae mais frequentemente envolvida em infecções nosocomiais após E. coli e K. pneumoniae (DAVIN-REGLI, PAGÈS, 2015).
Assim como a Klebsiella spp, Enterobacter spp está entre os cinco microrganismos que mais frequentemente causam pneumonia (GALES A, et al 2012)
1.2 TRATAMENTO DE INFECÇÕES CAUSADAS POR ENTEROBACTERIACEAE
Desde meados da década de 1940, muitos antibióticos com ação em diferentes alvos celulares foram descobertos e introduzidos na prática clínica para controle de infecções bacterianas (WALSH, 2003; NOSKIN, 2005; GUPTA et al., 2009). Antibióticos são caracterizados em virtude de seu mecanismo de ação, dentre os quais se citam (1) a interferência na síntese de parede celular, (2) a inibição da síntese de proteína, (3) a interferência na síntese de ácido nucleico, (4) a inibição de vias metabólicas (TENOVER, 2006) e (5) alteração da membrana plasmática (ROLAIN, MORAND, OLAITAN, 2014).
A gama de diferentes micro-organismos contra os quais um agente antimicrobiano atua é chamada de espectro de atividade. Os agentes que são eficazes contra um grande
número de micro-organismos de uma ampla extensão de grupos taxonômicos, incluindo tanto bactérias Gram-positivas como Gram-negativas, são considerados possuidores de um amplo espectro de atividade. Os que são eficientes apenas contra um pequeno número de micro-organismos ou um único grupo taxonômico possuem um estreito espectro de atividade (BLACK, 2002).
Com relação às classes de antimicrobianos que possuem eficácia sobre as bactérias Gram-negativas estão: β-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos, fenicóis, quinolonas e polipeptídeos (polimixinas). Esses antimicrobianos possuem diferentes mecanismos de ação, como inibição da síntese de parede celular, inibidores de sínteses de proteínas e atuação na membrana plasmática (SANTOS, 2014). Dentre os principais antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções causadas por enterobactérias estão os β-lactâmicos (NICOLAU, 2008).
1.3 ANTIMICROBIANOS β-LACTÂMICOS
O primeiro antibiótico β-lactâmico foi acidentalmente descoberto por Alexander Fleming, em 1928, como uma substância secretada pelo fungo Penicillium notatum, sendo então nomeada penicilina (FLEMING, 1929). Desde a descoberta da penicilina, vários outros β-lactâmicos foram descritos e são atualmente divididos em quatro principais grupos em função da sua estrutura química apresentada: penicilinas, cefalosporinas, monobactans e carbapenens (Figura 1) (ESSACK, 2001).
Figura 1: Estrutura dos principais grupos de β-lactâmicos. Retirado da dissertação de JUNIOR, 2014.
Estes antimicrobianos são os mais utilizados no mundo para o tratamento de infecções bacterianas. O modo de ação dos β-lactâmicos está intimamente ligado à estrutura e a biossíntese da parede celular bacteriana. A parede celular bacteriana é composta por unidades alternadas de ácido N-acetilmurâmico (NAM) e N-acetilglicosamina (NAG), cuja ligação covalente é catalisada por transglicosidases. A ligação entre as cadeias com repetições de NAM e NAG é feita entre os terminais pentapeptídicos das moléculas de NAM. Cada NAM possui um terminal pentapeptídico com dois resíduos de D-alanina na sua extremidade. A ligação covalente entre esses dois resíduos – transpeptidação – é catalisada por enzimas chamadas transpeptidases (PBPs, do inglês penicillin-binding proteins), também chamadas de proteínas ligadores de penicilina. Essas ligações, que se repetem ao longo de toda a parede celular, são essenciais para conferir rigidez e estabilidade. O anel β-lactâmico tem sua estrutura semelhante ao terminal D-alanina-D-alanina do NAM, o que permite a sua ligação
às PBPs, que por sua vez sofrem uma reação de acilação durante essa interação, o que as torna incapazes de catalisar outras reações de transpeptidação. A parada da síntese de parede celular causada pelo β-lactâmico resulta na desestruturação da parede e predispõe a célula à lise osmótica (DRAWZ, BONOMO, 2010).
Há evidências de que as enzimas que inativam os antibióticos β-lactâmicos, conhecidas como β-lactamases, eram produzidas pelas bactérias muito antes da introdução e aperfeiçoamento destes antibióticos no uso clínico (CONCEIÇÃO et al, 2004). Os fenômenos de resistência bacteriana a antibióticos β-lactâmicos são conhecidos desde a descoberta do primeiro antibiótico da classe, a penicilina. A primeira β-lactamase a ser descrita foi identificada em uma cepa de E.coli em 1940 (ABRAHAM e CHAIN, 1940).
A partir do final da década de 1980, os antibióticos β-lactâmicos da classe dos carbapenêmicos, como imipenem (1987), meropenem (1996) e ertapenem (2001), foram instituídos como alternativas terapêuticas de última escolha para tratamento de infecções graves provocadas, principalmente, por bactérias Gram-negativas multirresistentes (SHAH, 2008). Carbapenêmicos possuem um espectro de ação ampliado, demonstrando atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo espécies bacterianas anaeróbias (ZHANEL et al, 2007).
1.4 RESISTÊNCIA AOS CARBAPENÊMICOS
No curso da evolução, bactérias desenvolveram várias estratégias para evitar a ação de antibióticos que conduziram eventualmente à resistência (NORDMANN; DORTET et al., 2012). Em enterobactérias, a inativação enzimática dos antimicrobianos é o mecanismo de resistência aos β-lactâmicos mais frequentemente detectado (BUSH; FISHER, 2011). Em alguns países, devido à resistência, os antibióticos carbapenêmicos não funcionariam em mais da metade das pessoas tratadas por infecções causadas por K. pneumoniae (PITOUT, NORDMANN, POIREL, 2015).
Durante a década de 80, com a introdução das cefalosporinas de 3ª geração (oxiamino-cafalosporinas) no mercado, isolados com um espectro de resistência estendido frente aos β-lactâmicos emergiram em virtude da expressão de enzimas do tipo ESBL (do inglês,
Extended-Spectrum β-Lactamases), que hidrolisam todos os β-lactâmicos com exceção dos
carbapenêmicos, ou AmpC (PITOUT et al., 2005; LIVERMORE; WOODFORD, 2006). Isolados de enterobactérias produtoras de ESBL comumente apresentam corresistência a outras classes de antimicrobianos tais como as fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, inibidores
da síntese de folatos, tetraciclinas e cloranfenicol (PITOUT; LAUPLAND, 2008). Em consequência deste ampliado perfil de resistência, o uso de carbapenens, que são β-lactâmicos resistentes à ação de ESBL, aumentou significantemente, promovendo uma nova pressão seletiva e a consequente emergência de isolados resistentes aos carbapenêmicos (DESHPANDE et al., 2006). Devido a sua estabilidade frente às β-lactamases, enzimas frequentemente detectadas em enterobactérias, os carbapenens apresentam alta eficácia no tratamento de infecções causadas por enterobactérias quando comparados a outros β-lactâmicos (NICOLAU, 2008).
A resistência bacteriana aos carbapenêmicos pode ser intrínseca, que é natural e ocorre sem uma exposição prévia ao antimicrobiano, ou adquirida. Nesse último caso, pode ocorrer por meio de mutação espontânea no material genético bacteriano ou por genes adquiridos de outras bactérias. (COOKSEY, 1997; TENOVER, 2006).
Os quatro principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos são: (a) alteração do sítio ativo; (b) diminuição da expressão de porinas; (c) aumento da expressão de bombas de efluxo; (d) produção de β-lactamases – carbapenemases (LIVERMORE & BROWN, 2001).
1.4.1 CARBAPENEMASES
A resistência aos carbapenêmicos é principalmente associada à produção de enzimas carbapenemases em enterobactérias. As carbapenemases são β-lactamases que hidrolisam e inativam os carbapenêmicos, que podem ser classificadas em: metalo-β-lactamases (ex.: IPM,VIM, NDM), oxacicilinases de espectro ampliado (ex.: OXA-48) ou serina-β-lactamases (ex.: KPC, GES) (MONTEIRO et. al, 2009). As carbapenemases representam a família mais versátil de β-lactamases, com uma amplitude de espectro de ação superior ao de outras enzimas que hidrolisam β-lactâmicos (GALLENI et al., 2001; QUEENAN, BUSH, 2007). Em enterobactérias, as primeiras carbapenemases descritas foram SME-1 (do inglês, Serratia
marcescens enzyme), detectada em 1982 em isolados de Serratia marcescens isoladas de
pacientes internados em um hospital no Reino Unido (YANG et al., 1990); e IMI-1 (do inglês,
imipenem-hydrolyzing β-lactamase), detectada em 1984 em uma cepa de E. cloacae
recuperada de infecção de ferida de um paciente internado na Califórnia, USA (RASMUSSEN et al., 1996).
(1995). Bush e Jacoby propuseram uma classificação expandida, que distribuiu as enzimas em grupos (1, 2 e 3) e em subgrupos (representados por vogais), considerando características tanto estruturais quanto funcionais das enzimas. As enzimas com espectro para carbapenens estão nos grupos 2df, 2f, 3a e 3b (JACOBY; MUNOZ-PRICE, 2005; BUSH; JACOBY, 2010; BUSH; FISHER, 2011). A classificação de Ambler é a mais utilizada para as β-lactamases. Ela divide essas enzimas em quatro classes (A, B, C e D) baseadas em sua sequência de aminoácidos (AMBLER, 1980). Ambler originalmente especificou duas classes: classe A, com serina no sítio ativo – serino-β-lactamases; e classe B, as metalo-β-lactamases que requerem um íon bivalente para sua atividade, usualmente Zn2+. Mais tarde, uma nova classe de serino-β-lactamases foi encontrada com sequência pouco semelhante com as já conhecidas enzimas da classe A. Designada classe C (JAURIN, GRUNDSTROM, 1981), seus membros foram de chamados de “AmpC” β-lactamases. Outra classe de serina β-lactamases, familiarmente conhecida como OXA β-lactamases foram encontradas também contendo pouca semelhança com a classe A ou C, sendo designada, então, de classe D (OULLETTE, BISSONNETTE, ROY, 1987) (Figura 2).
Figura 2: Classificação de carbapenemases segundo Ambler. Retirada da dissertação de JUNIOR, 2014.
Dentro das carbapenemases de classe A, a enzima KPC é a que mais de destaca. KPC-1 foi relatada no final dos anos KPC-1990 em um isolado de K. pneumoniae na Carolina do Norte, EUA) durante a execução de um projeto de vigilância epidemiológica (Intensive Care
Antimicrobial Resistance Epidemiology – ICARE, 1996) para monitoramento da resistência a
antibióticos em UTIs. KPC-1 e KPC-2 possuem a mesma sequência de aminoácidos e é a mais frequente carbapenemase identificada em Enterobacteriaceae. Após a descrição de KPC-1 foi descoberto um erro de uma base na região de codificação de KPC-1, que a tornara idêntica a KPC-2 (YGITI, QUEENAN, ANDERSON, 2001).
Isolados de K. pneumoniae produtores de KPC apresentam resistência aos β-lactâmicos cefalosporinas, aztreonam, imipenem e meropenem. Até o momento, 20 variantes da enzima KPC foram descritas, embora KPC-2 e -3 permanecem como as variantes mais frequentemente identificadas (WALTHER-RASMUSSEN J, HOIBY N. 2007; YIGIT et al., 2001; SMITH MOLAND et al., 2003). Esta enzima é mais comumente encontrada em espécies de Klebsiella sp., mas frequentemente é identificada em E. coli e E. cloacae. (HIRSCH AND TAM, 2010; SIDJABAT H, et al., 2011).
No Brasil, K. pneumoniae produtora de KPC foi primariamente detectada em 2006 por Monteiro e cols. (2009) oriundo de amostras de um paciente do estado de Pernambuco. Além da resistência a todos os β-lactâmicos testados, os isolados apresentavam mecanismos de resistência a outras classes de antimicrobianos, como, por exemplo, às fluoroquinolonas, o que restringia as opções terapêuticas à gentamicina, tigeciclina e polimixina (MONTEIRO et al 2009). O crescente número de casos foi subsequentemente reportado em cidades brasileiras geograficamente distantes, o que indicou uma ampla disseminação de K. pneumoniae produtoras de KPC-2 no Brasil (CASTANHEIRA et al., 2012; NICOLETTI et al., 2012).
Bactérias produtoras de MBLs (classe B) são frequentemente resistentes a penicilinas, carbapenêmicos, cefalosporinas e cefamicinas, mas permanecem suscetíveis aos monobactâmicos e têm sua atividade inibida por quelantes de metal, como ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e ácido dipicolínico (PITOUT, NORDMANN, POIREL 2015). Essa classe engloba principalmente as enzimas NDM (do inglês New Delhi
metallo-β-lactamase), VIM (do inglês, Verona integron–encoded metallo-β-lactamase) e IMP, sendo
NDM o grupo mais comumente identificado em todo o mundo. Embora os isolados de IPM sejam identificados principalmente na China, Japão e Austrália, isolados de K. pneumoniae produtores de VIM são encontrados principalmente na Itália e na Grécia (NORDMANN, NAAS, POIREL, 2011).
Dentro desta classe, destaca-se a enzima NDM, que foi identificada em 2008 na Suécia em isolados de K. pneumoniae e E. coli recuperadas de um paciente indiano, que havia sido, previamente, hospitalizado em Nova Deli, Índia (YONG et al., 2009). A dispersão de isolados de enterobactérias produtores de NDM é a mais recente preocupação mundial devido à alta capacidade conjugativa dos plasmídeos que portam genes blaNDM. Além disto, estes
plasmídeos são diversos e frequentemente albergam determinantes genéticos que conferem resistência a outras classes de antibióticos. Devido a esses fatores, os isolados produtores de NDM são o foco de atenção mundial (NORDMANN; NAAS; et al. 2011). A distribuição dos
genes que codificam carbapenemases indica a facilidade com a qual a resistência pode se espalhar. Achados de um estudo feito em Nova Deli mostraram bactérias produtoras de NDM-1 em água potável, sugerindo a possibilidade de aquisição de resistência fora das instalações de cuidados à saúde. No ambiente hospitalar, a disseminação de clones resistentes pode ser rápida e geram consequências severas para os pacientes vulneráveis (WALSH TR et. al, 2011).
Em 2013, ocorreu no Brasil o primeiro relato de uma cepa de Providencia rettgeri produtora de NDM, isolada a partir de um paciente atendido em hospital no Rio Grande do Sul. Informações sobre histórico de viagem para algum país endêmico para NDM não foram relatadas (CARVALHO-ASSEF et al., 2013). Em seguida, foi relatada a detecção de seis isolados do mesmo clone de Enterobacter hormaechei subsp. oharae produtor de NDM reportados no mesmo hospital (CARVALHO-ASSEF et al, 2014). Depois disso, isolados de
Morganella morganii e do complexo Enterobacter cloacae produtores de NDM foram
encontrados em três diferentes hospitais de Porto Alegre (ROZALES et al, 2014). Em 2014, PEREIRA e cols (2014) relataram a presença de K. pneumoniae produtora de NDM-1 no Rio de Janeiro.
Dentro da classe D, algumas OXA β-lactamases têm a capacidade de hidrolisar carbapenêmicos. Em Enterobacteriaceae, OXA-48 e suas enzimas relacionadas são as que requerem atenção. OXA-48 foi encontrada em K. pneumoniae pela primeira vez em 2001 na Turquia. Essa enzima hidrolisa β-lactâmicos de espectro estreito, como penicilinas, hidrolisa fracamente os carbapenêmicos, mas não as cefalosporinas de amplo espectro (POIREL et al, 2004.) Nove outras variantes alélicas foram relatadas em poucos estudos individuais (POIREL, POTRON, NORDMANN, 2012). No Brasil, uma nova variante alélica, denominada OXA-370 foi recentemente observada em Enterobacter hormaechei isolado do Rio Grande do Sul. A OXA-370 difere da OXA-48 pela mudança de três nucleotídeos, resultando na substituição de um aminoácido (SAMPAIO et al, 2014). O gene OXA-48 geralmente se encontra em plasmídeos, e pode se disseminar para outras espécies de enterobactérias, porém a maioria dos relatos ocorre em K. pneumoniae, associados também à produção de ESBL.
Esses isolados se revelam resistentes a todos os β-lactâmicos, inclusive cefalosporinas.
K. pneumoniae produtora de OXA-48 com β-lactamases relacionadas têm sido reportadas na
Turquia, África do Norte, e recentemente na região do Golfo e na Índia (ZOWAWI et al, 2013; POIREL, POTRON, NORDMANN, 2012). Também existem relatos de surtos na Europa. No entanto, sua prevalência não é estimada, principalmente pela dificuldade em se
detectar a produção de OXA-48 em isolados, os quais podem apresentar graus variáveis de resistência aos carbapenêmicos e podem permanecer suscetíveis a cefalosporinas. A ocorrência dessas oxacilinases permanece rara nos Estados Unidos (DOI, PATERSON et al, 2015). No Brasil, a variante alélica OXA-370 foi reportada no Rio de Janeiro em três espécies de enterobactérias: K. pneumoniae, E. aerogenes e E. cloacae. No mesmo estudo foi detectada a disseminação clonal de K. pneumoniae produtora de OXA-370 nesse estado (PEREIRA et al, 2015).
Além disso, as enzimas como as β-lactamases de espectro estendido da classe A de Ambler (ESBLs) ou as cefalosporinases AmpC da classe C de Ambler, além de algumas outras (CTX-M-15, CMY-2) podem contribuir para a redução de suscetibilidade aos carbapenêmicos quando combinados com defeitos na permeabilidade de membrana (NORDMANN, MAMMERI, 2007).
O grau de resistência irá depender da quantidade de enzima produzida, da habilidade dessa enzima em hidrolisar o antimicrobiano em questão (potência) e da velocidade com que o β-lactâmico penetra pela membrana externa da bactéria (permeabilidade da membrana). (CONCEIÇÃO et al, 2004). Estas enzimas hidrolisam o anel β-lactâmico pela quebra da ligação amida, perdendo assim, a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana (WILLIAMS, 1999).
Segundo a ANVISA, dados de infecções primárias de corrente sanguínea confirmadas laboratorialmente, associadas ao uso de cateter venoso central em pacientes adultos internados em unidades de terapia intensiva (UTIs) entre janeiro e dezembro de 2013 demonstraram a presença de 33% de isolados de K. pneumoniae resistentes às cefalosporinas de amplo espectro e carbapenêmicos. Com relação a Enterobacter spp., 17,7% eram resistentes às cefalosporinas de 4ª geração e carbapenêmicos (Rede Nacional de Monitoramento de Resistência Microbiana em Serviços de Saúde, 2014).
Infecções causadas por microrganismos que apresentam multidroga-resistência (MDR) são um problema mundial, considerando a ampla disseminação de clones MDR. Os micro-organismos MDR são definidos como os que são resistentes a pelo menos um agente em três ou mais categorias de antimicrobianos. XDR (do inglês, extensively drug-resistant) é definida como resistente a pelo menos um agente. PDR (do inglês, pandrug-resistant) é definido como não suscetível a todos os agentes em todas as categorias de antimicrobianos (MAGIORAKOS et al, 2012). A recente emergência global de bactérias produtoras de carbapenemases frequentemente resulta em opções terapêuticas muito limitadas. Como consequência, as polimixinas são agora consideradas um dos últimos recursos para tratamento de infecções
causadas por patógenos Gram-negativos MDR (JAYOL et al, 2014). No entanto, o delicado balanço entre a necessidade clínica e a prevenção da resistência é mais comprometido pelo uso na pecuária de antibióticos humanos, onde muitos países têm usado a polimixina em produção animal (DOYLE et al, 2013).
1.5 ANTIMICROBIANOS DA CLASSE DAS POLIMIXINAS
As polimixinas (polimixina B e colistina ou polimixina E) são antimicrobianos bactericidas que agem na maioria das bactérias Gram-negativas, exceto as do gênero Proteus,
Providencia, Morganella, Serratia, Edwardsiella e Burkholderia, que são intrinsecamente
resistentes a estas drogas (BISWAS et. al, 2012).
A polimixina B e a colistina (polimixina E) diferem em sua estrutura apenas pela mudança de um aminoácido na posição 6 (Figura 3), onde na polimixina B encontra-se uma D-Phe (D-fenialanina) enquanto que na colistina encontra-se D-Leu (D-leucina) (Yu et al, 2015). Há vantagens potenciais para o uso de polimixina B ao invés de colistina, muitas dos quais resultam a partir do fato de colistina ser administrada como uma pró-droga inativa. Apenas uma fração da pró-droga é convertida em colistina e esta conversão é lenta, com concentrações máximas em ≥ 7 horas após a administração (GARONZIK SM et al, 2011). Uma vez que esta conversão é lenta e ineficaz em doentes com uma função renal normal, a maioria da pró-droga inativa é limpa antes da conversão para colistina. A polimixina B pode atingir concentrações séricas máximas mais elevadas, que são obtidas muito mais rapidamente do que com colistina (GARONZIK SM et al, 2011; SANDRI AM et al, 2013).
diferença estrutural entre polimixina B e E. Adaptado de YU et al, 2015.
As polimixinas são derivadas do Bacillus polymyxa subespécie colistinus e são ativas somente contra as bactérias Gram-negativas. Estruturalmente são decapeptídeos que se ligam a cadeias de ácidos graxos (FALAGAS, RAFAILIDIS, MATTHAIOU, 2010). Como outros antimicrobianos peptídeos, as polimixinas interagem com o lipídeo A do lipopolissacarídeo (LPS) das membranas externas das bactérias Gram-negativas, essa membrana age como uma barreira de permeabilidade. O LPS é composto por três domínios: mais internamente o lipídeo A, região central de olisossacarídeos e externamente a cadeia de antígeno O. De todos eles, o domínio mais importante é o lipídeo A, que serve como uma âncora hidrofóbica que estabiliza a estrutura da membrana externa. Alguns cátions divalentes como Ca2+ e Mg2+ usualmente servem como ponte entre as moléculas de LPS para a estabilização da monocamada da membrana externa.
O inicial alvo das polimixinas é o LPS da membrana externa e acredita-se que as polimixinas matam as bactérias através da lise de sua membrana, como mostra a figura 4. Primeiramente, a carga positiva das polimixinas provém uma atração eletrostática à carga negativa do lipídeo A, resultando em um deslocamento dos cátions Ca2+ e Mg2+. Em seguida, as polimixinas se inserem dentro da membrana externa. Essa inserção irá enfraquecer os lipídeos A adjacentes, induzindo a expansão dessa membrana. Isso facilita a formação de áreas de desestabilização através da interação das polimixinas com a membrana externa. Finalmente, as polimixinas irão destruir a integridade física e a bicamada fosfolipídica da membrana interna levando a lise dessa membrana e morte celular, como exemplificado na figura 4.
Seu uso foi praticamente abandonado entre 1970 e 1980 devido a sua alta toxicidade, principalmente causando nefrotoxicidade. Entretanto, com o aparecimento de bactérias Gram-negativas MDR, principalmente aquelas produtoras de carbapenemases, e a ausência de novos antimicrobianos para combater esses patógenos, estas têm sido novamente utilizadas, sendo um componente chave nos esquemas para tratamento de infecções graves por bactérias produtoras de carbapenemases (GIRARDELLO, 2012). Esses antimicrobianos são umas das poucas opções que possui atividade contra K. pneumoniae produtora de KPC (KPC-KP, do inglês Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae) (GIANI et al, 2011; BOGDANOVICH et al, 2011; HRABAK et al, 2011).
Como consequência do aumento da utilização de polimixinas, tem sido observado um aumento da resistência a estas drogas, o que gera grande preocupação (GIRARDELLO, 2012). A emergência de KPC-KP resistente a colistina tem sido reportada em algumas áreas e o problema tem atingido proporções notáveis (GIANI et al, 2011; BOGDANOVICH et al, 2011; HRABAK et al, 2011).
1.6 RESISTÊNCIA ÀS POLIMIXINAS
O principal mecanismo que leva a resistência às polimixinas são modificações na membrana externa da bactéria, principalmente pela adição covalente de fosfoetanolamina (pEtN) e 4-deoxyaminoarabinose (Lara4N) ao LPS (JAYOL et al, 2014), que diminui a afinidade das polimixinas pelo seu alvo LPS (HELANDER et al, 1996). Essa modificação é realizada por produtos do operon pmrHFIJKLM, que é conservado nas enterobactérias e é regulado positivamente pelos sistemas de sinalização PhoQ/PhoP e PmrAB (CHENG, CHEN, PENG, 2010), bem como a inativação do gene mgrB (POIREL et al, 2015).
A proteína integral de membrana PhoQ possui um domínio periplasmático envolvido com sinalização. Ela é ativada por baixa concentração extracelular de magnésio (Mg2+), pH ácido (pH 5.5) ou pela presença de antimicrobianos peptídicos catiônicos (CAMPs) (GROISMAN, 2001; KATO, TANABE, UTSUMI, 1999). Após sua ativação, PhoQ ativa PhoP por fosforilação, então PhoP ativa a expressão do operon pmrHFIJKLM, também chamado de pmrF, pbg ou operon arn (MITROPHANOV et al, 2008). Este operon codifica enzimas responsáveis pela síntese e transferência de Lara4N ao lipídeo A, o que confere resistência às polimixinas devido à modificação do LPS alvo (KATO A, TANABE H, UTSUMI R., 1999). Já MgrB é uma pequena proteína transmembrana cuja produção é induzida após a ativação do sistema de sinalização PhoQ/PhoP. Ela exerce uma regulação
negativa nesse mesmo sistema através de interação direta com PhoQ kinase (LIPPA, GOULIAN, 2009) (Figura 5).
Essa função regulatória de MgrB tem sido demonstrada em Escherichia coli,
Salmonella enterica e Yersinia perstis, mas a conservação notável desta proteína entre Enterobacteriaceae sugere que a sua função pode ser conservada também em outras bactérias,
como K. pneumoniae (LIPPA, GOULIAN, 2009).
Figura 5: Sistema de regulação negativa de MgrB no sistema PhoQ/PhoP. A baixa concentração de Mg2+, diminuição do pH ou presença de peptídeos antimicrobianos catiônicos no meio extracelular ativam a proteína de membrana PhoQ. Essa, por sua vez, ativa a proteína PhoP por fosforilação. A transcrição do gene mgrB é induzida após a ativação do sistema PhoQ/PhoP, levando à produção da proteína transmembrana MgrB. A MgrB inibe a ativação da proteína PhoQ, regulando negativamente esse sistema. Adaptado de LIPPA, GOULIAN, 2009.
Já foi demonstrado também o papel da proteína PmrB na resistência a polimixinas (JAYOL et al, 2014). O operon pmrCAB codifica a PmrC fosfoetanolamina fosfotransferase, a PmrA regulatória (também chamada BasR) e PmrB cinase (também chamada BasS) (GUNN JS, 2008). Em E. coli e Salmonella enterica, PmrB age como uma proteína cinase com função de sensor ligada a membrana citoplasmática que é ativada por altas concentrações de ferro (Fe3+) e pH ácido (pH 5.5). Após ativação, ele ativa a PmrA por fosforilação (FALAGAS, RAFAILIDIS, MATTHAIOU 2010). In vivo, PmrAB está envolvido como sensor do
microambiente e é necessário pela sobrevivência dentro dos macrófagos e virulência (GUNN, 2008). Mutações nos genes pmrA ou pmrB usualmente resultam em ativação constitutiva de PmrA, que interfere na regulação de pmrC, que codifica uma aminotransferase envolvida na inclusão de pEtN no LPS, pmrE, que codifica a UDP-glicose desidrogenase, que é a primeira enzima envolvida na via biossintética da Lara4N, e no operon pmrHFIJKLM que codifica enzimas responsáveis pela síntese e transferência de Lara4N ao lipídeo A (GUNN, 2008). Logo, a ativação constitutiva de PmrA leva a modificação do LPS, reduzindo a afinidade às polimixinas (JAYOL et al, 2014) (Figura 6).
Figura 6: Ativação dos genes modificadores do lipopolissacarídeo envolvidos na resistência a polimixina em bactérias Gram-negativas. Retirado de ROLAIN, MORAND, OLAITAN, 2014.
A inativação insercional do gene mgrB foi detectado em 60% de amostras mutantes resistentes a colistina em um estudo, confirmando a função desse mecanismo (embora não o único) de resistência a esse antimicrobiano (CANNATELLI et. al, 2013). Nos mutantes resistentes à colistina carreando a inativação insercional ou deleção do gene mgrB, foi detectada regulação positiva da transcrição de phoP, phoQ, e pmrK (que é parte do operon pmrHFIJKLM). Esses dados demonstram que a inativação de MgrB leva a uma regulação positiva do sistema de sinalização PhoQ/PhoP e do operon pmrHFIJKLM, que era aparentemente responsável pela aquisição de resistência colistina (CANNATELLI et. al, 2013).
o desenvolvimento da resistência à colistina. Mutações foram observadas dentro da sequência do gene mgrB e também na sua região promotora, provavelmente levando a redução da expressão do gene mgrB nesse último caso. No geral, o mgrB faz um papel crucial na contribuição para a susceptibilidade à colistina normalmente observada em K. pneumoniae (POIREL et al, 2015).
A alteração do gene mgrB em K. pneumoniae tem sido identificado como tendo uma função proeminente na resistência à polimixina nessa bactéria. Várias alterações em mgrB têm sido descritas recentemente em diversos casos clínicos e não clínicos de K. pneumoniae e K.
oxytoca resistentes à colistina, incluindo inativação por inserção de elementos como IS5-like
(CANNATELLI et al, 2013; LÓPEZ-CAMACHO et al, 2013; GAIBANI et al, 2014; OLAITAN et al, 2014b; POIREL et al, 2014). Uma pequena deleção ou a eliminação completa do locus mgrB foi reportado em várias estirpes resistentes à colistina (CANNATELLI et al., 2014a; OLAITAN et al., 2014b). Em São Paulo, um isolado de K.
pneumoniae produtor de carbapenemase resistente à polimixina B pelo truncamento no gene mgrB foi reportado (MARTINS et al, 2016).
Além dos mecanismos acima descritos, recentemente foi reportado um gene de origem plasmideal responsável por mediar resistência à colistina, chamado mcr-1. Esse gene é responsável por codificar a proteína MCR-1, que é membro de uma família de enzimas fosfoetanolamina-transferases, onde a sua expressão em E. coli resulta na adição de fosfoetanolamina (PEtN) ao lipídeo A. Esse gene foi encontrado em isolados E. coli e K.
pneumoniae isoladas de carnes de animais, comida e pacientes na China (LIU et al, 2015).
Desde então, a detecção de isolados positivos para mcr-1 foi reportada em enterobactérias em todo mundo, incluindo nas enterobactérias produtoras de ESBL (ZURFUH et al, 2016; MALHOTRA-KUMAR et al, 2016; FALGENHAUER et al, 2016; ZENG et al, 2016). Então, a aquisição do mcr-1 por enterobactérias produtoras de carbapenemases tem o potencial de torná-las verdadeiramente pan-resistentes a drogas, resultando em infecções não tratáveis (LIU et al, 2015).
A descoberta do gene mcr-1 representa um grande desafio no tratamento das infeções causadas por enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, principalmente por já serem reportados em rios, vegetais prontos para o consumo e carnes, constituindo uma possível rota de disseminação de resistência a polimixina (ZURFUH et al, 2016).
Recentemente, mais um mecanismo de resistência foi sugerido por WRITH e cols, 2015 e CHENG e cols, 2016. Segundo os estudos, um sistema regulatório CrrAB (do inglês
A e, consequentemente, à resistência à colistina. O mecanismo ainda não está bem elucidado, porém dados prévios indicam que a proteína CrrB e seu regulador adjacente CrrA compõem o sistema CrrAB, o qual aumenta a expressão de uma proteína chamada CrrC. Esta proteína regula o gene pmrC através do sistema PmrAB, o que culmina na modificação do lipídeo A e na diminuição da susceptibilidade à colistina (WRITH et al, 2015 e CHENG et al, 2016) (Figura 7).
Figura 7: Os sistemas CrrAB, PmrAB e PhoPQ induzem a expressão de pmrC e pmrHFIJKLM, que geram mudanças no LPS. Esses sistemas são regulados por MgrB, CrrC e PmrD. MgrB faz a regulação negativa, enquanto que CrrC e PmrD fazem regulação positiva. Mutações ou interrupções nesses componentes podem levar a uma regulação anormal resultando em um aumento da modificação do LPS associada ao operon pmrHFIJKLM e pmrC. Adaptado de CHENG et al, 2016.
1.7 EPIDEMIOLOGIA DA RESISTÊNCIA ÀS POLIMIXINAS
As taxas de susceptibilidade às polimixinas de Klebsiella spp. e Enterobacter spp. têm decrescido no Brasil nos últimos 20 anos (SADER et al, 2004; GALES, JONES, SADER, 2011; GALES et al, 2012). Muitos isolados de enterobactérias produtoras de carbapenemase ainda permanecem suscetíveis a polimixinas, porém cada vez mais têm sido reportados isolados de K. pneumoniae produtores de KPC resistentes à colistina (LEE et al, 2009; MAMMINA et al, 2012; BODDANOVICH et al, 2011; MEZZATESTA et al, 2011; JAYOLet al, 2014).
estudos já demonstraram sua existência (AL-AGAMY et al, 2013; ARPIN et al, 2012). Esses casos são em sua maioria reportados nos pacientes que já foram expostos a antibioticoterapia com colistina. Portanto, é prudente que se avalie a suscetibilidade do paciente se este já tiver feito tratamento com polimixinas (DOI, PATERSON 2015).
A presença de isolados de K. pneumoniae resistentes à colistina já foram descritos em hospitais na Grécia e Coréia do Sul (ANTONIADOU et al. 2007; SUH et al, 2010). Na Grécia, a resistência a colistina em K. pneumoniae aumentou de 1% para 19% de 2005 a 2008 (NEONAKIS et al, 2010). A emergência da resistência às polimixinas por KPC-KP durante a terapia com esses agentes também foi reportado em hospitais de Nova Iorque, onde o organismo é epidêmico (LEE et al, 2009; ELEMAM, RAHIMIAN, DOYMAZ, 2010).
Na Europa e Canadá, estudos reportam a presença de KPC-KP e Enterobacter sp. resistentes à colistina presentes em amostras de pacientes internados em UTI, enfermaria cirúrgica, pacientes ambulatoriais e departamento de emergência. Foram isolados de materiais clínicos como sangue, urina, material de trato respiratório superior, entre outros (MONACO et al, 2014; REYNOLDS et al, 2013; WALKTY et al, 2009; KÁDÁR, et al. 2015; BOGDANOVICH et al, 2011). Recentemente, também foi reportado pela primeira vez casos de E. cloacae produtor de carbapenemase (IMI-1) e resistente à colistina nos Estados Unidos e na China. (ANDREW et al, 2016; HUANG et al, 2015).
No Brasil, a presença de enterobactérias, incluindo E. aerogenes e K. pneumoniae, produtoras de carbapenemases e resistentes a polimixinas já foi demonstrada (PEREIRA PS et al, 2013; TAVARES CP et al, 2015). Em 2015, foram reportados casos de KPC-KP resistentes a polimixinas em um hospital terciário em Ribeirão Preto, São Paulo. Os pacientes apresentavam sérias complicações de saúde, faziam uso prolongado de antibioticoterapia e uso de cateteres e drenos. Aproximadamente 75% dos pacientes faleceram (GASPAR et al, 2015). Recentemente, em Porto Alegre, foram descritos isolados de enterobactérias resistentes a carbapenêmicos (CRE, do inglês carbapenem-resistant Enterobacteriaceae) resistentes à colistina (PEREZ, PHARMD, DIAS, 2016). No mesmo estado, posteriormente foi relatado a presença de KPC-KP resistente a polimixina B em materiais clínicos como sangue, urina, líquor e aspirado traqueal em pacientes que, em sua maioria, já havia sido exposto a antibioticoterapia com polimixina B (PEREZ, DIAS, 2016). Tuon e cols. 2015 relataram presença de isolados pan-resistentes de K. pneumoniae produtora de KPC resistentes à colistina em infecções de corrente sanguínea em um hospital de Curitiba de isolados entre 2013 e 2014.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS:
Avaliar a taxa de resistência a polimixina B de isolados de Enterobacteriaceae produtores de carbapenemases obtidos de amostras clínicas de hospitais de diferentes estados brasileiros e analisar a diversidade genética dentre os resistentes à polimixina B.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Investigação de produção de carbapenemases nos isolados selecionados;
Avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos nos isolados produtores de carbapenemases;
Avaliar a frequência de resistência à polimixina B nos isolados produtores de carbapenemases;
Determinar a concentração inibitória mínima para polimixina B; Investigar os possíveis mecanismos de resistência às polimixinas;
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 AMOSTRAS BACTERIANAS
Foram selecionadas 101 isolados de K. pneumoniae e Enterobacter spp. produtores de carbapenemases, provenientes de materiais clínicos, encaminhadas ao Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar – IOC – FIOCRUZ no período entre 2009-2014, por hospitais e LACENs dos estados do Rio de Janeiro (RJ), Rio Grande do Sul (RS), Espírito Santo (ES) e Goiás (GO). Estas amostras bacterianas pertencem a Coleção de Culturas de Bactérias de Origem Hospitalar (CCBH) do Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar (LAPIH) e estão estocadas em nitrogênio líquido.
Para avaliar a pureza das amostras, estas foram retiradas do meio BHI com glicerol (-20ºC), semeadas em meio Ágar Eosina-azul de metileno (EMB - Difco) e incubadas a 37ºC por 18 a 24 horas. A identificação das amostras foi feita a partir de testes bioquímicos convencionais, os quais envolvem os meios TSI (Remel, Lenexa, KS), SIM (Difco), meio Citrato de Simmons (Difco), meio de urease e, por fim, detecção das enzimas lisina, arginina e ornitina descarboxilase. Para a espécie K. pneumoniae os resultados na identificação bioquímica esperados são fermentação dos três açúcares no meio TSI, não produção de H2S,
não produção de indol e aspecto imóvel no meio SIM, mudança do meio Citrato Simmons de verde para azul, mudança do meio de Urease de laranja para rosa e detecção da enzima lisina descarboxilase através da mudança do meio de amarelo para lilás. Para Enterobacter
aerogenes e Enterobacter cloacae os resultados esperados são os mesmos, com exceção da
presença das enzimas descarboxilases. São os resultados esperados: fermentação dos três açúcares no meio TSI, não produção de H2S, não produção de indol, aspecto móvel no meio
SIM, mudança do meio de Urease de laranja para rosa. Com relação às enzimas, é esperado a positividade para as enzimas lisina e ornitina descarboxilases. Para Enterobacter cloacae é esperado a positividade para as enzimas arginina e ornitina descarboxilase, podendo variar com arginina descarboxilase negativa.
3.2 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
3.2.1 Teste de difusão em ágar
A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através da técnica de difusão em ágar conforme descrito no CLSI (2015). A partir da cultura em ágar nutriente (Difco) foi retirado do meio o equivalente a 3 a 5 colônias a fim de se obter uma suspensão padronizada em solução salina fisiológica, com turbidez equivalente a 0,5 na escala de McFarland através do aparelho Densichek (Biomérieux). Esta suspensão bacteriana foi semeada de maneira uniforme em toda a superfície do Meio Müeller Hinton Agar (MHA; Difco) utilizando um
swab estéril. Em seguida, foram aplicados os discos de antimicrobianos com uma pinça
esterilizada deixando, entre eles, um espaço de 2,5 cm, no mínimo. Foram utilizados os seguintes antimicrobianos: cefepima (30 µg), ceftadizima (30 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg), ertapenem (10 µg), gentamicina (10 µg), ciprofloxacina (5 µg), fosfomicina (200 µg) e cloranfenicol (30 µg). Após 16h a 18h, o diâmetro dos halos foi medido e interpretado como sensível, intermediário ou resistente de acordo com as recomendações do CLSI, 2015.
3.2.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de polimixina B
A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada através do método de Etest (AB Biodisk) e a metodologia foi a mesma utilizada para o teste de difusão em ágar com posterior adição da fita do Etest com gradiente de concentração da polimixina B. A interpretação dos resultados foi realizada de acordo com as recomendações do BrCast (2016).
Devido à má difusão das moléculas de polimixina em ágar, as taxas de falsos suscetíveis são elevadas (até 32%) (MONACO M. et al, 2014). Para a confirmação do CIM para polimixina B, foi utilizada a metodologia da microdiluição em placas (padrão-ouro).
Para a preparação da microplaca, foram colocados 384μL de uma solução de polimixina B a 1000μg/mL (Sigma-Aldrich) em 2616μL de caldo Müeller Hinton ajustado (20-25mg/L de Ca2+ e 10-12,5mg/L de Mg2+) em um tubo estéril. Em seguida, foram acrescentados 200μL desse caldo contendo polimixina B (128μg/mL) em cada poço da primeira coluna da placa. Foram adicionados 100μL de caldo ajustado sem antibiótico a partir da segunda coluna da placa. Foi feita uma diluição seriada, retirando 100μL de cada poço por
coluna, a partir da primeira coluna, e acrescentando na coluna seguinte, até a penúltima coluna da placa. A taxa de concentração testada foi de 0,125 a 128 μg/mL de polimixina B. Após o preparo da placa foi feita a semeadura dos poços. A partir de cultura recente em ágar nutriente (OXOID), foi retirada uma pequena alçada, equivalente a 3 a 5 colônias para a obtenção de uma suspensão padronizada, em solução de salina fisiológica, com turbidez equivalente à do padrão 0,5 na escala de McFarland. Essa suspensão bacteriana foi diluída em 1:10 e em seguida foram aplicados 5μL da suspensão em cada poço, de forma com que cada linha representasse uma amostra. As placas foram incubadas em uma estufa a 35ºC, por 16 a 18h (Figura 8). Os resultados foram interpretados de acordo com as recomendações do BrCast (2016). A cepa E. coli ATCC 25922 foi utilizada como controle.
Figura 8: Representação da microplaca para a determinação da concentração inibitória mínima de polimixina B pelo método de microdiluição em caldo. Legenda: C- = caldo Müeller Hinton sem polimixina B.
3.3 CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DOS GENES DE CARBAPENEMASES, mgrB E
3.3.1 Extração do DNA bacteriano
Para tal, as amostras bacterianas foram semeadas em ágar nutriente e incubadas por 18 a 24h a 37ºC. Células bacterianas contidas em uma alça foram adicionadas a um microtubo tipo eppendorf contendo 500 μL de água Milli-Q. Após esse processo foram homogeneizadas em vórtex. As células foram lisadas por 2 ciclos de 30 segundos no banho de ultrassom e após centrifugada por 1 minuto a 12000 rpm e mantida em gelo até a utilização. Foram usadas as seguintes amostras como controle positivo: CCBH4640 (K. pneumoniae ST437 – produtora de KPC-2), CCBH20303 (K. pneumoniae produtora de NDM), CCBH14822 (K. pneumoniae produtora de OXA-48), CCBH17440 (K. pneumoniae com mgrB alterado), CCBH23595 (K.
pneumoniae portadora de mcr-1) e a E. coli ATCC 25922 como controle negativo.
3.3.2 Reação de amplificação dos genes de resistência
Foram realizadas reações de PCR para a detecção dos seguintes genes: blaNDM, blaKPC,
blaOXA-48, mcr-1 e mgrB (Tabela 1). Foi realizado PCR Multiplex para a detecção das
carbapenemases. A mistura para a reação de PCR Multiplex foi preparada com volume final de 25µL, onde 7,5µL eram água Milli-Q, 12,5µL eram “JumpStart REDTaq ReadyMix Reaction Mix” (Sigma), 0,5µL de cada iniciador a 20 pmoles/µL e 2µL de DNA bacteriano. Logo após, este material foi levado para o termociclador (BIORAD). O ciclo de amplificação para os genes de carbapenemases foi: desnaturação inicial: 94ºC / 3 min, 35 ciclos: desnaturação (94ºC / 1 min), anelamento (50ºC / 1 min), extensão (72ºC / 1 min) e extensão final (72ºC / 10 min) (MONTEIRO e cols, 2011). Para o gene mgrB foi: desnaturação inicial: 95ºC / 3 min 30 ciclos: desnaturação (95ºC / 30 seg), anelamento (55ºC / 30 seg), extensão (72ºC / 1 min) e extensão final (72ºC /5 min) (in house). E para o gene mcr-1 o ciclo de amplificação foi: desnaturação inicial: 94ºC / 5 min 30 ciclos: desnaturação (94ºC / 45 seg), anelamento (55ºC / 45 seg), extensão (72ºC / 45 seg) extensão final (72ºC /5 min) (in house).
Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados para a detecção dos genes de carbapenemases, mcr-1 e
mgrB.
Gene Sequência (5’-3’) Tamanho do
produto (pb) Referências blaKPC KPC-F CGGTTACGGCCAGTGGGAATA KPC-R GACGCAGACCGAATCGAACT 785 MONTEIRO e cols, 2011 blaNDM NDM-F GGTTTGGCGATCTGGTTTTC NDM-R CGGAATGGCTCATCACGATC 82 MONTEIRO e cols, 2011 bla OXA-48 OXA-48- F GCTTGATCGCCCTCGATT OXA-48-R GATTTGCTCCGTGGCCGAAA 177 MONTEIRO e cols, 2011 mgrB MGRB-R AAGGCGTTCATTCTACCACC MGRB-F TTAAGAAGGCCGTGCTATCC 144 CANNATELLI e cols, 2013 mcr-1 MCR-1-F CGGTCAGTCCGTTTGTTC MCR-1-R CTTGGTCGGTCTGTAGGG 273 LIU e cols, 2015
3.3.3 Eletroforese em gel de agarose
O produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em TBE 0,4X (EDTA 0,5M pH 8,0; Tris 1M pH 8,0; Ácido Bórico 0,035M). A eletroforese foi realizada com tampão de corrida TBE 0,4X sob uma corrente de 100 Volts por 35 minutos. Após a corrida eletroforética, o gel foi corado com Gel Red por 30 minutos. Em seguida, o gel foi submetido à luz ultravioleta, para a visualização dos fragmentos de DNA amplificados, com auxílio do equipamento foto-documentador Lpix Molecular Imaging (Loccus Biotecnologia).
3.4 DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO GENÉTICO
A metodologia de eletroforese em gel de campo pulsado ou PFGE (do inglês, pulsed
field gel eletrophoresis) é a técnica de “DNA fingerprinting” mais utilizada para avaliação da
relação genética de uma variedade de bactérias. Consiste na macrorrestrição do DNA bacteriano através de enzimas de restrição e posterior separação desses fragmentos grandes em um gel de agarose ao aplicar pulsos alternados, de forma que o fragmento consiga se movimentar através da malha de agarose (DWORKIN et al, 2006). A determinação do polimorfismo genético foi realizado nos isolados de K. pneumoniae resistentes a polimixina B.
3.4.1 Extração do DNA bacteriano
Para a extração de DNA total, as amostras foram semeadas em tubo contendo ágar nutriente inclinado e incubadas a 35ºC por 24 horas. Após a incubação, as amostras bacterianas foram suspensas em 1 mL de BSC (EDTA 0,5M pH 8,0, TRIS-HCl 1M pH 8,0) até alcançar a turvação 3 na escala de McFarland. Em seguida, foram colocados 200 µL desta suspensão em um microtubo tipo eppendorf e adicionados 5 µL de proteinase K (Sigma) - 50 mg/µL. Após essa etapa, os microtubos foram homogeneizados por inversão. Foram adicionados à suspensão de células 200 µL de agarose 1% contendo SDS (0,1g de agarose - SeaKem Gold Agarose, 0,5 mL de SDS 1%, 9,4 mL de TE [TRIS-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 MM pH 8,0]). A mistura foi homogeneizada e distribuída em moldes. Após a solidificação dos blocos de agarose contendo DNA bacteriano total, os mesmos foram transferidos para tubos Falcon de 15mL contendo 2 mL de solução de lise (Trisma base 1,0 M pH 8,0/ EDTA 0,5 M pH 8,0/ N-Lauril sarcosil 10% Água ultrapura do tipo 2 [q.s.p.]) e 5 µL de proteinase K (50 mg/ µLSigma) e incubados a 56ºC por 2 horas. Após a incubação, foi retirada a solução de lise, e foram feitas duas lavagens acrescentando 10 mL de água ultrapura esterilizada a 50ºC por 15 minutos e uma lavagem com 10 mL de Tampão TE a 50ºC por 15 minutos. Em seguida, os blocos foram armazenados em 2 mL de TE a 4ºC.
3.4.2 Digestão com enzima de restrição e corrida eletroforética
Foi realizada a digestão com a enzima de restrição XbaI (10U/µL – Promega). Um pedaço correspondente a um terço do bloco de agarose foi transferido para um microtubo tipo eppendorf e tratados por 3 horas a 37ºC, com o mix contendo a enzima de restrição XbaI (5 µL de solução tampão da enzima (10X), 0,5 µL de BSA, 3 µL da enzima e 41,5 µL de água ultrapura).
Os blocos de agarose contendo o DNA digerido foram incorporados em um gel de agarose - SeaKem Gold Agarose a 1%, preparados em TBE 0,4 X . Após a solidificação do gel, este foi submetido à eletroforese de campo pulsado, para separação dos fragmentos de restrição, utilizando o sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad, Richmond, EUA). Foram utilizadas as seguintes condições para a eletroforese: pulso crescente de 0,5 a 35 segundos, por 17 horas, com ângulo de 120º, a 6 V/cm, na temperatura de 13ºC. Foram utilizados padrões de peso molecular “Lambda DNA Leader Pulse” (50-1000 Kb - Sigma) nas corridas.
Após as corridas eletroforéticas, os géis foram corados com Gel RED e fotografados utilizando-se a ferramenta de foto-documentação “L-pix Molecular Imaging” (Loccus Biotecnologia).
3.4.3 Critério para avaliação dos perfis
Para avaliar o polimorfismo genético das amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC, OXA-48 e NDM, foi realizada a análise visual e automatizada dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico obtidos após digestão com a enzima XbaI e separação pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Consideramos pertencentes ao mesmo grupo clonal amostras com mais de 80% de similaridade, com auxílio do software BioNumerics v.4.0 (Applied Maths, Belgium), utilizando coeficiente de Dice e tolerância de 1,5%..
