DANIEL VIVIAN
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
LONDRINA – PARANÁ 2006
DANIEL VIVIAN
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação (nível: Mestrado) em Ciência Animal da Universidade Estadual de Londrina para a obtenção de título de Mestre em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo
Alfieri
LONDRINA – PARANÁ 2006
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal pelo Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, sob orientação do Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri.
Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às agências e órgãos de fomento à pesquisa abaixo relacionados:
1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
3. Fundação Araucária (FAP/PR)
4. PROPPG: Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade Estadual de Londrina
Candidato:
DANIEL VIVIAN
Título da dissertação:
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
Londrina, 25 de agosto de 2006.
Comissão Examinadora:
Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri
Prof. Dr.Júlio César de Freitas
Prof. Dr. Luiz César da Silva
Agradeço
Aos meus pais pelo amor, incentivos e compreensão em todos os momentos Ao meu irmão pelo incentivo e pelas “broncas”.
Aos funcionários dos Departamentos de Medicina Veterinária Preventiva e Laboratório de Patologia Clínica, Professora Mara, José, Joãozinho, Elza, Inês.
Aos funcionários do Laboratório de Virologia Animal, Dalíria, Maria, pela paciência e amizade.
A Kerlei, pela amizade, carinho e conselhos desde os tempos de estagiário. Ao coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, orientador
Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri, pela orientação, paciência e principalmente pela compreensão que teve durante a realização do trabalho.
Ao Prof. Dr. Júlio César de Freitas, Profa. Dra. Alice Fernandes Alfieri e Dra. Márcia de Aguiar Ferreira pela participação na banca de qualificação e ao Prof.
Dr. Júlio César de Freitas e Prof. Dr. Luiz César da Silva pela participação na banca de defesa.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal pela transmissão de conhecimento.
A Marlise, “a irmã que não tive”, por tudo que fez por mim, não vou esquecer disso nunca!! Você tem um lugar especial no meu coração!!
Ao Luis Afonso Claus, pela grande ajuda durante o experimento, pela ótima companhia durante as viagens, pelos conselhos, e boas risadas.
A Raquel pela amizade, pelo carinho e companhia.
Aos meus amigos e amigas, de turma do mestrado que estiveram junto comigo em todas as horas.
Aos amigos dos demais laboratórios em especial da virologia que estiveram presentes em algum momento durante a realização do mestrado. A Juliana Arena Galhardo, pela amizade que se tornou cada vez maior. A Betinha, que sempre teve a sabedoria em usar as palavras certas nos
momentos difíceis.
A Flora pelos conselhos e amizade, além das risadas.
A Vanessa, que se tornou uma grande amiga, pela companhia constante durante a fase de redação da dissertação e durante o nosso interminável
treinamento profissional.
Ao Fábio Galli, Luciano Malanski “meus irmãos” que sempre estiveram juntos comigo nas horas tristes e felizes, “gosto muito de vocês”.
Ao monstro do laboratório, pelos erros que ocorreram. A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente.
Todos vocês tem um lugar no meu coração, uns alojados nos átrios e outros nos ventrículos, mas todos no meu coração!!
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
RESUMO
Os papilomavírus (PVs) pertencem a um grupo heterogêneo de vírus DNA epitéliotrópicos, que infectam as células basais induzindo-as à formação de lesões neoplásicas, conhecidas como papilomas ou verrugas, nos epitélios cutâneo e mucoso. A família Papillomaviridae é constituída por 16 gêneros e mais de uma centena de tipos virais. Até o momento foram caracterizados apenas seis tipos de papilomavírus bovino (BPV-1 a BPV-6), que estão incluídos nos gêneros Delta-papillomavirus (BPV-1 e 2),
Episilon-papillomavirus (BPV-5) e Xi-papillomavírus (BPV-3, 4 e 6). Considerando o
tropismo celular e as lesões ocasionadas, os seis tipos de BPV podem ser classificados em dois subgrupos. O subgrupo A (BPV-1, 2 e 5) compreende os fibropapilomavírus e o subgrupo B (BPV-3, 4 e 6) os papilomavírus epiteliotrópicos. A ORF L1 é o gene mais conservado no genoma do papilomavírus e tem sido utilizada para a identificação dos tipos de BPV mais freqüentes em uma região e também de novos tipos virais. Os
primers genéricos FAP59 e FAP64 foram utilizados para a amplificação de um
fragmento com 478 pb do gene L1 do papilomavirus em nove amostras de papilomas cutâneos obtidos de seis animais provenientes de quatro rebanhos bovinos da região norte do Estado do Paraná. Em todas as amostras foi possível a amplificação de um produto de tamanho molecular esperado. Por meio da análise filogenética das seqüências foi possível identificar o BPV-2 em três amostras, o BPV-1 em uma e o BPV-6 em cinco amostras. O BPV-6 foi encontrado, tanto em papilomas cutâneos presentes no teto, quanto em outras partes do corpo. Em um dos animais, onde foram colhidas mais de uma amostra, foi encontrada infecção mista com o BPV-1 e BPV-2. As cinco amostras positivas para o BPV-6 apresentaram 100% de similaridade na matriz de identidade com a amostra padrão, porém foram identificadas divergências entre as amostras do BPV-2 e BPV-1 e aquelas depositadas em bases públicas de dados. As amostras do BPV-2, quando comparadas entre si, mostraram-se diferentes demonstrando o envolvimento de duas variantes virais.
IDENTIFICATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF BOVINE PAPILLOMAVIRUS TYPES 1, 2 AND 6 IN SKIN WARTS IN CATTLE HERDS
OF NORTH OF PARANA STATE ABSTRACT
The papillomavirus (PVs) belong to a heterogeneous group of epitheliotropic double-stranded DNA virus, that infect the basal cells inducing the neoplasic lesions formation, known as papillomas or warts, in the cutaneous and mucous epithelia. The family Papillomaviridae is constituted by 16 genus and more than a hundred of virus types. Until the moment only six types of bovine papilomavírus were characterized (BPV-1, BPV-6), that are included in the genus Delta-papillomavirus (BPV-1 and 2), Episilon-papillomavirus (BPV-5) and Xi-papillomavirus (BPV-3, 4 and 6). Considering the cellular tropism and the caused lesions, the six types of BPV can be classified in two subgrupos. The subgrupo A (BPV-1, 2 and 5) understands the fibropapillomavirus and the subgrupo B (BPV-3, 4 and 6) the epitheliotropic papillomavirus. The ORF L1 gene is the most conserved in the genoma of the papillomavirus and has been used for the identification of the types of most frequent BPV in an region and also of new virus types. The generic primers FAP59 and FAP64 were used for the amplification of a fragment with 478 bp of the L1 gene of papillomavirus in nine cutaneous papilomas samples obtained of six animals from four cattle herds of the north of Paraná State. In all samples was possible the amplification of an expected molecular size product. Through the filogenetic analysis of the sequences was possible to identify BPV-2 in three samples, BPV-1 in one and BPV-6 in five samples. BPV-6 was found, present in cutaneous papillomas on the teat, as in other parts of the body. In one of the animals, were collected more than one sample, was found mixed infection with BPV-1 and BPV-2. The five positive samples for BPV-6 presented 100% of similarity in the identity matrix with the pattern sample, however were identified divergences between the samples of BPV-2 and BPV-1 and those deposited in public data bases. The samples of BPV-2, when compared to each other, showed different demonstrating the involvement of two viral variants.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
BPV Papilomavírus bovino BPV-1 Papilomavírus bovino tipo 1 BPV-2 Papilomavírus bovino tipo 2 BPV-3 Papilomavírus bovino tipo 3 BPV-4 Papilomavírus bovino tipo 4 BPV-5 Papilomavírus bovino tipo 5 BPV-6 Papilomavírus bovino tipo 6 COPV Canine oral papillomavirus DNA Ácido desoxinucléico DEPEC dietilpirocarbonato HPV Papilomavírus humano LCR Long control region
ORF Open reading frame
pb Pares de base
PBS Tampão fosfato salina
PCR Reação em cadeia pela polimerase pmol Pico mol
p/v Peso por volume
q.s.p Quantidade suficiente para SDS Dodecil sulfato de sódio TRIS hidroximetil amino metano
LISTA DE FIGURAS
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
FIGURA 1 Eletroforese em gel de agarose 2% com brometo de etídeo, dos produtos do gene L1 do papilomavírus bovino (BPV) amplificados pela PCR com primers genéricos FAP59 e FAP64, a partir de papilomas cutâneos em bovinos.
FIGURA 2 Árvore filogenética original, construída pelo método de agrupamento de vizinhos (neighbor-joining) com suporte de bootstrap para 1000 réplicas, a partir de um produto do gene L1 de papilomavírus amplificado pela PCR com primers genéricos (FAP59 e FAP64), incluindo nove amostras de papilomavírus bovino (LVA) identificadas no Estado do Paraná e estirpes padrão de papilomavírus bovino (BPV-1 a 6); humano (HPV-16 e 19) e canino (COPV) .
LISTA DE QUADROS
PAPILOMAVÍRUS BOVINO: ASPECTOS MOLECULARES E CLÍNICOS
QUADRO 1 Função das proteínas dos papilomavírus
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
QUADRO 1 Distribuição dos tipos de papilomavírus bovino, identificados pela PCR e seqüenciamento, de acordo com a origem e algumas características das amostras de papiloma cutâneo analisadas.
QUADRO 2 Matriz de identidade entre as seqüências de nucleotídeos de um fragmento do gene L1 do papilomavírus bovino, amplificado pela PCR com primers genéricos (FAP59 e FAP64) a partir de lesões cutâneas em bovinos, e as seqüências dos papilomavírus bovino tipos 1 a 6 disponíveis no GenBank.
QUADRO 3 Matriz de identidade entre as seqüências de nucleotídeos de um fragmento do gene L1 do papilomavírus bovino, amplificado pela PCR com primers genéricos (FAP59 e FAP64) a partir de lesões cutâneas em bovinos.
SUMÁRIO
1. REVISÃO DE LITERATURA
PAPILOMAVÍRUS BOVINO: ASPECTOS MOLECULARES E CLÍNICOS
Introdução ... 1
Características e propriedades gerais... 1
Estrutura e organização genômica... 2
Classificação... 6
Identificação de novos tipos virais... 7
Critérios de classificação... 7
Comparação dos tipos de PV... 8
Enfermidades associadas... 8
Patogenia e replicação... 12
Diagnóstico ... 14
Vacinas... 16
Perspectivas e considerações finais... 16
Referências... 17
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral ... 242.2 Objetivos Específicos ... 24
3. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ Resumo ... 26 Abstract ... 27 Introdução ... 28 Material e Métodos ... 30 Resultados ... 33 Discussão ... 39 Referências... 42
4. CONCLUSÕES...
475. APÊNDICES
Apêndice A – Lista de Reagentes ... 49
Apêndice B – Soluções e Tampões ... 50
Apêndice C – Protocolos de Técnicas ... 53
Apêndice D – Comunicação em Congressos... 56
PAPILOMAVÍRUS BOVINO: ASPECTOS MOLECULARES E CLÍNICOS INTRODUÇÃO
A natureza viral da papilomatose foi deduzida pela transmissão experimental de filtrados estéreis obtidos de verrugas em humanos em 1907. O primeiro papilomavírus (PV) animal foi identificado em 1933 por Richard Shope, que caracterizou a transmissão natural de papilomas cutâneos em coelhos (CRPV – cottontail rabbit papillomavirus) (DAVID et al., 2001).
Embora o papiloma de coelho tenha sido o primeiro a ser estudado mais detalhadamente, incluindo a observação da transformação do papiloma em carcinoma escamoso, todo o processo dessa transformação ainda não está completamente elucidado (DAVID et al., 2001).
Os PVs são vírus oncogênicos epiteliotrópicos que comprometem diversas espécies animais, incluindo seres humanos, e induzem uma grande variedade de lesões hiperplásicas, papilomatosas e verrucosas em células escamosas nos epitélios cutâneo e mucoso (CAMPO, 2002; BLOCH et al., 1997).
A ausência de replicação do PV em culturas celulares, devido às características do próprio agente, impediu por muitos anos a análise detalhada desse vírus. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante e da clonagem gênica, nos anos de 1970, o genoma do PV foi clonado em bactérias. O desenvolvimento de metodologias moleculares proporcionou a retomada dos estudos com o PV e, desde então, avanços consideráveis envolvendo a caracterização molecular e antigênica têm sido conquistados.
CARACTERÍSTICAS E PROPRIEDADES GERAIS
Os PVs são um grupo de pequenos oncovírus, com 52-55 nm de diâmetro, não envelopados, de simetria icosaédrica que replicam no núcleo das células do epitélio escamoso. A partícula viral consiste em uma molécula única de DNA de fita dupla circular com aproximadamente 8000 pb, que é envolta por uma camada protéica que constitui o capsídio viral que é composto por 72 capsômeros pentaméricos. A massa molecular do ácido nucleico é de 5 x 106
daltons e representa 12% do virion. A porcentagem de guanina e citosina para a maioria dos PVs é constituída por 42% (DAVID et al., 2001).
ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
O capsídio é constituído por dois tipos de proteínas estruturais, sendo uma proteína principal de 55 Kda, denominada L1, que é gênero-específico, e uma proteína secundária, com 50 Kda, denominada L2, que é tipo-específica. A presença dessas proteínas está relacionada à presença do virion completo nos tecidos, podendo ser utilizada como parâmetro indireto de infectividade (DAVID et al., 2001; SYRJÄNEN e SYRJÄNEN , 2000).
O genoma viral é composto por dois segmentos denominados precoce (E – early) e tardio (L– late) que codificam proteínas estruturais e com função enzimática, e um segmento LCR (long control region) constituído por elementos reguladores da replicação e transcrição. O segmento E codifica proteínas necessárias para a replicação e transcrição do DNA viral, induzindo a transformação celular, assim como também codifica proteínas virais regulatórias. Este segmento representa 45% do genoma e é expresso tanto em células infectadas não-produtivas quanto em células transformadas. O segmento L é responsável por codificar as proteínas do capsídio viral (L1 e L2) que são expressas somente nas células com infecção produtiva, e representam 40% do genoma. Entre os segmentos E e L localiza-se a LCR, representando 15% do genoma e que não codifica proteína. A LCR contém elementos promotores que são responsáveis pelos fatores celulares assim como fatores regulatórios transcricionais virais (CAMPO, 1997; DAVID et al., 2001).
As funções das proteínas codificadas pelo PV têm sido extensivamente estudadas, principalmente em estirpes virais de papilomavírus humano (HPV) e também de papilomavírus bovino (BPV-1) (CAMPO, 1997). E estão relacionadas no quadro 1.
Quadro 1 – Função das proteínas dos papilomavírus Proteína Função
E1 Permite o desenrolar do genoma viral e age como fator de elongação na replicação do DNA.
E2 Envolvida tanto no controle da transcrição quando na replicação do DNA viral. Responsável pelo reconhecimento e ligação da origem da replicação.
E4 Desestabiliza a cadeia de citoqueratina, permitindo a liberação de partículas semelhantes a vírus. Também está envolvida na transformação da célula hospedeira.
E5 Proteína de transformação que interage com receptores de fatores de crescimento. Obstrui os mecanismos de supressão do crescimento, dominando o controle do ciclo celular.
E6 Proteína de transformação que se liga com a proteína de supressão de tumores p 53 levando à sua degradação. Domina o controle do ciclo celular.
E7 Proteína de transformação celular que se liga à proteína retinoblastoma pRb 105 inibindo a fosforilação. Domina o controle do ciclo celular.
E3 e E8 Não apresentam nível tão elevado de conservação, mas são encontrados no BPV-2. São considerados prováveis genes e suas funções ainda não são conhecidas.
L1 Principal proteína capsídica. Pode formar partículas semelhantes a vírus, é importante na maturação do virion e apresenta os epítopos da neutralização viral.
L2 Proteína secundária do capsídio viral, possível proteína de embalagem do DNA. Também é importante na maturação do vírion. Fonte: Campo et al. (1994); Campo (1997); David et al. (2001)
A forma de apresentação do genoma do PV pode ser distinta, conforme o tipo de lesão associada à infecção. Nas lesões benignas, o genoma do PV está presente em múltiplas cópias e na forma epissomal, ou seja, não integrado ao genoma da célula hospedeira. Nas lesões malignas, o genoma do PV pode
se integrar ao genoma da célula hospedeira formando uma ligação estável e perdendo a capacidade de replicação de maneira autônoma. A integração do HPV no genoma hospedeiro é provavelmente um importante evento na transformação maligna (CULLEN et al., 1991; LUKASZUK et al., 2003). Quando o fenômeno da integração ocorre, o genoma circular do papilomavírus é rompido, geralmente entre os genes E1 e E2. Os genes E6 e E7 e LCR geralmente permanecem íntegros. Com a inativação do gene E2, que codifica uma proteína reguladora que reprime a transcrição excessiva das proteínas E6 e E7, há uma super produção dos produtos desses genes. Os danos observados no gene E2 constituem-se no estágio para a transformação celular (THORLAND et al., 2000; KALANTARI et al., 2001).
O potencial oncogênico do HPV está relacionado aos produtos dos genes E6 e E7 que interagem e inativam as proteínas celulares derivadas dos genes supressores de tumores p53 e retinoblastoma (pRb), respectivamente, além, de promoverem a degradação destes genes, bloqueando a sua função. Acredita-se que os danos na proteína p53 resultem no bloqueio das respostas celulares aos danos sofridos pelo DNA, permitindo assim o acúmulo de alterações genéticas e a formação de um genótipo maligno. A proteína E7 se liga à pRb e evita a sua fosforilação. A ausência da pRb pode causar depressão ainda maior nas defesas celulares contra o desenvolvimento de malignidade. Assim, as proteínas E6 e E7 podem fornecer às células um fenótipo maligno. Portanto, a oncogenicidade vai depender diretamente do grau de afinidade entre as proteínas derivadas dos genes supressores de tumores e as proteínas virais derivadas de E6 e E7 (ZUR HAUSEN, 2000).
O resultado da integração do vírus é a imortalização das células. A morfologia celular demonstra figuras de mitoses anormais, pleomorfismo nuclear, aneuploidia e alteração da arquitetura dos cromossomos. Porém, essas células só passam a ser tumorais quando os genes E6 e E7 transformados são expostos a oncogenes celulares ativados. No entanto, o PV não atua isoladamente na oncogênese, outros fatores devem estar presentes (CAMPO, 1997; DAVID et al., 2001). Esse sistema de integração viral, relacionado à indução da transformação celular, está bem caracterizado para o HPV de alto risco como o HPV-16 e o HPV-18. Para o BPV-2 ainda não
existem estudos que relatem esse fenômeno de integração em amostras clínicas relacionadas a tumores naturais.
A análise genética do BPV-2 e do BPV-1 demonstra alta homologia entre esses vírus. Estudos de base molecular com o BPV-1 identificaram três proteínas de transformação, E5, E6 e E7. A E5 é a principal proteína de transformação do BPV-1, que pode afetar a atividade e o metabolismo de receptores de fatores de crescimento (DAVID et al., 2001; CAMPO, 2002). Ao contrário da proteína E6 do HPV, no BPV-1 a proteína E6 não promove a ligação e a degradação da p53, e ainda não são conhecidas as funções dessa proteína na célula. A proteína E7 do BPV-1 também não realiza as mesmas funções da proteína do HPV, que se liga a pRb. Porém, não foi realizado ainda nenhum estudo funcional da proteína E7 do BPV-1 (DAVID et al., 2001).
Os genes E1 e E2 do BPV-1 estão envolvidos na regulação da transcrição e replicação do vírus. Os genes E6 e E7 apresentam regulação negativa dos genes E1 e E2, e na ausência destes genes reguladores os produtos de E6 e E7 são oncogenes potentes, suficientes para a transformação de algumas culturas de tecidos. Estudos sugerem que o gene E2 é necessário para expressão da oncoproteína E5. A perda da ação do gene E1 pode resultar em maior atividade transformante. A integração do genoma do BPV-1 não é requerida para a iniciação ou manutenção do estado transformado onde a transformação é dependente da expressão contínua do genoma viral (DAVID et al., 2001).
Apesar da grande semelhança genômica entre o BPV-1 e o BPV-2, esses vírus apresentam características clínicas diferentes. O BPV-2 é implicado na etiologia de tumores epiteliais na bexiga de bovinos, associados aos sinais clínicos de hematúria enzoótica. O BPV-1 não foi implicado nessa etiologia, sendo relacionado aos sinais clínicos de papiloma cutâneos em bovinos e do sarcóide eqüino (CHAMBERS et al., 2003).
CLASSIFICAÇÃO
Os PVs pertencem à família Papillomaviridae. Análises filogenéticas consideram, atualmente, 16 gêneros nessa família. Os gêneros onde estão incluídos os BPV são: Delta-papilomavírus (BPV-1 e 2); Epsilon-papilomavírus (BPV-5) e Xi-papilomavírus (BPV-3, 4 e 6) (DE VILLIERS et al., 2004; FAUQUET et al., 2004).
A classificação das espécies de papilomavírus é realizada com base na espécie hospedeira, enquanto que a classificação dos tipos virais, baseia-se na origem e extensão das lesões associadas à infecção. A classificação de novas espécies virais é obtida com base na homologia genômica e comparação da sequência de nucleotídeos de regiões específicas do genoma frente aos tipos virais já conhecidos. Segundo critérios adotados pelo Comitê de Nomenclatura do Papilomavírus, a sequência dos genes E6, E7 e L1 de um novo tipo não pode exceder 90% para as sequências correspondentes em PVs já conhecidos. Uma relação mais próxima considera a existência de subtipos (homologia entre 90 e 98%) e variantes virais (maior que 98%) (DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD , 2005).
Atualmente, 118 tipos de HPV já foram completamente descritos e um número maior de prováveis novos tipos foi relatado por meio de dados preliminares do seqüenciamento de fragmentos subgenômicos (DE VILLIERS et al., 2004; OGAWA et al., 2004).
Em bovinos, de acordo com a estrutura e composição do DNA, em conjunto com características clínicas e anatomopatológicas, são descritos seis tipos virais (BLOCH et al., 1994; CAMPO, 1995, SCHUCH, 1998). Cinco prováveis tipos de papilomavírus foram descritos em bovinos por meio da amplificação parcial do gene L1 pela PCR realizada com primers genéricos (ANTOSSON e HANSSON, 2002). Outros prováveis 11 tipos foram considerados de acordo com os estudos moleculares parciais realizados por Ogawa et al. (2004).
IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS TIPOS VIRAIS
O gene L1 é a porção mais conservada do genoma viral e por essa razão é utilizado para a identificação de novos tipos de PVs. Novos tipos virais são reconhecidos quando o genoma é clonado e a sequência do DNA da ORF do gene L1 diferir em mais de 10% de um PV completamente conhecido. Quando obtem-se diferenças variando entre 2 e 10% de homologia em um fragmento clonado se estabelece os subtipos, e diferenças menores que 2% caracterizam as variantes virais.
Dezenas de prováveis novos tipos de PV, tanto de origem humana quanto animal, foram identificados com a utilização de primers consensos genéricos para a amplificação parcial do gene L1 em reação de PCR (FORSLUND et al., 1999; ANTOSSON e HANSSON, 2002; OGAWA et al., 2004).
Particularmente por problemas técnicos, como a toxicidade dos sistemas, a clonagem completa do genoma do PV tem sido limitada. Isso tem levado ao aumento da utilização da amplificação pela PCR de fragmentos genômicos, que por posterior sobreposição, deduz-se o genoma completo (DE VILLERS et al., 2004).
CRITÉRIOS DE CLASSIFICAÇÃO
Para estabelecer um sistema de diferenciação entre a clonagem por técnicas convencionais daqueles resultados gerados por amplificação pela PCR utiliza-se o termo HPV/BPV candidato, seguido de um número, até o posterior seqüenciamento completo e determinação do tipo, subtipo ou variante.
O estabelecimento de critérios de classificação taxonômica para os PVs tornou-se de fundamental importância, devido ao rápido aumento no número de PV caracterizados parcialmente. Os critérios devem estabelecer uma relação entre os tipos de PV; a condição taxonômica de “espécie” e “gênero” que são
usados para sistemática de todos os organismos biológicos, e freqüentemente aplicado em virologia; e investigação da relação entre a classificação taxonômica e as propriedades biológicas e patológicas do vírus (DE VILLIERS et al., 2004).
COMPARAÇÃO DOS TIPOS DE PV
Estudos comparativos utilizando os genes E6, L1 ou a combinação das ORFs E6-E7-L1 tem estabelecido árvores filogenéticas similares, ou com idêntica relação. Centenas de tipos de PVs tem sido parcialmente identificados sob a forma de pequenos fragmentos de DNA. A partir de um produto com 291 pb, amplificado a partir de um segmento do gene L1, é possível gerar informação suficiente para a realização de estudos de comparação filogenética (BERNARD, 1994). A utilização dessa estratégia e a falta de regulamentação na taxonomia dos PVs animais tem gerado muitas publicações onde, devido à falta de informações complementares, os tipos mais recentemente descritos podem ser os mesmos em diferentes publicações (DE VILLIERS et al., 2004).
ENFERMIDADES ASSOCIADAS
O PV está associado a diversas neoplasias em seres humanos e em diferentes espécies animais. As lesões distribuem-se nos diferentes sistemas incluindo o sistema urogenital, trato respiratório superior e digestivo, bexiga e pele (ANTONSSON e HANSSON, 2002; CAMPO, 2002).
Papilomatose cutânea
Os animais acometidos pela papilomatose cutânea podem gerar perdas econômicas significativas. Em bovinos com aptidão leiteira os prejuízos refletem-se na produção, devido a mastites por ordenha ineficiente, descarte do leite durante o tratamento para mastite e também devido ao comprometimento do estado orgânico do animal (CAMPO, 2002). Em rebanhos de corte, os prejuízos refletem-se principalmente na depreciação do couro e também em
problemas relacionados com a amamentação das crias, levando a desmama de animais com menor peso corporal.
Nos reprodutores, papilomas penianos interferem diretamente na reprodução, tanto em animais de repasse a campo, quanto naqueles em regime de coleta de sêmen. Infecções secundárias, miíases e emagrecimento progressivo podem levar à depreciação e ao descarte precoce de animais de alto valor zootécnico.
Na papilomatose cutânea bovina os BPVs tipos 1, 2, 5 e 6 (CAMPO, 1998) são descritos como os tipos epiteliotrópicos mais comuns. Os BPVs tipos 1 e 2, em infecções heterólogas, também estão associados às lesões características encontradas no sarcóide eqüino (CHAMBERS et al., 2003).
As lesões hiperproliferativas ou papilomas são classificadas segundo a sua localização, aspecto e forma em papilomas chatos ou planos, papilomas plantares (na palma ou sola) ou condiloma acuminatum, pedunculados e filamentosos (SMITH, 2002).
Papiloma do trato digestório superior e da bexiga
A relação entre o BPV e fatores ambientais tem sido fortemente documentada. O BPV-4 está envolvido na etiologia do carcinoma do trato alimentar, enquanto o BPV-2 é encontrado nos casos de papilomatose cutânea e nos tumores de bexiga (CAMPO et al., 1992; SANTOS et al, 1998; BORZACCHIELO et al., 2003). Normalmente os papilomas tendem a regredir espontaneamente em bovinos saudáveis. Porém, em animais imunocomprometidos, há uma alta correlação com a ocorrência de papilomatoses persistentes. Animais com hematúria enzoótica apresentam quadro clínico de hematúria intermitente, anemia, emagrecimento progressivo e lesões hiperplásicas na mucosa vesical, as quais evoluem freqüentemente para neoplasias. O BPV-2 é reconhecido como agente viral iniciador e/ou promotor da carcinogênese dos tumores de bexiga em bovinos, quando associado ao consumo de samambaia (Pteridium aquilinum) (CAMPO, 1997;
O BPV-2 foi detectado em amostras de bexiga de bovinos com e sem lesões neoplásicas, assim como em tecido do trato reprodutivo e em gametas (BORZACCHIELO et al., 2003; CARVALHO et al., 2003).
Embora o BPV-4 seja associado comumente aos tumores do trato digestório superior de bovinos, foi verificada também a presença deste tipo viral, pela técnica de PCR, a partir de lesões cutâneas caracterizando assim uma forma incomum de expressão dos tipos de BPV em diferentes tecidos (BLOCH et al., 1997).
Lesões macroscópicas e microscópicas
Macroscopicamente as lesões na epiderme causadas pela infecção pelo PV apresentam-se sob a forma pedunculada e plana. A forma plana tem a base ampla, coloração clara, apresenta pêlos e compreende grandes áreas do corpo do animal. Na forma pedunculada as massas apresentam aspecto verrucoso, com forma grosseira e áspera parecidas com “couve-flor”. Esses papilomas, que iniciam como pequenas lesões podem comprometer grandes áreas da pele, apresentam coloração variando do cinza ao preto e tamanho e forma irregulares. As lesões podem estar fixas na superfície da pele por meio de uma base larga ou por apenas uma conexão estreita, conferindo o aspecto pedunculado. Inicialmente as lesões são circulares e lisas, tornando-se ásperas e córneas com o aumento da lesão (GUPTA et al., 1989; SMITH et al., 1995).
Microscopicamente, as infecções produtivas causadas pelo PV nas células epiteliais resultam em hiperplasia celular da camada espinhosa (acantose). Essas células mostram aumento de tamanho e no número dos desmossomos e tonofibrilas. Outras células epiteliais podem apresentar alterações degenerativas como a perda das tonofibrilas, separação dos desmossomos, atipia nuclear focal e vacuolização do citoplasma. Nas camadas superiores do epitélio essas mudanças são mais pronunciadas. Na camada granular a degeneração nuclear é evidente, com marginação e condensação da cromatina.
Em contraste com essas alterações celulares estão os fibromas induzidos pelos fibropapilomavirus. Estes fibromas apresentam extensiva proliferação fibroblástica, com as células arranjadas em círculo e com padrões irregulares. Os fibropapilomas exibem uma combinação desses efeitos, sendo
que a primeira reação da pele é a estimulação dos fibroblastos na derme, acompanhada por uma resposta inflamatória com congestão, edema e infiltração leucocitária. Em torno de uma semana após a infecção a reação inflamatória diminui, mas a estimulação fibroblástica continua seguida pela invasão da camada papilar da derme por fibroblastos. O epitélio superior desta área de hiperplasia dérmica prolifera e apresenta acantose e hiperqueratose (LANCASTER e OLSON, 1982; JELÍNEK e TACHEZY, 2005).
Papilomavírus e Câncer
Embora a etiologia viral dos tumores esteja bem estabelecida, os mecanismos moleculares que o vírus expõe sobre a célula transformada não estão bem entendidos, como por exemplo, a ausência do DNA viral em tumor e em células transformadas in vitro. Sugere-se que o vírus seja responsável pelos eventos iniciais da carcinogênese, mas não pela manutenção das transformações fenotípicas, onde a informação genética do vírus não é necessária para a manutenção da malignidade. Também não está claro como fatores carcinogênicos e agentes promotores estão envolvidos em diferentes estágios no desenvolvimento de papilomas e carcinomas (GAUKROGER et al., 1991).
Como a maior parte dos papilomas não progride para o câncer e o desenvolvimento maligno somente ocorre após um longo período de latência, a infecção pelo PV é considerada uma condição necessária, mas não suficiente, para o desenvolvimento de diferentes tipos de tumores epiteliais. O PV dá início às alterações displásicas, mais do que provoca uma tumoração evidente. A progressão para uma doença maligna, quando ocorre, é lenta e, em humanos, pode levar de 2 a 10 anos (SYRJÄNEN e SYRJÄNEN, 2000).
Embora o HPV seja comumente encontrado em lesões de pele em humanos, análises por PCR identificaram a presença do vírus também em pele sadia, demonstrando a capacidade de latência, infecção subclínica ou presença de vírus em uma forma comensal (FORSLUND et al., 1999; ANTONSSON et al., 2000).
O PV é adquirido por inoculação cutânea direta por meio de soluções de continuidade da pele. A replicação viral ocorre nas células basais do epitélio estimulando a divisão celular e ocasionando o crescimento excessivo dessas células. Com isso, são formados os papilomas, ou verrugas, que geralmente regridem sem ocasionar problemas clínicos mais sérios aos seus hospedeiros (CAMPO, 1997; SCHUCH, 1998).
A primeira etapa da infecção viral é a ligação do vírus à célula. O PV, além das células do epitélio escamoso do seu hospedeiro natural, encontra receptores em uma grande variedade de tipos celulares. No entanto, ainda não são conhecidos os fatores que levam à predileção por queratinócitos, que parecem não ser por receptor celular específico. Após a entrada na célula o vírus é transportado em fagossomos e perde o capsídio protéico até a entrada no núcleo, local de replicação viral, onde nenhum vírion completo é observado (DAVID et al., 2001).
O ciclo de replicação do vírus é completado em processos de diferenciação das células epiteliais. O vírus infecta os queratinócitos basais, expressa partes de seus genes nas camadas basais e suprabasais. O genoma é replicado na região de diferenciação da camada espinhosa e granular. A expressão dos genes estruturais ocorre na camada escamosa. A progênie viral é então finalmente liberada com a escamação queratinizada. O genoma viral é incorporado no interior da célula, mantido como um elemento extracromossômico, com replicações sincronizadas com o ciclo celular, ou pode ser perdido até mesmo pelas células transformadas (CAMPO, 1997).
A infecção por um fibropapilomavírus começa pela transformação dos fibroblastos sub-epiteliais, seguida por acantose e a formação de papilomas. A infecção produtiva das células pode ser dividida em dois estágios, sendo um estágio precoce e o outro tardio. Esses estágios são semelhantes aos da diferenciação das células epiteliais e também se relacionam aos genes transcritos do PV. O tropismo específico do vírus por células do epitélio escamoso é evidenciado pela restrição das funções da replicação viral, como na síntese do DNA viral vegetativo, a produção das proteínas do capsídio e a montagem do vírion, que só ocorre nos queratinócitos em processo terminal de diferenciação. Visto que as células basais são as únicas células do epitélio escamoso capazes de se dividirem, o vírus precisa infectar esse tipo célular
para induzir uma lesão que pode ser persistente. A transcrição dos genes da região precoce tem sido detectada nas células basais da epiderme, enquanto que a expressão dos genes tardios pode ser detectada apenas nas camadas mais superficiais. Após a maturação viral, os vírions são liberados pela descamação dos tecidos superficiais por meio da ruptura da célula (HOPKINS, 1986; CAMPO et al.,1994).
O processo de replicação da forma produtiva do PV apresenta grande interesse para o diagnóstico e a produção de antígeno viral em larga escala. Os PVs são capazes de infectar diversas células do organismo, no entanto, o processo de replicação depende da multiplicação e diferenciação das células-alvo do epitélio. Dessa forma, em culturas de células imortalizadas, onde não ocorre à diferenciação celular, o PV é capaz de infectar as células, iniciar o seu processo de replicação (fase precoce), mas não é capaz de produzir vírions maturos, tornando a infecção não-produtiva e dificultando o processo de isolamento viral. Em culturas de tecidos, porém, onde ocorre tanto a multiplicação quanto a diferenciação celular, os processos de replicação viral são completados, caracterizando a infecção produtiva (DAVID et al., 2001).
Segundo Chia et al. (1991), seqüências do DNA do HPV podem ser encontradas em células sangüíneas polimorfonucleadas de pacientes com infecção urogenital. Santos et al., (1998) e Wosiacki et al., (2005) também detectaram seqüências do BPV-2 em células sanguíneas de bovinos. Freitas et al. (2003) detectaram seqüências do BPV-1 no sangue. Estas observações são potencialmente importantes pela implicação direta na patogênese da infecção, uma vez que ainda não existem evidências sugerindo que os PVs podem se multiplicar em células sangüíneas, admite-se apenas que o PV está presente somente na epiderme ou epitélio mucoso estratificado.
DIAGNÓSTICO
A maioria das viroses patogênicas pode ser diagnosticada por meio de técnicas tradicionais de virologia como cultura de células, microscopia eletrônica ou sorologia. Entretanto nenhum desses métodos é aplicado rotineiramente. Para o diagnóstico dos PVS são frequentemente utilizadas
técnicas que detectam o DNA viral como a hibridização e a PCR (BLOCH et al., 1997; BERNARD, 2005).
Os exames histopatológicos permitem a identificação de neoplasia intraepitelial, a qual pode estar associada a viroses potencialmente oncogênicas e que são de risco para a progressão do câncer. A interpretação histológica é também dificultada quando as alterações vírus-associadas são mínimas, além de não permitir a identificação de infecção latente (SYRJÄNEN e SYRJÄNEN, 2000).
A sorologia no diagnóstico de rotina do HPV tem-se demonstrado promissora apesar de ainda estar em estudo. No momento, a técnica de VLP-ELISA (ensaio imunoenzimático com partículas semelhantes a vírus) apresenta baixa especificidade e sensibilidade (WANG et al., 2005). A técnica de imunoistoquímica é um método pouco sensível e específico, necessitando grandes quantidades de vírus para a detecção (GAUKROGER et al., 1991; ABDOUSLAM et al., 1997).
Os grandes avanços nos sistemas de detecção têm levado a um rápido impacto na tecnologia diagnóstica. Os sistemas de determinação direta ou indireta, radioativos ou não-radioativos, tendem a ser mais sensíveis que os métodos tradicionais. Com as técnicas de biologia molecular, várias metodologias impulsionaram a revolução tecnológica, que incluem o uso de enzimas de restrição, análises do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA (RFLPs), técnicas de seqüenciamento do ácido nucléico e de proteínas e a amplificação do ácido nucléico in vitro pela PCR.
A identificação direta do DNA do PV é o método de escolha para a detecção desse vírus em amostras de tecidos e esfregaços. As técnicas de hibridização foram as primeiras a serem utilizadas destacando-se entre elas: i)
Southern blot que ainda é considerado o “padrão ouro” para a detecção do
genoma do PV. Esse método é um valioso instrumento de pesquisa, mas não tem aplicação para a rotina diagnóstica; ii) Dot blot é um método com baixa especificidade; iii) a hibridização in situ com filtro (FISH) é um método muito simples utilizado para triagem, porém apresenta baixa especificidade e sensibilidade; iv) a hibridização in situ (ISH) é a única técnica que permite a localização do DNA ou RNA em células específicas, ou regiões teciduais, porém essas técnicas somente detectam infecções virais com mais de 10 a 20
cópias do genoma do vírus por célula; v) sanduíche ou locução de hibridização (HCA) é uma das mais antigas metodologias de hibridização de ácidos nucléicos, porém não diferencia entre os tipos específicos do vírus e a sua aplicação como método de pesquisa é limitada, mas pode representar um bom teste para o uso clínico de rotina (SYRJÄNEN e SYRJÄNEN, 2000).
A PCR é uma técnica que permite a amplificação de segmentos específicos do DNA ou RNA in vitro. Após o seu desenvolvimento em 1985, a técnica foi rapidamente difundida à medida que se expandiram novos campos de aplicabilidade na biologia molecular também para o diagnóstico. Atualmente, devido à alta sensibilidade e especificidade, é considerada uma das técnicas mais importantes na biologia molecular.
A capacidade de obter um aumento do número de seqüências de DNA em poucas horas, a especificidade e a fidelidade à enzima utilizada, faz da PCR um instrumento versátil quando aplicada no campo diagnóstico. A sua aplicação em situações nas quais os agentes etiológicos envolvidos são difíceis e lentos de serem cultivados fazem desta estratégia a mais adequada para o diagnóstico etiológico, disponibilizando seqüências de DNA para a análise filogenética. Devido à praticidade, sensibilidade e especificidade a PCR tem sido amplamente utilizada para o diagnóstico e caracterização molecular dos PVs de origem humana e animal em todo o mundo (OTTEN et al.,1993; WOSIACKI et al., 2005).
VACINAS
Os primeiros estudos sobre a vacinação contra diferentes tipos de BPV foram realizados por Jarret et al. (1990; 1991), Campo e Jarret (1994) e Campo (1995) que sugeriram a imunidade tipo-específica do PV. Em seres humanos, diversos estudos foram realizados (BRINKMAN et al., 2005; HARPER et al., 2005; LENZ et al., 2005) e atualmente estudos clínicos com vacinas experimentais estão sendo realizadas no Brasil.
Diferentes vacinas têm sido utilizadas para o controle da infecção pelo PV destacando-se entre elas: i) vacina autógena, utilizada em larga escala como tratamento de infecções cutâneas em animais, principalmente bovinos; ii) vacinas com vírus purificados, que foi o primeiro tipo de vacina em bovinos; iii) proteína recombinante expressa em bactérias, de forma fracionada e como partículas semelhantes a vírus (VLPs); iv) vacinas de DNA, geneticamente modificadas. É importante ressaltar que a imunidade humoral é pouco importante no controle da infecção pelo PV, sendo a imunidade celular mais efetiva (CAMPO et al., 1991; NICHOLLS e STANLEY, 2000).
PERSPECTIVAS e CONSIDERAÇÔES FINAIS
No Brasil as lesões cutâneas, conhecidas como papilomas ou verrugas, estão amplamente disseminadas nos rebanhos bovinos de corte e, principalmente, naqueles de aptidão leiteira. Essas lesões, devido às conseqüências diretas e indiretas no organismo do animal, podem determinar prejuízos econômicos consideráveis à exploração pecuária.
A hematúria enzoótica bovina e o carcinoma do trato digestório superior de bovinos, são outras duas formas de apresentação clínica da infecção pelo BPV-2 e BPV-4, respectivamente. Essas duas entidades clínicas, apresentam distribuição regional e são freqüentes nos rebanhos bovinos de corte, particularmente devido ao tipo extensivo de criação que proporciona o acesso e a ingestão da samambaia (Ptiridium aquilinum). Em associação, a infecção pelo BPV-2 ou BPV-4 e a ingestão da samambaia, também ocasionam grandes prejuízos econômicos tanto devido à mortalidade dos animais comprometidos quanto pelo descarte precoce dos animais de reprodução expressando sinais clínicos.
Os estudos com o BPV no Brasil ainda estão em fase inicial e até o momento, poucas estirpes virais foram caracterizadas. Considerando que a imunidade contra o BPV é tipo-específica e que vários grupos de pesquisa em todo o mundo têm-se empenhado no desenvolvimento de vacinas para o
controle da infecção, a definição dos tipos virais mais freqüentes em uma região assume importância epidemiológica.
Com isso, os estudos que objetivem a definição dos tipos virais circulantes nas distintas regiões geográficas brasileiras, bem como o desenvolvimento de estratégias imunoprofiláticas e/ou imunoterapeuticas devem ser incrementados e incentivados em nosso país.
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Objetivo Geral
• Identificar tipos de BPV causadores de lesões cutâneas em bovinos de rebanhos do Estado do Paraná.
Objetivos Específicos
• Padronizar a técnica da PCR com os primers genéricos FAP59 e FAP64 para a detecção de um produto com 478 pb do gene L1 do papilomavírus em lesões cutâneas em bovinos.
• Caracterização do amplicon por meio do seqüenciamento dos produtos amplificados.
• Realizar análises filogenéticas e comparar a seqüência de nucleotídeos das amostras estudadas com amostras padrão do BPV.
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO
PAPILOMAVÍRUS BOVINO TIPOS 1, 2 e 6 DE LESÕES CUTÂNEAS EM REBANHOS DO ESTADO DO PARANÁ
RESUMO
Os primers genéricos FAP59 e FAP64 foram utilizados para a amplificação de um fragmento com 478 pb do gene L1 do papilomavírus em nove amostras de papilomas cutâneos obtidos de seis animais provenientes de quatro rebanhos bovinos da região norte do Estado do Paraná. Em todas as amostras foi possível a amplificação de um produto com tamanho molecular esperado. Por meio da análise filogenética das seqüências foi possível identificar o BPV-2 em três amostras, o BPV-1 em uma e o BPV-6 em cinco amostras. O BPV-6 foi encontrado, tanto em papilomas cutâneos presentes no teto, quanto em outras partes do corpo. Em um dos animais, onde foram colhidas mais de uma amostra, foi encontrada infecção mista com o BPV-1 e BPV-2. As cinco amostras positivas para o BPV-6 apresentaram 100% de similaridade na matriz de identidade com a amostra padrão, porém foram identificadas divergências entre as amostras do BPV-2 e BPV-1 e aquelas depositadas em bases públicas de dados. As amostras de BPV-2, quando comparadas entre si, demonstraram o envolvimento de duas variantes virais.
IDENTIFICATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF BOVINE PAPILLOMAVIRUS TYPES 1, 2, AND 6 IN SKIN WARTS IN CATTLE HERDS
FROM NORTHERN PARANÁ ABSTRACT
The generic primers FAP59 and FAP64 were used for the amplification of a 478 bp amplicon of papillomavirus L1 gene in nine cutaneous papillomas samples obtained from six animals in four different cattle herds from northern of Paraná. In all samples examined it was possible the amplification of a product with the expected molecular size. By phylogenetic analysis of the sequences it was possible to characterize BPV-2 in three samples, BPV-1 in one, and BPV-6 in five samples. BPV-6 was found, present in cutaneous papillomas on the teat, as well as in other parts of the body. In one of the animals, where more than one sample were collected, a mixed infection with BPV-1 and BPV-2 was observed. The five positive samples of BPV-6 demonstrated a identity matrix of 100% with the reference strain available in the GenBank. However, divergences between the samples of BPV-2 and BPV-1 and those deposited in GenBank were observed. When the samples of BPV-2 were compared with each other the involvement of two viral variants was identified .
INTRODUÇÃO
Os papilomavírus (PVs) pertencem a um grupo heterogêneo de vírus DNA epitéliotrópicos, que infectam as células basais induzindo-as à formação de lesões neoplásicas, conhecidas como papilomas ou verrugas, nos epitélios cutâneo e mucoso. As lesões são geralmente benignas e com tendência à regressão, porém sob condições especiais, podem transformar-se em tumores malignos (CAMPO e JARRETT, 1986; HOPKINS, 1986; LANCASTER e OLSON, 1982). A papilomatose cutânea encontra-se amplamente disseminada em todo o mundo e ocorre em diversas espécies de mamíferos e aves.
A família Papillomaviridae é constituída por 16 gêneros e mais de uma centena de tipos virais. Até o momento foram caracterizados apenas seis tipos de papilomavírus bovino (BPV-1 a BPV-6), que estão incluídos nos gêneros
Delta-papillomavirus (BPV-1 e 2), Episilon-papillomavirus (BPV-5) e Xi-papillomavírus (BPV-3, 4 e 6) (DE VILLIERS et al., 2004). Mais recentemente,
com o uso de métodos moleculares, foram descritos 16 supostos novos tipos virais de BPV (ANTONSSON e HANSSON, 2002; OGAWA et al., 2004).
Considerando o tropismo celular e as lesões ocasionadas, os seis tipos de BPV podem ser classificados em dois subgrupos. O subgrupo A (BPV-1, 2 e 5) compreende os fibropapilomavírus e o subgrupo B (BPV-3, 4 e 6) os papilomavírus epiteliotrópicos (CAMPO, 1987, 1997). Todos os tipos de BPV já foram identificados em papilomas cutâneos presentes em várias partes do corpo, incluindo teto e úbere (BLOCH et al., 1997; CAMPO, 1998; JELÍNEK e TACHEZY, 2005). Lesões neoplásicas em bexiga e no trato digestório superior de bovinos também são relacionadas, respectivamente, à infecção pelo BPV-2 e BPV-4, em associação a co-fatores oncogênicos presentes na samambaia (Pteridium aquilinum) (CAMPO et al., 1992; BORZACCHIELLO et al., 2001).
O genoma do papilomavírus é constituído por uma fita dupla de DNA circular que contém 10 ORFs, distribuídas em dois segmentos (E e L) principais conforme a fase de transcrição. O segmento precoce (early – E) compreende oito ORFs e o segmento tardio (late – L) duas ORFs. Entre os segmentos E e L existe ainda um outro segmento denominado LCR (long control region). O segmento E codifica proteínas não-estruturais, o segmento L as proteínas
estruturais L1 e L2 e o LCR contém elementos promotores e reguladores da replicação viral. O capsídeo viral é formado pelas proteínas L1 e L2. A proteína gênero-específica L1 é a principal proteína do capsídeo, contém epítopos que induzem anticorpos neutralizantes e pode formar partículas semelhantes a vírus (CAMPO e JARRETT, 1994; CAMPO, 1995; DAVID et al., 2001).
A ORF L1 é o gene mais conservado no genoma do papilomavírus e tem sido utilizada para a identificação de novos tipos virais. Um novo tipo de papilomavírus é reconhecido quando, após a clonagem do genoma completo, o seqüenciamento da ORF L1 demonstrar diferença de homologia superior a 10%, em análises que incluam todos os outros papilomavírus com seqüências disponíveis em bases públicas de dados. Diferenças de homologia entre 2 e 10% definem um subtipo e inferiores a 2% uma variante viral (DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD, 2005).
Forslund et al. (1999), utilizando os oligonucleotídeos genéricos FAP59 e FAP64 para a amplificação parcial do gene L1 e posterior seqüenciamento do produto amplificado, descreveram 12 supostos novos tipos de papilomavírus humano (HPV). Posteriormente, essa mesma estratégia possibilitou a identificação de 16 supostos novos tipos de BPV provenientes tanto de lesões cutâneas quanto de pele saudável (ANTONSSON et al., 2000, ANTONSSON e HANSSON, 2002; OGAWA et al., 2004), sugerindo que a mesma diversidade molecular já caracterizada no papilomavírus humano (HPV), onde atualmente são reconhecidos 118 tipos virais, também pode ocorrer em papilomavírus de origem bovina.
Este trabalho teve como objetivo identificar tipos de BPV presentes em lesões cutâneas de bovinos da região norte do Estado do Paraná por meio do seqüenciamento e de análises filogenéticas de produtos do gene L1 amplificados pela PCR com os primers genéricos FAP59 e FAP64.
MATERIAL E MÉTODOS Papilomas
Foram avaliadas nove amostras de papilomas cutâneos. Para evitar uma possível contaminação com diferentes tipos de BPVs presentes num mesmo animal, cada amostra era constituída por um único papiloma colhido assepticamente. As amostras foram provenientes de seis animais (A a F) de quatro rebanhos (1 a 4) bovinos da região norte do Estado do Paraná. Em três animais (B,C e E) foi colhido um único papiloma e em outros três (A, D e F) foram colhidos dois papilomas por animal em diferentes regiões do corpo. Nas amostras com excesso de queratina as porções mais externas do papiloma foram retiradas. Após a colheita as amostras foram conservadas individualmente a 4°C e posteriormente estocadas a -20°C até o processamento.
Extração do Ácido Nucléico
Os papilomas foram triturados em PBS pH 7,2 (137 mM NaCl; 3 mM KCl; 8 mM Na2HPO4; 15 mM KH2PO4) e a emulsão (10% p/v) foi centrifugada por 15 min a 3000 x g a 4°C. Alíquotas de 250 µl do sobrenadante foram incubadas com tampão de lise (1% Nonidet P40, 2% SDS e 0,2 mg/ml proteinase K) a 56°C por 30 min. Para a extração do DNA foi utilizada uma combinação das técnicas fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/tiocianato de guanidina (ALFIERI et al., 2004). As amostras foram tratadas com igual volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), homogeneizadas e aquecidas a 56°C por 15 min (SAMBROOK e RUSSEL, 1989). Após centrifugação a 10.000 x g por 10 min, a fase aquosa foi processada com sílica/tiocianato de guanidina (BOOM et al., 1990). O DNA foi eluído em 125 µL de água DEPEC e mantido a -20°C até a sua utilização. Como controle negativo, uma alíquota de água ultrapura estéril foi incluída em todos procedimentos de extração de DNA.
