Análise de vitaminas
Métodos
ensaios biológicos
em animais e humanos
apenas usados quando não existem métodos alternativos
ensaios microbiológicos
com protozoários, bactérias e leveduras requerem passos de extracção da vitamina
resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade
restritos a vitaminas hidrossolúveis lentos
aplicáveis a diversos materiais biológicos, não necessitando de grandes modificações requerem menor preparação de amostra que os
métodos físico-químicos
Análise de vitaminas Métodos
ensaios físico-químicos
métodos espectrofotométricos, fluorimétricos, cromatográficos, enzimáticos, imunológicos e radiométricos
requerem extracção das vitaminas
resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade
simples, precisos e rigorosos sobretudo os que usam HPLC
processos de extracção
procedimentos específicos para cada vitamina usam:
calor, ácidos, bases, solventes, enzimas ácido ascórbico
extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido acético vitaminas B1e B2
aquecimento em ácido, seguido de tratamento enzimático
niacina
aquecimento em base (cereais)
aquecimento em ácido (outros produtos) vitaminas A, E, D
extracção com solvente orgânico, saponificação e nova extracção em solvente orgânico
adição de antioxidantes
Análise de vitaminas
vitamina A
adição de um antioxidante no início do procedimento pirogalol
HPLC é único método capaz de dar resultados rigorosos ex. determinação de vitamina A em leite infantil
trabalhar sempre com luz artificial fraca amostra saponificada
vitamina A extraída com solvente orgânico e concentrada
evaporação sob N2, com adição de hexadecano impedir degradação
HPLC em coluna de sílica
eluentes: heptano e isopropanol isocrático
UV, 340 nm
Análise de vitaminas vitamina A cálculos Métodos químicos T T ST A x W x DF A -retinol(mg/mL) = V trans C C SC A x W x DF A -retinol(mg/mL) = V cis
AT– área do pico de trans-retinol na amostra AST– área do pico de trans-retinol no padrão WT– peso da amostra (mg)
DF – factor de diluição V – volume da amostra (mL)
AC– área do pico de cis-retinol na amostra ASC– área do pico de cis-retinol no padrão WC– peso da amostra (mg)
DF – factor de diluição V – volume da amostra (mL)
Análise de vitaminas
vitamina E
presente nos alimentos como 8 diferente compostos todos 6-hidroxicromanos
, , , tocoferóis
, , , tocotrienóis insaturados
amostra saponificada sob refluxo, extraída com hexano e injectada num HPLC de fase normal
detector de fluorescência
ex= 290 nm; em= 330 nm para margarinas e cremes de barrar
amostra dissolvida em hexano
adiciona-se MgSO4para remover água extracto filtrado e analisado em HPLC amostras de óleo são dissolvidas em hexano e
directamente injectadas em HPLC
vitamina E
Análise de vitaminas vitamina E
saponificação feita na presença de pirogalol (antioxidante) e ao abrigo da luz
quantificação feita por padrão externo
Análise de vitaminas
vitamina C
ácido L-ascórbico + ácido L-dehidroascórbico
oxidação favorecida a pH elevado e na presença de iões Fe3+e Cu2+
análise feita a baixo pH e na presença de agente quelante
Métodos químicos
Análise de vitaminas vitamina C
titulação com 2,6-dicloroindofenol
ácido L-ascórbico oxidado pelo indicador
no ponto final, indicador que não reage é rosado em meio ácido
ácido L-dehidroascórbico determinado após conversão em ácido L-ascórbico
vitamina C
em soluções coradas, ponto final determinado por absorção electrónica a 545 nm
cálculos
DF ácido ascórbico (mg/mL) = C x V x
WT
C – mg ácido ascórbico/mL indicador V – volume de indicador usado na titulação (mL) WT – peso da amostra (g)
DF – factor de diluição
Análise de vitaminas vitamina C
método microfluorométrico
mede ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico ácido ascórbico oxidado a ácido L-dehidroascórbico com
o-fenilenediamina
forma composto fluorescente ex= 356 nm, em= 440 nm cálculos Métodos químicos A - B DF ácido ascórbico (mg/mL) = x S x C - D WT
A e C – fluorescência da amostra e do padrão
B e D – fluorescência dos brancos da amostra e do padrão S – concentração do padrão (mg/mL)
Análise de vitaminas vitamina C
ex: determinação de vitamina C por colorimetria com
redução de iões cúpricos
extracção (amostras húmidas - vegetais): picar amostra e pesar ~50 g
adicionar 2 vezes peso de solução ácido metafosfórico a 5%
homogeneizar em liquidificador
retirar 5 – 20 g do extracto para balão de 100 mL completar volume com H2O
agitar
desprezar ~30 mL e adicionar 2 mL clorofórmio agitar e deixar sedimentar
fase de CHCl3fica no fundo com fenóis, terpenos, vitaminas lipossolúveis, pigmentos e lípidos
Métodos químicos
Análise de vitaminas vitamina C
extracção (amostras secas – leite em pó, sopas em pó, sumos em pó, …):
pesar ~1 - 4 g de amostra finamente moída transferir para tubo de 70 mL com tampa de rosca adicionar 20 mL de H2SO40.1 N e ácido
metafosfórico 5% (1:1) adicionar 2 mL CHCl3 tapar e agitar
deixar separar fases ou centrifugar CHCl3dissolve lípidos
ácido ascórbico fica na fase aquosa
vitamina C
reacção:
medir 5 mL da fase aquosa
adicionar 1 mL de tampão acetato pH 4.6 e 5 mL de um reagente de complexação
95 mL de acetato cúprico 0.075% em álcool isoamílico + 5 mL 2,2-biquinolina 0.4% em tolueno
tapar e agitar
deixar separar fases ou centrifugar
medir 3 mL da fase superior (álcool isoamílico) e adicionar 0.5 mL EtOH
EtOH para clarificar
ler absorvância a 545 nm contra branco construir curva padrão
Análise de vitaminas
vitamina B1(tiamina)
fosfatos de tiamina são extraídos e sofrem hidrólise enzimática
segue-se purificação por cromatografia de permuta iónica tiamina oxidada a tiocromo
determinado por fluorescência ex= 365 nm, em= 435 nm
Análise de vitaminas vitamina B1
tiocromo é fotosensível análise feita sob luz fraca cálculos Métodos químicos b 0 b P S - S C 25 V tiamina (μg/g) = x x x Std - Std A V WT
S e Sb– fluorescência da amostra e do padrão
Std e Stdb– fluorescência dos brancos da amostra e do padrão C – concentração do padrão (g/mL)
A – volume da alíquota (mL) 25 – volume eluído na coluna (mL) Vp– volume que atravessa a coluna (mL) V0– volume de diluição da amostra (mL) WT – peso da amostra (g)
Análise de vitaminas
vitamina B2(riboflavina)
extracção, seguida de purificação determinação por fluorimetria
ex= 440 nm, em= 565 nm riboflavina muito sensível a luz UV
trabalhar sempre com luz pouco intensa riboflavina não dissolve bem em água
cuidado a preparar padrões cálculos
Métodos químicos
A - C CS DF riboflavina (mg/g) = x x
B - A V WT
A e C – fluorescência da amostra contendo respectivamente água e hidrossulfito de sódio
B – fluorescência da amostra contendo padrão CS – concentração do padrão (mg/mL) V – volume da amostra (mL)
